Summary
我们描述了在进化模型系统中操纵基因的方法. 描述了三种不同的技术: Tol2 介导的转基因、使用 CRISPR/Cas9 对基因组进行有针对性的操纵以及使用吗啡酮敲除表达。这些工具应有助于直接研究表面和洞穴居住形式之间变异背后的基因。
Abstract
洞穴动物提供了一个引人注目的系统, 用于调查许多复杂特征的进化机制和遗传基础, 包括眼睛退化、白化病、睡眠不足、高血糖和感官处理。由于不同洞穴系统之间的环境压力, 来自世界各地的紫鱼物种表现出形态和行为特征的收敛进化。在实验室环境中研究了不同的洞穴物种。墨西哥的泰拉,具有视觉和盲目性的形式, 提供了独特的见解, 生物和分子过程的基础, 进化复杂的性状, 并作为一个新兴的模型系统的良好的准备。虽然在 mexicanus 中已经确定了调节不同生物过程进化的候选基因, 但验证单个基因作用的能力有限。转基因和基因编辑技术的应用有可能克服这一重大障碍, 并研究复杂性状进化的机制。在这里, 我们描述了一种不同的方法来操纵基因表达在 a. mexicanus。方法包括使用吗啡、 Tol2转基因和基因编辑系统来操纵马塞卡努斯的基因功能, 这些系统通常用于斑马鱼和其他鱼类模型. 这些协议包括详细描述定时繁殖程序、受精卵的收集、注射和转基因动物的选择。这些方法将允许研究遗传和神经机制的演变的不同性状的影响。
Introduction
自达尔文的物种起源1 以来, 科学家们已经深入了解了由于洞穴生物2的作用, 这些特性是如何进化形成的, 以应对确定的环境和生态压力.墨西哥的特拉, a. mexicanus, 包括眼睛祖先的 "表面" 人口居住在整个墨西哥和南部的得克萨斯州的河流, 以及至少29个地理上孤立的洞穴形态种群居住在塞拉德阿布拉和墨西哥东北部其他地区 3。一些与洞穴相关的特征已经被发现在一个维菌, 包括改变的耗氧量, 脱色, 眼睛的损失, 和改变喂养和觅食行为4,5, 6, 7,8,9。由于清晰的进化史、对生态环境的详细描述以及独立演化洞穴的存在, mexicanus为研究收敛进化的机制提供了一个强有力的模型人口10,11。在洞穴中存在的许多洞穴衍生特征, 包括眼睛丢失、睡眠不足、增加喂养、失去学业、减少攻击性和减少压力反应, 都是通过独立的起源多次进化的, 通常使用洞穴8,12, 13,14,15之间的不同遗传途径。这种反复的进化是一个强大的方面 , 可以提供洞察更普遍的问题 , 遗传系统可能会扰产生类似的表型。
虽然基因技术在许多鱼类 (包括鱼) 基因功能机械调查中的应用有限, 但斑马鱼的最新进展为鱼类的基因技术发展提供了基础16,17,18,19,20。许多工具被广泛用于斑马鱼操纵基因表达, 这些程序的实施早已标准化。例如, 在单细胞阶段注射吗啡寡核苷酸 (mo) 有选择地阻断 rna, 并在开发过程中阻止短时间窗口的翻译 21, 22.此外, 基因编辑方法, 如聚集定期间隔的短回文重复 (CRISPR)/crispr 相关蛋白 9 (Cas9) 和转录激活剂样效应核酸酶 (TALEN), 允许产生定义的缺失或在某些情况下, 通过基因组19、20、23、24 的重组进行插入。转基因是用来操纵稳定的基因表达或功能在细胞类型的特定方式。Tol2系统有效地用于生成转基因动物, 方法是将转座酶 mrna 与含有转基因 25,26的tol2 dna质粒进行共置。Tol2系统利用 Medaka 的tol2移位酶生成具有稳定性的转基因结构的种系插入。产生Tol2转基因包括为tol2转座酶17注入含有由Tol2整合位点和 mrna 两侧的转基因的质粒.该系统已被用来生成一系列的转基因线斑马鱼, 它的使用最近已扩展到其他的紧急模型系统, 包括鱼, 小鱼, 粘背, 以及最近, 墨西哥洞穴 27, 28,29,30。
虽然紫鱼是一个迷人的生物系统, 用于阐明性状进化的机制, 但它作为进化模型的全部能力尚未得到充分利用。这在一定程度上是由于无法直接操纵遗传和细胞功能 31。利用定量性状位点 (qtl) 研究确定了调节复杂性状的候选基因, 但这些候选基因的验证一直很困难, 有 32,33, 34。最近, 利用吗啡进行瞬态击倒, 使用 CRISPR 和 T吃饭系统进行基因编辑, 以及使用Tol2介导的转基因技术, 研究了一些性状35、36、37的遗传基础.,38。这些技术的实施和标准化将允许对生物特性的分子和神经基础进行操作, 包括基因功能的操纵、已定义细胞群的标记以及功能记者的表达。虽然这些基因工具的成功实施, 以操纵基因或细胞功能已在紧急模型系统中证明, 详细的协议仍然缺乏在a. mexicanus。
Mexicanus提供了对进化机制的关键洞察, 以应对不断变化的环境, 并提供了识别调节不同性状的新基因的机会。一些因素表明, mexicanus是一个极其可操作的模型, 用于应用现有遗传模型中现有的既定基因组工具, 包括在实验室中轻松维持鱼类的能力、大的育苗大小、透明度, 一个测序的基因组, 并定义行为检测39。在这里, 我们描述了一种方法, 用于使用吗啡, 转基因, 和基因编辑的表面和洞穴种群的. 这些工具在马西卡努斯的更广泛应用将允许对海鱼和河豚发育、生理和行为差异演变背后的分子过程进行机械研究。
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Protocol
1. 莫菲洛里诺寡核苷酸设计
注: 通过国家生物技术信息中心 (NCBI) 基因和 NCBI SARA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 以及 Ensembl 基因组浏览器 (https://www.ensembl.org) 提供了a. mexicanus的序列。在设计用于表面和洞穴居住形式的吗啡时, 在这一阶段识别形态之间的任何遗传变异是至关重要的, 因此可以避免这些遗传区域成为吗啡的目标。吗啡目标站点内的任何多态性变化都可能导致无效的绑定。这种设计类似于斑马鱼等其他鱼类系统, 此前已在a. mexicanus21、36、40 中被证明能有效工作.
