Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर

Published: April 22, 2019 doi: 10.3791/59093
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 2,3
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

हम विकासवादी मॉडल प्रणाली Astyanax mexicanusमें जीन के हेरफेर के लिए दृष्टिकोण का वर्णन । तीन विभिंन तकनीकों का वर्णन कर रहे हैं: Tol2-mediated transgenesis, जीनोम के लक्षित हेरफेर CRISPR का उपयोग कर/ इन उपकरणों से सतह और गुफा में रहने वाले रूपों के बीच अंतर के अंतर्निहित जीन की प्रत्यक्ष जांच की सुविधा होनी चाहिए ।

Abstract

गुफा जानवरों के विकासवादी तंत्र और आनुवंशिकी आंख अध: पतन, albinism, नींद की कमी, hyperphagia, और संवेदी प्रसंस्करण सहित कई जटिल लक्षण में परिवर्तन अंतर्निहित अड्डों की जांच के लिए एक संमोहक प्रणाली प्रदान करते हैं । दुनिया भर से cavefish की प्रजातियों रूपात्मक और व्यवहार अलग गुफा प्रणालियों के बीच साझा पर्यावरण के दबाव के कारण लक्षण के अभिसरण विकास प्रदर्शित करते हैं । प्रयोगशाला की स्थापना में विविध गुफा प्रजातियों का अध्ययन किया गया है । देखा और अंधा रूपों के साथ मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, जैविक और आणविक जटिल लक्षण के विकास अंतर्निहित प्रक्रियाओं में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है और अच्छी तरह से एक उभरते मॉडल प्रणाली के रूप में तैयार है । हालांकि विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के विकास को विनियमित करने वाले उम्मीदवार जीन की पहचान मेक्सिकैनस में की गई है, लेकिन व्यक्तिगत जीन के लिए एक भूमिका को मान्य करने की क्षमता सीमित कर दी गई है । Transgenesis और जीन संपादन प्रौद्योगिकी के आवेदन के लिए इस महत्वपूर्ण बाधा को दूर करने और जटिल लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने की क्षमता है । यहां, हम एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति हेरफेर के लिए एक अलग पद्धति का वर्णन । दृष्टिकोण morpholinos का उपयोग, Tol2 transgenesis, और जीन संपादन प्रणाली, सामांयतः zebrafish और अंय मछली के मॉडल में इस्तेमाल किया, एक. mexicanusमें जीन समारोह में हेरफेर शामिल हैं । इन प्रोटोकॉल समय पर प्रजनन प्रक्रियाओं के विस्तृत विवरण शामिल हैं, निषेचित अंडे का संग्रह, इंजेक्शन, और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के चयन । इन methodological दृष्टिकोण आनुवंशिक और तंत्रिका एक. mexicanusमें विविध लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देगा ।

Introduction

1 प्रजातियों के डार्विन मूलके बाद से, वैज्ञानिकों में गहन अंतर्दृष्टि प्राप्त की है कि कैसे लक्षण विकास परिभाषित पर्यावरण और पारिस्थितिक दबाव, गुफा जीवों2के लिए धंयवाद के रूप में आकार रहे हैं । मैक्सिकन tetra, ए mexicanus, है ' पैतृक ' सतह आबादी है कि मेक्सिको और दक्षिणी टेक्सास भर में नदियों निवास और कम से दूर 29 व्युत्पंन गुफा morphs की भौगोलिक दृष्टि से अलग आबादी के होते है सिएरा डेल abra inhabiting और पूर्वोत्तर मेक्सिको3के अंय क्षेत्रों । एक कई गुफा से जुड़े लक्षण एक. mexicanusमें, बदल ऑक्सीजन की खपत, depigmentation, आंखों की हानि, और बदल खिला और foraging व्यवहार सहित की पहचान की गई है4,5,6, 7,8,9. ए mexicanus एक अच्छी तरह से परिभाषित विकासवादी इतिहास, पारिस्थितिक पर्यावरण के एक विस्तृत लक्षण वर्णन के कारण अभिसरण विकास के तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रस्तुत करता है, और स्वतंत्र रूप से विकसित गुफा की उपस्थिति आबादी10,11। गुफा के कई लक्षण है कि cavefish में मौजूद हैं, आंख की हानि, नींद की कमी, वृद्धि खिला, स्कूली शिक्षा के नुकसान, कम आक्रामकता, और कम तनाव की प्रतिक्रियाएं शामिल हैं, स्वतंत्र मूल के माध्यम से कई बार विकसित किया है, अक्सर उपयोग गुफा8,12,13,14,15के बीच विभिन्न आनुवंशिक रास्ते । यह दोहराया विकास ए mexicanus प्रणाली का एक शक्तिशाली पहलू है और कैसे आनुवंशिक प्रणाली के लिए समान phenotypes उत्पंन क्षुब्ध हो सकता है के अधिक सामांय प्रश्न में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

जबकि जीन समारोह की यंत्रवादी जांच के लिए आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के आवेदन कई मछली प्रजातियों में सीमित किया गया है ( ए mexicanusसहित), zebrafish में हाल ही में अग्रिमों मछली में आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के विकास के लिए एक आधार प्रदान 16,17,18,19,20। कई उपकरण व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए zebrafish में इस्तेमाल कर रहे हैं, और इन प्रक्रियाओं के कार्यांवयन के लंबे समय मानकीकृत किया गया है । उदाहरण के लिए, एक कोशिका चरण चुनिंदा ब्लॉकों आरएनए पर morpholino oligos (MOs) के इंजेक्शन और विकास के दौरान एक संक्षिप्त अस्थाई खिड़की के लिए अनुवाद से बचाता है21,22। इसके अलावा, जीन संपादन दृष्टिकोण, जैसे संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/CRISPR-associated प्रोटीन 9 (Cas9) और ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक जैसे effector न्यूक्लेज (TALEN), परिभाषित विलोपन की पीढ़ी के लिए अनुमति या, कुछ मामलों में,19,20,23,24जीनोम में एक पुनर्संयोजन के माध्यम से निवेशन । पारजनन का उपयोग कोशिका-प्रकार विशिष्ट तरीके से स्थिर जीन व्यंजक या फलन में हेरफेर करने के लिए किया जाता है । Tol2 प्रणाली का प्रयोग ट्रांसजेनिक जानवरों को एक Tol2 डीएनए प्लाज्मिड जिसमें ट्रांसजीन25,26शामिल है Tol2 प्रणाली medaka के Tol2 transposase का इस्तेमाल करने के लिए ट्रांसजेनिक construct17 के स्थिर कोशिका जो जर्मलाइन निवेशन उत्पंन करते हैं । Tol2 पराजीनी एक प्लाज्मिड Tol2 एकीकरण साइटों और Tol2 transposase17के लिए mrna द्वारा flanked युक्त coinjecting शामिल है । इस प्रणाली के लिए zebrafish में ट्रांसजेनिक लाइनों की एक सरणी उत्पंन इस्तेमाल किया गया है और इसके उपयोग हाल ही में अतिरिक्त आपात मॉडल सिस्टम को विस्तारित, सहित चिचिल्ड, killifish, stickleback, और, और हाल ही में, मैक्सिकन cavefish27, 28,29,30।

जबकि cavefish विशेषता विकास के तंत्र elucidating के लिए एक आकर्षक जैविक प्रणाली है, एक विकासवादी मॉडल के रूप में अपनी पूरी क्षमता पूरी तरह से इस्तेमाल नहीं किया गया है । यह आंशिक रूप से एक आनुवंशिक और सेलुलर समारोह सीधे हेरफेर करने में असमर्थता के कारण किया गया है31। उम्मीदवार जीन को विनियमित जटिल लक्षण मात्रात्मक विशेषता loci (qtl) अध्ययन का उपयोग कर की पहचान की गई है, लेकिन इन उंमीदवार जीन के सत्यापन मुश्किल गया है३२,३३,३४। हाल ही में, क्षणिक पछाड़ना morpholinos का उपयोग कर, जीन संपादन crispr और talen सिस्टम का उपयोग कर, और Tol2-mediated transgenesis के उपयोग के लिए आनुवंशिक लक्षण की संख्या में अंतर्निहित आधार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है३५,३६,३७ ,३८. कार्यांवयन और इन तकनीकों के मानकीकरण के जोड़तोड़ कि आणविक और जैविक लक्षण के तंत्रिका मद जीन समारोह के हेरफेर, परिभाषित सेल आबादी के लेबल सहित, पूछताछ के लिए अनुमति देगा और फंक्शनल रिपोर्टर्स की अभिव्यक्ति । जबकि जीन या सेलुलर समारोह में हेरफेर करने के लिए इन आनुवंशिक उपकरणों के सफल कार्यांवयन आपात मॉडल प्रणालियों में प्रदर्शन किया गया है, विस्तृत प्रोटोकॉल अभी भी एक. mexicanusमें कमी कर रहे हैं ।

