Summary
進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos を使用して、式のノックダウンを使用してゲノムの対象となる操作。これらのツールは、表面と洞窟の住居形態の間変化を根底にある遺伝子の直接の調査を促進するべき。
Abstract
洞窟動物は進化のメカニズムと遺伝的基盤で目の変性、白子症、睡眠不足、過食、感覚処理など、多数の複雑な特性の変化を調査するため説得力のあるシステムを提供します。世界中から毒の種は洞窟システム間共有の環境圧力のための形態および行動の特性の収斂進化を表示します。多様な種は、実験室の設定で研究されている.晴眼者と視覚障害者のフォームで、メキシコのテトラアステュアナクス メキシコ、複雑な形質の進化の基礎となる生物学的および分子プロセスのユニークな洞察を提供している、新興のモデル システムとしてふさわしい。多様な生物学的過程の進化を制御する候補遺伝子群は、A. メキシコで発見されている、しながら、個々 の遺伝子の役割を検証する機能が制限されています。遺伝子と遺伝子編集技術のアプリケーションには、この大きな障害を克服するために、複雑な形質の進化のメカニズムを調査する可能性があります。ここでは、 A. メキシコにおける遺伝子発現を操作するための別の手法について述べる。メダカ Tol2遺伝子、morpholinos の使用を組み込むし、遺伝子編集システム、頻繁に使用されるゼブラフィッシュと他の魚をモデルに、 A. メキシコで遺伝子の機能を操作します。これらのプロトコルには、タイミングの繁殖手順の詳細な説明、受精卵、注射、および遺伝子改変動物の選択のコレクションが含まれます。A. メキシコの多様な形質の進化の遺伝学的および神経メカニズムの調査のためこれらの方法論的アプローチになります。
Introduction
ダーウィンの種の起源1、以来科学者は洞窟生物2のおかげで、定義された環境および生態学的な圧力への応答では、形質が進化の過程で形づけられるに深い洞察力を得ています。メキシコのテトラ、 A. メキシコメキシコと南テキサス中の河川に生息する目の祖先 '表面' 集団シエラ ・ デル ・ アブラに生息する派生洞窟モーフの少なくとも 29 の地理的に隔離された集団の構成と北東メキシコ3の他の領域。A. メキシコ、変更された酸素消費量、色素脱失、目の損失餌と採餌行動4,5,6、変更などで識別された洞窟関連形質の数 7,8,9。独立して明確に定義された進化の歴史、生態学的環境の詳細な評価との存在により収斂進化のメカニズムを調査するための強力なモデル進化洞窟A. メキシコプレゼント人口10,11。血脈、目の損失などがある、睡眠の損失、餌、スクーリングの損失の増加、侵略を減少とストレス反応を減少、独立した起源は、しばしば活用を通じて複数回を進化している洞窟の派生形質の多く様々 な遺伝的経路間8,12,13,14,15の洞窟します。これには、 A. メキシコシステムの強力な側面は、どのように遺伝的システムのより一般的な質問への洞察力は似たような表現型を生成するため、提供して進化が繰り返されます。
ゼブラフィッシュにおける最近の進歩が魚の遺伝的技術開発の基礎を提供する遺伝子の機能解明のための遺伝子の技術のアプリケーションは、多くの魚種 ( A. メキシコを含む) に限定されている、しながら16、17、18、19,20。数多くのツールは遺伝子発現を操作するゼブラフィッシュで広く使用されて、これらの手順の実装を標準化されている長い間。たとえば、単細胞段階で morpholino oligos (MOs) の噴射は選択的に RNA をブロックし、開発21,22中簡単な時間窓の変換を防ぐことができます。さらに、遺伝子編集アプローチなど定期的にクラスター化された空間短い回文繰り返し (CRISPR) CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) に定義された削除の生成を可能にします。または、いくつかのケースでは、ゲノム19,20,23,24の再結合を挿入します。遺伝子は、細胞型固有の方法で安定した遺伝子発現または関数の操作に使用されます。メダカ Tol2システムを効果的に coinjecting トランスポサーゼによるトランスジェニック動物を生成する使用 transgene25,26を含んでいるメダカ Tol2 DNA プラスミッドと mRNA。メダカ Tol2システムは、安定した生殖細胞系遺伝子組換え construct17 の挿入を生成するめだかのメダカ Tol2転移を利用しています。メダカ Tol2遺伝子組み換えを生成するには、メダカ Tol2転移17メダカ Tol2統合サイトと mRNA が並ぶ遺伝子を含むプラスミドを coinjecting が含まれます。ゼブラフィッシュにおけるトランスジェニックは行の配列を生成するこのシステムを使用されているし、その使用は最近追加する創発モデル システム、シクリッド、メダカ、トゲウオなどに拡大し、もっと最近のメキシコ毒27、 28,29,30です。
血脈は形質の進化のメカニズム解明のための魅惑的な生物学的システムが、進化モデルとしてその完全な能力が完全に利用されてないです。これは部分的に遺伝子を操作することができないのためにされており、携帯機能直接31。複雑な形質を制御する候補遺伝子群は量的形質遺伝子座 (QTL) の研究を使用して識別されているが、これらの候補者の遺伝子の検証は困難な32、33,34。最近では、morpholinos、遺伝子 CRISPR と TALEN システムとメダカ Tol2の使用を使用して編集を使用して一時的なノックダウン-仲介された遺伝子の遺伝的基盤の特徴35、36、37の数を調査する使用されています。、38。定義された細胞集団の標識遺伝子機能の操作を含む、生物学的特性の分子・神経基盤の調査操作の実装とこれらの技術の標準化可能になると機能的な記者の式です。遺伝子や細胞の機能を操作するこれらの遺伝的ツールの実装を成功させる、創発モデル システムで実証されているに対し、詳細なプロトコルはまだA. メキシコに欠けています。
A. メキシコ環境の変化への応答の進化のメカニズムに重要な洞察力を提供する、多様な特徴を制御する新規遺伝子群を特定する機会を提示します。A. メキシコ研究室、ひな大型の魚を簡単に維持する能力を含む、確立された遺伝的モデルで現在利用可能な確立されたゲノム ツールの適用の非常に扱いやすいモデルである要因の数が提案します。透明性、配列されたゲノムと定義された行動アッセイ39。ここでは、morpholinos、遺伝子導入、遺伝子編集a. メキシコの表面と洞窟の集団での使用のための方法論について述べる。血脈と表層魚群の発達、生理学、行動の違いの進化の基礎となる分子プロセスに制御機構解明のためA. メキシコでこれらのツールの広範なアプリケーションになります。
