Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Published: April 22, 2019 doi: 10.3791/59093
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 2,3
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Abstract

Grot dieren vormen een dwingende systeem voor onderzoek naar de evolutionaire mechanismen en genetische basis ten grondslag liggen aan veranderingen in talrijke complexe eigenschappen, met inbegrip van oog degeneratie, albinisme slaap verlies, hyperphagia en zintuiglijke verwerking. Soorten cavefish van over de hele wereld weergeven een convergente evolutie van morfologische en gedrags eigenschappen als gevolg van gedeelde belasting van het milieu tussen verschillende grot systemen Divers grot soorten hebben onderzocht in het laboratorium-omgeving. De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, met slechtzienden en blinden vormen, heeft unieke inzicht in biologische en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen en is goed klaar als een opkomende modelsysteem. Terwijl in A. mexicanus kandidaat-genen regulering van de evolutie van de verschillende biologische processen zijn vastgesteld, is de mogelijkheid voor het valideren van een rol voor afzonderlijke genen beperkt gebleven. De toepassingvan Transgenese en bewerken van gen technologie heeft het potentieel om te overwinnen deze aanzienlijke belemmering en te onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen. Hier beschrijven we een andere methode voor het manipuleren van genexpressie in A. mexicanus. Benaderingen omvatten het gebruik van morpholinos, Tol2 Transgenese, en gen-editing systemen, gebruikte in zebrafish en andere vissen huizen modellen, te manipuleren van de genfunctie in A. mexicanus. Deze protocollen bevatten gedetailleerde beschrijvingen van getimede fokken procedures, de collectie van bevruchte eieren, injecties en de selectie van genetisch gemodificeerde dieren. Voor het onderzoek naar de genetische en neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van de diverse eigenschappen in A. mexicanustoestaat deze methodologische benaderingen.

Introduction

Sinds Darwins Origin of Species1, hebben de wetenschappers diepgaande inzichten in hoe eigenschappen evolutionair worden gevormd in reactie op bepaalde milieu- en ecologische druk, dankzij grot organismen2opgedaan. De Mexicaanse tetra, A. mexicanus, bestaat uit eyed voorouderlijke 'oppervlak' populaties die bewonen rivieren in Mexico en Zuid-Texas en van ten minste 29 geografisch geïsoleerde populaties van afgeleide grot morphs bevolken de Sierra del Abra en andere gebieden van Noordoost Mexico3. Een aantal grot-geassocieerde kenmerken zijn geïdentificeerd in A. mexicanus, waaronder veranderde zuurstofverbruik depigmentatie, verlies van ogen en voeding en gedrag4,5,6, foerageren veranderd 7,8,9. A. mexicanus presenteert een krachtig model voor het onderzoek naar mechanismen van convergente evolutie als gevolg van een welomschreven evolutionaire geschiedenis, een gedetailleerde karakterisering van de ecologische omgeving en de aanwezigheid van onafhankelijk geëvolueerd grot populaties10,11. Veel van de grot-afgeleide eigenschappen die aanwezig zijn in cavefish, met inbegrip van verlies van het oog verlies slapen, verhoogde voederen, verlies van scholing, agressie, verminderd en verminderd stress reacties, geëvolueerd zijn meerdere malen door onafhankelijke oorsprong, vaak met behulp van verschillende genetische routes tussen grotten8,12,13,14,15. Dit herhaald evolution is een krachtige aspect van het systeem van A. mexicanus en bieden inzicht in de meer algemene kwestie van hoe genetische systemen voor het genereren van soortgelijke fenotypen kan worden verstoord.

Terwijl de toepassing van genetische technologie voor het mechanistisch onderzoek van de genfunctie heeft is beperkt in vele vissoorten (met inbegrip van A. mexicanus), vormen recente vooruitgang in de zebravis een basis voor de ontwikkeling van de genetische technologie in vis 16,17,18,19,20. Tal van hulpmiddelen worden veel gebruikt in zebrafish te manipuleren van genexpressie en de uitvoering van deze procedures lang zijn gestandaardiseerd. Bijvoorbeeld, de injectie van morfolino oligos (MOs) stadium de eencellige selectief blokkeert RNA en voorkomt de vertaling voor een korte tijd venster tijdens ontwikkeling21,22. Bovendien, bewerken van gene benaderingen, zoals geclusterd regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) interspaced / CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN), toestaan voor de generatie van gedefinieerde verwijderingen of, in sommige gevallen, invoegingen door middel van een recombinatie in genomes19,,20,,23,24. Transgenese wordt gebruikt voor het manipuleren van stabiele genexpressie of functie in een celtype specifieke wijze. Het Tol2 systeem effectief wordt gebruikt voor het genereren van transgene dieren door coinjecting transposase mRNA met een Tol2 DNA plasmide met een transgenic25,26. Het Tol2 -systeem maakt gebruik van de Tol2 transposase van medaka voor het genereren van stabiele germline inlassingen uit transgene construct17. Genereren van Tol2 transgenics houdt een plasmide met een transgenic geflankeerd door Tol2 integratie sites en mRNA voor Tol2 transposase17coinjecting. Dit systeem is gebruikt voor het genereren van een matrix van transgene lijnen in de zebravis en het gebruik ervan heeft onlangs uitgebreid tot extra opkomende modelsystemen, waaronder cichliden killifish, de stekelbaars, en, meer recentelijk, de Mexicaanse cavefish27, 28,29,30.

Terwijl de cavefish een fascinerende biologische systeem voor informatief mechanismen van trait evolutie is, heeft zijn volledige vermogen als een evolutionaire model niet zijn volledig benut. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een onvermogen om te manipuleren genetische en cellulaire functie direct31. Kandidaat-genen regulering van complexe eigenschappen zijn geïdentificeerd met behulp van kwantitatieve trait loci (QTL) studies, maar de validatie van deze kandidaat-genen is moeilijk32,33,34. Onlangs, voorbijgaande knockdown met behulp van morpholinos, gene bewerken met behulp van systemen voor CRISPR en TALEN en het gebruik van Tol2-gemedieerde Transgenese zijn gebruikt voor het onderzoeken van de genetische basis ten grondslag liggen aan een aantal eigenschappen35,36,37 ,38. De uitvoering en de standaardisatie van deze technieken zal toestaan voor manipulaties die ondervragen van de moleculaire en neurale basis van biologische eigenschappen, met inbegrip van de manipulatie van de genfunctie, de etikettering van gedefinieerde cel populaties, en de expressie van functionele verslaggevers. Overwegende dat de succesvolle tenuitvoerlegging van deze genetische hulpprogramma's voor het manipuleren van genen of cellulaire functie is aangetoond in opkomende modelsystemen, zijn gedetailleerde protocollen nog steeds ontbreekt in A. mexicanus.