ए मेक्सिकैनस एक बदलते वातावरण के जवाब में विकास के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते है और उपंयास विविध लक्षण विनियमन जीन की पहचान करने का अवसर प्रस्तुत करते हैं । कई कारकों का सुझाव है कि एक. mexicanus स्थापित जीनोमिक उपकरण स्थापित आनुवंशिक मॉडल में वर्तमान में उपलब्ध है, आसानी से प्रयोगशालाओं में मछली को बनाए रखने की क्षमता सहित लागू करने के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक मॉडल है, बड़े चिंता आकार, पारदर्शिता, एक sequenced जीनोम, और परिभाषित व्यवहार३९assays हैं । यहां, हम morpholinos के उपयोग के लिए एक पद्धति का वर्णन, transgenesis, और सतह और एक. mexicanusकी गुफा आबादी में जीन संपादन । एक. mexicanus में इन उपकरणों के व्यापक आवेदन विकास, शारीरिक, और cavefish और सतह मछली के बीच व्यवहार के अंतर के विकास के अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं में एक यंत्रवादी जांच के लिए अनुमति देगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. morpholino oligo डिजाइन

नोट: ए mexicanus के लिए दृश्यों जैव प्रौद्योगिकी सूचना के राष्ट्रीय केंद्र (Ncbi) जीन और NCBI एसआरए (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) के माध्यम से उपलब्ध हैं, साथ ही साथ Ensembl जीनोम ब्राउज़र (https://www.ensembl.org) से । दोनों सतह और गुफा में रहने वाले रूपों में उपयोग के लिए एक morpholino डिजाइनिंग, यह इस स्तर पर morphs के बीच किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, तो इन आनुवंशिक क्षेत्रों morpholino के लिए लक्ष्य के रूप में बचा जा सकता है. एक morpholino लक्ष्य साइट के भीतर किसी भी बहुरूपी भिन्नता अप्रभावी बाध्यकारी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. डिजाइन ऐसे zebrafish के रूप में अंय मछली प्रणालियों, के समान है, और पहले से प्रभावी ढंग से एक. mexicanusमें काम करने के लिए दिखाया गया है21,३६,४०।

  1. अनुवाद की डिजाइन-morpholinos अवरुद्ध
    नोट: अनुवाद-morpholinos अवरुद्ध अंतर्जात शुरू साइट के लिए बाध्यकारी द्वारा ब्लॉक अनुवाद और त्रिविमी hinderance के माध्यम से mrna अनुक्रम बंधन से ट्रांसलेशनल मशीनरी बाधा.
    1. लक्ष्य जीन के कोडिंग क्षेत्र की पहचान ATG प्रारंभ साइट के साथ शुरू ।
    2. एक पाठ संपादक या प्रयोगशाला नोटबुक में अनुक्रम कॉपी-और-चिपकाने के द्वारा लक्ष्य अनुक्रम के पहले 25 आधार जोड़े रिकॉर्ड करें ।
    3. या तो ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग (जैसे, http://reverse-complement.com) या मैनुअल अनुवाद, लक्ष्य अनुक्रम के पूरक रिवर्स उत्पंन करते हैं । परिणामी रिवर्स पूरक किसी पाठ संपादक या प्रयोगशाला नोटबुक में सहेजें ।
    4. एक कंपनी है कि morpholino ओलियोन्यूक्लियोटाइड उत्पंन से रिवर्स पूरक अनुक्रम के साथ एक morpholino आदेश । कंपनियों के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  2. Splice के डिजाइन-morpholinos अवरुद्ध
    नोट: ब्याह अवरुद्ध morpholinos ब्लॉक splice और, इस प्रकार, एक परिपक्व mRNA अणु के गठन को रोकने. यह पछाड़ना के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है जब शुरू साइटों को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं, या एक और अधिक इष्टतम दृष्टिकोण जब पछाड़ना के माध्यम से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) की मांयता वांछित है । एक जेल पर कल्पना रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आरटी)-पीसीआर और आकार मतभेदों के साथ आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है कि एक्ट्रेस बहिष्करण या intron शामिल करने के लिए-यह splice अवरुद्ध morpholinos का लाभ । आरटी-पीसीआर और जेल रूपीनो प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए ।
    1. लक्ष्य जीन के प्री-एमआरएनए अनुक्रम को पहचानें । A. मेक्सिकैस जीनोम से ncbi के माध्यम से उपलब्ध जानकारी का उपयोग करें या इनट्रोन-exon सीमाएं३३का निर्धारण करने के लिए ensembl ।
    2. Intron समावेश या एक्ट्रेस बहिष्करण के लिए एक्ट्रेस-intron (ब्याह दाता) या intron-एक्ट्रेस सीमा (ब्याह स्वीकर्ता) साइटों लक्ष्य ।
      नोट: spliceosome आम तौर पर एक "गुजरात" अनुक्रम (U1 लक्ष्य) intron में 5 ' ब्याह साइट और एक "एजी" अनुक्रम में 3 ' (U2 लक्ष्य) intronic ब्याह साइट पर लक्ष्य । सामांय परिस्थितियों में, spliceosome U1 और U2 सब यूनिटों के पूर्व पर इन लक्षित साइटों बांध उचित splicing के लिए mrna अनुक्रम होने के लिए । हालांकि, अगर इन लक्ष्यों दृश्यों के या तो एक morpholino द्वारा अवरुद्ध है, spliceosome अगले उपलब्ध U1 या U2 साइट पर कदम, या तो एक intron अपवर्जन या mrna अनुक्रम में एक्ट्रेस के कारण होगा । इसमें लक्ष्य जीन की प्रकृति के आधार पर आयोजना/अनुकूलन शामिल होगा । आम तौर पर, एक आंतरिक U1 साइट अवरुद्ध अगले उपलब्ध U1 साइट के लिए ब्याह रीडायरेक्ट, एक एक्ट्रेस काटना कारण । वैकल्पिक रूप से, पहले या अंतिम ब्याह जंक्शन को अवरोधित करने के कारण कोई intron शामिल है क्योंकि कोई अंय साइट के लिए ब्याह पुनर्निर्देशित करने के लिए है । विभिंन बहिष्करणों बनाम inclusions के प्रभाव का पूर्वानुमान करने के लिए अनुक्रम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । भविष्यवाणियों संभावित framfts या समयपूर्व रोक codons संकेत कर सकते हैं, mRNA व्यवधान के लिए एक और अधिक प्रभावी लक्ष्य साइट का संकेत है ।
    3. एक बार लक्ष्य साइट की पहचान की है, एक पाठ संपादक या प्रयोगशाला पुस्तक में अपने अनुक्रम रिकॉर्ड । सुनिश्चित करें कि लक्ष्य साइट 25 आधार जोड़े (bp) लंबा है ।
    4. या तो ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग (जैसे, http://reverse-complement.com) या मैनुअल अनुवाद, लक्ष्य अनुक्रम के पूरक रिवर्स उत्पंन करते हैं । एक पाठ संपादक या प्रयोगशाला पुस्तक में अपने अनुक्रम रिकॉर्ड.
    5. एक कंपनी है कि morpholino ओलियोन्यूक्लियोटाइड उत्पंन से रिवर्स पूरक अनुक्रम के साथ एक morpholino आदेश । नमूना कंपनियों के लिए सामग्री तालिका देखें ।

2. इंजेक्शन के लिए morpholinos

नोट: कई सांद्रता या मो इंजेक्शन की मात्रा इंजेक्षन करने के लिए इष्टतम एकाग्रता स्थापित करने के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता होगी । ठेठ इंजेक्शन मात्रा 400-मो के 800 स्नातकोत्तर हैं । मॉर्डोलिनो नॉकआउट का प्रभाव 6 दिनों तक पोस्टइंजेक्शन के लिए बना रह सकता है ।

  1. शेयर morpholino प्राप्त करें । शेयर morpholino आता है lyophilized । यह बाँझ एच2ओ वांछित स्टॉक एकाग्रता (जैसे, 4 मिमी) पर उपयोग करने से पहले के साथ हाइड्रेट । का उपयोग करें जब तक-20 डिग्री सेल्सियसपर स्टोर ।