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封堵吗啡的设计
注: 转化阻断吗啡通过绑定到内源起始位点阻止翻译, 并阻止翻译机械通过斯特粒线结合 mRNA 序列。- 从 ATG 起始位置开始识别目标基因的编码区域。
- 通过复制记录目标序列的前25个基对, 并将序列粘贴到文本编辑器或实验室笔记本中。
- 使用在线软件 (例如, http://reverse-complement.com) 或手动翻译, 生成目标序列的反向补语。将生成的反向补语保存在文本编辑器或实验室笔记本中。
- 从一家生成吗啡寡核苷酸的公司订购具有反向补数序列的吗啡。请参阅公司材料表。
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堵花吗啡的设计
注: 分裂阻断吗啡块剪接, 从而防止形成成熟的 mRNA 分子。这为在起始位点未明确定义时进行击倒提供了另一种方法, 或者在需要通过聚合酶链反应 (PCR) 验证击倒时提供了一种更优化的方法。这种阻止脾的吗啡 (通过 atg 阻滞 Mo) 的好处是, 可以通过逆转录酶 (RT)-pcr 和凝胶上的大小差异在凝胶上可视化来很容易地评估外显子排斥或内含子。RT-PCR 和凝胶电泳, 以确定吗啡的疗效应使用标准的实验室程序。- 识别目标基因的 mrna 前序列。利用来自 mexicanus 基因组的现有信息, 通过 Ncbi 或 Ensembl 确定内含子边界33。
- 目标外显子 (拼接供体) 或内含子边界 (接合受体) 位点用于内含子夹杂物或外显子排除点。
注: 拼接体通常以 5 ' 拼接点的内含子中的 "GU" 序列 (U1 目标) 为目标, 在 3 ' (U2 目标) 内耳接点处的"ag"序列为目标。在正常情况下, 拼接 U1 和 U2 亚基将这些目标位点结合在 mrna 前序列上, 以便进行适当的拼接。但是, 如果这些目标序列中的任何一个被吗啡阻止, 拼接体将移动到下一个可用的 U1 或 U2 站点, 从而导致 mRNA 序列中的内含子排除或外显子。这将涉及规划优化, 取决于目标基因21的性质。通常, 阻止内部 U1 站点会将拼接重定向到下一个可用的 U1 站点, 从而导致外显子切割。或者, 阻止第一个或最后一个拼接连接点会导致内含子, 因为没有其他站点将拼接重定向到。使用序列软件预测各种排除与包含的影响。预测可以表明潜在的帧和过早停止密码子, 表明一个更有效的目标站点的 mRNA 中断。 - 一旦确定了目标站点, 就将其顺序记录在文本编辑器或实验室书籍中。确保目标站点有25个基对 (bp) 长。
- 使用在线软件 (例如, http://reverse-complement.com) 或手动翻译, 生成目标序列的反向补语。将其顺序记录在文本编辑器或实验簿中。
- 从一家生成吗啡寡核苷酸的公司订购具有反向补数序列的吗啡。请参阅样品公司的材料表。
2. 注射用吗啡
注: 需要进行几种浓度或多体积的 mo 注射, 以确定最佳的注射浓度。典型的注射量为 400–800 pg 的 MO。吗啡敲倒的效果可持续长达6天注射后。
- 获取库存吗啡。股票吗啡到达冻干。在使用所需的库存浓度 (例如, 4 mm) 之前, 用无菌 h2o 对其进行保湿。储存在- 20°c, 直至使用。
3. CRISPR gRNA 的设计、体外转录和制备
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CRISPR gRNA 设计
注: Grna 是利用 Varshney 等人和 Wierson 等人的先前公布的研究结果生成的.- 使用基因组浏览器, 识别感兴趣的基因的编码区域。利用基因组序列, 通过寻找一个 20 bp 核苷酸目标测序, 从 GRNA 开始, 然后是 PAM 序列 (NGG), 来识别外显子中的 gRNA 目标序列。启动 (ATG) 后的基因区域将成为目标。
注: 如果在该基因所需的外显子中找不到具有 5 ' 端 GG 的目标序列, 则可以用一个或两个g 替代序列末尾的第一和第二核苷酸。然而, 这两个 G的必须纳入寡核苷酸, 因为这些都是 t7 转录所必需的。 - 设计和订购一种基因特异性寡核苷酸 (寡核苷酸 A:5 '-taacactacacttagnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttgattaagtagc-3')。在 T7 启动子序列 (红色) 和用于退火的重叠序列之间添加基因特异性 20 bp gRNA 目标序列 (带根), 而不添加 PAM 序列。退火和放大 (见步骤 3.2.1) 这个寡核苷酸 a 和第二个寡核苷酸 (寡核苷酸 B: 5 '-GOCCCCCACCCACTGGCACTGCTTCTGAGGGTAGTTTTATTATTATTATTACTTTTTTACTCTTAACTTAACTTAACT-3 ') 生成用于转录的 gRNA 模板。