A. mexicanus kritisch inzicht geven in de mechanismen van de evolutie in antwoord op een veranderende omgeving en presenteren van de mogelijkheid om nieuwe genen regulering van diverse eigenschappen te identificeren. Een aantal factoren suggereren dat A. mexicanus een uiterst hanteerbare model is voor de toepassing van gevestigde genomic instrumentarium momenteel in gevestigde genetische modellen, inclusief de mogelijkheid om de vis in de laboratoria, groot brood formaat, gemakkelijk te onderhouden transparantie, een gesequenceerd genoom en gedefinieerde gedrags assays39. Hier beschrijven we een methodologie voor het gebruik van morpholinos, Transgenese en gene bewerken in oppervlakte en grot populaties van A. mexicanus. De bredere toepassing van deze instrumenten in A. mexicanus zal zorgen voor een mechanistisch onderzoek naar de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en gedragsmatige verschillen tussen cavefish en oppervlakte vissen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. morfolino oligo ontwerp

Opmerking: A. mexicanus reeksen zijn beschikbaar via het nationale centrum van Biotechnology Information (NCBI) gen en NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), alsook vanuit de Ensembl genoom browser (https://www.ensembl.org). Bij het ontwerpen van een morfolino voor gebruik in beide vormen van oppervlakte - en grot-woning, is het cruciaal voor het identificeren van een genetische variatie tussen de morphs in dit stadium, zodat deze genetische gebieden kunnen worden vermeden als doelen voor morpholinos. Polymorfe afwijkingen binnen een doelsite morfolino kan leiden tot inefficiënt bindend. Het ontwerp is vergelijkbaar met andere systemen, vis, zoals zebrafish, en is eerder aangetoond effectief te werken in A. mexicanus21,36,,40.

  1. Ontwerp van de vertaling-blocking morpholinos
    Opmerking: Vertaling-blocking morpholinos blokkeren vertaling door binding aan de site van de endogene start en belemmeren translationeel machines van de opeenvolging van mRNA via sterische huidkleur bindend.
    1. De codering regio van het target-gen beginnen met de ATG start site te identificeren.
    2. De eerste 25 baseparen van de doel-reeks opnemen door te kopiëren-en-plakken, wordt de volgorde in een tekst-editor of lab-notebook.
    3. Met online software (bijvoorbeeld http://reverse-complement.com) of handmatige vertaling, genereren de omgekeerde aanvulling van de doel-reeks. Sla de resulterende omgekeerde aanvulling in een teksteditor of lab notebook.
    4. Bestel een morfolino met de aanvulling van de omgekeerde volgorde bij een bedrijf dat morfolino oligonucleotides genereert. Zie Tabel van materialen voor bedrijven.
  2. Ontwerp van splice-blocking morpholinos
    Opmerking: Morpholinos Splice-blokkerende blokkeren splicing en, waardoor de vorming van een volwassen mRNA-molecuul. Dit voorziet in een alternatieve methode knockdown wanneer de start sites zijn niet goed gedefinieerde, of een meer optimale aanpak wanneer validatie van knockdown via de Kettingreactie van de polymerase (PCR) is gewenst. Dit voordeel van splice-blocking morpholinos (over ATG-blokkerende MOs) is dat uitsluiting van de exon of intron opneming kan gemakkelijk worden beoordeeld met reverse-transcriptase (RT)-PCR, vergroten en verkleinen van verschillen gevisualiseerd op een gel. RT-PCR en gel elektroforese te bepalen morfolino werkzaamheid moet worden gedaan met behulp van standaard laboratorium procedures.
    1. Identificeren van de opeenvolging van de pre-mRNA van het gen van de doelgroep. Gebruik maken van beschikbare informatie van het genoom van de A. mexicanus via NCBI of Ensembl om te bepalen van intron-exon grenzen33.
    2. Target exon-intron (splice donor) of intron-exon grens (splice acceptor) sites voor intron opname of exon uitsluiting.
      Opmerking: Het spliceosoom normaal richt zich op een reeks van "GU" (U1 doel) in het intron op de 5' splice site en een reeks AG" ""op de 3' (U2) intronic splice doelsite. Onder normale omstandigheden binden het spliceosoom U1 en U2 subeenheden deze doel-sites op de volgorde van de pre-mRNA voor juiste splicing te voorkomen. Echter, als een van deze doel-sequenties is geblokkeerd door een morfolino, het spliceosoom gaan over tot de volgende beschikbare U1 of U2 site, intron uitsluiting of exon veroorzaakt in de opeenvolging van mRNA. Hierbij zal de planning/optimalisatie, afhankelijk van de aard van de doelgroep gene21. In het algemeen, een interne U1 site blokkeren de splice omgeleid naar de volgende beschikbare U1 site, waardoor een exon besnijdenis. Anderzijds blokkeren van de eerste of laatste splice kruising zorgt ervoor dat een opname intron omdat er geen andere site voor het omleiden van de splice aan. Reeks software gebruiken voor het voorspellen van het effect van verschillende uitsluitingen versus insluitsels. Voorspellingen kunnen aangeven potentiële leesraamverschuiving of voortijdige stop codonen, die een meer effectieve doelsite voor mRNA verstoring aangeeft.
    3. Zodra de doelsite is geïdentificeerd, wordt de reeks opnemen in een tekst-editor of lab-boek. Controleer of dat de doelsite is 25 basenparen (bp) lang.
    4. Met online software (bijvoorbeeld http://reverse-complement.com) of handmatige vertaling, genereren de omgekeerde aanvulling van de doel-reeks. De reeks opnemen in een tekst-editor of lab-boek.
    5. Bestel een morfolino met de aanvulling van de omgekeerde volgorde bij een bedrijf dat morfolino oligonucleotides genereert. Zie Tabel van materialen voor bedrijven van de steekproef.

2. Morpholinos voor injectie

Opmerking: Verschillende concentraties of volumes van MO injectie zal moeten worden uitgevoerd om de optimale concentratie te injecteren. Typische injecties hoeveelheden zijn 400 – 800 pg van MO. Het effect van morfolino knockdown kan aanhouden gedurende maximaal 6 dagen postinjection.

  1. De voorraad morfolino verkrijgen. De voorraad morfolino arriveert gelyofiliseerd. Hydrateren het met steriele H2O voorafgaand aan het gebruik van op de gewenste voorraad concentratie (bijvoorbeeld 4 mM). Bewaren bij-20 °C tot gebruik.

3. CRISPR gRNA ontwerp, in vitro transcriptie en voorbereiding

  1. CRISPR gRNA ontwerp
    Opmerking: gRNAs werden gegenereerd met behulp van de eerder gepubliceerde onderzoek door Varshney et al.40 en Wierson et al.41.
    1. Een genoom-browser gebruikt, identificeren de codering regio van het gen van belang. Met behulp van de genomic volgorde, identificeren van de opeenvolging van de target gRNA binnen een exon door te zoeken naar een 20 bp nucleotide doel sequencing begint met GG en gevolgd door een reeks van PAM (NGG). Een gedeelte van het gen na de start (ATG) zal worden gericht.
      Opmerking: Als een opeenvolging van de doelgroep met GG eind 5' niet kan worden gevonden in de gewenste exon van het gen, een of beide van de G's kan worden vervangen voor de nucleotiden van het eerste en tweede op de 5' einde van de reeks. Echter, de twee G's moet worden opgenomen in de oligo, als deze vereist voor de Transcriptie T7 zijn.
    2. Ontwerpen en bestellen van een gen-specifieke oligonucleotide (oligo A: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). De gen-specifieke 20 bp gRNA doel volgorde (vet) toevoegen zonder de PAM-sequentie tussen een T7 promotor reeks (rood) en een reeks van de overlapping gebruikt om te ontharden aan een tweede oligonucleotide (blauw). Anneal en versterken (zie stap 3.2.1) deze oligo A en een tweede oligo (oligo B: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT-AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') voor het genereren van de gRNA-sjabloon gebruikt voor transcriptie.
      Opmerking: Oligo B is hetzelfde voor elke reactie en slechts 1 x moeten worden besteld.
  2. voorbereiding van de gRNA en transcriptie
    1. Anneal en versterken de oligos. Omvatten de volgende inleidingen om de gRNA te versterken teneinde de opbrengst: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 primer) en 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA primer). Het uitvoeren van een PCR polymerase van litoralis kodakaraensis (KOD) gebruiken.
      Opmerking: Voor beide inleidingen in oligo A en oligo B, 10 cycli wordt aanbevolen voor een goede opbrengst. Een gedetailleerd protocol kan worden gevonden in Wierson et al.41.
    2. Transcriberen van de gRNA met behulp van commercieel beschikbare in vitro transcriptie kits (Zie Tabel van materialen). Dit wordt gedaan door wijzigingen aan de fabrikant's-protocol gepubliceerd door Klaassen et al.42.
    3. Neerslaat, wassen en resuspendeer de gRNA zoals beschreven door Klaassen et al.42.
      Opmerking: De gRNA moet worden resuspended in RNase-gratis water ter voorkoming van de afbraak.
    4. De concentratie van de gRNA, die kan worden bepaald met behulp van een spectrofotometer geregistreerd. Beoordeling van de kwaliteit van het RNA door 2 µL uit te voeren op een agarose gel. Aliquot RNA voorkomen vorst/dooi en opslaan bij-80 °C tot vlak voor de injecties.
  3. Voorbereiding van de Cas9 en transcriptie
    1. Cas9 mRNA kan worden overgezet met behulp van commercieel beschikbare in vitro transcriptie kits (Zie Tabel van materialen) zoals eerder beschreven43. Gebruik de nls-Cas9-nls versie43.
    2. De concentratie van de gRNA wordt geregistreerd en beoordelen van de kwaliteit door het uitvoeren van 2 µL op een agarose gel. Aliquot RNA te vermijden ontleding die door meerdere ontstaat cycli bevriezen-ontdooien en sla de aliquots bij-80 °C.

4. bereiding van Tol2 constructies, Tol2 transposase en Transgenese

  1. Voorbereiden Tol2 transgenic constructies voor injectie.
    Opmerking: We hebben met succes gebruikt gepubliceerd/beschikbare zebravis en medaka construeert in A. mexicanus. Deze constructies zijn volledig functioneel in A. mexicanus, waarschijnlijk vanwege het hoge niveau van reeks homologie (verwijzen naar de repository AddGene en het informatienetwerk van de zebravis [ZFIN] databases voor beschikbaar constructies). De zebravis promotor fragmenten geuit de transgenen in de verwachte weefsels wanneer gebruikt in A. mexicanus.
    1. Verwerven van Tol2 constructies of Genereer plasmide met een weefsel-specifieke promotor, de gewenste transgenic en Tol2 wapens (Zie Kwan et al.44). Na ontvangst, volgorde van de constructie voor het valideren van de plasmide.
    2. Uitvoeren van een midiprep voor constructies volgens de fabrikant's richtsnoeren. Elueer de definitieve plasmide in RNase-vrije H2O, bepalen van de concentratie met een spectrofotometer, Verdun de concentratie aan 100-300 ng /μL, en aliquot en winkel de constructies bij-20 °C.
  2. Tol2 transposase plasmide verteren en synthetiseren van mRNA.
    1. Een kopie krijgen van het Tol2 transposase plasmide (PC-zT2TP) als een sjabloon voor het genereren van Tol2 mRNA45.
    2. Midiprep de pCS-zT2TP bouwen volgens de fabrikant's richtsnoeren. Elueer het in een lage hoeveelheid RNase-gratis water of buffer (~ 50 μl). Opslaan van de aliquots bij-20 °C.
    3. Verteren de plasmide van de Tol2 met behulp van een restrictie-enzym.
      1. Een samenvatting van de beperking op 10 µg circulaire pCS-zT2TP plasmide met behulp van tabel 1uitvoeren.
      2. Splitsen van de reactie in 2-50 μl reacties en de reacties op 37 °C in een thermische cycler's nachts uit te broeden.
      3. De volgende dag, inactivering van het enzym door verhitting het tot 65 °C gedurende 20 min.
      4. Zuiveren van gelineariseerde plasmide onmiddellijk na de digest, met behulp van commercieel beschikbare PCR reiniging kits (Zie Tabel van materialen) per de fabrikanten' -richtsnoeren. Elueer de plasmide in 15 μL van RNase-vrije H2O en bepaal de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer.
      5. Voer 1 μL van verteerd plasmide en 1 μL van Onbesneden plasmide op een 1,5% agarose gel te bevestigen gelineariseerde plasmide.
    4. Het uitvoeren van een in vitro transcriptie van mRNA van Tol2.
      1. 1 µg gelineariseerde pCS-zT2TP plasmide gebruiken als een sjabloon voor transcriptie. Volg de fabrikant's richtsnoeren voor in vitro transcriptie (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in tabel 2.
      2. Incubeer bij 37 °C in een thermische cycler per de fabrikant's richtsnoeren.
      3. Voeg 1 µL van DNase, het Incubeer bij 37 °C in een thermische cycler per de fabrikant's richtsnoeren.
      4. Lithium chloride neerslag per transcriptie kit protocol uit te voeren. Resuspendeer de pellet RNA in ~ 20-30 μL van RNase-vrije H2O.
      5. Bepaal de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer en de RNA-kwaliteit opnemen.
      6. Verdun het product te ~ 100-300 ng/µL aliquot in 5-10 μL monsters om te voorkomen dat herhaalde bevriezen-ontdooien. Bewaren ze op-80 °C tot gebruik.
        Opmerking: Het is mogelijk om te controleren van 1-2 µL van gezuiverde Tol2 mRNA van uitstrijkjes/band met gelelektroforese.

5. microinjections

  1. Voorbereiding van algemene hulpmiddelen voor injecties
    Opmerking: De procedures in deze sectie zijn in detail beschreven door Kowalko et al.,46, en een overzicht met kleine aanpassingen hier wordt gepresenteerd.
    1. Genereren injectie platen door gieten warme 3% agarose opgelost in vis systeem water in een 100 mL petrischaal. Zorgvuldig plaatst een ei injectie schimmel in de vers gegoten agarose te maken van putten voor de kuit. Plaats de zijde van de schimmel in agar in een hoek van 45° en dan langzaam lager het in de agarose; langzaam het verlagen van de mal op een hoek vermijdt lucht krijgen gevangen onder de schimmel. Voorzichtig de mal te verwijderen zodra de agarose is gestold. De platen kunnen worden opgeslagen, verzegeld, bij 4 °C voor maximaal 1 week.
    2. Trekken verder breinld zonder knop van borosilicaatglas haarvaten voor injectie in de trekker van een elektrode/naald volgens de fabrikant's richtsnoeren. Dit protocol zal variëren per pipet trekker; echter kan een steekproefprogramma naald-pulling worden gevonden in tabel 3.
      Opmerking: Optimaliseren van de naald is belangrijk voor injecties, zoals naalden die te lang zal buigen in plaats van netjes de eicel te doordringen.
    3. Groot-boring glas pipetten maken voor de overdracht van het ei door het breken van standaard glas pipetten, dus de opening groot genoeg voor de eieren is. Met behulp van een Bunsenbrander, Pools gebroken ultimo het glas door het einde van de gebroken pipetten aan de vlam bloot te leggen totdat het is glad.
  2. Fokken van setup
    Opmerking: Er zijn veel verschillende protocollen gebruikt voor het kweken van A. mexicanus. Zie voor een gedetailleerde protocol, Borowsky39. Start fokkerij setup 1 week vóór de injecties.
    1. Op dag 1, plaatst u twee tot drie vrouwen en drie tot vier mannen in een interne 10-gallon tank onderhouden bij 24 ± 1 °C.
    2. Op de dagen 1-7, verhogen het vervoederen aan ~ 3 x per dag. Controleer dat de voeding bevat levende voedsel, zoals zwarte wormen en Artemia.
    3. Op dag 6, het toevoegen van een enkele tankverwarming ingesteld op 27 °C.-Lab tank temperaturen kunnen variëren; Dit zal dus een stijging van 2-3 °C ten opzichte van de normale tank temperatuur.
    4. Op de avond van dag 7, oftewel de avond (zeitgeber [ZT] 9-11) van injectie nacht, grondig de tanks met een water gedrenkte spons schoon en verwijder eventuele overtollig voedsel of puin met een fijne maaswijdte net of een sifon.
    5. Start zoeken oppervlakte kuit op ZT15 op de nacht van dag 7, en blijven controleren elke 15-30 min tot ZT18. Voor cavefish, start zoeken eieren op ZT17 en blijven controleren elke 15-30 min tot ZT20.
      Opmerking: De tijden zijn gebaseerd op een 14:10 h licht: donker cyclus met gebruikmaking van zeitgeber tijd. Fok tijden zijn schattingen en individuele labs exacte tijden moeten bepalen. Het is van cruciaal belang voor het verzamelen van eieren, zodra ze vrijgegeven/bevrucht zijn teneinde injecteert ze eencellige stadium.
  3. Collectie van eencellige fase eieren
    1. De nacht waarin fokken verwachting, onderzoeken de tanks elke 15-30 min en monitor voor eieren aan de onderkant van de tank. Eieren verschijnen doorschijnend, meten van ongeveer 1 mm in diameter.
    2. Gebruik een fijne mesh vis net voor het verzamelen van eieren en hen overbrengen in een glazen kom gevuld met verse vis systeem water. Onderzoeken de eieren onder een microscoop om te bevestigen dat de eieren in de een-cel-stadium.
    3. Met behulp van glas pipetten, eencellige eieren naar de injectie platen overbrengen. Glas pipetten dienen in dit stadium als de eieren aan kunststof vasthouden zal.
    4. Met behulp van een precisiepipet, zorgvuldig laat de eieren in de putjes van de plaat agarose injectie van punt 5.1. Vul de rijen van de plaat voorverwarmde (op kamertemperatuur) injectie met het maximum aantal eieren (30-40 per rij, en maximaal vijf rijen). Volledige rijen helpen voorkomen dat de eieren bewegen tijdens de injecties. De eieren tot de prestaties van de injecties op de plaat van de injectie met een kleine hoeveelheid vis systeem water gehydrateerd te houden.
  4. Pico-injectie setup en Algemeen inspuitpomp optimalisatie richtsnoeren
    1. Aanvulling van de funderingsput de naalden van de injectie met behulp van een precisiepipet gel-laden tips die passen binnen de capillaire of met behulp van standaard micropipet tips en een 2-4 µL bolus toe te voegen aan het einde. Zodra de naald wordt gevuld, gebruik pincet om trim de lengte van de overtollige vanaf de injectie naald.
    2. Uitvoeren van microinjections met behulp van een naald in een micromanipulator, aangesloten op een picoliter microinjector gemonteerd.
    3. De injectie tijd ingesteld op 0.03 s en de druk uit op ~0.0 psi. De druk van de injectie zal variëren dienovereenkomstig met kleine verschillen tussen naalden, zo optimaliseren om een ~1.0 nL injectie bolus.
      Opmerking: De druk van de injectie is vaak in het bereik van ~ 10-30 psi.
    4. Standaardiseren van de bolus injectie door injecteren in minerale olie en het meten van de bolus maat met een dia micrometer tot een ~ 1-1.5 nL geïnjecteerde volume. Aanpassen van de druk van de injectie (psi) u verhoogt of verlaagt het volume van de bolus.
    5. Tekenen van water op de top van de eieren met behulp van een lab weefsel.
      Opmerking: De Astyanax ei chorion is iets moeilijker om te penetreren dan zebrafish eieren. Wij vinden dat het water off van de bovenkant van de eieren tekening helpt penetratie van de naald in de eicel vergemakkelijken. Optimalisatie van de plaat kan zorgen voor ~ 200 eieren op een enkele plaat.
    6. Gebruik de micromanipulator om elk ei met de naald doordringen, en injecteert direct in de dooier. Zodra gepositioneerd in de dooier, injecteren de eicel door te drukken op de invoeren-knop of injectie voetpedaal.
      Opmerking: Een volledige plaat kan worden geïnjecteerd binnen ~ 15 min. De eencellige fase duurt ~ 40 min.
  5. Injectie van morpholinos
    Opmerking: De hoeveelheid morfolino die nodig zijn voor knockdown zonder toxiciteit moet worden geoptimaliseerd per gene doel; een concentratie van 400 pg is echter een goede plek om te beginnen.
    1. Morfolino voor te bereiden zodat 400 pg van morfolino zullen worden ingespoten per ei. Morfolino op ijs ontdooien. De injectie-oplossing bestaat uit morfolino (op de gewenste concentratie), RNase-vrije H2O of Danieau's oplossing, en fenol rood (10% van het uiteindelijke volume). Voor een voorbeeld, Zie tabel 4.
    2. Injecteren van 1 nL per embryo.
  6. CRISPR injecties
    1. Bereiden RNA zodat 25 pg van gRNA en 300 pg van Cas9 mRNA totale zullen per embryo worden ingespoten. Zie voor een voorbeeld CRISPR/Cas9 injectie mengsel, tabel 5.
    2. Injecteren van 2 nL van gRNA/Cas9 mRNA per embryo rechtstreeks in het embryo.
  7. Injectie van Tol2 transposase en Tol2-geflankeerd plasmide voor Transgenese
    1. Ontdooien transposase mRNA en Tol2 plasmide op ijs. Combineer Cas9 mRNA (bij 25 ng/µL), gewenste Tol2 construct (bij 25 ng /μL), en fenol rood (≤10% van het uiteindelijke volume) in RNase-gratis water. Voor een monster Tol2 Transgenese injectie mengsel, Zie tabel 6.
    2. Houd de injectie oplossing en naalden op ijs om te voorkomen dat de afbraak van mRNA. Injecteren op 1 nL in volume per embryo.

6. fok- en screening geïnjecteerd vis

  1. Ingespoten vis veehouderij
    1. Nadat de eieren zijn geïnjecteerd, onmiddellijk overbrengen naar glazen kommen (10 x 5 cm), gevuld met ~ 200 mL vis systeem water. Eieren zijn gemakkelijk gespoeld door dompelen de injectie platen in kommen gevuld met vis, water en spoelen de eitjes met een pipet.
    2. Plaats van ~ 50-80 ingespoten embryo's per kom en ze aan de achterkant bij 22-24 °C.
    3. Reinigen van de kommen met ingespoten vissen 2 x per dag te verwijderen dode embryo's en veranderen van ~ 20% van het water op een dagelijkse basis.
    4. Extra fokken is verricht overeenkomstig de eerder gepubliceerde protocollen39.
  2. Screening van morfolino-geïnjecteerd individuen
    1. Visualiseer de dieren onder een stereomicroscoop aan het scherm voor fenotypen. Het effect van morpholinos kan aanhouden tot ~ 5 dagen postinjection21.
    2. Maatregel gedrags fenotypen op 4 dagen postinjection.
  3. Screening voor CRISPR microdeleties
    1. Het ontwerpen van inleidingen om genomic DNA rond de doelsite te vergroten. Inleidingen zo ontwerpen dat het PCR-product van target ongeveer 100-is 125 bp.
      Opmerking: bijvoorbeeld, voor de oca2 locus, de regio rondom de doelsite gRNA werd versterkt met behulp van de voorwaartse primer 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' en de omgekeerde primer 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' voor een PCR product lengte van 105 bp.
    2. Offeren van embryo's of fin clip volwassen vis volgens het institutionele protocol van het dier.
    3. Verzamelen van de embryo's of ontleed vinnen in PCR buizen en DNA uitpakken en uitvoeren van PCRs. monster PCR protocollen voor gen-specifieke primers kunnen worden gevonden in Ma et al.35.
    4. Om te beoordelen voor de mutagenese, voeren 5 zal µL van het PCR-product op een 3% agarose gel bij 70 V voor 3 h. Wild-type (nonmutagenized) DNA resulteren in een PCR product als een duidelijke band. Mutant DNA zal resulteren in een smeary band op de gel.
    5. Om te bepalen van de volgorde van de mutant allelen, TA kloon het PCR-product volgens de fabrikant's instructies, kiest u kolonies en miniprep culturen. De resulterende DNA voor het rangschikken verzendt.
    6. Treffen en handhaven van de lijnen van vis toezending van mutant allelen, door volwassen ingespoten vis te steken naar de wild-type vis en scherm 5-10 embryo's om te bepalen als een van de nakomelingen een mutant allel van de volgende stappen 6.3.1-6.3.6 gen dragen.
      Opmerking: Verschillende F1 personen uit de dezelfde F0 oprichter vis kunnen het dragen van verschillende mutaties. Zorgen mutant lijnen zijn sequenced om te verkrijgen van mutaties voorspeld voor de productie van allelen die buiten het frame.
    7. Vis met een mutant allel door PCR met behulp van de smeary band assay (stappen 6.3.1-6.3.6) of door het ontwerpen van allele-specifieke PCR inleidingen die mutant en wild-type bands (figuur 2C versterken zal) te identificeren.
    8. Zodra een lijn van vis wordt gevestigd, de mutant allelen homozygose om te testen voor recessief fenotypen.
  4. Screening voor transgene positieve personen
    Opmerking: Met behulp van constructies met een fluorescerende maker wordt aanbevolen om het stroomlijnen van de screening voor transgene positieve personen. Standaardpcr screeningmethoden kan echter worden gebruikt aan het scherm voor transmissie.
    1. Visualiseer weefsel-specifieke fluorescente proteïnen in F0 vis zo spoedig 2 dagen postinjection, met een epifluorescence ontleden toepassingsgebied.
      Opmerking: De expressie in F0 larven is mozaïek en positieve individuen kunnen een scala van expressie fenotypen hebben.
    2. Oprichter vis positieve individuen als F0 houden.
    3. Wanneer F0s geslachtsrijp, backcross stichtende vis aan nontransgenic personen afkomstig uit de dezelfde populatie/lab voorraad. Scherm F1 nakomelingen met hetzelfde protocol, zoals beschreven in stap 6.2.
      Opmerking: De expressie in F1 larven is uniform en zorgt voor consistentie tussen F1 broers en zussen.
    4. Aangezien Tol2 integratie geen site-gemedieerde is en integratie kan variëren tussen oprichters, selecteer F1 broers en zussen afgeleid van een enkele F0 oprichter en uiten van positieve F1 broers en zussen voor het genereren van F2s interbreed. Deze nakomelingen zullen de basis voor een stabiele lijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Meerdere populaties van grot-woning A. mexicanus Toon verminderde slaap en verhoogde wakkerheid/activiteit ten opzichte van hun oppervlakte-woning soortgenoten14. Hypocretin/orexine (HCRT) is een zeer geconserveerde neuropeptide, die fungeert toe wakker, en afwijkingen in de HCRT-pathway narcolepsie veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren47,48. Wij hebben eerder aangetoond dat grot A. mexicanus gestegen expressie van HCRT peptide, suggereren dat een verhoogde expressie van dit peptide het verlies van de slaap in cavefish38ten grondslag kan liggen. De MO knockdown van hcrt expressie biedt een krachtige aanpak voor de behandeling direct het effect van verhoogde hcrt meningsuiting bemiddelen van het verlies van de slaap in cavefish.

Om zich te buigen over de relatie tussen hcrt meningsuiting en slaap, ontwierpen we een morfolino vertaling-blokkeren. De MO doelstellingen de eerste 25 bp van exon, met inbegrip van de ATG starten website (figuur 1A,B). Als een besturingselement gebruikt wij een commercieel beschikbare gecodeerde MO besturingselement (figuur 1B). Met behulp van het algoritme BLAST op NCBI, bevestigd we dat er geen af-target effecten voor beide MO gedurende het genoom (gegevens niet worden weergegeven). A. mexicanus oppervlakte vissen en Pachón cavefish werden gefokt en hun eieren werden verzameld en vervolgens geïnjecteerd met 400 pg van MO in een 1 nL-volume in het stadium van de één-cel (Figuur 1 c,D). De vissen waren verhoogd tot 4 dpf en vervolgens gemeten voor activiteit en slaap gedrag.

Grot A. mexicanus ingespoten met het besturingselement MO tentoongesteld aanzienlijk meer motorische activiteit en slaap verminderd gedurende 24 h ten opzichte van oppervlakte vissen ook ingespoten met de gecodeerde MO (figuur 1E,F), suggereren geen effect van de Morfolino injecties controleren, zoals de resultaten met de eerder gepubliceerde activiteit en slaap patronen in elke morphotype stroken (t = 5.021, df = 88, p < 0.0001). De injectie van de HCRT-MO had weinig effect op slaap in oppervlakte vissen in vergelijking met controle-geïnjecteerd vis (t = 0.17, df = 88, p > 0.99). Daarentegen had hcrt knockdown via MO injectie een significant effect op slaap in grot-woning vis. Pachón cavefish larven bleek minder dan een verlaging van de viervoudige in motorische activiteit, en slapen bijna twee keer meer dan controle Pachón larven (1E cijfer,F; t = 2.694, df = 88, p < 0,05). Een vergelijking van motorische activiteit en slaap in MO-knockdown oppervlak - en grot-woning vis toonde vergelijkbare bedragen voor motoriek en slaap (figuur 1E, F). Deze gegevens bieden een directe link tussen hcrt meningsuiting en slaap verlies en een methode om de biologische mechanismen voor verlies van slaap in de evolutionair afgeleide grot-woning morphs ondervragen.

Verlies van pigmentatie is een kenmerk van de grot organismen en meerdere grot-woning Astyanax populaties tonen verlies van pigmentatie. Albinism in Molino en Pachón cavefish is toegewezen met behulp van QTL toewijzing aan een genomic regio met het gen, oogbeschadigingen en/of albinisme 2 (oca2), suggereren mutaties in oca2 ten grondslag liggen aan albinisme in cavefish6.

Als u wilt valideren oca2 als de oorzakelijke locus voor albinisme in Pachón grot morphs, we gebruikt CRISPR/Cas9 gene bewerken om te muteren van deze regio in oppervlakte vispopulaties. Aangezien exon 21 wordt verwijderd in Molino vis6, ontwierpen we een gRNA te richten op deze regio van het gen (figuur 2A). De genomische volgorde, met inbegrip van de volgorde van de target gRNA en de PAM (vet), is 5'-GGTCATGTGGGTCTCAGCTTTGG-3 '. Deze volgorde van de doelgroep (zonder de volgorde van de PAM) werd gebruikt voor het genereren van een gRNA voor gerichte mutagenese. Oppervlakte fokkers werden gemaakt om te paren, en de resulterende embryo's werden verzameld in het stadium van de één-cel. Één-cel fase embryo's werden ingespoten met Cas9 mRNA en gRNA-targeting oca2, en de geïnjecteerde dieren volwassenheid43zijn gefokt. De geïnjecteerde volwassenen werden gemaakt om te paren aan wild-type oppervlakte vissen, en de embryo's uit deze kruizen waren gegenotypeerde om te bepalen van de kiembaan transmissie, gebruikend inleidingen van stap 6.3.1. Wij een mutant oca2 allel sequenced en geïdentificeerd een kiem-lijn-verzonden 2 bp schrapping in oca2 (figuur 2B,C). Voor het gemak van genotypering ontwierpen we allele-specifieke primers de wild-type en mutant allelen (figuur 2D) en gegenotypeerde vis, identificeren met behulp van PCR, gevolgd door de Elektroforese van het gel (figuur 2E). We incrossed oppervlakte vissen heterozygoot voor deze oca2 mutant allel. De resulterende nakomelingen werden gepigmenteerde of albino (figuur 2F-Ik). Gepigmenteerde personen waren wild-type of heterozygoot op de oca2 locus, terwijl albino personen homozygoot mutant (figuur 2E waren). Deze gegevens geven een directe link tussen de oca2 gene locus en albinisme in A. mexicanus cavefish.

Talloze gedrag zoals slaap, voeding en stress verschillen in A. mexicanus cavefish ten opzichte van de oppervlakte soortgenoten, maar de onderliggende neuronale determinanten tussen morphs onduidelijk blijven. Geheel-hersenen calcium imaging biedt een krachtige onbevooroordeelde benadering voor de behandeling van correlaties tussen veranderde neurale activiteit en gewijzigde gedrag. We genereerden oppervlakte vissen en cavefish met een in de buurt van de alomtegenwoordige neuronale uitdrukking van de genetisch gecodeerde calcium-indicator, GCaMP6s, met behulp van reagentia in zebrafish onderzoek op grote schaal gebruikt. ELAV-achtige neuron-specific RNA-bindende eiwit 3 (elavl3) endogeen wordt uitgedrukt in nieuw gedifferentieerde neuronen in het centrale zenuwstelsel49 en in zebrafish is gebruikt om te rijden de expressie van eiwitten gedurende het grootste deel van het zenuwstelsel50. We verkregen een Tol2-constructie met ~2.8 kb zebrafish elavl3 promotor transcriptie stroomopwaarts van de genetisch gecodeerde calcium indicator GCaMP6s (een fusie van groen fluorescent proteïne [GFP], Calmoduline en M13, een peptide opeenvolging van myosin licht-keten kinase), geflankeerd aan de uiteinden van het 5' en 3' met Tol2 sites (Tol2 -elavl3:GCaMP6s-Tol2)51.

A. mexicanus oppervlakte vissen en Molino cavefish werden gefokt, en de resulterende embryo's werden coinjected in het stadium van de eencellige met 25 ng/μL van de Tol2 -elavl3:GCaMP6s-Tol2 construct en 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA (figuur 3A). Op 24 – 48 dpf, werden larven vertoond voor een voorbijgaande neuronale uitdrukking van GCaMP6s. Die ingespoten (F0) embryo's met een uiting van GCaMP6s waren verhoogd naar volwassenheid en backcrossed met wild-type volwassenen afgeleid van de dezelfde bloedlijn van oppervlakte vis of cavefish. De resulterende F1 volwassenen werden vertoond voor een stabiele uitdrukking van GCaMP6s meningsuiting en die larven werden onderhouden voor het genereren van stabiele lijnen (figuur 3B,C). Omdat elke volwassene F1 met een stabiele uitdrukking heeft waarschijnlijk geïntegreerd Tol2 -elavl3: GCaMP6s-Tol2 op verschillende genomic locaties, elk F1 is aangewezen een verschillende allel. Met deze aanpak, we hebben die zijn gegenereerd stabiele F1s voor oppervlakte vis en Molino cavefish populaties (figuur 3B,C), aldus inschakelen live calcium imaging om verschillen in neuronale activiteit bemiddelen gedragsveranderingen in de grot bloot te leggen omgeving (Figuur 3 C,D). Verder is deze benadering legt de basis voor de expressie van veel extra transgenen te karakteriseren en te manipuleren van de genfunctie in A. mexicanus.

Figure 1
Figuur 1: Morfolino knockdown van Hcrt vermindert activiteit en slaap in cavefish verhoogt. (A) vertaling-blocking morfolino doelstellingen de eerste 25 bp van de codering van de reeks, met inbegrip van de ATG start site Hcrt. (B) Hcrt morfolino oligo (MO) en besturingsprocessen. (C) uitlijning van ~ 200 eencellige eieren op agarose ei-mallen voor injectie. (D) Microinjection van 1.0 nL van injectie mengsel met fenol rode indicator voor visualisatie. De schaal bar = 0,5 mm. (E) morfolino knockdown van Hcrt vermindert de activiteit (totale afgelegde afstand) van Pachón cavefish (t = 5.021, df = 88, p < 0.0001) maar niet van oppervlakte vissen (t = 1.318, df = 88, p > 0.72). (F) Knockdown verhoogt slaap in Pachón cavefish (t = 2.694, df = 88, p < 0.05) maar heeft geen effect op het oppervlakte vissen (t = 0.17, df = 88, p > 0.99). De schaal bar = 1 mm. Foutbalken in panelen E en F duiden de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: CRISPR gen-bewerken van oca2 introduceert albinisme in oppervlakte-woning A. mexicanus. (A) Schematische voorstelling van de oca2 codering gebieden, en gids RNA (gRNA) gericht op exon 21 voor het bewerken van CRISPR-gemedieerde gen. (B) Sequencing chromatogram van wild-type Oca2 + en (C) mutant Oca2 - allelen. Het rode vak in deelvenster B geeft aan de 2 bp-reeks, die ontbreekt in de mutant Oca2 - allel afgebeeld in deelvenster C. (D) gericht CRISPR introduceert een 2 bp schrapping, ontregelen Oca2 functie. Primers zijn ontworpen voor de genotypische screening van 2 bp schrapping in F0 nakomelingen. (E) PCR en gel elektroforese van Oca2 in wild-type oppervlak vis (band grootte = 134 bp) en F0 CRISPR-geïnjecteerd nakomelingen (band grootte = 133 bp). Personen die homozygoot of heterozygoot voor het wild-type variant van Oca2 (Oca2 +) zijn gepigmenteerde, terwijl F0s homozygoot voor de 2 bp verwijdering (Oca2 -) haven albinisme. (F) Whole-body beelden van wild-type oppervlak van vis en (G) van oppervlakte vissen met CRISPR-gemedieerde albinisme. De schaal bar = 5 mm. (H en I) Magnified view van de hoofden van personen die zijn afgebeeld in deelvensters, F en G, respectievelijk. De schaal balk = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Tol2 Transgenese van pan-neuronale GCAMP6s kunt de live beeldvorming van de hersenactiviteit in A. mexicanus. (A) Tol2-gemedieerde Transgenese in A. mexicanus. Coinjection van Tol2 mRNA en Tol2 -elav3l: GCAMP6s-Tol2-plasmide integreert GCAMP6s transgenic in F0 oprichters. Backcrossing de oorspronkelijke voorraad wild-type vis levert F1 individuen met een stabiele pan-neuronale uiting van GCAMP6s. (B en C) de resulterende nakomelingen worden gescreend voor een stabiele uitdrukking met behulp van de dissectie en confocale microscopie. Stabiele TgAsty(elav3l: GCaMP6s) F1 individuen hebben vastgesteld voor zowel oppervlakte-(afgebeeld in deelvenster B) en grot-woning morphotypes (afgebeeld in deelvenster C). De schaal bar = 200 μm.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Reagens Volume of bedrag
10.0 μg van pCS-zT2TP plasmide DNA X μl
NEB CutSmart Buffer 10.0 μl
Kennisgevingen-HF enzym 2.0 μl
Nuclease-vrije H2O X μl
BSA 1,0 µl
Totaal 100 µl

Tabel 1: Beperking digest van Tol2 plasmide.

Reagens Volume of bedrag
1.0 μg gelineariseerde pCS-zT2TP plasmide DNA X μl
10 x reactie buffer 2.0 μl
2 x NTP/CAP 10.0 μl
SP6 enzym mix 2.0 μl
RNase-vrije H2O X μl
Totaal ≤20 μl

Tabel 2: In vitro synthese van Tol2 mRNA.

De naam van de instelling Waarde van de instelling
Warmte 510
Trek 55
Velocity 100
Tijd 40
Druk 500
Oprit 534

Tabel 3: Voorbeeld pipet-pulling protocol. 

Reagens Volume of bedrag
Morfolino (diepvries stock @ 4mM) 1,0 µl
Nuclease-vrije H2O of Danieau de oplossing 17.0 μl
Fenol rood 2.0 μl
Totaal 20 μl

Tabel 4: Morfolino injectie mengsel.

Reagens Volume van bedrag
gRNA (werkende eindconcentratie @ 100ng/µl) 1 μl
Cas9 mRNA (werkende eindconcentratie @ 1200ng/µl) 1 μl
RNase-vrije H2O 2 μl
Totaal 4 μl

Tabel 5: Sample CRISPR/Cas9 injectie mengsel.

Reagens Volume van bedrag
Tol2 plasmide (werkende eindconcentratie @ 25ng/µl) X μl
Tol2 mRNA (werkende eindconcentratie @ 25ng/µl) X μl
Fenol rood 1,0 µl
RNase-vrije H2O X μl
Totaal 15 µl

Tabel 6: Monster Tol2 Transgenese injectie mengsel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier, verstrekt wij een methodologie voor het manipuleren van de genfunctie met morpholinos, CRISPR/Cas9 gene bewerken en Transgenese methodologie. De rijkdom van de genetische technologie en het optimaliseren van deze systemen in zebrafish zal waarschijnlijk zorgen voor de overdracht van deze tools in A. mexicanus met gemak52. Recente bevindingen hebben gebruikt deze benaderingen in A. mexicanus, maar ze blijven onderbenutte in het onderzoek van verschillende morfologische, ontwikkelingsstoornissen en gedrags eigenschappen in dit systeem30,36,,42 , 53.

Morpholinos hebben wijd gebruikt in zebrafish onderzoek naar knockdown de expressie van genen. De aanpak is facile en resulteert in een krachtige knockdown van meningsuiting. Echter, af-target effecten geweest wijd gedocumenteerd22,53; Dus, dieren waarin morpholinos zijn ingespoten om moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor elke onverwachte fenotypen22,55. Indien mogelijk, moeten morfolino knockdown verkregen resultaten worden gevalideerd door het gebruik van andere methoden, zoals CRISPR/Cas9-gemedieerde knockout benaderingen. Terwijl morpholinos is voorzien van de krachtige knockdown van genexpressie, is morfolino-gemedieerde knockdown voorbijgaande aard. Zo is de volwassen fenotypen analyseren dus niet mogelijk bij gebruik van deze methode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese biedt directe manipulatie van specifieke genen. Verder, in tegenstelling tot morfolino-gemedieerde knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese zorgt voor de analyse van de mutant fenotypen naar volwassenheid. Om te voorkomen dat af-target effecten van CRISPR/Cas9, mutant lijnen moeten worden outcrossed meerdere generaties, en indien mogelijk, meer dan één allel moet worden verkregen en getest. De CRISPR/Cas9-systeem biedt ook de mogelijkheden voor het gebruik van gen-bewerken benaderingen te kloppen-allelen of specifieke genetische veranderingen produceren. Het systeem van CRISPR/Cas9 is in zebrafish gebruikt voor de productie van nauwkeurige integraties van exogene DNA en voor het genereren van precieze puntmutaties19,20,56,,57,58, 59. met de sequentiebepaling van het genoom cavefish, is het nu mogelijk om enkele nucleotidepolymorfisme (SNPs) of andere subtiele genetische veranderingen tussen oppervlakte vissen en cavefish populaties33te identificeren. De toepassing van CRISPR/Cas9 gene bewerken biedt de mogelijkheid om te wisselen van allelen tussen oppervlakte vissen en cavefish, of tussen verschillende populaties van cavefish, te onderzoeken van de rol van deze genetische veranderingen in verschillende ontwikkelings processen.

De Transgenese benaderingen in dit protocol omschreven bieden een eenvoudige en krachtige methode voor winst-van-functie studies en voor het genereren van hulpmiddelen om het genetisch veranderen van biologische processen. Het Tol2 systeem wordt veel gebruikt in zebrafish onderzoek, en we hebben aangetoond dat er ook krachtige in A. mexicanus. Bovendien, we toonden een transgene construct gegenereerd in zebrafish dat maakt gebruik van een zebravis promotor en endogene expressie in A. mexicanusrecapituleert. Wij hebben gevonden dat vier andere initiatiefnemers geïsoleerd van zebravis dat station weefsel-specifieke expressie zoals verwacht in A. mexicanus (gegevens niet worden weergegeven). Omdat zebrafish initiatiefnemers hun geconserveerde expressiepatronen in A. mexicanus recapituleren, suggereert dit dat veel van de genetische hulpmiddelen kunnen worden overgedragen vanuit de zebravis naar A. mexicanus zonder de behoefte aan wijziging met A. mexicanus promotoren. Met de vooruitgang in sequencing technologieën in A. mexicanus33toestaat de transgene benaderingen beschreven hier bovendien een sterke toekomst voor het onderzoek van smaakversterkers en stoffen die een rol bij de variatie tussen spelen kunnen oppervlak en grot vormen. Tot slot, de krachtige hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van biologische processen die hebben zebrafish waardevolle zijn even belangrijk in A. mexicanus60,61,62,,63. Verschillen in diverse gedrags eigenschappen, zoals slapen, voeding, stress en agressie, tussen A. mexicanus oppervlak - en grot-woning vormen zijn uitgebreid gedocumenteerd12,14,15 ,38,64, maar de onderliggende neuronale correlaten zijn niet goed wordt begrepen. Hulpprogramma's zoals Tg(elavl3:GCaMP6s) toestaat een dissectie van hoe verschillen in neuronale activiteit hersenen bestrijkende correleren met verschillen in gedrag en bieden een uniek inzicht in hoe de hersenen heeft evolutionair worden gewijzigd.

Tezamen, is A. mexicanus klaar om een toonaangevende model voor het onderzoek naar de evolutie van allerlei morfologische en gedragsmatige kenmerken. De diverse verschillen in complexe biologische processen in A. mexicanus bieden een platform voor onderzoek naar de genetische mechanismen voor trait evolution. De toepassing van tools voor het manipuleren van genfuncties kan helpen ontwikkelen van dit organisme in een model dat kan worden toegepast voor het onderzoek naar biologische ziekten gerelateerd aan oog degeneratie, neurologische afwijkingen en slapeloosheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Sunishka Thakur voor haar hulp bij genotypering en beeldvorming van de oca2 mutant vis afgebeeld in Figuur 2. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) award 1656574 naar A.C.K., NSF award, 1754321, J.K. en A.C.K. en National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. en E.R.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Tags

Genetica kwestie 146 Life sciences Life Sciences (generaal) cavefish CRISPR gene-editing Transgenese morfolino knockdown
Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin,… More

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S. R., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter