Summary
Denne artikkelen beskriver innkapsling av falcarindiol i lipid-belagt 74 nm nanopartikler. Mobilnettet opptaket av nanopartikler av menneskelige stamceller i lipid dråper overvåkes av fluorescerende og AC confocal bildebehandling. Nanopartikler fremstille av rask injeksjon metoden løsemiddel skiftende, og deres størrelse måles med dynamisk lysspredning teknikken.
Abstract
Nanopartikler er fokus for en økt interesse narkotika leveringssystemer for kreft terapi. Lipid-belagt nanopartikler er inspirert i struktur og størrelse av low-density lipoproteiner (LDLs) fordi kreftceller har økt behov for kolesterol til spredning, og dette har blitt utnyttet som en mekanisme for å levere anticancer narkotika til kreft celler. Videre, avhengig av narkotika kjemi, innkapsle stoffet kan være fordelaktig å unngå nedbrytning av stoffet i sirkulasjon i vivo. Derfor, i denne studien denne designen brukes å dikte lipid-belagt nanopartikler av anticancer narkotika falcarindiol, gir en potensiell ny levering system av falcarindiol for å stabilisere sin kjemiske struktur mot nedbrytning og forbedre sin opptak av svulster. Falcarindiol nanopartikler, ble med en phospholipid og kolesterol monolayer innkapsle renset narkotika kjernen av partikkelen, utformet. Lipid monolayer belegget består av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), kolesterol (Chol) og 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE pinne 2000) sammen med den selvlysende fargen etiketten DiI (molar prosenter av 43:50:5:2). Nanopartikler fremstille bruker rask injeksjon metoden, som er en rask og enkel teknikk for å utløse nanopartikler av god-løsningsmiddel for anti-løsemiddel exchange. Det består av en rask injeksjon av en etanol løsning som inneholder hydrogenion komponentene i en vandige fasen. Størrelsen på fluorescerende nanopartikler måles med dynamisk lysspredning (DLS) på 74,1 ± 6,7 nm. Opptaket av nanopartikler er testet i menneskelig mesenchymal stamceller (hMSCs) og fotografert fluorescens og AC confocal mikroskopi. Opptaket av nanopartikler er observert i hMSCs, noe som tyder på muligheten for slik en stabil stoffet levering system for falcarindiol.
Introduction
Lipid-belagt nanopartikler ser en økt interesse om deres funksjon som narkotika leveringssystemer for kreft terapi1. Kreft har en endret lipid-metabolsk reprogramming2 og økt behov for kolesterol å spre3. De overexpress LDLs1 og ta i mer LDLs enn normale celler, i den grad at en kreftpasient LDL teller kan selv gå ned4. LDL opptak fremmer aggressiv fenotyper5 resulterer i spredning og invasjonen i bryst kreft6. En overflod av LDL reseptorer (LDLRs) er en prognostiske indikator for metastatisk potensial7. Inspirert av LDL og dens opptak av kreftceller, en ny strategi har blitt kalt: gjøre stoffet ligne krefts mat8. Dermed disse nye hydrogenion stoffet levering design8,9,10 har blitt inspirert av kjerne - og lipid-stabilisert utformingen av den naturlige LDLs11 som en mekanisme for å levere anticancer narkotika til kreftceller. Denne passiv målretting levering system støtter ESP, spesielt, hydrofobe narkotika, som er vanligvis gitt i oral dosering form, men gir bare en liten mengde narkotika i blodet, så begrenser deres forventede effekt12. Med stealth liposomer13, en polyetylenglykol (PEG) belegg bidrar til å redusere noen immunologiske respons og utvider sirkulasjonen i blodet for optimal svulst opptak av den påståtte forbedret gjennomtrengning og oppbevaring (EPR) effekt 14 , 15. men i tillegg til, i noen tilfeller, ustabilitet i sirkulasjon og uønsket distribusjon i systemet16, noen hindringer uløst, for eksempel hvordan og i hvilken grad slik nanopartikler er tatt av celler og hva er deres intracellulær skjebne. Det er her at dette papiret adressene hydrogenion opptaket av en bestemt hydrofobe anticancer narkotika falcarindiol, med AC confocal og epifluorescence imaging teknikker.