注: Oligo B 对于每个反应都是相同的, 只需订购1x。
- 使用基因组浏览器, 识别感兴趣的基因的编码区域。利用基因组序列, 通过寻找一个 20 bp 核苷酸目标测序, 从 GRNA 开始, 然后是 PAM 序列 (NGG), 来识别外显子中的 gRNA 目标序列。启动 (ATG) 后的基因区域将成为目标。
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gRNA 制备和转录
- 退火并放大寡核苷酸。包括以下引物来扩增 gRNA 以提高产量: 5 '-TAATACACACATA-3 ' (T7 引物) 和 5 '-Gatcgccacgggggggggg-3 ' (3 ' gRNA 引物)。使用kod聚合酶进行 PCR。
注: 对于寡核苷酸 a 和寡核苷酸 b 中的引物, 建议使用10个周期以获得良好的产量。在 Wierson 等人41 中可以找到详细的协议。 - 使用市售的体外转录试剂盒 (见材料表) 转录 gRNA。这是通过修改 Klaassen等人42公布的制造商协议来实现的.
- 如 Klaassen 等人所述, 沉淀、清洗和重新悬浮 grna。
注: gRNA 必须重新悬浮在无 rnase 的水中, 以防止降解。 - 记录 gRNA 的浓度, 这可以用分光光度计确定。通过在琼脂糖凝胶上运行2μl 来评估 RNA 的质量。在注射前, 请将其保存在- 80°c。
- 退火并放大寡核苷酸。包括以下引物来扩增 gRNA 以提高产量: 5 '-TAATACACACATA-3 ' (T7 引物) 和 5 '-Gatcgccacgggggggggg-3 ' (3 ' gRNA 引物)。使用kod聚合酶进行 PCR。
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Cas9 制剂和转录
- Cas9 mRNA 可以使用商业上可用的体外转录试剂盒 (见材料表) 进行转录, 如前面所述的43。使用 nls-cas9-nls版本 43。
- 记录 gRNA 的浓度, 并通过在琼脂糖凝胶上运行2μl 来评估其质量。Aliquots RNA, 以避免通过多个冻融循环产生的分解, 并将等价物存储在-80°c.
4. 托2结构、托二转座酶和转染的制备
- 准备 Tol2 转基因结构以进行注射。
注: 我们已经成功地利用了公共/可用的斑马鱼和美达卡结构在a. mexicanus。这些结构在mexicanus中完全起作用, 这可能是因为序列同源性很高 (有关可用的结构, 请参阅 adgene 存储库和 Zebrafish 信息网络 (zfin) 数据库)。斑马鱼启动子碎片在mexicanus中使用时, 在预期的组织中表达了转基因。- 获取 Tol2 结构或生成质粒与组织特异性启动子, 所需的转基因, 和 Tol2 臂 (见 Kwan 等人,44)。收到后, 对构造进行排序以验证质粒。
- 根据制造商的指导原则, 对建筑进行准备.在无 Rnase-h2o 中清除最终质粒, 用分光光度计测定浓度, 将浓度稀释至 100–300 Ng/μl,并将结构储存在- 20°c.
- 摘要 Tol2 转座酶质粒, 并合成 mRNA。
- 获取 Tol2 转座酶质粒 (Pcs-zt2tp) 的副本, 作为生成 Tol2 mRNA45的模板。
- Midiprep Pcs-zt2tp 结构根据制造商的准则。在低容量的无 rnase 水或缓冲液中使用它 (~ 50μl)。将等价物存放在- 20°c。
- 使用限制性酶消化 Tol2 质粒。
- 使用表 1对10微克的圆形 pcs-zt2p 质粒进行限制性消化。
- 将反应分成2-50μl 反应, 并在37°c 的热循环中孵育反应.
- 第二天, 将酶加热到65°c20分钟, 使其失活。
- 在消化后立即纯化线性化质粒, 根据制造商的指南使用市售 pcr 纯化试剂盒 (见材料表)。在15μl 的无 rnase-h2o 中清除质粒, 并用分光光度计测定产品的浓度。
- 在1.5% 琼脂糖凝胶上运行1Μl 的消化质粒和1Μl 的未切割质粒, 以确认线性化质粒。
- 进行 Tol2 mRNA 的体外转录。
- 利用1μg 的线性化 Pcs-zt2tp 质粒作为转录模板。如表 2所示, 请遵循制造商的体外转录指南 (参见材料表).
- 根据制造商的指导, 在37°c的热循环中进行孵化.