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Protocol
1. Morpholino オリゴ設計
注: A. メキシコのシーケンス、Ensembl ゲノム ブラウザー (https://www.ensembl.org) からだけでなく、ナショナル センターの生物工学情報 (NCBI) 遺伝子と NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) を通じて利用できます。両方の表面、洞窟住居のフォームで使用できる morpholino を設計するとき、morpholinos のターゲットとしてこれらの遺伝領域を避けることができるので、この段階でモーフの間の遺伝的変異を識別するために重要です。Morpholino ターゲット サイト内ですべての多型変異は、無効なバインドにつながります。デザインはゼブラフィッシュなど、他の魚のシステムと同様、以前a. メキシコ21,36,40.で効果的に動作するように示されています。
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Morpholinos の翻訳をブロックのデザイン
注: 翻訳ブロック morpholinos 内因性の開始部位に結合して翻訳をブロックし、立体 hinderance を mRNA シーケンスをバインディングから並進機械を妨げます。- ATG 開始サイトで始まるターゲット遺伝子のコーディングの地域を識別します。
- テキスト エディターまたは演習ノートにシーケンスのコピーと貼り付けによってターゲット シーケンスの最初 25 塩基対を記録します。
- オンライン ソフトウェア (例えば、http://reverse-complement.com) またはマニュアル翻訳のいずれかを使用して、ターゲット シーケンスの逆の補数を生成します。テキスト エディターまたは実験室のノートに結果の逆の補数を保存します。
- Morpholino オリゴヌクレオチドを生成する会社から逆の補数シーケンス morpholino を注文します。会社の材料表を参照してください。
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スプライス ブロック morpholinos の設計
注: 継手ブロック morpholinos スプライシング ブロックし、成熟した mRNA 分子の形成を防ぐ。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) によるノックダウンの検証が必要な場合、これはノックダウン開始サイトは、明確に定義がない場合、最適なアプローチ方法を提供します。スプライス ブロック morpholinos (MOs ATG ブロック) 以上のこの利点はエクソン排除または逆転写酵素 (RT) が容易に行われるイントロン インクルー ジョン-PCR およびゲルの可視化の違いをサイズします。RT-PCR およびゲルの電気泳動 morpholino 効果を行う必要がありますを決定する標準的な検査手順を使用して。- ターゲット遺伝子 mRNA シーケンスを識別します。NCBI または Ensembl イントロン ・ エクソン境界33を決定するA. メキシコゲノムから入手可能な情報を利用します。
- エクソン ・ イントロン (スプライス ドナー) やイントロンの包含またはエクソンの除外のイントロン ・ エクソン境界 (スプライス アクセプター) サイトをターゲットします。
注: スプライソソーム通常 5' スプライス部位のイントロンと 3' (U2 ターゲット) イントロン スプライス部位に"AG"シーケンスで「ジーユー」シーケンス (U1 ターゲット) を対象します。通常の条件下でスプライソソーム U1 と U2 のサブユニット mRNA シーケンスが発生する適切なスプライスするためにこれらのターゲット ・ サイトをバインドします。ただし、これらのターゲット シーケンスのいずれかが、morpholino によってブロックされている場合スプライソソーム サイトに移動する、次利用可能な U1 または U2、mRNA シーケンスでイントロン除外またはエクソンを引き起こしています。計画/最適化、ターゲット遺伝子21の性質によってはします。一般に、内部の U1 サイトをブロック エクソン切除の原因次利用可能な U1 サイト スプライスにリダイレクトします。また、最初または最後の継手接合部のブロックが原因でイントロンの封入体に接続をリダイレクトする他のサイトがないです。介在物と様々 な除外の効果を予測するのにシーケンス ソフトウェアを使用します。予測は、潜在的な frameshifts または mRNA の破壊のより効果的なターゲット サイトを示す時期尚早停止コドンを示すことができます。 - ターゲット サイトが識別されるは、テキスト エディターまたはラボ本にそのシーケンスを記録します。ターゲット ・ サイトは 25 塩基対 (bp) 長いことを確認します。
- オンライン ソフトウェア (例えば、http://reverse-complement.com) またはマニュアル翻訳のいずれかを使用して、ターゲット シーケンスの逆の補数を生成します。テキスト エディターまたはラボ本にそのシーケンスを記録します。
- Morpholino オリゴヌクレオチドを生成する会社から逆の補数シーケンス morpholino を注文します。サンプル企業の材料表を参照してください。
2. 注射用 Morpholinos
注: いくつかの濃度または MO 注入量を注入する最適な濃度を確立する実行する必要があります。典型的な注入量が 400-800 MO の pgMorpholino 打撃の効果は、最大 6 日間これらの永続化できます。
- ストック morpholino を取得します。ストック morpholino 到着する凍結乾燥。目的のストック濃度 (例えば、4 mM) を使用する滅菌 H2O 前水和物それ。使用するまで-20 °C で保存します。
3. CRISPR gRNA 設計、生体外のトランスクリプションおよび準備
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CRISPR gRNA デザイン
注: gRNAs によって生成されたを使用して以前に発行した調査 Varshney ら40と Wierson ら41。- ゲノムのブラウザーを使用して、興味の遺伝子のコーディングの地域を識別します。20 bp ヌクレオチド ターゲット シーケンス始まる GG を検索することによってエクソン内 gRNA ターゲット シーケンスを識別し、PAM 並び (NGG) に続いてゲノム シーケンスを使用します。後開始 (ATG) の対象となる遺伝子の地域。
注: 5' 端で GG とターゲット シーケンスは、遺伝子、1 つまたは両方の G'の目的のエクソンに見つからない場合 s は最初と 2 番目のヌクレオチド シーケンスの 5' 端に置き換えることが。ただし、2 つの G's は、これらは T7 転写、oligo で組み込む必要があります。 - 設計し、遺伝子特定のオリゴヌクレオチドを発注 (オリゴ a: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3')。T7 プロモーター (赤) と第 2 オリゴヌクレオチド (青) にアニールする重複順序間 PAM シーケンスなし遺伝子特定 20 bp gRNA ターゲット シーケンス (太字) を追加します。アニール、このオリゴ A と 2 番目のオリゴ (手順 3.2.1 参照) を増幅 (オリゴ b: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') 転写用 gRNA テンプレートを生成します。
注: Oligo B はすべての反応と同じ、のみ 1 x を注文する必要があります。
- ゲノムのブラウザーを使用して、興味の遺伝子のコーディングの地域を識別します。20 bp ヌクレオチド ターゲット シーケンス始まる GG を検索することによってエクソン内 gRNA ターゲット シーケンスを識別し、PAM 並び (NGG) に続いてゲノム シーケンスを使用します。後開始 (ATG) の対象となる遺伝子の地域。
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gRNA の作製と転写
- アニールし、oligos を増幅します。次の収穫を増加するために、gRNA を増幅するプライマーを含める: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 プライマー) と 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA プライマー)。好熱(KOD) ポリメラーゼを用いた PCR を実行します。
注: oligo A と 2 B で両方のプライマーの 10 サイクルは良好な収率をお勧めします。詳しいプロトコルは、Wierson ら41で見つけることができます。 - 市販の生体外のトランスクリプション キット (材料の表を参照) を使用して gRNA を書き写します。これは、メーカー'への変更を介して行われます Klaassen ら42刊 s プロトコル。
- 沈殿物、洗浄、および Klaassen ら42で説明されているように、gRNA を再懸濁します。
注: gRNA は劣化を防ぐための水の RNase フリーの再停止する必要があります。 - 分光光度計を使用して決定することができます gRNA の濃度を記録します。Agarose のゲルの 2 μ L を実行することによって、RNA の品質を評価します。フリーズ/フリーズ解除を回避し、-80 °C まで注射の直前にそれを格納する因数の RNA。
- アニールし、oligos を増幅します。次の収穫を増加するために、gRNA を増幅するプライマーを含める: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 プライマー) と 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA プライマー)。好熱(KOD) ポリメラーゼを用いた PCR を実行します。
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Cas9 の作製と転写
- 市販の生体外のトランスクリプション キット (材料の表を参照) を使用して Cas9 の mRNA を転写することができます43を前述のよう。43nls Cas9 nls バージョンを使用します。
- GRNA の濃度を記録し、agarose のゲルの 2 μ L を実行することによってその品質を評価します。因数の RNA および-80 °c. で因数を格納する複数の凍結融解のサイクルによって生じる分解を避けるために
4. メダカ Tol2 構造、メダカ Tol2 トランスポザーゼと遺伝子導入の準備
- 注射用メダカ Tol2 遺伝子コンストラクトを準備します。
注: 我々 は発行/利用可能なゼブラフィッシュを利用して正常に、めだかはA. メキシコで構築されます。これらの構成要素は配列相同性の高レベルの可能性が高いA. メキシコで完全に機能 (AddGene リポジトリを参照し、ゼブラフィッシュの情報ネットワーク [ZFIN] データベースの利用可能な構成要素)。ゼブラフィッシュ プロモーター断片が予想される組織で使用されるときに transgenes を表明しているA. メキシコ。- メダカ Tol2 構造を取得またはティッシュ特定の促進者、目的遺伝子とメダカ Tol2 腕 (クワンら44を参照) が付いているプラスミッドを生成します。受領後、シーケンスのプラスミッドを検証するコンストラクトを実行します。
- メーカー'によると構造のため、midiprep を実行 s ガイドライン。RNase フリー H2O の最終的なプラスミドを溶出、分光光度計と濃度を決定する、100-濃度を希釈 300 ng/μL、因数とストア-20 °c. でコンストラクトを作成
- メダカ Tol2 トランスポザーゼ プラスミドを消化し、mRNA を合成します。
- メダカ Tol2 mRNA45を生成するためのテンプレートとしてメダカ Tol2 トランスポザーゼ プラスミド (Pc zT2TP) のコピーを取得します。
- Midiprep Pc zT2TP'のメーカーによると s のガイドラインを構築します。RNase フリー水やバッファー (~ 50 μ L) の低音量でそれを溶出します。因数-20 °C で保存します。
- 制限酵素を用いたメダカ Tol2 プラスミドを消化します。
- 表 1使用円形 Pc zT2TP プラスミドの 10 μ g で制限のダイジェストを実行します。
- 2-50 μ L 反応に反応を分割し、37 °C で熱 cycler で一晩反応を孵化させなさい。
- 次の日の 65 °C 20 分間加熱して酵素を不活性化します。