Målet med undersøkelsen er å dikte lipid-belagt nanopartikler av falcarindiol og studere deres intracellulær opptak i hMSCs. Dermed, potensielt stabilisere administrasjonen, overvinne utfordringene som er tilknyttet leveringen og forbedre biotilgjengeligheten. Dermed vurdere en ny levering system for denne anticancer narkotika. Tidligere har falcarindiol blitt administrert muntlig via en høy konsentrasjon renset falcarindiol som en food supplement17. Det er imidlertid behovet for en mer strukturert tilnærming til å levere dette lovende stoffet. Derfor ble falcarindiol nanopartikler, med phospholipid og kolesterol innkapsle monolayer med renset stoffet utgjør kjernen i partikkelen, utformet. Rask injeksjon metoden løsemiddel skiftende, som nylig utviklet av Needham et al. 8, brukes i denne studien for å kapsle polyacetylene falcarindiol.
Metoden har tidligere blitt brukt til fabrikasjon av lipid nanopartikler å kapsle diagnostic imaging agenter18,19, samt teste molekyler (triolein)27 og narkotika (orlistat, niclosamide stearate)8 ,27,28. Det er en relativt enkel teknikk når de utføres med høyre molekyler. Den danner nanosized partikler, på grensen av deres kritisk nucleation (~ 20 nm diameter), av svært uløselig hydrofobe solutes oppløst i en polar løsemiddel. Løsemiddel utveksling gjøres ved en rask injeksjon av organisk løsningen i et overskudd av antisolvent (vanligvis en vandige fasen i en 1:9 organisk: vandig volumkontrollen)20,21.
Kompositoriske utformingen av nanopartikler gi opphav til flere fordeler. DSPC:Chol komponentene gir et svært stramt, nesten ugjennomtrengelig, biokompatible og biologisk nedbrytbart monolayer. PINNEN gir en sterically stabiliserende grensesnitt som fungerer som et skjold fra opsonization av immunsystemet, bremse noen opptak av reticuloendothelial system (lever og milt) og beskytte mot mononukleære phagocyte systemet, hindrer deres oppbevaring og nedbrytning av immunsystemet, og derfor økende opplaget pause i blod22. Dette gjør partikler å sirkulere før de extravasate på syke områder, for eksempel svulster, der det vaskulære systemet er lekk, tillater EPR-effekt å gi opphav til passiv opphopning av partikler. I tillegg gjør lipid pelsen det mulig å ha bedre kontroll over nanopartikler størrelse av kinetically overlapping kjernen på sin kritiske kjernen dimensjon27,28. Lipider indusere ulike overflateegenskaper (inkludert peptid målretting, som ennå ikke var tilgjengelig for dette prosjektet), en ren narkotika kjerne og en lav polydispersity22,27,28. Metoden som brukes for partikkel størrelse analyse er DLS, en teknikk som tillater forskere å måle størrelsen på et stort antall partikler samtidig. Imidlertid kan denne metoden bias målene til større størrelser, hvis nanopartikler ikke monodispersed23. Dette problemet vurderes med lipid pelsen også. Flere detaljer om disse grunnleggende design og måling av alle kjennetegn er gitt i andre publikasjoner27,28.
Stoffet innkapslet i nanopartikler er falcarindiol, en kosttilskudd polyacetylene finnes i planter fra Skjermplantefamilien familien. Det er en Sekundær metabolitt fra alifatisk C17polyacetylenes typen har blitt funnet for å vise helsefremmende effekter, inkludert anti-inflammatorisk aktivitet, antibakteriell effekt og cytotoksisitet mot en rekke kreftcelle linjer. Dens høy reaktivitet gjelder sin evne til å samhandle med forskjellige biomolecules, som en svært reaktive alkylating partsrepresentant mot mercapto og amino grupper24. Falcarindiol har tidligere vist seg å redusere antall neoplastic lesjoner i kolon17,25, selv om de biologiske mekanismene er fortsatt ukjent. Men er det tanken på at det fungerer sammen med biomolecules som NF-κB, COX1, COX-2, og cytokiner, hemme svulst progresjon og celle spredning prosessene, fører til arrestere celle syklusen, endoplasmatiske retikulum (ER) stress og apoptose 17,26 i kreftcellene. Falcarindiol brukes i denne studien som et eksempel anticancer narkotika pga anticancer potensial og mekanisme blir undersøkt for øyeblikket, og fordi den viser lovende anticancer effekter. Mobilnettet opptaket av nanopartikler er testet i hMSCs og avbildet med epifluorescence og AC confocal mikroskopi. Denne cellen type ble valgt på grunn av sin store størrelse, noe som gjør dem ideelle for mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hydrogenion syntese av rask løsemiddel skiftende teknikk
- Definere følgende for nanopartikler forberedelse: en blokk ovn/sample konsentrator, en desiccator, en digital dispensering system med en 1 mL glass sprøyte, en 12 mL hetteglass, en magnetisk rørestang, en magnetisk loppe (15 mm x 4,5 mm, i sylinderform med polytetrafluoroethylene [PTFE] belegg) i hetteglass og en rotatory fordamperen.