- 加入1Μl 的 DNase, 按照制造商的准则, 在37°c的热循环器中孵育。
- 根据转录试剂盒协议执行氯化锂沉淀。将 RNA 颗粒在 ~ 20–30Μl的无 rnase h2o 中再置。
- 使用分光光度计确定产品的浓度, 并记录 RNA 质量。
- 将产品稀释至 ~ 100–300 ngμl, 并将其稀释为5-10μl 样品, 以避免重复冻融.将其存放在- 80°c, 直至使用。
注: 可以用凝胶电泳检测1–2Μl 纯化的 Tol2 mRNA 是否有熔体带。
5. 微注射
- 注射通用工具的制备
注: Kovalko 等人46对本节中的程序作了详细介绍, 并在此概述了一些小的修改。- 将溶解在鱼类系统水中的温暖3% 琼脂糖浇注到100毫升培养皿中, 生成注射板。小心地将一个鸡蛋注射模具放入新鲜倒的琼脂糖, 为鱼卵打井。将模具的侧面置于45°角, 然后将其慢慢降低到琼脂;慢慢降低模具在一个角度, 避免空气被困在模具下面。琼脂糖凝固后, 轻轻取出霉菌。板材可在4°c下存放、密封, 最长可达1周。
- 根据制造商的指导原则, 从硼硅酸盐玻璃毛细血管中拔针, 在电致针拉拔器中注射.该协议将因移液器拉拔而异;但是, 在表 3中可以找到一个拉针程序的示例。
注: 优化针头对注射很重要, 因为太长的针头会弯曲而不是干净地穿透鸡蛋。 - 通过打破标准的玻璃移液器, 为鸡蛋的转移制作大口径玻璃移液器, 使开口足够大, 可以容纳鸡蛋。使用本森燃烧器, 通过将破碎的移液器的末端暴露在火焰中, 直到其光滑, 对玻璃破碎的端进行抛光。
- 育种设置
注: 有许多不同的协议用于繁殖a. mexicanus。有关详细的协议, 请参阅博罗夫斯基39。在注射前1周开始繁殖。- 第1天, 将2至3名女性和3至4名男性放置在一个10加仑的油箱中, 保持在 24±1°c.
- 在第1天至第7天, 将喂养增加到每天约3倍。确保饮食包括生活食物, 如黑虫和盐水虾。
- 第6天, 添加一个设置为27°c的单罐式加热器. 实验室的水箱温度可能会有所不同;因此, 这将是一个增加 2-3°c相对于正常的储罐温度。
- 在第7天的晚上, 也就是注射之夜的晚上 (zeitgeber [ZT]9-11), 用水浸透的海绵彻底清洗储罐, 并用细网或虹吸管清除多余的食物或杂物。
- 在第7天的晚上, 开始检查 ZT15 的表面鱼卵, 并继续每15-30分钟检查一次, 直到 ZT18。对于空鱼, 开始检查鸡蛋在 ZT17, 并继续检查每 15-30分钟,直到 ZT20。
注: 时间基于14:10 小时的光: 使用时间的暗周期。繁殖时间是估计, 个别实验室必须确定确切的时间。在卵被释放后不久收集卵子是至关重要的, 以便在单细胞阶段注射。
- 单细胞级卵的收集
- 预计繁殖的夜晚, 每15-30分钟检查一次储罐,并监测储罐底部的鸡蛋。鸡蛋呈半透明, 直径约为1毫米。
- 使用一个精细的网状鱼网收集鸡蛋, 并将其转移到一个玻璃碗充满新鲜的鱼系统水。在显微镜下检查鸡蛋, 以确认鸡蛋处于单细胞阶段。
- 使用玻璃移液器, 将单细胞卵转移到注射板。在这个阶段需要玻璃移液器, 因为鸡蛋会粘在塑料上。
- 使用移液器, 小心地将鸡蛋释放到5.1 节琼脂糖注入板的井中。用最大鸡蛋数量 (每排 30–40, 最多5排) 填充预热 (室温下) 的注射板。完整的行有助于防止鸡蛋在注射过程中移动。用少量的鱼系水保持注射板上的鸡蛋水分, 直到注射的效果。
- 皮针装置和一般注射优化指南
- 使用适合毛细管内部的凝胶加载移液器吸头或使用标准的微移液器吸头, 并在末端添加一个2-4Μl的螺栓, 以填充注射针。填充针头后, 使用钳子修剪注射针的多余长度。
- 使用安装在微机械手中的针头进行微注射, 连接到皮镜微喷射器上。
- 将注射时间设置为 0.03 s, 将压力设置为 ~ 0.0 psi。注射压力会相应地变化, 但针头之间的差异不大, 因此优化以实现 ~ 1.0 nL 注射螺栓。
注: 注射压力通常在 ~ 10–30 psi 的范围内。 - 通过注入矿物油和测量螺栓大小与滑动千分尺, 以实现约1–1.5nl 注入量, 从而标准化注入孔。调整注射压力 (psi) 以增加或减少球体体积。
- 用实验室组织从鸡蛋的顶部抽水。
注:阿斯蒂安克斯蛋绒毛膜比斑马鱼蛋稍微难以穿透。我们发现, 从鸡蛋顶部抽水有助于针头进入鸡蛋。板材优化可以让一个盘子上的鸡蛋约200个。 - 使用微机械手用针头穿透每个鸡蛋, 并直接注入蛋黄。一旦定位在蛋黄中, 通过按下注射按钮或注射脚踏踏板注射鸡蛋。
注: 一个完整的板可以在 ~ 15分钟内注入。单细胞阶段持续约40分钟。
- 吗啡酮注射液
注: 在不造成毒性的情况下击倒所需的吗啡量需要针对每个基因靶标进行优化;然而, 集中 4 0 0 p 是一个很好的起点。- 准备吗啡, 以便每个鸡蛋将注入 400 pg 的吗啡。在冰上解冻吗啡。注射溶液由吗啡 (在所需浓度下)、无 rnase h2o 或 D14.au 溶液和苯酚红色(最终体积的 10%) 组成.有关示例, 请参见表 4。
- 每个胚胎注入 1 nL。
- CRISPR 注射
- 准备 RNA, 使每个胚胎注射 25 Pggg而 r, 300 pg mRNA 总数。关于 CRISPR/Cas9 注射混合物的样品, 见表 5。
- 将每个胚胎的 Grn\ cas9 mrna 直接注入胚胎 2 Nl。
- 应用 Tol2 转座子和 Tol2 侧向质粒进行转染
- 在冰上解冻转座酶 mRNA 和 Tol2 质粒。将 Cas9 mRNA (在 25ngμl)、所需的 Tol2 结构 (在 25ng/μl) 和苯酚红色 (≤10%的最终体积) 结合在无 rnase 的水中.关于 Tol2 转基因注射混合物样本, 见表 6。
- 将注射溶液和针头放在冰上, 以避免 mRNA 的降解。以每个胚胎的体积为 1 nL 的速度注入。
6. 饲养和筛选注射鱼
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注入鱼饲养
- 注射鸡蛋后, 立即将其转移到玻璃碗 (10 x 5 厘米), 其中含有 ~ 200 毫升的鱼系水。鸡蛋很容易通过将注射盘浸入装满鱼水的碗中, 用移液器冲洗鸡蛋来冲洗。
- 每个碗放置~ 50–80个注射胚胎, 并在22–24°c下进行.
- 每天用注射的鱼清洗碗 2倍, 去除死去的胚胎, 每天改变 ~ 20% 的水。
- 额外的饲养是按照以前公布的协议进行的.
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吗啡注射个体的筛选
- 在立体显微镜下对动物进行可视化, 以筛选表型。吗啡的作用可持续到注射后 21~ 5天。
- 在注射后4天测量行为表型。
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对 CRISPR indels 的筛选
- 设计引物来扩增目标部位周围的基因组 DNA。设计引物, 使目标 PCR 产品约为100–125 bp。
注: 例如, 对于caf2位点, 使用正向引物 5 '-ctctgggggggc-3 ' 和反向引物 5 '-ggggggtttttgatggc-3 ' 放大了 grna 靶点周围的区域, 用于 pcr 产品长度为 105 bp。 - 根据机构动物协议, 牺牲胚胎或鱼翅夹住成年鱼。
- 将胚胎或分离的鳍收集到 PCR 管中, 提取 DNA, 并进行 Pcr. 基因特异性引物的 PCR 样本方案可在ma 等人中找到。
- 为了评估诱变, 在 70 V 的3% 琼脂糖凝胶上运行 5μl PCR 产物, 3 h. 野生型 (非诱变化) DNA 将导致 PCR 产物作为一个独特的带。突变 DNA 会导致凝胶上有一个涂抹带。
- 为了确定突变等位基因的序列, TA 根据制造商的指令克隆 PCR 产品,选择菌落和微制备培养物。发送生成的 DNA 进行测序。
- 为了建立和维持传播突变等位基因的鱼类线, 将成年鱼与野生鱼类交叉注射, 并筛选5-10 个胚胎, 以确定是否有任何后代携带基因的突变等位基因, 遵循 6.3.1-6.3.6 步骤。
注: 不同的f1 个体从相同的 f0创始人鱼可以携带不同的突变。确保突变系被排序, 以获得预测的突变, 从而产生出框架外的等位基因。 - 通过 PCR 识别携带突变等位基因的鱼类, 方法是使用涂抹带分析 (步骤 6.3.1-6.3.6) 或设计等位基因特异性 PCR 引物, 从而扩增突变带和野生型基位基因 (图 2C)。
- 一旦一条鱼的线建立, 纯合突变等位基因来测试隐性表型。
- 设计引物来扩增目标部位周围的基因组 DNA。设计引物, 使目标 PCR 产品约为100–125 bp。
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转基因阳性个体的筛选
注: 建议使用含有荧光制造商的结构来简化转基因阳性个体的筛选。然而, 标准的 PCR 筛选方法可用于筛查传输。- 在注射后 2天, 将 F0鱼的组织特异性荧光蛋白可视化, 并具有浅荧光解剖范围。
注: F0幼虫中的表达是马赛克的, 阳性个体可能有一系列的表达表型。 - 保持积极的个人作为 F0创始人鱼。
- 当 F0的成熟度时, 反交叉的创业鱼对非转基因个体来自于相同的数量/实验室股票。使用步骤6.2 中所述的相同协议筛选 F1后代。
注: F1幼虫中的表达式是一致的, 并确保 f1兄弟姐妹之间的一致性。 - 由于 Tol2 整合不是现场介导的, 而不同的创始人之间的整合可能会有所不同, 因此选择 F1兄弟姐妹得出一个 f0 创始人和杂交正表达 f 1兄弟姐妹来生成 f 2 s.这个后代将是稳定线的基础。
- 在注射后 2天, 将 F0鱼的组织特异性荧光蛋白可视化, 并具有浅荧光解剖范围。
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Representative Results
多种群的血管居住 a . mexicanus显示减少睡眠和增加清醒活性相对于他们的表面居住的康特14。低聚体/奥氏症 (hcrt) 是一种高度保守的神经肽, 其作用是增加清醒, hcrt 途径中的畸变在人类和其他哺乳动物中引起嗜睡症 47,48。我们之前已经证明, 洞穴a. mexicanus增加了 hcrt 肽的表达, 这表明这种肽的表达增加可能是导致睡眠丧失的原因在腔鱼38。Hcrt表达的 mo 敲除提供了一个强有力的方法, 直接检查增加hcrt表达的效果, 调解在空鱼睡眠损失。
为了研究hcrt表达和睡眠之间的关系, 我们设计了一种被翻译阻断的吗啡。MO 的目标是前 25 bp 的外显子 1, 包括 ATG 起始站点 (图 1a,b)。作为一个控件, 我们使用了一种商业上可用的拼接 MO 控件 (图 1b)。在 NCBI 上使用 BLAST 算法, 我们确认在整个基因组中, 这两个 mo 都没有目标外的影响 (数据未显示)。在单细胞阶段, 对一种 mexicanus表面鱼类和 Pachón 河豚进行了繁殖, 并收集了它们的卵, 然后在 1 nl 体积中注射了 400 PG 的 Mo (图 1c,d)。鱼被提高到 4 dpf, 然后测量活动和睡眠行为。
与同时注射拼接 MO 的表鱼相比, 注射于对照 mo的 a. mexicanus在24小时内表现出明显的运动活动和减少的睡眠 (图 1e,f), 这表明没有影响。控制吗啡注射, 因为结果与以前公布的活动和睡眠模式一致, 在每个模式 (t = 5.02, df = 88, p < 0.0001)。与控制注射鱼相比, 注射 HCRT-MO 对水面鱼类的睡眠影响不大 (t = 0.17, df = 88, p > 0.17)。相反, 通过 mo 注射对洞穴鱼类的睡眠有显著影响。帕孔空虫幼虫的运动活动减少不到四倍, 睡眠量几乎是控制帕孔幼虫的两倍 (图 1e、f;t = 2.694, df = 88, p < 0.05)。对 mot 敲床表面和洞穴居住的鱼类的运动活动和睡眠的比较显示了可比的运动和睡眠量 (图 1E,F)。这些数据提供了hcrt表达与睡眠损失之间的直接联系, 并提供了一种方法来询问进化衍生的洞穴居住形态中睡眠损失的生物机制。
色素沉着损失是洞穴生物的一个特征, 多个洞穴居住的Astyanax种群显示色素沉着的损失。莫利诺和帕孔空鱼中的白化病已被映射到一个基因组区域包含基因,眼睛白化病 2 (ca2), 这表明突变在 ca2 下白化病在松角 6.
为了验证 cau2 作为帕孔洞穴形态中白化病的致病位点, 我们利用 crispr/cas9 基因编辑技术在表亲鱼类种群中对这一区域进行了突变。由于在 Molino 鱼6中删除了 exon 21, 因此我们设计了一个 grna 来定位该基因的这一区域 (图 2a)。基因组序列, 包括 gRNA 目标序列和 PAM (螺栓), 是 5 '-ggtggtggtgctctt tgg-3'。这个目标序列 (没有 PAM 序列) 被用来生成一个 gRNA, 用于有针对性的诱变。进行了表面育种者交配, 并在单细胞阶段采集了产生的胚胎。单细胞期胚胎注射 cas9 mRNA 和 grna 靶向ca2, 注射动物提高到成年43。注射的成虫与野生型表鱼交配, 并利用步骤6.3.1 引物对这些杂交的胚胎进行基因型, 以确定胚系的传播。我们对一个突变体的局长2等位基因进行了排序, 并在考 2中发现了一个细菌行传输的2 Bp 删除 (图 2b, c)。为了便于基因分型, 我们设计了等位基因特异性引物, 以识别野生类型和突变等位基因 (图 2E) 和基因型鱼类, 使用 pcr, 然后是凝胶电泳 (图 2e)。我们为这个考2突变等位基因切割表面鱼类杂合。由此产生的后代是色素或白化病 (图 2f-i).色素个体在局位处为野生型或杂合, 而白化病个体为纯合突变体 (图 2e)。这些数据提供了一个直接的联系之间的外2基因位点和白化病在a. mexicanus 。
睡眠、喂养和压力等各种行为在不同的情况下, 相对于表面的特征, 但形态之间潜在的神经元决定因素仍不清楚。全脑钙成像为检查改变后的神经活动和改变的行为之间的相关性提供了一种强大的无偏见的方法。我们利用斑马鱼研究中广泛使用的试剂, 利用基因编码钙指示器 Gcmp6 的几乎无处不在的神经元表达, 生成了表面鱼类和空鱼。弹性体样神经元特异性 rna 结合蛋白 3(elavl3) 在整个中枢神经系统的新分化神经元中内生表达, 并已被用于斑马鱼, 以推动蛋白质在整个神经系统的大部分50的表达.我们得到了一个 Tol2 结构, 其中含有 ~ 2.8 kb 斑马鱼elavl3启动子转录的基因编码钙指标 GCaMP6s (绿色荧光蛋白 [gfp]、钙调素和 m13 (肌球蛋白的肽序列的融合)光链激酶), 两侧在 5 ' 和 3 ' 结束与 Tol2 站点 (Tol2-elavl3:gcamp6s-tol2)51。
培育了一种 mexicanus表面鱼类和 molino 紫外鱼, 并在单细胞阶段用 25 Ngμμμlstol2:gmp6-tol2 结构和 25 ngμl Tol2 Tolosase Mrna (图 3a) 共同注射。在 24–48 dpf 时, 对幼虫进行了 Gmp6 瞬态神经元表达的筛查。那些注射了 Gcmp6 表达的胚胎被提升到成年, 并与来自表面鱼类或空鱼同一谱系的野生成虫回交。对由此产生的 F1 成虫进行了 Gcmp6 表达稳定表达的筛选, 并对这些幼虫进行了维护, 以产生稳定的线条 (图 3B,c)。因为每个具有稳定表达的 F1 成虫都可能在不同的基因组位置集成了 Tol2-elavl3:gmp6s-tol2, 因此每个 f1 都被指定为不同的等位基因。利用这种方法, 我们为表象和莫利诺空鱼种群生成了稳定的 f1 (图 3b,c), 从而能够发现调节洞穴行为变化的神经元活动的差异(图 3,d)。此外, 这种方法奠定了基础, 表达许多额外的转基因基因, 以表征和操纵基因功能的 a. mexicanus。
图 1: 莫菲利诺击倒Hcrt可减少活动, 增加在空鱼中的睡眠.(A) 翻译阻断的吗啡瞄准 hcrt 编码序列的前 25个 bp, 包括 atg 起始站点。(B) hcrt吗啡寡核苷酸 (mo) 和控制序列。(C) 在琼脂糖蛋模上对 ~ 200个单细胞卵进行对齐。(D) 微注射 1.0 nl 的注射混合物与苯酚红色指示剂的可视化。刻度条 = 0.5 mm. (e) morpholino 敲倒 hcrt 减少了 Pachón 空鱼的活动 (总行驶距离) (t = 5.021, df = 88, p < 0.0001), 但不是表面鱼的活动 (t = 1.318, df = 88, p> 0.72)。(F) 击倒会增加 Pachón 空鱼的睡眠 (t = 2.694, df = 88, p < 0.05), 但对表面鱼没有影响 (t = 0.17, df = 88, p > 0.17)。刻度条 = 1 毫米。E和f面板中的误差条表示平均值的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: CICPR 基因编辑在表面居住的a· mexicanus 中引入了白化病. (A) 局数2编码区的原理图, 并指导 rna (grna) 靶向外显子 21, 用于 crispr 介导的基因编辑。(B) 野生型oca2 +和 (c) 突变体oca2 -等位基因的测序色谱。面板b中的红色框表示 2 bp 序列, 这在 c 组中描述的突变的oca2 -等位基因中缺失。(D) 有针对性的 CRISPR 引入了 2 bp 删除, 破坏了 oca2功能。引物是为 F0 后代中 2 bp 缺失的基因型筛选而设计的。(E) 在野生型表鱼 (带径 = 134 bp) 和 f0 Crispr 注射后代 (带数 = 133bp) 中的 osa2 pcr 和凝胶电泳。个体纯合或杂合为野生类型的变种 oca2 (oca2 +) 着色, 而 f0 纯合为 2 Bp 删除(oca2-) 港口白化病。(F) 野生型表鱼和 (g) 具有 crispr 介导的白化病的表象。刻度条 = 5 毫米 (h和i) 分别在f和g面板中描绘的个人头部的放大视图。刻度栏 = 2 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图3:Tol2 泛神经元 GCAMP6s 的转录使大脑活动的实时成像. (A) 托2介导的 mexicanus 的转染. Tol2 mRNA 和 Tol2-elav3l:gcamp6s-tol2 质粒在 F0 创始人中整合 GCAMP6s 转基因.与野生鱼类的原始种叉产生 F1 个体具有稳定的全神经元表达 GCAMP6s 。(B和c) 用解剖和共聚焦显微镜筛选出的后代进行稳定表达。稳定的 TgAsty(elav3l:gmc6) f1 个体已经建立了为表面 (见 b 组) 和空虫居住的 mor感图 (在面板 c 中描述)。刻度杆 = 200 微米。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 数量或金额 |
| 10.0 微克的 Pcs-zt2p 质粒 DNA | X 微米 |
| NEB 切割智能缓冲器 | 10.0μl |
| 非 hf 酶 | 2.0 微米 |
| 无核酸酶h2o | X 微米 |
| Bsa | 1.0μl |
| 总 | 100μl |
表 1: Tol2 质粒的限制性消化。
| 试剂 | 数量或金额 |
| 1.0 微克线性化的 pcs-zt2tp 质粒 dna | X 微米 |
| 10倍反应缓冲器 | 2.0 微米 |
| 2x ntpcap | 10.0μl |
| SP6 酶混合物 | 2.0 微米 |
| 无 rnaseh2o | X 微米 |
| 总 | ≤20μl |
表 2: Tol2 mRNA 的体外合成。
| 设置名称 | 设置值 |
| 热 | 510 |
| 拉 | 55 |
| 速度 | 100元 |
| 时间 | 40 |
| 压力 | 500元 |
| 斜坡 | 534 |
表 3: 示例移液管方案。
| 试剂 | 数量或金额 |
| Morpholino (Freezer stock @ 4mM) | 1.0μl |
| 无核酸酶h2o或 D纳 ieau 的解决方案 | 17.0 微米 |
| 苯酚红 | 2.0 微米 |
| 总 | 20μl |
表 4: 莫菲利诺注射液混合物。
| 试剂 | 金额 |
| gRNA (最终工作浓度 @ 100ng/μl) | 1μl |
| Cas9 mRNA (最终工作浓度 @ 1200ng/μl) | 1μl |
| 无 rnaseh2o | 2μl |
| 总 | 4μl |
表 5: CRISPR/Cas9 注射液混合物样品。
| 试剂 | 金额 |
| Tol2 质粒 (最终工作浓度 @ 25ng/μl) | X 微米 |
| Tol2 mRNA (最终工作浓度 @ 25ng/μl) | X 微米 |
| 苯酚红 | 1.0μl |
| 无 rnaseh2o | X 微米 |
| 总 | 15μl |
表 6: 样品 Tol2 转基因注射混合物
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Discussion
在这里, 我们提供了一种使用吗啡、CRISPR/Cas9 基因编辑和转基因方法来操纵基因功能的方法。斑马鱼的丰富基因技术和这些系统的优化, 很可能会使这些工具轻松地转移到中.最近的发现在mexicanus中使用了这些方法, 但在调查该系统中的各种形态、发育和行为特征时, 它们仍未得到充分利用。,53岁
吗啡已被广泛用于斑马鱼的研究, 以敲除基因的表达。这种方法很简单, 并导致了一个强大的击倒表达。然而, 已经广泛记录了22、53 的非目标效应;因此, 在其中注射吗啡的动物应该仔细监测任何意想不到的表型 22,55。在可能的情况下, 从吗啡击倒获得的结果应通过使用其他方法进行验证, 如 crispr或许卡森介导的淘汰赛方法。虽然吗啡允许基因表达的鲁棒击倒, 但吗啡介导的击倒是短暂的。因此, 在使用此方法时, 不可能分析成人表型。
Crisprs9 介导的诱变提供了对特定基因的直接操纵。此外, 与吗啡介导的击倒不同, CRISPR/Cas9 突变体允许分析突变表型进入成年。为了防止 CRISPR/Cas9 的非目标效应, 突变线应该超过几代, 在可能的情况下, 应该获得和测试一个以上的等位基因。CRISPR/Cas9 系统还提供了利用基因编辑方法进行敲入等位基因或产生特定基因变化的潜力。Crispr/cas9 系统已被用于斑马鱼, 以产生精确的外源 dna 整合, 并产生精确的点突变 19,20,56,57, 58,59. 随着独角鱼基因组的测序, 现在可以确定表面鱼类和独角鱼群体之间的单一核苷酸多态性或其他微妙的基因变化 33.CRISPR/Cas9 基因编辑的应用提供了一个机会, 以交换外位基因之间的表面鱼类和紫鱼, 或不同种群之间的紫外量, 以审查这些基因变化在不同的发育过程中的作用。
本协议中描述的转基因方法为功能增益研究和产生改变基因生物过程的工具提供了一种简单而有力的方法。Tol2 系统在斑马鱼研究中得到了广泛的应用, 我们已经证明, 它在中同样强大。此外, 我们还展示了斑马鱼的转基因结构, 利用斑马鱼启动子并重述了一种在a. mexicanus中的内源性表达。我们发现了从斑马鱼中分离出的另外四个启动子, 如预期的那样, 驱动组织特异性表达 (数据未显示)。由于斑马鱼促进剂重述了它们在一种保存的表达模式中, 这表明许多遗传工具可以直接从斑马鱼转移到一种不需要用 a 进行修饰的情况下转移到一种化学的过程中。梅西卡努斯促进者。此外, 随着a. mexicanus33测序技术的进步, 这里描述的转基因方法将为研究增强剂和促进剂提供一个强大的未来, 这些促进剂和促进剂可能在两者之间的变异中发挥作用。表面和洞穴形式。最后, 使斑马鱼有价值的生物过程基因操纵的有力工具在 a. mexicanus60、61、62、63中同样重要。不同行为特征的差异, 如睡眠, 喂养, 压力, 和攻击性, 在不同的行为特征, 如在马西卡努斯表面和洞穴居住的形式已被广泛记录 12,14, 15 38, 64,然而潜在的神经元相关性并不十分清楚。Tg(elavl3:GCaMP6s )等工具将允许剖析神经元活动的差异与大脑范围内的差异之间的关系, 并提供一个独特的洞察如何改变大脑的进化。
综合来看, mexicanus正准备成为调查各种形态和行为特征演变的主要模型。不同的生物过程差异为研究性状进化的遗传机制提供了一个平台。应用操纵基因功能的工具可能有助于将这种生物体发展成为一个模型, 可用于调查与眼睛变性、神经发育异常和失眠有关的生物疾病。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Sunishka Thakur 在基因分型和成像图2中描述的考2 突变鱼方面提供的帮助。这项工作得到了国家科学基金会 (NSF) 对 a. c. k. 的1656574奖、国家科学基金会授予 j. k. 和 a. c. k. 的1754321奖, 以及国家卫生研究院 (NIH) 授予 R21NS105071 a. c. k. 和 e. r. d。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
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