- 市販 PCR 精製キット (材料表参照) メーカー'ガイドラインあたりを使用してダイジェストの直後線形プラスミッドを浄化します。RNase フリー H2O の 15 μ L のプラスミッドを溶出し、分光光度計を使用して製品の濃度を決定します。
- 消化されたプラスミド 1 μ を実行し、1.5% アガロースゲルのノーカットのプラスミッドの 1 μ L のゲルの線形プラスミッドを確認します。
- メダカ Tol2 mRNA の生体外のトランスクリプションを実行します。
- 転写するためのテンプレートとしての一直線に並べられた Pc zT2TP プラスミド 1 μ g を利用します。次の製造元'生体外のトランスクリプションのための s のガイドライン (材料の表を参照)の表 2で説明したよう。
- 37 °C サーマルサイクラー'メーカーごとにガイドラインをインキュベートします。
- DNase の 1 μ L を追加し、37 °C サーマルサイクラー'メーカーごとでインキュベート s ガイドライン。
- 転写キット プロトコル 1 リチウム塩化物の沈殿物を実行します。RNase フリー H2o ・の ~ 20-30 μ L の RNA ペレットを再懸濁します
- 分光光度計を使用して製品の濃度を決定し、RNA の品質を記録します。
- 100 〜 300 ng/μ L の-そして因数に製品を希釈凍結融解の繰り返しを避けるために 5 つの-10 μ L のサンプルに。使用するまで-80 °C で保存します。
注: 1-をチェックすることはゲル電気泳動法で塗抹標本/吹奏楽のための浄化されたメダカ Tol2 mRNA の 2 μ L。
5. 薬剤
- 注射のための一般的なツールの準備
注: このセクションの手順は、Kowalko ら46が詳細に記載されている、マイナーな変更の概要を次に示します。- 注ぐ暖かい 3% アガロース 100 mL のシャーレに魚システム水に溶解して注入プレートを生成します。慎重に魚の卵のための井戸に注がれた新鮮な agarose の射出成形金型の卵を配置します。45°の角度で寒天で金型の側面の場所、アガロース; に、ゆっくりと下ろしますゆっくりと下げる角度で金型を取得、金型の下に閉じ込められた空気を回避できます。Agarose を凝固させて金型を慎重に取り外します。プレートは 4 °C まで 1 週間で、密封保存できます。
- プル針メーカー'によると電極/針引き手で注射用ホウケイ酸ガラス管から s ガイドラインであります。このプロトコルはピペットの引き手によって異なりますただし、表 3の針を抜くのサンプル プログラムを見つけることが。
注: は針を最適化が長すぎて針がきれいに卵に浸透するのではなく、曲げるが、注射のために重要です。 - 開口部は十分な大きさ、卵のように標準的なガラス ピペットを壊すことによって卵の転送のため大口径ガラス ピペットを作る。ブンゼン バーナーを使用して、なめらかになるまで炎に壊れたピペットの最後を公開することによってガラスの切断端を磨きます。
- 繁殖のセットアップ
注: A. メキシコの繁殖のために使用される多くの異なるプロトコルがあります。詳細なプロトコル Borowsky39を参照してください。1 週間注射前に繁殖セットアップを開始します。- 1 日に 2、3 の女性と 3 〜 4 男性 24 ± 1 °C で維持される単一の 10 ガロン タンク
- 日 1-、7 〜 3 日 x への給餌を増やします。国会にはライブ食品、黒ワームやブラインシュリンプなどが含まれていますを確認します。
- 6 日に追加設定への 27 °c. ラボ タンク温度は変わることができる; 単一タンク ヒーターしたがって、これは通常の水槽の温度に 2-3 °C の相対的な増加になります。
- 射出夜の夜 (同調因子 [ZT] 9-11) である、7 日目の夜に徹底的に水に浸したスポンジでタンクをきれいにし余分な食べ物や細かいメッシュ ネットを使用して破片やサイフォンを削除します。
- 7 日目の夜、ZT15 で表面の魚の卵のチェックを開始し、チェックすべての 15-ZT18 まで 30 分続けます。血脈、ZT17 で卵のチェックを開始し、ZT20 まで 30 分毎の 15-をチェックする継続します。
注: 時間は、14:10 に基づいて使用して同調因子 h: 明暗サイクル。繁殖時は推定値であり、各研究室は、正確な時間を決める必要があります。単一細胞の段階でそれらを注入するためにリリース/受精後すぐに卵を集めることが重要です。
- 単一細胞期の卵のコレクション
- 繁殖が期待されている夜は、タンクごとの 15-30 分、タンクの底で卵のモニターを調べます。卵は直径約 1 mm、半透明の表示されます。
- 細かいメッシュの魚網を使用して、卵を収集し、新鮮な魚システム水で満たされたガラスのボウルに転送します。卵が 1 細胞期であることを確認するには顕微鏡下で卵を調べる。
- ガラス ピペットを使用して、転送単一細胞卵注入プレート。ガラス ピペットは、卵は、プラスチックに固執すると、この段階で必要です。
- ピペットを使用して、慎重にセクション 5.1 からアガロース射出プレートのウェルに卵をリリースします。卵の最大数 (常温) prewarmed 射出プレートの行を塗りつぶす (30-40 と 5 つの行まで、行ごと)。完全な行の注射の中に移動から卵を保つを助けます。注射のパフォーマンスまで魚システム水の少量を注入板水和卵をしてください。
- ピコ インジェクション設定と一般的な注入最適化のガイドライン
- バックフィルは、どちらのゲルの読み込みのピペットを使用して注射針のヒント キャピラリーまたは標準的なマイクロ ピペット ヒントを使用し、末尾に 2-4 μ L ボーラスを追加内に収まる。一度針をいっぱいすると、注射針から余分な長さをトリムするのには鉗子を使用します。
- Picoliter マイクロインジェクターに接続、マイクロマニピュレーターにマウントされている針を用いて薬剤を実行します。
- 0.03 射出時間を設定 s と ~0.0 psi の圧力。射出圧力が異なりますに応じて針のマイナーな違いを持つので ~1.0 nL 注入食塊を達成するために最適化します。
注: 噴射圧力はしばしば 〜 10-30 psi の範囲内です。 - 鉱物油に注入して、食塊を測定によって注入食塊を標準化サイズ 1 〜-を達成するためにスライド マイクロメータをもつ 1.5 nL 注入量。Bolus 量を増減する射出圧力 (psi) を調整します。
- 研究室のティッシュを使用して卵の最上部から水を引きます。
注:アステュアナクス卵の卵殻はゼブラフィッシュ卵よりも浸透する少し厳しいです。我々 は、卵の上から水を描画するのに役立ちます卵に針貫通を見つけます。プレートの最適化を単一の平板で 〜 200 卵の許可できます。 - 指針が、それぞれの卵に浸透し、卵黄を直接注入するマニピュレーターを使用します。卵黄に位置し、かつては、注入ボタンまたは注入足のペダルを押すことによって卵を挿入します。
注: 完全な板は 〜 15 分以内注入することができます。単一細胞期 ~ 40 分続きます。
- Morpholinos の注入
注: morpholino 毒性を引き起こすことがなくノックダウンに必要な量が遺伝子ターゲットごとに最適化する必要があります。ただし、濃度 400 頁ですを開始する良い場所です。- 卵 1 個につき注入される morpholino の 400 pg ように morpholino を準備します。氷の融解 morpholino。注射液は (望ましい集中) で morpholino、RNase フリー H2O または Danieau'から成る s ソリューション、およびフェノールレッド (最終巻の 10%)。例については、表 4を参照してください。
- 1 を注入胚あたり nL。
- CRISPR 注射
- GRNA の 25 pg との Cas9 mRNA 合計 300 pg は胚 1 つあたりに注入されるように RNA を準備します。サンプル CRISPR/Cas9 注入混合物は、表 5を参照してください。
- 2 を注入 gRNA/Cas9 の nL 胚胚に直接あたり mRNA。
- メダカ Tol2 トランスポザーゼと遺伝子のメダカ Tol2 並ぶプラスミドの注入
- トランスポザーゼの雪解け mRNA とメダカ Tol2 プラスミド氷の上。コンバイン Cas9 mRNA (25 ng/μ L) で、目的のメダカ Tol2 コンストラクト (25 ng/μL)、RNase フリーの水中のフェノール赤 (最終巻の≤10%)。サンプル メダカ Tol2 遺伝子注入の混合物、表 6を参照してください。
- 注射剤や mRNA の分解を避けるために氷の上針にしてください。1 注入胚あたりのボリュームで nL。
6. 飼育と注入された魚をスクリーニング
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注入された魚飼育
- 卵を注入後、すぐにガラス鉢 (10 x 5 cm) ~ 200 ml 水の魚系に転送します。卵でいっぱいのボウルに射出プレートを浸漬洗浄が簡単に魚の水やピペットで卵を洗浄します。
- 一杯 〜 50-80 注入された胚を置き、22-24 °c. でそれらをリア
- きれいに注入された魚 2 ボウル死胚を削除し、日常的に水の 20% を変更する一日あたりの倍。
- その他飼育は、以前に公開されたプロトコル39に従って実行されます。
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Morpholino 注入個人のスクリーニング
- 表現型の画面に顕微鏡の下で動物を視覚化します。Morpholinos の効果は、注射後約 5 日間21を永続化できます。
- 4 日間のこれらの行動の表現型を測定します。
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CRISPR オクターリピートのスクリーニング
- ターゲット ・ サイトの周りのゲノム DNA を増幅するプライマーを設計します。プライマーを設計するときにターゲットの PCR の製品の約 100-なるよう 125 bp。
注: たとえば、 oca2遺伝子座の gRNA ターゲット サイトを囲む領域増幅された 3 を使用して、前方のプライマー 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-' と逆プライマー 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' 105 の PCR の製品長さの bp。 - 胚を犠牲に、または制度上の動物のプロトコルに従ってクリップ大人の魚のひれ。
- PCR チューブに胚または切り裂かれたフィンを収集し、DNA を抽出実行 PCRs。 サンプルの PCR プロトコル遺伝子特定のプライマーは Ma ら35で見つけることができます。
- 突然変異の誘発の評価 5 を実行するには、は、異なるバンドとして PCR の製品に 3 h 野生型 (nonmutagenized) DNA の 70 V で 3% の agarose のゲルの PCR の製品の μ L をなります。突然変異の DNA をゲルでべたつくバンドになります。
- 突然変異体の対立遺伝子のシーケンスを決定する TA クローン メーカー'によると PCR の製品の指示、ピックアップ植民地・ miniprep の文化。シーケンスの結果として得られる DNA を送信します。
- 確立し魚が突然変異体の対立遺伝子を送信の行を維持、野生型魚と画面 5-次の手順 6.3.1-6.3.6 遺伝子の突然変異体の対立遺伝子を運ぶ子孫のいずれかかどうかを決定する 10 の胚に注入された成魚をクロスします。
注: 同じ F0創始者魚から別の F1個体は異なる突然変異を運ぶことができます。突然変異系統変異予測フレームの外にある対立遺伝子を生成するを取得するシーケンスに配置されますを確認します。 - べたつくバンド アッセイ (手順 6.3.1-6.3.6) を用いた PCR によるまたは変異体と野生型バンド (図 2) を増幅する対立遺伝子特定の PCR のプライマーを設計することによって突然変異対立遺伝子を運ぶ魚を識別します。
- 魚のラインが確立されると、劣性表現型をテストする homozygose 突然変異体の対立遺伝子。
- ターゲット ・ サイトの周りのゲノム DNA を増幅するプライマーを設計します。プライマーを設計するときにターゲットの PCR の製品の約 100-なるよう 125 bp。
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トランスジェニックの肯定的な個人のためのスクリーニング
注: 蛍光メーカーを含む構造を使用して遺伝子組み換え肯定的な個人検診を合理化する勧めします。ただし、標準 PCR のスクリーニング方法を使用できます送信画面にします。- スコープ解剖落射蛍光と早ければ 2 日これら F0魚組織特異蛍光蛋白を視覚化します。
注: F0幼虫の式がモザイクと肯定的な個人式表現型の範囲があります。 - 創設者魚 F0として肯定的な個人を保持します。
- F0s が成熟に達したら、同じ人口・ ラボ株式から派生したヒトアンギオテンシノーゲン個人創設の魚を戻し交配します。手順 6.2 で説明されているように同じプロトコルを使用して画面 F1の子孫。
注: F1幼虫の式は制服は、F1兄弟間の整合性します。 - メダカ Tol2 統合ではないサイトを介すると統合することができます創設者によって異なる、選択 F1兄弟派生単一 F0の創業者、F2s を生成する F1兄弟を肯定的な表現を交配します。この子孫は、安定したラインのための基礎になります。
- スコープ解剖落射蛍光と早ければ 2 日これら F0魚組織特異蛍光蛋白を視覚化します。
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Representative Results
洞窟住居a. メキシコの複数の集団は、減少睡眠とその海面にすむ個体14を基準にして覚醒/活動の増加を示しています。オレキシン/ヒポクレチン (HCRT) は覚醒を増加する行為は、非常に節約された神経ペプチドと人間および他哺乳類47,48HCRT 経路の異常引き起こすナルコレプシー。我々 は以前、洞窟を示しているA. メキシコは、このペプチドの発現増加が血脈38睡眠の損失の根底にあることを示唆している HCRT ペプチドの発現を増加しています。Hcrt式の MO のノックダウンは、直接血脈の睡眠の損失を媒介増加hcrt式の効果を調べるための強力なアプローチを提供します。
Hcrt式と睡眠との関係を調べる、翻訳ブロック morpholino を考案しました。ATG を含む 1 つは、エクソンの MO ターゲット最初の 25 bp は、サイト (図 1 a,B) を開始します。コントロールとしては、市販のスクランブル MO コントロール (図 1 b) を利用されています。NCBI の BLAST アルゴリズムを使用して、(データは示されていない) ゲノム全体でどちらかの MO のオフターゲット効果がないことを確認しました。A. メキシコ表面魚や Pachón の血脈を飼育したり卵を収集され (図 1D) 1 細胞期で 1 nL ボリュームで MO の 400 頁 [注射します。魚は、4 dpf に発生いたし、活動および睡眠の行動の測定します。
洞窟a. メキシコMO 展示大幅より自発運動のコントロールに挿入し、睡眠を短縮期間 24 時間スクランブル MO (図 1E,F) で注射も表面の魚と比較して、ないことを示すの効果、結果は各 morphotype で以前に発行された活動と睡眠パターンと一致している morpholino 注射を制御 (t = 5.021 以上、df = 88 p < 0.0001)。HCRT MO のインジェクション制御注入魚と比較して表面の魚で睡眠にはほとんど影響を持っていた (t = 0.17, df = 88、 p > 0.99)。対照的に、MO 注入によってhcrtノックダウンは、洞窟に住む魚の睡眠に大きな影響を持っていた。Pachón 血脈幼虫自発運動の 4 倍削減未満を示したし、制御 Pachón の幼虫 (図 1E、Fより約 2 倍の睡眠t = 2.694、df = 88、< p 0.05)。自発運動量と MO ノックダウン表面と洞窟住居の魚の睡眠の比較では、匹敵する運動や睡眠の量 (図 1 e、F) を明らかにしました。これらのデータhcrt式と睡眠の損失間の直接リンクし進化派生の洞窟住居モーフで睡眠の損失のための生物学的メカニズムを調査する方法を提供します。
色素沈着損失洞窟生物の特徴であり複数の洞窟住居アステュアナクス人口色素の損失を示します。モリノと Pachón の血脈のアルビノは白子 2 (oca2) oca2 変異血脈6白皮症の根底にあることを示唆、遺伝子を含んでいるゲノムの領域に QTL マッピングを使用してマップされています。
Pachón 洞窟モーフでアルビノの使役の軌跡としてoca2を検証するため、表面の魚の個体数のこの地域を変異させる CRISPR/Cas9 遺伝子編集を利用しました。エクソン 21 はモリノ魚6で削除されます、ので (図 2 a) 遺伝子のこの地域を対象とする gRNA を考案しました。GRNA ターゲット シーケンスと PAM (太字) を含むゲノムの配列は 5'-GGTCATGTGGGTCTCAGCTTTGG-3'。PAM のシーケンス) を除いたこのターゲット シーケンスは、標的突然変異誘発のための gRNA の生成に使用されました。表面のブリーダーは、チームメイトに行われ、結果胚一の細胞段階で収集されました。1 セル段階の胚の Cas9 mRNA と gRNA ターゲットoca2、注入された、大人43に挿入された動物が提起されました。注入された大人は野生型表面の魚、チームメイトに行われ、これらの交差から胚がステップ 6.3.1 からプライマーを用いた生殖系列伝送を決定する誘因。我々 は変異oca2遺伝子のシーケンス、 oca2 (図 2 b,C) の生殖線送信 2 bp 削除を識別しました。遺伝子多型性、ゲルの電気泳動 (図 2 e) 続いて PCR を使用して (図 2 D) 野生型と変異型の対立遺伝子および誘因の魚を識別する対立遺伝子特定のプライマーを設計しました。我々 この oca2 突然変異体の対立遺伝子のヘテロ接合体 incrossed 表面魚。結果子孫が色素沈着やアルビノ (図 2F-私)。色素性の個人がワイルド タイプ、oca2 遺伝子座でヘテロ接合体アルビノ個体ホモ変異体 (図 2 e)。これらのデータは、 oca2遺伝子座とA. メキシコ血脈白子症との間の直接リンクを提供します。
モーフの基になる神経決定は明白でなく残るけれども表面の同種を基準にしてa. メキシコ血脈で睡眠、栄養、ストレスなど無数の動作が異なります。全体脳カルシウム イメージングは、神経活動の変化と修正された動作の相関関係を調べるため強力な公平なアプローチを提供します。我々 は、表面の魚と遺伝的コード化カルシウム インジケーター、GCaMP6s の近くユビキタス神経式と血脈ゼブラフィッシュの研究に広く用いられる試薬を使用して生成されます。ELAV のようなニューロン特異 RNA 結合蛋白質 3(elavl3) は新しく分化ニューロン中枢神経系49全体で内生的表現し、ゼブラフィッシュ神経系50の大半を通じて蛋白質の発現をドライブに使用されています。~2.8 kb ゼブラフィッシュelavl3プロモーター上流のトランスクリプション遺伝子コード型カルシウム インジケーター GCaMP6s (緑色蛍光タンパク質 [GFP]、カルモジュリン、M13、ミオシンからペプチッド シーケンスの融合を含むメダカ Tol2 コンストラクトを用いてください。軽鎖キナーゼ) メダカ Tol2 サイトと 5' と 3' 端に並ぶ (メダカ Tol2-elavl3:GCaMP6s-メダカ Tol2)51。
A. メキシコ表層魚群とモリノ血脈が繁殖したと結果胚はメダカ Tol2-elavl3:GCaMP6sの 25 ng/μ L、単一細胞の段階で coinjected された-メダカ Tol2 25 ng/μ L メダカ Tol2 転移を構築し mRNA (図 3 a)。24-48 dpf で GCaMP6s の一過性神経発現の幼虫を上映されました。GCaMP6s の式でそれらの注入 (F0) 胚は成人に発生され、表面魚や毒の同じ系統から派生した野生型大人と。結果 F1 大人 GCaMP6s 式の安定した表現のため上映し、(図 3 b、C) の安定したラインを生成するこれらの幼虫が維持されました。安定した表現と各 F1 大人がメダカ Tol2-elavl3を統合して可能性が高いため: GCaMP6s-メダカ Tol2 遺伝子の異なるサイトで、各 F1 は、異なる対立遺伝子を指定されています。このアプローチを使用すると、安定した F1s 表層魚群のモリノ血脈集団 (図 3 b、C)、洞窟の中での行動の変化を仲介する神経活動の違いを明らかにするイメージングこうして有効にするライブ カルシウムを生成しています。環境 (図 3 C、D)。さらに、このアプローチを特徴付けるし、A. メキシコで遺伝子の機能を操作する多くの追加遺伝子の表現の土台となります。
図 1: Hcrtの Morpholino 打撃軽減活動と血脈睡眠が増加します。(A) の ATG 開始サイトを含むシーケンスを符号化 Hcrt morpholino ターゲット最初の 25 bp を翻訳ブロックします。(B) Hcrt morpholino オリゴ (MO) と制御シーケンス。(C) 注射用アガロース卵型の ~ 200 単一細胞卵の配置です。1.0 (D) マイクロインジェクション nL フェノールレッド インジケーターの可視化と射出の混合物の。スケール バー Pachón 血脈の 0.5 mm (E) Morpholino 打撃Hcrtの削減活動 (総距離) を = (t = 5.021 以上、df = 88 p < 0.0001) ではなく表層魚群の (t = 1.318、df = 88、 p。> 0.72)。(F) ノックダウン増加 Pachón 血脈睡眠 (t = 2.694、df = 88 p < 0.05) 表面の魚には影響はありません (t = 0.17, df = 88、 p > 0.99)。スケール バー = 1 mm。パネルEおよびFの誤差範囲は、平均値の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: CRISPR はoca2の遺伝子編集表面住居でアルビノを紹介A. メキシコ。 (A) 回路図、oca2 のコーディングの地域、およびガイド RNA (gRNA) CRISPR 媒介性遺伝子編集するためエクソン 21 のターゲットします。(B) 野生型Oca2 +および (C) 変異Oca2 -遺伝子のクロマト グラムをシーケンスします。パネルBで赤いボックスは、パネルCに描かれている変異Oca2 -遺伝子に欠けている 2 の bp シーケンスを示します。(D) 対象に CRISPR は 2 bp 削除、中断Oca2関数を紹介します。プライマーは、F0 の子孫で 2 bp 削除の遺伝のスクリーニングのために設計されています。野生型表層魚群のOca2の (E) PCR およびゲル電気泳動 (バンドのサイズ = 134 bp) と F0 CRISPR 注入の子孫 (バンドのサイズ = 133 bp)。F0 2 bp 削除のホモ接合体中、 Oca2 (Oca2 +) の野生型のバリアント型のヘテロ接合体、ホモ接合体または個人は、ピグメント(Oca2 -) ハーバーのアルビノ。(F) 野生型の全身画像 CRISPR 性白皮症表面の魚の魚と (G) を表面。スケール バー = 5 mm (Hと私) 拡大鏡表示パネルFとG、それぞれ描かれている個人の頭の。スケール バー = 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: パン神経 GCAMP6s のメダカ Tol2 遺伝子導入により、脳活動のライブ イメージングA. メキシコ。(A) A. メキシコでメダカ Tol2 を介した遺伝子導入。メダカ Tol2 mRNA とメダカ Tol2-elav3lの射出: GCAMP6s メダカ Tol2 プラスミド統合 F0 創設者の GCAMP6s 遺伝子。野生型魚の元の在庫に戻し交配 F1 児 GCAMP6s の安定したパン神経式が得られます。(BとC) 郭清と共焦点顕微鏡を用いた安定した表現のため生じる子孫が上映されます。安定したTgAsty(elav3l: GCaMP6s) F1 個人面 - (パネル B に描かれている) と洞窟住居型 (パネル C に描かれている) の両方の確立されています。スケール バー 200 μ m を =。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | ボリュームまたは量 |
| Pc zT2TP プラスミド DNA の 10.0 μ g | X μl |
| くちばし CutSmart バッファー | 10.0 μ l |
| 東北大学からの HF 酵素 | 2.0 μ l |
| ヌクレアーゼ フリー H2O | X μl |
| BSA | 1.0 μ l |
| 合計 | 100 μ l |
表 1: メダカ Tol2 プラスミドの制限のダイジェスト。
| 試薬 | ボリュームまたは量 |
| 線形Pc zT2TP プラスミド DNA の 1.0 μ g | X μl |
| 反応バッファー x 10 | 2.0 μ l |
| 2 x の NTP/キャップ | 10.0 μ l |
| SP6 酵素ミックス | 2.0 μ l |
| RNase フリー H2O | X μl |
| 合計 | 引時間: 20 μ l |
表 2: メダカ Tol2 mRNA の生体外の統合。
| 設定の名前 | 設定値 |
| 熱 | 510 |
| プル | 55 |
| 速度 | 100 |
| 時間 | 40 |
| 圧力 | 500 |
| ランプ | 534 |
表 3: サンプル ピペット引っ張ってプロトコル。
| 試薬 | ボリュームまたは量 |
| Morpholino (4 mM @ 冷凍庫ストック) | 1.0 μ l |
| ヌクレアーゼ フリー H2O または Danieau のソリューション | 17.0 μ l |
| フェノールレッド | 2.0 μ l |
| 合計 | 20 μ l |
表 4: Morpholino 注入混合物。
| 試薬 | 量のボリューム |
| gRNA (100ng/μ l @ 最終濃度作業) | 1 μ l |
| Cas9 mRNA (1200ng/μ l @ 最終濃度作業) | 1 μ l |
| RNase フリー H2O | 2 μ l |
| 合計 | 4 μ l |
表 5: サンプル CRISPR/Cas9 注入混合物。
| 試薬 | 量のボリューム |
| メダカ Tol2 プラスミド (25ng/μ l @ 最終濃度作業) | X μl |
| メダカ Tol2 mRNA (25ng/μ l @ 最終濃度作業) | X μl |
| フェノールレッド | 1.0 μ l |
| RNase フリー H2O | X μl |
| 合計 | 15 μ l |
表 6: サンプル メダカ Tol2 遺伝子注入混合物
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Discussion
ここでは、我々 は morpholinos、編集、CRISPR/Cas9 遺伝子および遺伝子導入方法論を用いた遺伝子機能を操作するための方法論を提供しました。遺伝子技術の富とゼブラフィッシュのこれらのシステムの最適化されます可能性が高い容易52 A. メキシコにこれらのツールの転送できます。最近の知見は、 A. メキシコでこれらのアプローチを使用しているが、彼らはこのシステム30,36,42で多様な形態的・発達・行動特性の調査で使用率の低いまま,53。
Morpholinos は、遺伝子の発現をノックダウンするゼブラフィッシュ研究で広く使用されています。アプローチは簡易式の堅牢なノックダウンであり。しかし、オフターゲット効果されて広く文書化された22,53;したがってで morpholinos に注入されている動物は、予想外の表現型22,55注意深く監視する必要があります。可能であれば、CRISPR/Cas9 を介したノックアウト アプローチなど、その他のメソッドを使用して morpholino 打撃から得られた結果を検証しなければなりません。Morpholinos 遺伝子発現の堅牢なノックダウンが可能、morpholino 媒介のノックダウンは一時的です。したがって、アダルト表現型の分析はできませんこのメソッドを使用する場合です。
CRISPR/Cas9 を介した突然変異誘発では、特定の遺伝子の直接操作を提供しています。さらに、morpholino を介したノックダウンとは異なり CRISPR/Cas9 変異大人に突然変異体の表現型解析できます。CRISPR/Cas9 のオフターゲット効果を防ぐためには、いくつかの世代の突然変異系統を outcrossed して 1 つ以上の対立遺伝子を入手し、テストする必要があります可能であれば。CRISPR/Cas9 システムはまたノックする遺伝子編集アプローチを利用するための可能性を提供します-アリルまたは特定の遺伝的変化を生成します。外因性 DNA の正確なインテグレーションを生産し、正確なポイント突然変異19,20,56,57,58,を生成するゼブラフィッシュ CRISPR/Cas9 システムを使用されています59。 血脈のゲノムの配列、それは、今単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) または表面の魚と血脈人口33の間他の微妙な遺伝の変更を識別することが可能。CRISPR/Cas9 遺伝子編集のアプリケーションは、表面の魚と毒、または異なる発達プロセスのこれらの遺伝の変更の役割を調べるため、血脈の異なった人口間の対立遺伝子を交換する機会を提供します。
このプロトコルで説明した遺伝子導入方法は、機能獲得研究、遺伝子生物学的プロセスを変更するツールを生成するシンプルで強力な方法を提供します。ゼブラフィッシュ研究でメダカ Tol2 システムを用い、 A. メキシコで同様に強力だ示されています。さらに、ゼブラフィッシュのプロモーターを利用して、 A. メキシコにおける内因性表現を繰り返すゼブラフィッシュで生成された遺伝子組換えコンストラクトを示しました。我々 は、4 つの他のプロモーターから分離されたゼブラフィッシュ組織特異的発現そのドライブA. メキシコ(データは示されていない) で期待どおりに発見しました。これは、遺伝的ツールの多くに転送できますゼブラフィッシュから直接メキシコ A. A.で変更を必要とせず示唆しているゼブラフィッシュ プロモーター 。 メキシコその保存式パターンを要約するだろう、のでメキシコ休眠打破。また、 A. メキシコ33シーケンス テクノロジーの進歩でここで説明したトランスジェニック アプローチ、エンハンサーやプロモーター間変動の役割を果たす可能性がありますの調査のための強力な未来を許可します。表面と洞窟のフォーム。最後に、ゼブラフィッシュを貴重にした生物学的過程の遺伝的操作のための強力なツールは、 A. メキシコ60、61、62,63で同様に重要です。ストレス、睡眠、授乳などの多様な行動特性の差とA. メキシコ表面と洞窟の住居形態の間の侵略はずっと広く文書化された12,1415, ,38,64、まだ基礎となる神経がよく理解されていません。Tg(elavl3:GCaMP6s)などのツールは、どのように動作の違いと相関し、脳は、どのようにユニークな洞察を進化的変更を提供の違い神経脳全体の解剖が許可されます。
一緒に取られて、 a. メキシコは様々 な形態および行動特性の進化を調査するための先行モデルになる態勢を整えています。A. メキシコの複雑な生物学的プロセスの多様な違いは、形質の進化の遺伝的機構を調査するためのプラットフォームを提供します。遺伝子の機能を操作するためのツールのアプリケーション目の変性、神経発達異常、不眠症に関連する生物学的疾患を調査するために適用できるモデルにこの生物を開発に役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は Sunishka Thakur のジェノタイピングおよび図 2にoca2変異体の魚をイメージングで彼女の援助をありがちましょう。この作品は、国立科学財団 (NSF) 賞を受賞 1656574 A.C.K.、j. k.、A.C.K.、NSF 賞 1754321、A.C.K. と E.R.D. に国立衛生研究所 (NIH) 賞 R21NS105071 に支えられ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
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