- Dispensere 2,4 mL av 250 µM falcarindiol lager oppløst i 70% EtOH vann blandingen i scintillation ampuller.
- Fordampe væske brøk, bruker du prøve konsentratoren ca 4 h, hente tørr falcarindiol.
- Sett inn scintillation ampullen i blokk varmeren; eksempel presisjonstørking leverer gass over eksemplet bruke rustfritt stål nåler, konsentrere prøven. Fordampe ved romtemperatur; ikke bruk varme.
- Når tørket, legge følgende komponenter av lipid belegget i ovennevnte scintillation ampullen: 16,3 µL 31.64 mm DSPC kloroform lagerløsning, 3,4 µL 17.82 mM DSPE pinne 2000 kloroform lager løsning, 24 µL av 25 mM kolesterol kloroform lager løsningen, og 6 µL 4 mm DiI kloroform lagerløsning. Rengjør sprøyten med kloroform etter hver komponent for å unngå kryss-kontaminering.
FORSIKTIG: Umiddelbart lukke hetteglass som inneholder lipider slik at løsemiddelet ikke fordampe og, dermed endre konsentrasjonen. Arbeid i avtrekksvifte.
Merk: Konsentrasjonen av kloroform lager løsninger kan variere, avhengig av den kjemiske leverandør eller fortynninger i laboratoriet. - Pakk ampullen med aluminiumsfolie å beskytte DiI fra lys. La prøven over natten i desiccator å fordampe kloroform.
- Oppløse desiccated eksemplet i absolutt etanol et endelig antall 1,2 mL, gir endelige konsentrasjoner av DSPC, DSPE pinne 2000, kolesterol og DiI 0.43 mM, 0.05 mM, 0,5 mM og 0.02 mM, henholdsvis. Denne løsningen representerer organisk fasen.
- Ta 12 mL hetteglass, fylle den med 9 mL renset vann og legge til magnetisk loppen i ampullen inneholder 9 mL vann. Holde ampullen på magnetisk rørestang, røring 500 RPM (figur 1).
- Fest 1 mL glass sprøyten dispensering systemet og rengjøre den med kloroform å unngå enhver kontaminering. Dette av, sakte trekker kloroform i glass sprøyten og dispensing manuelt i et avfall samler minst 10 tiems.
Advarsel: Dette må gjøres under avtrekksvifte. - Fyll sprøyten med etanol. Priming erstatter den gamle løsningsmiddel, samt fjerner eventuelle luftbobler.
Advarsel: Dette må gjøres under avtrekksvifte. - Bruker sprøyten, Sug opp 1 mL av organisk fasen.
- Legg sprøyten i hetteglass, frem til midten av 9 mL vannmerket, og holde den stødig i ampullen (som vist i figur 1).
- Injisere løsningen med den valgte hastigheten av injeksjon (833 µL/s) ved å trykke knappen dispense dispensering systemet (figur 2). Dette genererer 10 mL av 50 µM lipid-belagt nanopartikler av falcarindiol i 10% etanol inneholder vann.
Merk: Denne injeksjon hastigheten har funnet for å oppnå fineste partiklene, skaffe en smal partikkel størrelsesDistribusjon. Det er viktig å kontrollere at sprøyten er i sentrum, jevn og rett når dispensing løsningen. - Umiddelbart etter injeksjon, fjerne ampullen fra rørestang og overføre prøven til en 50 mL runde bunn kolbe (RBF).
- Fest RBF til roterende fordamperen og fordampe 1 mL organisk løsemiddel, bruker roterende fordamperen ved romtemperatur. Unngå overflødig boble dannes.
Merk: Dette trinnet vil ta ~ 5 min. - Overføre hydrogenion suspensjon fra RBF til en annen 12 mL hetteglass. Kontroller at volumet er 9 mL. Delt eksemplet i to 12 mL hetteglass (put 4,5 mL i hver).
- Legg til 0,5 mL ultrapure vann en av hetteglass og 0,5 mL 10 x fosfat-bufret saltvann (PBS) til andre ampullen. Ta ut 1 mL av hvert utvalg for partikkel størrelse måling.
2. particle størrelse analyse ved hjelp av DLS-teknikk
Merk: Størrelse mål ble utført ved hjelp av en DLS analysator som bestemmer partikkel størrelse distribusjoner. Den er utstyrt med en 100 mW-laser som opererer på en bølgelengde på 662.2 nm og med en skred photodiode detektor plassert i 90° vinkel til hendelsen vinkel. Strålen er adspredt av nanopartikler og oppdaget av photodetector.
- Slå på DLS instrumentet og angi ønsket temperatur på 20 ° C, inntil det stabiliserer.
- Angi parametere for instrumentet som følger: data anskaffet = 4 s, antall oppkjøp = 30, automatisk nivåregulering funksjonen =, og auto-demping tidsgrenser = 0.
- Fyll den plast cuvette med 1 mL av hydrogenion suspensjon og starte målingen.
- Rapportere målt størrelsen avhengig av løsemiddelet brukes (vann eller PBS).
Merk: Måling i PBS man har en omtrentlig idé av størrelsen på cellene i medium ved behandling av cellene. Cellen behandling vil bli gjort med nanopartikler oppløst i vann. - Gjenta målingene 24 timer etter syntese, etter partikkel aggregering.
3. cell treatment
- Vokse hMSCs i minimum viktig medium (MEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin, i en humified kammer på 37° C med 5% CO2.
FORSIKTIG: Arbeid i sterilt laminær strømning panseret for trinn 3.1, 3.2 og 3.3. - Frø ca 50.000 celler å få en celle tetthet ca 30% på tidligere absolutt-EtOH-steriliseres #1.5 coverslips plassert i 6-og plater. Legge til minne for å få et endelig antall 3 mL i hver brønn. Inkuber 24 h under samme vilkår som trinn 3.1. Ætt cellene 24 timer før behandling.
Merk: Det er viktig cellene er seeded minst 24 timer før hydrogenion behandling, sørge for at cellene er i en tilstrekkelig samløpet. - Uten å fjerne mediet, legger du til 3 µL hydrogenion løsningen, en siste falcarindiol konsentrasjon av 5 µM. Incubate 24 h i samme vilkår som trinn 3.1.
Merk: Nanopartikler forberedelse ble utført ved celle behandling, å unngå partikkel aggregering. - Deretter 24 h behandling, vaskes cellene 2 x med PBS, fikse dem i 4% formaldehyd i 10 min ved romtemperatur og lagre dem i PBS ved 4° C i opptil flere måneder før fotografert.
Advarsel: Dette må gjøres under avtrekksvifte.- Alternativt etter fiksering, en 4, kan 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kjernefysiske flekker utføres. For dette, etter bestemmer cellene, permeabilize dem med 0,1% Triton X-100 i 30 min, vaske dem 2 x med PBS, og stain dem med 250 µL 300 nM DAPI i 5 minutter, beskyttet mot lyset.
4. mikroskopi
-
Fluorescens mikroskopi
- Bruk widefield fluorescens mikroskop utstyrt med et elektron-multiplisert CCD kamera hente bilder. Bruk 150 x NA 1.45 oljeobjektiv og GFP LP kanalen.
-
AC confocal mikroskopi
- Hente AC confocal mikroskopi bilder, bruker 63 x NA 1.4 oljeobjektiv, en Argon laser (514 nm) for DiI og en to-fotonet laser (780 nm) for DAPI, kontrollere opptaket av nanopartikler inn i cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To forskjellige typer nanopartikler ble fabrikkert, nemlig ren falcarindiol nanopartikler og lipid-belagt falcarindiol nanopartikler. Ulike konsentrasjoner av lipider og kolesterol ble testet. Som vist i tabell 1, hadde ubestrøket nanopartikler dannet i vann og målt i PBS en diameter på 71 ± 20,3 nm med polydispersity indeks (PDI) av 0.571. Disse parametrene ble målt på en DLS analysator. De lipid-belagt nanopartikler av falcarindiol brukes i forsøkene, og så med fluorescerende fargestoff, DiI, var av samme størrelse, nemlig 74,1 ± 6,7 nm; men de ble funnet for å være relativt monodispersed og hadde en lavere PDI av 0.182, som indikerer en mindre fordeling av partikkelstørrelser, siden PDI beskriver størrelsesDistribusjon av befolkningen hydrogenion. Vanligvis er en PDI under 0,3 ønskelig når fabrikere nanopartikler farmasøytiske formål.
Etter fabrikasjon, partikkelstørrelse ble målt etter 3t og 24 h, ganger basert på forsinkelsen kreves for tillegg av nanopartikler til cellekultur. Ingen samling ble observert etter 24 timer, men dataene ikke vises i dette manuskriptet som rapporteres i en annen studie, og det anbefales å teste for partikkel stabilitet etter 24 timer. Etter å ha bekreftet størrelse stabiliteten av lipid-belagt nanopartikler, var DiI-merket, lipid-belagt nanopartikler fabrikkert av følger protokollen og eventuelt brukes for opptak studier. For hver studie, ble en frisk hydrogenion prøve utarbeidet. En skjematisk av den endelige falcarindiol nanopartikler struktur vises i Figur 3og partikkels størrelse data etter fabrikasjon er vist i tabell 1, i tillegg til målingen tatt 3t etter fabrikasjon.
Innledningsvis av nanopartikler inne cellene, ble epifluorescence mikroskopi bildene anskaffet etter 24 timer for behandling. Nanopartikler var visualisert som hvit lyse prikker, og det kan være hypotesen at nanopartikler ble plassert i celler, rundt kjernen (Figur 4A).
For å bekrefte at falcarindiol nanopartikler hadde inn cellene, AC confocal mikroskopi ble utført på hMSCs behandlet for 24 h. Confocal bekreftet bilder at nanopartikler hadde inn cellene, og et stort antall nanopartikler ble spredt i cytoplasma i hver celle (Figur 4B-D). Disse resultatene viser at nanopartikler fungere som en stabil stoffet levering system for falcarindiol.
Figur 1 : Nanopartikler forberedelse oppsett viser montering for injeksjon under omrøring27. Oppsettet består av autopipette med en 1 mL glass sprøyte fylt med 1 mL av ethanolic løsningen inneholder nanopartikler komponenter. Hetteglass inneholder 9 mL vann og magnetiske loppe er plassert på det magnetisk rørestang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk blanding av løsemidler i rask injeksjon metoden løsemiddel skiftende27. Paneler viser injeksjon av 1 mL av ethanolic fase inneholder nanopartikler komponenter med en hastighet på 833 µL/s til 9 mL vann under omrøring på 500 rpm. Rask injeksjon med kaotisk blanding av ethanolic løsningen inneholder nanopartikler komponenter (falcarindiol, DSPC, kolesterol, DSPE pinne 2000 DiI) i antisolvent (vann), leadd til dannelsen av nanopartikler. Fargen er gitt av DiI. Det kan være observert hvordan den ethanolic løsningen er blandet, raskt økende konsentrasjonen og nanopartikler er dannet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skjematisk av den endelige falcarindiol nanopartikler struktur. Hydrogenion strukturen, inkludert DSPC, DSPE pinne 2000, kolesterol, DiI og falcarindiol. De ulike komponentene skaleres etter konsentrasjonene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bilder av lipid-belagt falcarindiol nanopartikler i menneskelige stamceller. (A) Epifluorescence mikroskopi bildet av hMSCs behandles med falcarindiol nanopartikler 24 h. Følgende paneler viser AC confocal mikroskopi bilder av hMSCs behandles med falcarindiol nanopartikler for 24 h: (B) DAPI flekk av kjerner, (C) DiI nanopartikler, og (D) en overlapping av både bilder, kjerner er vist i blått og nanopartikler i rødt. Skala barer er 10 µm. nanopartikler er visualisert som hvit lyse prikker i cellen cytoplasma. Bildene viser at et stort antall nanopartikler har angitt cellene etter 24 timer med inkubering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Typen nanopartikler | Løsemiddel | Hydrogenion størrelse (nm) | Polydisperisty (nm) | Polydispersity indeks (PDI) |
| Ubestrøket Falcarindiol | Vann | 83.9 | ± 23,9 | 0.571 |
| PBS | 71 | ± 20,3 | 0.571 | |
| Lipid belagt Falcarindiol | PBS | 91,6 | ± 6,4 | 0.141 |
| PBS etter 3h | 93,5 | ± 5,7 | 0.122 | |
| Lipid belagt Falcarindiol + DiI | PBS | 74,1 | ± 6,7 | 0.182 |
Tabell 1: ulike utførelser av fabrikkerte nanopartikler. Størrelse og polydispersity indeksen for syntetisk falcarindiol nanopartikler, avhengig av hvilken løsning og hydrogenion. Falcarindiol nanopartikler med og uten en lipid strøk ble fabrikkert. Ulike konsentrasjoner av pelsen komponentene ble testet. Partikkel aggregering ble testet etter 3 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljert protokoll for fabrikasjon lipid-belagt nanopartikler for narkotika-leveranser med enkel, rask, reproduserbare og skalerbar rask injeksjon metoden av løsemiddel skiftende ble fulgt27,28 og presenteres i dette papiret, som brukt på falcarindiol. Kontroll av hastigheten av injeksjon av organisk fasen i vandige fasen og bruker belegg lipider i riktig konsentrasjoner til coat falcarindiol kjernen, kan partikkel i sub-100 nm området hente vellykket. Muligheten for indusert polydispersity på grunn av involvering av turbulente miksing for falcarindiol nedbør alene ble kontrollert av tilstedeværelsen av belegg lipider. Strukturen til disse lipid-belagt nanopartikler lignet low-density lipoproteiner med unntak av den opprinnelige 500.000 kDa ApoB100 og ekstra tilstedeværelsen av PEG-lipider steric stabilitet). Dette passivt målrettet stoffet leveringssystemet lar innkapsling av en rekke spesielt hydrofobe narkotika og diagnostiske materialer18,19, redusere immunologiske respons og øke opphopning i kreft vev16,18. Videre, avhengig av de narkotika fornedrelse reaksjonene (f.eks hydrolyse, enzymolysis), stoffet leveringssystemet beskytter stoffet fra fornedrelse under dens omløpet i vivo.
Derfor ble falcarindiol nanopartikler, med en lipid-ESP monolayer som inneholder en ren kjerne av renset stoffet, designet og fabrikkert. Lipid monolayer belegget besto av DSPC, kolesterol og DSPE-pinne 2000, med fluorescerende etiketten DiI. Fabrikasjon av partikler ble gjennomført med rask injeksjon metoden løsemiddel skiftende, som består av en rask injeksjon av en ethanolic løsning som inneholder nanopartikler komponentene i et overskudd av vandige fasen (1:9). Størrelsen på nanopartikler ble målt ved hjelp av DLS, og opptaket av nanopartikler ble undersøkt i hMSCs og fotografert fluorescens og AC confocal mikroskopi.
Ubestrøket nanopartikler kan også fås med størrelsen på 71 ± 20,3 nm. Imidlertid etter følger protokollen beskrevet ovenfor, ble nanopartikler av 74,1 nm ± 6,7 nm, med polydispersity verdier av 0.182, fabrikkert. Dermed etter endring av nanopartikler ved å legge lipid pelsen, størrelse og PDI av nanopartikler var redusert, noe som gjør dem mer egnet for stoffet levering.
Det er viktig å være svært klar over kritisk trinnene i protokollen, for eksempel viktigheten av sprøyte posisjon når injisere den organiske fasen, utarbeidelse av nanopartikler samme dag behandling å unngå aggregering og seeding cellene dagen før å sikre tilstrekkelig samløpet nivå. Alle trinnene i den første delen av protokollen kan faktisk anses kritiske de enten påvirker størrelsen på nanopartikler eller endelige konsentrasjonen av aktive forbindelsen og belegg lipider. Vurderer "konsentrasjonen" som en viktig parameter, er trinn 1,2, 1,4, 1.6, 1.15 og 1,16 avgjørende. Vurderer 'hydrogenion størrelse' som en viktig parameter er trinn 1.7, 1.11 og 1.12 avgjørende.
Fluorescens og AC confocal mikroskopi viste at nanopartikler hadde inn cellene, og et stort antall nanopartikler ble spredt i cytoplasma i hver celle. Disse resultatene tyder på at nanopartikler designet i denne studien kan fungere som en ny og stabil stoffet levering system for falcarindiol.
Denne teknikken gir en enkel, rask og reproduserbar tilnærming for å kapsle inn ulike kreft narkotika, og begrensningene for metoden vurderes med lipid pelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Moustapha Kassem (universitetssykehus i Odense, Danmark) for de menneskelige stamcellene. Forfatterne takker dansk medisinsk Bioimaging senter for tilgang til sine mikroskoper. Forfatterne takker Carlsberg og Villum grunnlaget for økonomisk støtte (til E.A.C.). Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra Niels Bohr professorat prisen fra dansk National Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
References
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).
- Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228 (2017).
- Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).
- Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
- dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).
- Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).
- Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).
- Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
- Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).
- Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).
- Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).
- Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).
- Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).
- Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).
- Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).
- Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
- Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
- Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. , (2018).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).
- Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).
- Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).
- Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).
- Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
- Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
- Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). , (2018).
- Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , Stockholm, Sweden. (2017).