3. CRISPR gRNA डिजाइन, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, और तैयारी में

  1. CRISPR gRNA डिजाइन
    नोट: gRNAs Varshney एट अल४० और wierson एट अल.४१द्वारा प्रकाशित पहले अनुसंधान का उपयोग कर उत्पंन किया गया ।
    1. एक जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करना, ब्याज के जीन के कोडिंग क्षेत्र की पहचान । जीनोमिक अनुक्रम का प्रयोग, एक एक्ट्रेस के भीतर grna लक्ष्य अनुक्रम की पहचान GG के साथ एक 20 बीपी न्यूमोटाइड लक्ष्य अनुक्रमण शुरू करने के लिए खोज और एक पाम अनुक्रम (ngg) द्वारा पीछा किया । स्टार्ट (ATG) के बाद जीन के एक क्षेत्र को लक्षित किया जाएगा ।
      नोट: यदि 5 ' अंत में GG के साथ एक लक्ष्य अनुक्रम जीन के वांछित एक्ट्रेस में नहीं पाया जा सकता है, तो जी के एक या दोनोंको अनुक्रम के 5 ' अंत में प्रथम और द्वितीय न्यूनाभिकोटाइड के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । हालांकि, इन दो G's को oligo में शामिल किया जाना चाहिए, क्योंकि ये T7 ट्रांसक्रिप्शन के लिए आवश्यक हैं ।
    2. डिजाइन और आदेश एक जीन-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (ओलिगो ए: 5 ')-TAATACGACTCACTATA ग्nnnnnnn एनएनnnnnn nnn gttttagctagaaatagc-3 ') । जीन विशिष्ट 20 बीपी grna लक्ष्य अनुक्रम (bolded) एक T7 प्रमोटर अनुक्रम के बीच पाम अनुक्रम (लाल) और एक दूसरे ओलिनोन्यूक्लिओटाइड (नीला) के लिए अनील करने के लिए इस्तेमाल एक ओवरलैप अनुक्रम के बिना जोड़ें । अनील और बढ़ाना (चरण 3.2.1 देखें) इस oligo एक और एक दूसरे oligo (oligo बी: 5 '-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTCAGTTTAACGGACTTTTTTT-3 ') प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया gRNA टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए ।
      नोट: Oligo बी हर प्रतिक्रिया के लिए एक ही है और केवल 1x का आदेश दिया जाना चाहिए ।
  2. gRNA तैयारी और ट्रांसक्रिप्शन
    1. अनील और oligos बढ़ाना । उपज बढ़ाने के लिए gRNA बढ़ाना करने के लिए निम्न प्राइमर्स शामिल करें: 5 '-TAATACGACTसीएटीकेएसीटाटा-3 ' (T7 प्राइमर) और 5 '-GATCCGCACCGACTCGGTG-3 ' (3 ' gRNA प्राइमर) । थर्मोकोकस कोडाकारेन्सिस (कोड़) पोलीमरेज का उपयोग कर एक पीसीआर का प्रदर्शन करें ।
      नोट: oligo ए और oligo बी में दोनों प्राइमरों के लिए, 10 चक्र एक अच्छी उपज के लिए सिफारिश की है. एक विस्तृत प्रोटोकॉल Wierson एट अल.४१में पाया जा सकता है ।
    2. विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट ( सामग्री तालिकादेखें) में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग कर grna टाइप करना । यह कार्य निर्माता के ' क्लासेन एट अल.४२'द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल में संशोधनों के माध्यम से किया जाता है ।
    3. वेग, धोने, और gRNA के रूप में Klaassen एट अल.४२द्वारा वर्णित फिर से निलंबित ।
      नोट: gRNA RNase में resuspended किया जाना चाहिए-मुक्त पानी गिरावट को रोकने के लिए ।
    4. GRNA की एकाग्रता है, जो एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है रिकॉर्ड. एगरोस जेल पर 2 μL चलाकर आरएनए की गुणवत्ता का आकलन करें । Aliquot आर. ८० एन. ए. फ्रीज करने से बचने के लिए/
  3. Cas9 तैयारी और ट्रांसक्रिप्शन
    1. Cas9 mRNA को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट ( सामग्री तालिकादेखें) के रूप में पहले४३वर्णित का उपयोग कर प्रतिलिखित किया जा सकता है । Nls-Cas9-nls संस्करण४३का उपयोग करें ।
    2. GRNA की एकाग्रता रिकॉर्ड और एक agarose जेल पर 2 μL चलाकर इसकी गुणवत्ता का आकलन । Aliquot आरएनए अपघटन कि एकाधिक फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से उठता से बचने के लिए, और aliquot में-८० °C की दुकान ।

4. Tol2 constructs की तैयारी, Tol2 transposase, और transgenesis

  1. इंजेक्शन के लिए ट्रांसजीन constructs Tol2 तैयार करते हैं ।
    नोट: हम सफलतापूर्वक उपयोग किया है प्रकाशित/उपलब्ध zebrafish और medaka एक. mexicanusमें constructs । ये constructs एक. mexicanusमें पूरी तरह कार्यात्मक हैं, क्योंकि अनुक्रम समजातता के उच्च स्तर की संभावना (addgene भंडार और zebrafish सूचना नेटवर्क [zfin] के लिए उपलब्ध constructs डेटाबेस देखें) । Zebrafish प्रमोटर टुकड़े एक. mexicanus में इस्तेमाल किया जब उंमीद की ऊतकों में transgenes व्यक्त की है ।
    1. Tol2 constructs प्राप्त या एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर, वांछित ट्रांजीन, और Tol2 बाहों के साथ प्लाज्मिड उत्पंन (देखें Kwan एट अल.४४) । रसीद पर, अनुक्रम प्लाज्मिड को मान्य करने के लिए निर्माण.
    2. निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार constructs के लिए कोई midiprep निष्पादित करें । Elute में अंतिम प्लाज्मिड RNase मुक्त एच2ओ, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ एकाग्रता का निर्धारण, १००-३०० ng/μएल, और aliquot करने के लिए एकाग्रता पतला
  2. डाइजेस्ट Tol2 transposase प्लाज्मिड, और mRNA synthesize.
    1. MRNA४५Tol2 पैदा करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में Tol2 transposase प्लाज्मिड (पीसीएस-zT2TP) की एक प्रतिलिपि प्राप्त करें ।
    2. Midiprep पीसी-zT2TP निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसारनिर्माण. यह RNase मुक्त पानी या बफर की एक कम मात्रा में elute (~ ५० μL) । -20 डिग्री सेल्सियसपर aliquots स्टोर ।
    3. एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग Tol2 प्लाज्मिड डाइजेस्ट.
      1. तालिका 1का उपयोग कर परिपत्र पीसी-zT2TP प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम पर एक प्रतिबंध डाइजेस्ट प्रदर्शन ।
      2. अभिक्रिया को 2दृ५० μl अभिक्रियाओं में विभक्त करें तथा तापीय चक्रीय में रात्रि में ३७ °ब् पर अभिक्रियाओं को सेने ।
      3. अगले दिन 20 मिनट के लिए इसे ६५ डिग्री सेल्सियसतक गर्म करके एंजाइम को इनएक्टीवेट करें ।
      4. तुरंत डाइजेस्ट के बाद linearized प्लाज्मिड शुद्ध, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माताओंके दिशा निर्देशों के अनुसार. RNase मुक्त एच2ओ के 15 μl में प्लाज्मिड elute और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर उत्पाद की एकाग्रता का निर्धारण ।
      5. पचने वाले प्लाज्मिड के 1 μL और बिना खतना के प्लाज्मिड के 1 μL को १.५% एगरोस जेल में linearized प्लाज्मिड की पुष्टि करने के लिए चलाएँ.
    4. Tol2 mRNA के इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन को निष्पादित करें ।
      1. लिप्यंतरण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में linearized पीसी-zT2TP प्लाज्मिड की 1 माइक्रोग्राम का उपयोग. तालिका 2मेंबताए अनुसार निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन ( सामग्रियों की तालिकादेखें) के लिए ।
      2. निर्माताकेदिशा-निर्देशों के अनुसार थर्मल साइलर में ३७ डिग्री सेल्सियसपर सेक्यूबेट करना ।
      3. निर्माता के दिशा-निर्देशों के अनुसार तापीय चक्रक में 1-एल-३७ डी-ए----------------------।
      4. प्रतिलेखन किट प्रोटोकॉल प्रति लिथियम क्लोराइड वर्षण करते हैं । RNase मुक्त एच2ओ के ~ 20–30 ΜL में आरएनए गोली निलंबित ।
      5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके उत्पाद की एकाग्रता का निर्धारण और आरएनए गुणवत्ता रिकॉर्ड.
      6. ~ १००-३०० Ng/μl के लिए उत्पाद को पतला और यह 5-10 μl नमूनों में aliquot दोहराया फ्रीज-गल से बचने के लिए । उपयोग जब तक उंहें-८० °C पर स्टोर ।
        नोट: यह जांच करने के लिए संभव है 1–2 μl के शुद्ध Tol2 mrna स्लेप के लिए/

5. माइक्रोइंजेक्शन

  1. इंजेक्शन के लिए सामांय उपकरण की तैयारी
    नोट: इस खंड में प्रक्रियाओं Kowalko एट अल.४६द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया है, और मामूली संशोधनों के साथ एक सिंहावलोकन यहां प्रस्तुत किया है ।
    1. एक १०० मिलीलीटर पेट्री डिश में मछली प्रणाली के पानी में भंग गर्म 3% agarose गिरने से इंजेक्शन प्लेटें उत्पंन करते हैं । ध्यान से ताजा डाला agarose में एक अंडा इंजेक्शन मोल्ड जगह मछली अंडे के लिए कुओं बनाने के लिए । एक ४५° कोण पर आगर में मोल्ड के पक्ष प्लेस और, तो, धीरे से यह agarose में कम; धीरे से एक कोण पर मोल्ड कम हवा से बचा जाता है मोल्ड के नीचे फंस रही है । धीरे से मोल्ड को दूर एक बार agarose जम रहा है । प्लेटों को 1 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियसपर संग्रहित, सील किया जा सकता है ।
    2. निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार इलेक्ट्रोड/सुई खींचने में इंजेक्शन के लिए बोरोसिलिकेट कांच केशिकाओं से सुई खींचें. इस प्रोटोकॉल के प्रति पिपेट डांड़ी भिंन होगा; हालांकि, एक नमूना सुई खींच कार्यक्रम तालिका 3में पाया जा सकता है ।
      नोट: सुई अनुकूलन इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, सुई के रूप में है कि बहुत लंबे समय मोड़ होगा बजाय सफाई से अंडे घुसना ।
    3. अंडे के ट्रांसफर के लिए स्टैंडर्ड ग्लास पिपेट्स को तोड़कर लार्ज-बोर ग्लास पिपेट्स बनाएं ताकि अंडों के लिए ओपनिंग काफी बड़ी हो । एक bunsen बर्नर का उपयोग, कांच की टूटी हुई पिपेट के अंत को प्रकाश में लाने से लौ को जब तक यह चिकनी है के टूटे हुए अंत पॉलिश ।
  2. प्रजनन सेटअप
    नोट: कई अलग प्रोटोकॉल एक. mexicanusप्रजनन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, Borowsky३९देखें. प्रजनन सेटअप शुरू 1 सप्ताह इंजेक्शन से पहले ।
    1. 1 दिन, एक ही 10 गैलन टैंक में दो से तीन महिलाओं और तीन से चार पुरुषों प्लेस 24 ± 1 डिग्री सेल्सियसपर बनाए रखा ।
    2. 1 दिन-7 पर, खिलाने के लिए ~ 3x एक दिन में वृद्धि । आहार सुनिश्चित करें कि काले कीड़े और नमकीन झींगा के रूप में जीना भोजन, शामिल हैं ।
    3. 6 दिन, एक सिंगल टैंक हीटर 27 डिग्री सेल्सियसके लिए सेट जोड़ें । प्रयोगशाला टैंक तापमान भिंन हो सकते हैं; इसलिए, यह सामान्य टैंक तापमान के सापेक्ष 2–3 डिग्री सेल्सियसकी वृद्धि होगी ।
    4. 7 दिन की शाम, जो इंजेक्शन रात की शाम (zeitgeber [ZT] 9-11) है, अच्छी तरह से पानी से लथपथ स्पंज के साथ टैंकों को साफ और किसी भी अतिरिक्त भोजन या मलबे एक ठीक जाल नेट या एक साइपर का उपयोग कर हटा दें ।
    5. 7 दिन की रात, ZT15 पर सतह मछली के अंडे के लिए जांच शुरू करने और हर 15 की जांच करने के लिए जारी-30 मिनट ZT18 तक । Cavefish के लिए, ZT17 पर अंडे के लिए जांच शुरू करने और हर 15 की जांच करने के लिए जारी-30 मिनट ZT20 तक ।
      नोट: टाइंस एक 14:10 एच प्रकाश पर आधारित हैं: डार्क चक्र zeitgeber समय का उपयोग कर । प्रजनन बार अनुमान है और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं सटीक समय निर्धारित करना चाहिए रहे हैं । यह अंडे जल्द ही इकट्ठा करने के बाद वे जारी कर रहे है के लिए महत्वपूर्ण है/
  3. एकल सेल स्टेज अंडे का संग्रह
    1. जिस रात में ब्रीडिंग की संभावना होती है, हर 15–30 मिनट में टैंकों की जांच करें और टैंक के नीचे अंडों के लिए मॉनिटर कर लें । अंडे पारभासी, व्यास में लगभग 1 मिमी मापने दिखाई देते हैं ।
    2. अंडे इकट्ठा करने के लिए एक ठीक जाल मछली नेट का प्रयोग करें और उन्हें ताजा मछली प्रणाली के पानी से भरा एक गिलास कटोरा के लिए स्थानांतरण । एक माइक्रोस्कोप के तहत अंडे की जांच करने के लिए पुष्टि करते है कि अंडे एक कोशिका चरण में हैं ।
    3. ग्लास पिपेट्स का उपयोग करना, इंजेक्शन प्लेटों में एकल-कोशिका अंडे स्थानांतरित करना । इस अवस्था में कांच के पिपेट्स की आवश्यकता होती है क्योंकि अंडे प्लास्टिक से चिपक जाएंगे ।
    4. एक पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से अनुभाग ५.१ से एगारोस इंजेक्शन प्लेट के कुओं में अंडे जारी । (कमरे में तापमान पर) prewarmed की पंक्तियों को भरने के अंडे की अधिकतम संख्या के साथ इंजेक्शन प्लेट (प्रति पंक्ति 30-४०, और अप करने के लिए पांच पंक्तियों) । पूरी पंक्तियां अंडे को इंजेक्शन के दौरान हिलने से रखने में मदद करती हैं । इंजेक्शन प्लेट पर रखें अंडे को कम मात्रा में फिश सिस्टम पानी के साथ इंजेक्शन्स की परफॉर्मेंस तक हाइड्रेटेड रखे ।
  4. Pico-इंजेक्शन सेटअप और सामांय इंजेक्शन अनुकूलन दिशानिर्देश
    1. Backfill इंजेक्शन सुई का उपयोग कर या तो जेल लोड हो रहा है कि पिपेट सुझाव है कि केशिका के अंदर फिट या मानक micropipette सुझावों का उपयोग कर और अंत करने के लिए एक 2-4 μl सांस जोड़ने । सुई भर जाने के बाद, इंजेक्शन सुई से अतिरिक्त लंबाई ट्रिम करने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
    2. एक micromanipulator में घुड़सवार सुई का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन प्रदर्शन, एक picoliter microinjदखलदार से जुड़ा.
    3. ०.०३ एस के लिए इंजेक्शन समय सेट और ~ ०.० साई पर बाहर दबाव । इंजेक्शन दबाव सुइयों के बीच मामूली अंतर के साथ तदनुसार भिंन होगा, तो एक ~ १.० nL इंजेक्शन bolus प्राप्त करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करें ।
      नोट: इंजेक्शन दबाव की रेंज में अक्सर है ~ 10–30 साई.
    4. खनिज तेल में इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन बोलस का मानकीकरण और एक स्लाइड सूक्ष्ममापी के साथ बोलस आकार को मापने के लिए एक ~ 1–१.५ nL इंजेक्शन की मात्रा को प्राप्त करने के लिए । बोलस मात्रा बढ़ाने या घटाने के लिए इंजेक्शन के दबाव (psi) को समायोजित करें ।
    5. एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग कर अंडे के बहुत ऊपर से पानी ड्रा ।
      नोट: astyanax अंडे जरायु थोड़ा zebrafish अंडे से घुसना मुश्किल है । हम पाते है कि अंडे के शीर्ष के बंद पानी ड्राइंग अंडे में सुई प्रवेश की सुविधा में मदद करता है । प्लेट अनुकूलन एक ही थाली पर ~ २०० अंडे के लिए अनुमति दे सकते हैं ।
    6. Micromanipulator का उपयोग करने के लिए सुई के साथ प्रत्येक अंडा घुसना, और जर्दी में सीधे सुई । एक बार जर्दी में तैनात, इंजेक्षन बटन या इंजेक्शन पैर पेडल दबाने से अंडा सुई ।
      नोट: एक पूर्ण थाली ~ 15 मिनट के भीतर इंजेक्शन किया जा सकता है । एकल सेल चरण ~ ४० मिनट के लिए रहता है ।
  5. Morpholinos के इंजेक्शन
    नोट: विषाक्तता के कारण बिना पछाड के लिए आवश्यक morpholino की राशि जीन लक्ष्य प्रति अनुकूलित किया जा करने के लिए की आवश्यकता होगी; हालांकि, ४०० स्नातकोत्तर की एकाग्रता शुरू करने के लिए एक अच्छी जगह है ।
    1. Morpholino तैयार इतना है कि ४०० स्नातकोत्तर morpholino के प्रति अंडा इंजेक्शन दिया जाएगा । बर्फ पर morpholino पिघलना । इंजेक्शन के घोल (वांछित एकाग्रता), RNase मुक्त एच2ओ या Danieau's समाधान, और phenol लाल (अंतिम मात्रा का 10%) शामिल है । एक उदाहरण के लिए, तालिका 4देखें ।
    2. प्रति भ्रूण 1 एनएल इंजेक्षन ।
  6. CRISPR इंजेक्शन
    1. आरएनए को तैयार करें ताकि जीएनए के 25 स्नातकोत्तर और Cas9 एमआरएनए कुल के ३०० पीजी भ्रूण के प्रति इंजेक्ट किए जाएंगे । एक नमूना CRISPR/Cas9 इंजेक्शन मिश्रण के लिए, तालिका 5देखें ।
    2. भ्रूण में सीधे जीएनए/Cas9 एमआरएनए प्रति भ्रूण के 2 nL इंजेक्शन ।
  7. संक्रमण के लिए Tol2 transposase और Tol2-flanked प्लाज्मिड का इंजेक्शन
    1. बर्फ पर पिघलना पक्षाभ एमआरएनए और Tol2 प्लाज्मिड । Cas9 mRNA (25 ng/μL पर) का मिश्रण, वांछित Tol2 निर्माण (25 एनजी/μएल पर), और phenol लाल (अंतिम खंड के≤10%) rnase मुक्त पानी में । Transgenesis इंजेक्शन मिश्रण Tol2 एक नमूना के लिए, तालिका 6देखें ।
    2. MRNA की गिरावट से बचने के लिए बर्फ पर इंजेक्शन समाधान और सुई रखें । प्रति भ्रूण मात्रा में 1 nL पर सुई ।

6. पालन और स्क्रीनिंग मछली इंजेक्शन

  1. अंतःक्षिप्त मत्स्य पालन
    1. बाद अंडे इंजेक्शन हैं, तुरंत उंहें कांच के कटोरे (10 x 5 सेमी) से भरा ~ २०० मिलीलीटर मछली प्रणाली के पानी के लिए स्थानांतरण । अंडे आसानी से इंजेक्शन प्लेटों को मछली के पानी से भरे कटोरे में डुबो कर और एक पिपेट के साथ अंडे rinsed से rinsed हैं ।
    2. प्लेस ~ ५०-८० प्रति कटोरा भ्रूण इंजेक्शन और उंहें पीछे 22-24 डिग्री सेल्सियस।
    3. साफ इंजेक्शन मछली 2x प्रति दिन के साथ कटोरे को मृत भ्रूण को हटाने और परिवर्तन ~ एक दैनिक आधार पर पानी की 20% ।
    4. अतिरिक्त पालन पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल३९के अनुसार किया जाता है ।
  2. Morpholino इंजेक्शन व्यक्तियों की स्क्रीनिंग
    1. Phenotypes के लिए स्क्रीन करने के लिए एक stereomicroscope के तहत पशुओं कल्पना । Morpholinos का प्रभाव ~ 5 दिन postinjection21करने के लिए जारी रख सकते हैं ।
    2. 4 दिन पोस्टइंजेक्शन पर व्यवहार फीनोटाइप उपाय ।
  3. CRISPR indels के लिए स्क्रीनिंग
    1. डिजाइन प्राइमर्स लक्ष्य साइट के आसपास जीनोमिक डीएनए बढ़ाना । डिजाइन प्राइमरों ताकि लक्ष्य पीसीआर उत्पाद लगभग १००–१२५ बीपी है ।
      नोट: उदाहरण के लिए, oca2 locus के लिए, grna लक्ष्य साइट के आसपास के क्षेत्र को आगे प्राइमर 5 '-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3 ' और रिवर्स प्राइमर 5 '-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3 ' का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था एक पीसीआर उत्पाद लंबाई १०५ बीपी की ।
    2. इंस्टीट्यूशनल एनिमल प्रोटोकॉल के मुताबिक भ्रूण या फिन क्लिप एडल्ट फिश की कुर्बानी करें ।
    3. पीसीआर ट्यूब में भ्रूण या विच्छेदित पंख ले लीजिए और डीएनए निकालने और pcrs प्रदर्शन करते हैं । जीन-विशिष्ट प्राइमर्स के लिए नमूना पीसीआर प्रोटोकॉल एमए एट अल.३५में पाया जा सकता है ।
    4. Mutagenesis के लिए मूल्यांकन करने के लिए, 3 एच के लिए ७० V पर एक 3% एगरोस जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5 μL भागो (nonmutagenized) डीएनए एक अलग बैंड के रूप में एक पीसीआर उत्पाद में परिणाम होगा । उत्परिवर्ती डीएनए जेल पर एक स्मिरी बैंड में परिणाम होगा ।
    5. उत्परिवर्ती alleles के अनुक्रम का निर्धारण करने के लिए, टा निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआरउत्पाद क्लोन, कालोनियों उठाओ, और miniprep संस्कृतियों । अनुक्रमण के लिए परिणामी डीएनए भेजें.
    6. स्थापित करने और मछली की लाइनों को बनाए रखने के उत्परिवर्ती alleles संचारित, पार वयस्क जंगली प्रकार मछली के लिए इंजेक्शन मछली, और स्क्रीन 5-10 भ्रूण का निर्धारण करने के लिए अगर किसी भी संतान के जीन का एक उत्परिवर्ती विकल्पी कदम 6.3.1-6.3.6 ।
      नोट: एक ही एफ0 संस्थापक मछली से विभिंन उत्परिवर्तन ले जा सकते है अलग एफ1 व्यक्तियों । सुनिश्चित करें उत्परिवर्ती लाइनों के लिए युग्मविकल्पी कि फ्रेम से बाहर है उत्पादन की भविष्यवाणी उत्परिवर्तनों को प्राप्त sequenced हैं ।
    7. पीसीआर द्वारा एक उत्परिवर्ती विकल्पी ले मछली की पहचान स्मिरी बैंड परख (कदम 6.3.1-6.3.6) का उपयोग कर या विकल्पी विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों कि उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार बैंड बढ़ाना होगा डिजाइन द्वारा (चित्रा2 सी) ।
    8. एक बार जब मछली की एक रेखा स्थापित हो जाती है तो समयुग्मज उत्परिवर्ती युग्मज अप्रभावी फीनोटाइप के लिए परीक्षण करते हैं ।
  4. ट्रांसजेनिक सकारात्मक व्यक्तियों के लिए स्क्रीनिंग
    नोट: एक फ्लोरोसेंट निर्माता युक्त constructs का उपयोग ट्रांसजेनिक सकारात्मक व्यक्तियों के लिए स्क्रीनिंग को कारगर बनाने के लिए सिफारिश की है. तथापि, पारेषण के लिए स्क्रीन के लिए मानक पीसीआर स्क्रीनिंग विधियों का उपयोग किया जा सकता है ।
    1. के रूप में जल्दी 2 दिन postinjection के रूप में एफ0 मछली में ऊतक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना, एक epifluorescence विदारक गुंजाइश के साथ ।
      नोट: एफ0 में अभिव्यक्ति मोज़ेक है, और सकारात्मक व्यक्तियों अभिव्यक्ति phenotypes की एक श्रेणी हो सकती है ।
    2. F0 संस्थापक मछली के रूप में सकारात्मक व्यक्तियों रखें ।
    3. जब F0s परिपक्वता तक पहुंच, backcross एक ही जनसंख्या/प्रयोगशाला स्टॉक से व्युत्पंन nontransgenic व्यक्तियों को मछली संस्थापक । स्क्रीन F1 वंश चरण ६.२ में वर्णित के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।
      नोट: एफ1 लार्वा में अभिव्यक्ति एक समान है और एफ1 भाई बहन के बीच सामंजस्य सुनिश्चित करता है ।
    4. के बाद से Tol2 एकीकरण साइट-mediated नहीं है और एकीकरण के संस्थापकों के बीच भिंन हो सकते हैं, f1 भाई बहनों का चयन एक च0 संस्थापक और संकरण सकारात्मक-व्यक्त एफ1 भाई बहन उत्पंन करने के लिए एफ2एस । यह वंश स्थिर रेखा का आधार होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

गुफा में रहने वाले एक से अधिक आबादी एक मेक्सिकानस कम नींद और वृद्धि हुई जागना/गतिविधि उनके सतह पर रहने वाले conबारीकियों के सापेक्ष14। Hypocretin/orexin (hcrt) एक अत्यधिक संरक्षित neuropeptide है, जो जागृत करने के लिए कार्य करता है, और मानव और अन्य स्तनधारियों में नार्कोलेप्सी कारण hcrt मार्ग में aberrations४७,४८. हम पहले से दिखा दिया है कि गुफा ए mexicanus hcrt पेप्टाइड की अभिव्यक्ति बढ़ गई है, सुझाव है कि इस पेप्टाइड की वृद्धि की अभिव्यक्ति cavefish३८में नींद की हानि आबाद कर सकते हैं । Hcrt अभिव्यक्ति के मो मारकर गिरा दिया सीधे cavefish में नींद की हानि मध्यस्थता बढ़ hcrt अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Hcrt अभिव्यक्ति और नींद के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, हम एक अनुवाद-morpholino अवरुद्ध डिजाइन । मो एक एक्ट्रेस के पहले 25 बीपी लक्ष्य, atg शुरू साइट सहित (चित्रा 1a,बी) । एक नियंत्रण के रूप में, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मो नियंत्रण तले हुए (चित्र 1b) का उपयोग किया । NCBI पर ब्लास्ट एल्गोरिथ्म का उपयोग करना, हम पुष्टि की है कि वहां जीनोम (नहीं दिखाया डेटा) भर में या तो एमओ के लिए कोई बंद लक्ष्य प्रभाव कर रहे हैं । A. मेक्सिकैनस सतह मछली और pachón cavefish नस्ल और उनके अंडे एकत्र किए गए और फिर एक 1 NL में मो के ४०० स्नातकोत्तर के साथ इंजेक्शन-एक सेल चरण में मात्रा (चित्रा 1 सी,डी) । मछली के लिए उठाया गया था 4 dpf और फिर गतिविधि और सोने के व्यवहार के लिए मापा ।

गुफा ए mexicanus नियंत्रण एमओ के साथ इंजेक्शन काफी अधिक चलन गतिविधि और कम नींद का प्रदर्शन एक 24 घंटे से अधिक सतह मछली की तुलना में भी तले हुए मो के साथ इंजेक्शन (चित्रा 1e,F), का कोई प्रभाव नहीं सुझाव morpholino इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में परिणाम पहले से प्रकाशित गतिविधि के साथ संगत कर रहे हैं और प्रत्येक मोरफ़ोटाइप में नींद पैटर्न (t = ५.०२१, df = ८८, p < ०.०००१). HCRT के इंजेक्शन-MO सतह मछली में नींद पर नियंत्रण इंजेक्शन मछली की तुलना में कम प्रभाव था (टी = ०.१७, df = ८८, p > ०.९९) । इसके विपरीत, hcrt नॉकआउट via मो इंजेक्शन गुफा में रहने वाले मछली में नींद पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा । पचॉन कैफ़िश लार्वा ने चलन गतिविधि में चौगुना कमी दर्शाई, और पकॉन लार्वा के नियंत्रण की तुलना में लगभग दो गुना अधिक नींद ली (चित्र 1E,F; t = २.६९४, df = ८८, p < ०.०५) । गतिकारक गतिविधि की तुलना और मो-नॉकआउट सतह में नींद और गुफा में रहने वाली मछली तुलनीय चलन और नींद की मात्रा का पता चला (चित्र 1E, F) । ये डेटा एचसीआरटी एक्सप्रेशन और स्लीप लॉस के बीच एक सीधा संबंध प्रदान करते हैं और विकासवादी रूप से व्युत्पन्न गुफा में रहने वाले मॉर्फ में नींद की कमी के लिए जैविक तंत्र से पूछताछ करने की एक विधि प्रदान करते हैं ।

वर्णकता हानि गुफा जीवों की एक बानगी है, और कई गुफा में रहने वाले Astyanax आबादी pigmentation के नुकसान का प्रदर्शन । Molino और पचॉन cavefish में एल्बीनिज़्म एक जीनोमिक जीन, नेत्र एल्बीनिज़्म 2 (oca2) युक्त क्षेत्र के लिए qtl मानचित्रण का उपयोग कर मैप किया गया है, cavefish6में oca2 आबाद एल्बीनिज़्म में उत्परिवर्तनों का सुझाव ।

Pachón गुफा morphs में एल्बीनिज़्म के लिए प्रेरणाकारक लोकस के रूप में oca2 मान्य करने के लिए, हम सतह मछली आबादी में इस क्षेत्र के रूप बदलना करने के लिए crispr/Cas9 जीन संपादन का उपयोग किया । चूंकि एक्ट्रेस 21 molino मछली6में नष्ट कर दिया है, हम एक grna डिजाइन जीन के इस क्षेत्र को लक्षित (चित्रा 2a) । GRNA लक्ष्य अनुक्रम और पाम (bolded) सहित जीनोमिक अनुक्रम, 5 '-GGTCATGTGGCTCAGCTTTgg-3 ' है । यह लक्ष्य अनुक्रम (PAM अनुक्रम के बिना) लक्षित mutagenesis के लिए एक gRNA उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । भूतल प्रजनक को मेट बनाया गया, और परिणामस्वरूप भ्रूण को एक कोशिका अवस्था में एकत्र किया गया । एक सेल चरण भ्रूण Cas9 mRNA और gRNA के साथ इंजेक्शन थे oca2लक्ष्यीकरण, और इंजेक्शन जानवरों वयस्कता४३करने के लिए उठाए गए थे । इंजेक्शन वयस्कों जंगली प्रकार सतह मछली के लिए दोस्त बना रहे थे, और इन पार से भ्रूण को रोगाणु लाइन संचरण का निर्धारण genotyped थे, कदम 6.3.1 से प्राइमरों का उपयोग कर । हम एक उत्परिवर्ती oca2 विकल्पी sequenced और oca2 में एक रोगाणु लाइन संचारित 2 बीपी विलोपन की पहचान की (चित्र 2b,C) । Genotyping में आसानी के लिए, हम allele विशिष्ट प्राइमरों डिजाइन जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती युग्मविकल्पी (चित्रा 2 डी) और जीनोटाइप मछली की पहचान करने के लिए, जेल वैद्युतकणसंचलन के द्वारा पीछा पीसीआर का उपयोग (चित्रा 2e). हम इस oca2 उत्परिवर्ती allele के लिए सतह मछली विषमयुग्मज incrossed । परिणामस्वरूप संतति वर्णकित या ऐल्बिनो (चित्र 2F-1) थे । Pigmented व्यक्तियों oca2 locus में जंगली प्रकार या विषमयुग्मज थे, जबकि albino व्यक्तियों समयुग्मजी उत्परिवर्ती (चित्रा 2e) थे । ये डेटा oca2 जीन लोकस और एल्बीनिज़्म में ए मेक्सिकैनस cavefish के बीच एक सीधा संबंध प्रदान करते हैं ।

नींद, खिला, और तनाव के रूप में असंख्य व्यवहार में एक. mexicanus सतह conspecifics के सापेक्ष cavefish, अभी तक morphs के बीच अंतर्निहित न्यूरोनल निर्धारकों अस्पष्ट रहना । पूरे मस्तिष्क कैल्शियम इमेजिंग बदल तंत्रिका गतिविधि और संशोधित व्यवहार के बीच correlations की जांच के लिए एक शक्तिशाली निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है । हम एक के पास की सर्वव्यापी न्यूरोनल अभिव्यक्ति के साथ सतह मछली और cavefish उत्पंन आनुवंशिक रूप से एंकोडेड कैल्शियम संकेतक, GCaMP6s, अभिकर्मक व्यापक रूप से zebrafish अनुसंधान में इस्तेमाल किया का उपयोग कर । Elav की तरह ंयूरॉन-विशिष्ट आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन 3 (elavl3) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र४९ भर में नए विभेदित ंयूरॉंस में अंतर्जात व्यक्त की है और zebrafish में इस्तेमाल किया गया है तंत्रिका तंत्र५०के बहुमत भर में प्रोटीन की अभिव्यक्ति चलाओ । हम प्राप्त एक Tol2 से युक्त का निर्माण ~ २.८ kb zebrafish elavl3 प्रमोटर प्रतिलेखन के ऊपर आनुवंशिक रूप से एंकोडेड कैल्शियम संकेतक GCaMP6s (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक संलयन [gfp], calmodulin, और M13, मायोसिन से एक पेप्टाइड अनुक्रम लाइट-चेन kinase), 5 पर flanked ' और 3 ' Tol2 साइटों के साथ समाप्त होता है (Tol2-elavl3: GCaMP6s-Tol2)५१।

A. मेक्सिनस सतह मछली और मोलिनो cavefish पैदा किया गया, और परिणामस्वरूप भ्रूण एक कोशिका चरण में Tol2-elavl3के 25 एनजी/ GCaMP6s के एक क्षणिक न्यूरोनल अभिव्यक्ति के लिए 24-48 डीपीएफ में लार्वा की जांच की गई । उन इंजेक्शन (F0) GCaMP6s की अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण वयस्कता के लिए उठाए गए थे और जंगली प्रकार सतह मछली या cavefish की एक ही वंश से व्युत्पंन वयस्कों के साथ backcrossed । परिणामस्वरूप F1 वयस्कों GCaMP6s अभिव्यक्ति की एक स्थिर अभिव्यक्ति के लिए जांच की थी, और उन लार्वा को स्थिर लाइनें उत्पंन बनाए रखा गया (चित्रा 3b,सी) । क्योंकि एक स्थिर अभिव्यक्ति के साथ प्रत्येक F1 वयस्क होने की संभावना है एकीकृत Tol2-elavl3: GCaMP6s-Tol2 विभिंन जीनोमिक साइटों पर, प्रत्येक f1 एक अलग allele नामित है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम सतह मछली और molino cavefish आबादी के लिए स्थिर एफ1एस उत्पंन किया है (चित्रा 3b,सी), इस प्रकार जीना कैल्शियम इमेजिंग को सक्षम करने के लिए न्यूरोनल गतिविधि में मतभेदों को उजागर गुफा में व्यवहार में परिवर्तन मध्यस्थता पर्यावरण (चित्र 3C,D) । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण के लिए कई अतिरिक्त transgenes की अभिव्यक्ति के लिए आधार देता है और एक. mexicanus में जीन समारोह में हेरफेर ।

Figure 1
चित्रा 1: hcrt के morpholino पछाड़ना गतिविधि कम कर देता है और cavefish में नींद बढ़ जाती है । (ए) अनुवाद-morpholino अवरुद्ध एचसीआरटी कोडिंग अनुक्रम के पहले 25 बीपी लक्ष्य, atg प्रारंभ साइट सहित. (ख) एचसीआरटी मॉर्डोलिनो ओलिगो (एमओ) और नियंत्रण अनुक्रम । (ग) इंजेक्शन के लिए आगरोस अंडा molds पर ~ २०० एकल कोशिका अंडे का संरेखण । (घ) दृश्य के लिए phenol लाल संकेतक के साथ इंजेक्शन मिश्रण के १.० एनएल के microinjection । स्केल बार = ०.५ मिमी । (ङ) एचसीआरटी की मॉर्बोलिनो पछाडडाउन (कुल दूरी की कूच) पचॉन cavefish की गतिविधि (t = ५.०२१, df = ८८, p < ०.०००१) कम कर देता है, लेकिन सतह मछली की नहीं (t = १.३१८, df = ८८, p > ०.७२) । (च) Knockdown पचॉन cavefish में नींद बढ़ जाती है (t = २.६९४, df = ८८, पी < ०.०५) लेकिन सतह मछली (टी = ०.१७, df = ८८, पी > ०.९९) पर कोई प्रभाव नहीं है । स्केल बार = 1 मिमी । पैनल में त्रुटि सलाखों के ई और एफ मतलब के मानक त्रुटि निरूपित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: crispr जीन- oca2 के संपादन सतह में रहने वाले ए मेक्सिकैनस में एल्बीनिज़्म परिचय । (क) crispr-mediated जीन संपादन के लिए oca2 कोडिंग क्षेत्रों, और गाइड आरएनए (grna) को लक्षित करने के लिए एक्ट्रेस 21 लक्ष्यीकरण । (ख) जंगली प्रकार Oca2 + और (ग) उत्परिवर्ती Oca2- alleles के अनुक्रमण वर्णलेख । पैनल B में लाल बॉक्स 2 bp अनुक्रम को इंगित करता है, जो पैनल Cमें चित्रित उत्परिवर्ती Oca2- विकल्पी में अनुपलब्ध है । (घ) लक्षित CRISPR एक 2 बीपी विलोपन, Oca2 समारोह में खलल न डालें परिचय । Primers F0 वंश में 2 बीपी विलोपन की जीनप्ररूपी स्क्रीनिंग के लिए डिजाइन किए हैं । (ङ) वन्य-प्रकार सतह मछली में Oca2 की पीसीआर और जेल वैद्युत्संचलन (बैंड आकार = १३४ बीपी) और F0 crispr-इंजेक्शन वंश (बैंड आकार = १३३ बीपी) । Oca2 (Oca2 +) के जंगली प्रकार के संस्करण के लिए व्यक्तियों समयुग्मजी या विषमयुग्मज pigmented हैं, जबकि 2 बीपी विलोपन (Oca2-) बंदरगाह albinism के लिए समयुग्मजी F0s । (च) जंगली-प्रकार की सतह की मछली और (छ) सतह मछली के पूरे शरीर छवियों crispr-mediated albinism के साथ । स्केल बार = 5 mm. (ज और I) पैनलों एफ और जीमें चित्रित व्यक्तियों के सिर के आवर्धित दृश्य क्रमशः । स्केल बार = 2 मिमी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: Tol2-न्यूरोनल GCAMP6s के transgenesis एक मेक्सिकैनस में मस्तिष्क गतिविधि की लाइव इमेजिंग सक्षम बनाता है. (क) Tol2-मध्यस्थता में एक. मेक्सिकैनसमें transgenesis । Tol2 mRNA और Tol2-elav3lके coinjection: GCAMP6s-Tol2 प्लाज्मिड GCAMP6s संस्थापकों में F0 ट्रांसजीन को एकीकृत करता है । जंगली प्रकार मछली के मूल स्टॉक के लिए backcrossing GCAMP6s की एक स्थिर पैन neuronal अभिव्यक्ति के साथ F1 व्यक्तियों पैदावार । (ख और ग) जिसके परिणामस्वरूप संतति को विच्छेदन और संनाभि सूक्ष्मदर्शिकी का प्रयोग करके स्थिर अभिव्यक्ति की जांच की जाती है । स्थिर Tgasty(elav3l: GCaMP6s) F1 व्यक्तियों दोनों सतह के लिए स्थापित किया गया है-(ख पैनल में चित्रित) और गुफा में रहने वाले मोर्फोटाइप (पैनल सी में चित्रित) । स्केल बार = २०० μm ।  इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अभिकर्मक मात्रा या मात्रा
१०.० माइक्रोग्राम की pCS-zT2TP प्लाज्मिड डीएनए X μl
एनईबी CutSmart बफर १०.० μl
नोटी-एचएफ एन्जाइम २.० μl
न्यूक्लेस-फ्री एच2ओ X μl
Bsa १.० μl
कुल १०० μl

तालिका 1: Tol2 प्लाज्मिड का प्रतिबंध डाइजेस्ट ।

अभिकर्मक मात्रा या मात्रा
१.० माइक्रोग्राम linearized पीसी-zT2TP प्लाज्मिड डीएनए X μl
10x रिएक्शन बफर २.० μl
2x NTP/ १०.० μl
SP6 एंजाइम मिश्रण २.० μl
RNase-मुक्त एच2ओ X μl
कुल ≤ 20 μl

तालिका 2: Tol2 mRNA के विट्रो संश्लेषण में.

सेटिंग नाम सेटिंग मान
गर्मी ५१०
खींचना ५५
वेग १००
समय ४०
दबाव ५००
रैंप ५३४

तालिका 3: नमूना पिपेट-पुलिंग प्रोटोकॉल । 

अभिकर्मक मात्रा या मात्रा
Morpholino (फ्रीजर स्टॉक @ 4mM) १.० μl
न्यूक्लेस-फ्री एच2ओ या डैनआइयू का घोल १७.० μl
फीनॉल रक् त २.० μl
कुल 20 μl

तालिका 4: Morpholino इंजेक्शन मिश्रण ।

अभिकर्मक राशि की मात्रा
gRNA (अंतिम कार्यशील एकाग्रता @ 100ng/μl) 1 μl
Cas9 mRNA (1200ng/μl @ अंतिम कार्यशील एकाग्रता) 1 μl
RNase-मुक्त एच2ओ 2 μl
कुल 4 μl

तालिका 5: नमूना CRISPR/Cas9 इंजेक्शन मिश्रण ।

अभिकर्मक राशि की मात्रा
Tol2 प्लाज्मिड (अंतिम कार्यशील एकाग्रता @ 25ng/μl) X μl
Tol2 mRNA (25ng/μl @ अंतिम कार्यशील एकाग्रता) X μl
फीनॉल रक् त १.० μl
RNase-मुक्त एच2ओ X μl
कुल 15 μl

तालिका 6: नमूना Tol2 transgenesis इंजेक्शन मिश्रण

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ, हम morpholinos का उपयोग कर जीन समारोह में हेरफेर के लिए एक पद्धति प्रदान की, CRISPR/Cas9 जीन संपादन, और transgenesis पद्धति. आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के धन और zebrafish में इन पद्धतियों के अनुकूलन की संभावना को कम५२के साथ एक. mexicanus में इन उपकरणों के हस्तांतरण के लिए अनुमति देगा । हाल के निष्कर्षों ने एक. mexicanusमें इन तरीकों का इस्तेमाल किया है, लेकिन वे विविध morphological, विकास, और इस प्रणाली में व्यवहार लक्षण की जांच में कम उपयोग नहीं रह30,३६,४२ , ५३।

Morpholinos व्यापक रूप से जीन की अभिव्यक्ति मारकर गिरा करने के लिए zebrafish अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है । दृष्टिकोण फेसियल और अभिव्यक्ति का एक मजबूत पछाड़ना में परिणाम है । हालांकि, बंद लक्ष्य प्रभाव व्यापक रूप से प्रलेखित किया गया है22,५३; इस प्रकार, जानवरों में जो morpholinos के लिए इंजेक्शन किया गया है सावधानी से किसी भी अप्रत्याशित फीनोटाइप के लिए निगरानी की जानी चाहिए22,५५. जब संभव हो, morpholino पछाड़ना से प्राप्त परिणाम ऐसे crispr/Cas9-mediated नॉकआउट दृष्टिकोण के रूप में अंय तरीकों के उपयोग के माध्यम से मांय किया जाना चाहिए । जबकि morpholinos जीन अभिव्यक्ति के मजबूत पछाड़ना के लिए अनुमति देते हैं, morpholinos-mediated पछाडा क्षणिक है. इस प्रकार, इस विधि का उपयोग करते समय वयस्क फीनोटाइप का विश्लेषण संभव नहीं है ।

CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis विशिष्ट जीन के प्रत्यक्ष हेरफेर प्रदान करता है । इसके अलावा, morpholino-mediated पछाडा के विपरीत, crispr/Cas9 mutagenesis वयस्कता में उत्परिवर्ती फीनोटाइप के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । Crispr/Cas9 के बंद-लक्ष्य प्रभाव को रोकने के लिए, उत्परिवर्ती रेखाएँ कई पीढ़ियों को पार कर दी जानी चाहिए, और जब संभव हो, एक से अधिक विकल्पी प्राप्त और परीक्षण किया जाना चाहिए । Crispr/Cas9 प्रणाली भी जीन संपादन दृष्टिकोण के उपयोग के लिए दस्तक युग्मविकल्पी में या विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए क्षमता प्रदान करता है । Crispr/Cas9 प्रणाली बहिर्जात डीएनए के सटीक एकीकरण उत्पादन और सटीक बिंदु उत्परिवर्तन उत्पंन करने के लिए zebrafish में इस्तेमाल किया गया है19,20,५६,५७,५८, ५९. cavefish जीनोम के अनुक्रमण के साथ, अब यह संभव है की पहचान करने के लिए एकल न्यूकोटाइड बहुरूपताओं (snps) या अन्य सूक्ष्म आनुवंशिक परिवर्तन सतह मछली और cavefish आबादी के बीच३३। Crispr/Cas9 जीन संपादन के आवेदन के लिए सतह मछली और cavefish के बीच युग्मविकल्पी विनिमय का अवसर प्रदान करता है, या cavefish के विभिंन आबादी के बीच, विभिंन विकासात्मक प्रक्रियाओं में इन आनुवंशिक परिवर्तन की भूमिका की जांच करने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित transgenesis दृष्टिकोण लाभ के समारोह के अध्ययन के लिए एक सरल और शक्तिशाली तरीका प्रदान करते है और उपकरण पैदा करने के लिए जैविक प्रक्रियाओं में परिवर्तन आनुवंशिक रूप से । Tol2 प्रणाली व्यापक रूप से zebrafish अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, और हमने दिखाया है कि यह एक. mexicanusमें इसी तरह शक्तिशाली है । इसके अलावा, हम zebrafish कि एक zebrafish प्रमोटर का इस्तेमाल करता है और एक. mexicanusमें अंतर्जात अभिव्यक्ति recapitulates में उत्पंन एक ट्रांसजेनिक निर्माण का प्रदर्शन किया । हमने पाया है कि चार अंय प्रमोटरों zebrafish से अलग है कि ड्राइव ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति एक. mexicanus में उंमीद के रूप में (डेटा नहीं दिखाया गया है) । चूंकि zebrafish प्रमोटरों एक. mexicanusमें अपने संरक्षित अभिव्यक्ति पैटर्न संक्षेप, यह पता चलता है कि आनुवंशिक उपकरणों के कई सीधे zebrafish से एक के साथ संशोधन की आवश्यकता के बिना एक. mexicanus को हस्तांतरित किया जा सकता है । मेक्सिकैनस प्रोमोटर्स । इसके अलावा, एक. mexicanus३३में अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिम के साथ, ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण यहां वर्णित enhancers और प्रमोटरों कि के बीच भिन्नता में एक भूमिका निभा सकता है की जांच के लिए एक शक्तिशाली भविष्य की अनुमति होगी सतह और गुफा रूपों । अंत में, जैविक प्रक्रियाओं है कि zebrafish मूल्यवान बना दिया है की आनुवंशिक हेरफेर के लिए शक्तिशाली उपकरण एक. mexicanusमें समान रूप से महत्वपूर्ण है६०,६१,६२,६३। विभिंन व्यवहार लक्षण, जैसे नींद, खिला, तनाव, और आक्रामकता, के बीच एक. mexicanus सतह और गुफा में रहने वाले रूपों में अंतर बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है12,14,15 ,३८,६४, अभी तक अंतर्निहित न्यूरोनल संबद्ध अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । टीजी (elavl3: GCaMP6s) जैसे उपकरण, न्यूरोनल गतिविधि में मतभेद के एक विच्छेदन की अनुमति देगा मस्तिष्क व्यापक व्यवहार में मतभेदों के साथ सहसंबंधी और कैसे मस्तिष्क evolutionarily संशोधित किया जा रहा है में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

एक साथ लिया, ए mexicanus रूपात्मक और व्यवहार लक्षण की एक किस्म के विकास की जांच के लिए एक प्रमुख मॉडल बनने के लिए तैयार है । मेक्सिकैनस में जटिल जैविक प्रक्रियाओं में विविध भिन्नताएँ विशेषक विकास के आनुवंशिक तंत्रों की जांच के लिए एक मंच प्रदान करती हैं । जीन समारोह में हेरफेर के लिए उपकरणों के आवेदन एक मॉडल है कि आंख अध: पतन, neurodevelopmental असामान्यताओं, और अनिद्रा से संबंधित जैविक रोगों की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है में इस जीव को विकसित करने में मदद कर सकते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक sunishka ठाकुर जीनोटाइपिंग और इमेजिंग oca2 उत्परिवर्ती मछली में उसकी सहायता के लिए धंयवाद चित्रा 2में चित्रित । इस काम के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) पुरस्कार १६५६५७४ से A.C.K., जे और A.C.K. को NSF पुरस्कार १७५४३२१, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) पुरस्कार R21NS105071 A.C.K. और E.R.D. के लिए समर्थन किया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Tags

आनुवंशिकी मुद्दा १४६ जीवन विज्ञान जीवन विज्ञान (जनरल) cavefish CRISPR जीन संपादन transgenesis morpholino पछाडडाउन
मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin,… More

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S. R., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter