Summary
Denne artikel beskriver indkapsling af falcarindiol i lipid-belagt 74 nm nanopartikler. Den cellulære optagelse af nanopartikler af humane stamceller i lipid dråber er overvåget af fluorescerende og konfokal billeddannelse. Nanopartikler er fremstillet ved hurtig injektion metode af opløsningsmiddel skiftende, og deres størrelse måles med dynamisk lysspredning teknik.
Abstract
Nanopartikler er fokus på øget interesse for drug delivery systemer for kræftbehandling. Lipid-belagt nanopartikler er inspireret i struktur og størrelse af low-density lipoprotein (LDLs) fordi kræftceller har et øget behov for kolesterol at formere sig, og dette er blevet udnyttet som en mekanisme til at levere anticancermedicin til kræft celler. Desuden, afhængig af narkotika kemi, indkapsling stoffet kan være fordelagtigt at undgå nedbrydning af stoffet under omsætning in vivo. Derfor, i denne undersøgelse, dette design er brugt til at fabrikere lipid-belagt nanopartikler af anticancer narkotika falcarindiol, giver en potentiel ny levering system af falcarindiol for at stabilisere sin kemiske struktur mod nedbrydning og forbedre sin optagelse af tumorer. Falcarindiol nanopartikler, blev med en phospholipid og kolesterol éncellelag indkapsling renset drug kernen af partiklen, designet. Lipid éncellelag belægning består af 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), kolesterol (Chol) og 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PIND 2000) sammen med fluorescerende Label DiI (molære forhold af 43:50:5:2). Nanopartikler er fremstillet ved hjælp af hurtig injektion metode, som er en hurtig og enkel teknik til at udfælde nanopartikler af god solvens til anti-opløsningsmiddel exchange. Det består af en hurtig injektion af en ethanol opløsning indeholdende nanopartikler komponenter i en vandig fase. Størrelsen af de fluorescerende nanopartikler er målt ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) på 74.1 ± 6.7 nm. Udbredelse af nanopartikler er afprøvet i humane mesenkymale stamceller (hMSCs) og afbildet ved hjælp af fluorescens og konfokal mikroskopi. Optagelsen af nanopartikler er observeret i hMSCs, hvilket tyder på muligheden for sådanne en stabil drug delivery system for falcarindiol.
Introduction
Lipid-belagt nanopartikler ser en øget interesse med hensyn til deres funktion som lægemiddel levering systemer for kræft behandling1. Kræftformer har en ændret lipid-metaboliske omprogrammering2 og et øget behov for kolesterol at formere sig3. De overexpress LDLs1 og tage mere LDLs end normale celler, at en kræftpatient LDL count kan endda gå ned4. LDL optagelse fremmer aggressiv fænotyper5 medfører spredning og invasion i bryst kræft6. En overflod af LDL-receptorer (LDLRs) er en prognostiske indikator for metastatisk potentielle7. Inspireret af LDL og dens optagelse af kræftceller, en ny strategi er blevet kaldt: gøre stoffet ligner den kræft fødevarer8. Således, disse nye nanopartikel drug levering design8,9,10 har været inspireret af den kerne - og lipid-stabiliseret design af den naturlige disse11 som en mekanisme til at levere anticancermedicin at kræftceller. Denne passiv målretning levering system understøtter indkapsling af, især, hydrofobe narkotika, som er normalt gives i oral doseringsform, men giver kun en lille mængde af narkotika til blodbanen, så begrænser deres forventet effekt12. Som med stealth Liposomer13, en polyethylenglycol (PEG) belægning hjælper med at reducere enhver immunologiske reaktion og udvider omsætning i blodbanen for optimal tumor optagelsen af den påståede forbedret gennemtrængning og tilbageholdelse af (EPR) 14 , 15. dog ud over, i nogle tilfælde, ustabilitet i omløb og uønskede udbredelse i system16, nogle hindringer forblive uløst, såsom hvordan og i hvilket omfang sådanne nanopartikler er taget af celler og hvad er deres intracellulære skæbne. Det er her, at denne hvidbog omhandler nanopartikel udbredelsen af en bestemt hydrofobe anticancer lægemiddel falcarindiol, ved hjælp af Konfokal og epifluorescensmikroskop imaging teknikker.
Formålet med undersøgelsen er at fabrikere lipid-belagt nanopartikler af falcarindiol og studere deres intracellulære optagelse i hMSCs. Dermed, potentielt stabilisere sin administration, at overvinde udfordringerne forbundet med leveringen, og forbedre biotilgængelighed. Dermed vurderer en ny levering system for denne anticancer narkotika. Tidligere har falcarindiol været administreres oralt via en høj koncentration renset falcarindiol som en fødevare supplement17. Der er imidlertid behov for en mere struktureret tilgang til at levere denne lovende stof. Derfor, falcarindiol nanopartikler, med en phospholipid og kolesterol indkapsling éncellelag med renset stoffet der udgør kernen i partiklen, blev designet. Metoden hurtig injektion af opløsningsmiddel shifting, som for nylig udviklet af Needham et al. 8, der bruges i denne undersøgelse for at indkapsle polyacetylene falcarindiol.
Metoden har tidligere været anvendt til fabrikation af lipid nanopartikler til indkapsle diagnostic imaging agenter18,19, samt teste molekyler (triolein)27 og narkotika (orlistat, niclosamide stearat)8 ,27,28. Det er en forholdsvis enkel teknik når de udføres med de rigtige molekyler. Det danner nanosized partikler, på grænsen af deres kritiske Nukleering (~ 20 nm diameter), af meget tungtopløseligt hydrofobe opløste stoffer opløses i et polært opløsningsmiddel. Opløsningsmiddel udveksling opnås ved en hurtig injektion af den økologiske løsning i et overskud af antisolvent (normalt en vandig fase i en 1:9 økologisk: vandig volumen ratio)20,21.
Den kompositoriske udformning af nanopartikler giver anledning til flere fordele. DSPC:Chol komponenter giver en meget stram, næsten uigennemtrængelige, biokompatible og biologisk nedbrydelige éncellelag. STANGEN giver en sterically stabiliserende interface, der fungerer som et skjold fra hjælp af immunsystemet, bremse enhver optagelse af Retikuloendoteliale system (leveren og milten) og beskyttelse mod mononukleære phagocyt system, at forhindre deres fastholdelse og nedbrydning af immunsystemet, og dermed øge deres omsætning halvleg i blod22. Dette tillader partikler at cirkulere indtil de extravasate på syge sites, såsom tumorer, hvor det vaskulære system er utæt, så EPR-effekt til at give anledning til passiv ophobning af partikler. Derudover tillader lipid pelsen sig at have bedre kontrol over nanopartikler størrelse af kinetically diffusering core på sin kritiske kernen dimension27,28. Lipider fremkalde forskellige overflade egenskaber (herunder peptid målretning, der endnu ikke var tilgængelig for dette projekt), en ren narkotika kerne og en lav polydispersity22,27,28. Metoden anvendes til partikel størrelse analyse er DLS, en teknik, der gør det muligt for forskere at måle størrelsen af et stort antal partikler på samme tid. Denne metode kan dog bias målinger til større størrelser, hvis nanopartikler ikke er monodispersed23. Dette spørgsmål er vurderet med lipid pels så godt. Flere oplysninger om disse grundlæggende design og kvantificering af alle karakteristika gives i andre publikationer27,28.
Stoffet er indkapslet i nanopartikler er falcarindiol, en kosten polyacetylene fundet i planter fra familien Apiaceae. Det er en sekundær metabolit fra den alifatiske C17polyacetylener type, der er blevet fundet for at vise sundhedsfremmende effekter, herunder anti-inflammatorisk aktivitet, antibakterielle effekter og cytotoksicitet mod en bred vifte af kræft cellelinjer. Dens høje reaktivitet er relateret til dets evne til at interagere med forskellige biomolekyler, som en meget reaktive alkylating befuldmægtiget mod mercapto og amino grupper24. Falcarindiol har tidligere vist sig at reducere antallet af neoplastiske læsioner i kolon17,25, selv om de biologiske mekanismer er stadig ukendt. Men det er tanken om, at det interagerer med biomolekyler såsom NF-κB, COX1, COX-2, og cytokiner, hæmme deres tumor progression og celle spredning processer, fører til at arrestere cellecyklus, endoplasmatiske reticulum (ER) stress og apoptose 17,26 i kræftceller. Falcarindiol anvendes i denne undersøgelse, som et eksempel anticancer narkotika på grund af sine kræft potentiale og mekanisme studeres i øjeblikket, og fordi det viser lovende anticancer effekter. Den cellulære optagelse af nanopartikler er testet i hMSCs og afbildet ved hjælp af epifluorescensmikroskop og konfokal mikroskopi. Denne celletype blev valgt på grund af dens store størrelse, hvilket gør dem ideelle til mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanopartikel syntese af hurtige opløsningsmiddel shifting teknik
- Oprettet følgende for nanopartikler forberedelse: en blok varmelegeme/prøve koncentrator, en ekssikkator, en digital udlevering system med en 1 mL glas sprøjte, en 12 mL hætteglas, magnetomrører, et magnetisk loppe (15 mm x 4,5 mm, i en cylindrisk figur med polytetrafluorethylen [PTFE] belægning) inde i hætteglasset og en rotatorisk fordamper.
- Dispensere 2,4 mL 250 µM falcarindiol stock opløst i 70% EtOH vandblanding i en scintillation hætteglas.
- Fordampe den flydende fraktion, ved hjælp af prøven koncentrator for ca 4 timer, at få tørre falcarindiol.
- Indsæt scintillation hætteglasset i blok varmelegeme; prøven koncentrator leverer gas over prøven ved hjælp af rustfrit stål nåle, koncentrerer sig prøven. Fordampe ved stuetemperatur; Brug ikke varme.
- Når tørret, tilføje lipid belægning i ovennævnte scintillation hætteglas følgende komponenter: 16,3 µL af 31.64 mM DSPC chloroform stamopløsning, 3,4 µL af 17.82 mM DSPE PIND 2000 chloroform stamopløsning, 24 µL af 25 mM kolesterol chloroform lager løsning, og 6 µL af 4 mM DiI chloroform stamopløsning. Ren sprøjte med chloroform efter tilføjer hver komponent for at undgå krydskontaminering.
Forsigtig: Luk straks hætteglas indeholdende lipider, således at opløsningsmidlet ikke fordampe og dermed ændre koncentrationen. Arbejde i et stinkskab.
Bemærk: Koncentrationer af chloroform stamopløsninger kan variere, afhængigt af den kemiske leverandør eller fortyndinger i laboratoriet. - Wrap hætteglas med aluminiumsfolie at beskytte DiI fra lys. Lad prøven natten i ekssikkator til at fordampe chloroform.
- Opløse udtørret prøven i absolut ethanol til en afsluttende bind 1,2 ml, hvilket giver endelige koncentrationer af DSPC, DSPE PIND 2000, kolesterol og DiI 0,43 mM, 0,05 mM, 0,5 mM og 0,02 mM, henholdsvis. Denne løsning er den organiske fase.
- Tage 12 mL hætteglas, fylde den med 9 mL renset vand, og sammenlægge den magnetiske loppe i hætteglas indeholdende 9 mL vand. Holde hætteglasset på magnetomrører, omrøring på 500 rpm (figur 1).
- Tillægger den udlevering system 1 mL glas sprøjte og rense det med chloroform at undgå kontaminering. Dette af, langsomt trække chloroform i glas sprøjte og udlevering manuelt til en indsamler mindst 10 tiems.
Forsigtig: Dette skal ske i et stinkskab. - Prime sprøjte med ethanol. Priming erstatter den gamle opløsningsmiddel, som fjerner eventuelle luftbobler.
Forsigtig: Dette skal ske i et stinkskab. - Ved hjælp af sprøjten, Aspirér 1 mL af den organiske fase.
- Indsætter hætteglasset, op til midten af vandmærket 9 mL sprøjten og vedligeholde det støt midt i hætteglasset (som vist i figur 1).
- Injicere løsning på den valgte hastighed af injektion (833 µL/s) ved at trykke på knappen dispensere på udlevering system (figur 2). Dette genererer 10 mL 50 µM lipid-belagt nanopartikler af falcarindiol i 10% ethanol-holdige vand.
Bemærk: Denne injektion hastighed er blevet fundet for at opnå de fineste partikler, at opnå en smal partikelstørrelsesfordeling. Det er afgørende for at sikre, at sprøjten er i centrum, stabil og lige når udlevering løsningen. - Umiddelbart efter injektionen, fjerne hætteglasset fra omrøreren og overføre prøven til en 50 mL runde-bunden kolbe (RBF).
- Tillægger rotationsinddamperen RBF og fordampe 1 mL af den organiske opløsningsmidler, ved hjælp af en roterende fordamper ved stuetemperatur. Undgå overskydende boble dannelse.
Bemærk: Dette trin vil tage ~ 5 min. - Overføre nanopartikel suspension fra RBF til en anden 12 mL hætteglas. Sikre, at lydstyrken er 9 mL. Split prøven i to 12 mL hætteglas (Læg 4,5 mL i hver).
- Tilføje 0,5 mL i ultrarent vand til en af hætteglassene og 0,5 mL 10 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til andre hætteglasset. Tage ud 1 mL af hver prøve for partikel størrelse måling.
2. partikel størrelse analyse ved hjælp af DLS teknik
Bemærk: Størrelse målinger blev udført ved hjælp af en DLS analyzer, som bestemmer partikel størrelse distributioner. Det er udstyret med en 100 mW laser, der opererer ved en bølgelængde på 662.2 nm og med en lavine fotodiode detektor placeres på en 90° vinkel ud til den hændelse vinkel. Bjælken er spredt af nanopartikler og opdaget af fotodetektor.
- Tænd DLS instrument og indstille den ønskede temperatur på 20 ° C, indtil det stabiliserer.
- Angive parametrene instrument som følger: data erhvervelse tid = 4 s, antallet af erhvervelser = 30, auto-dæmpning funktion = On, og frister auto-dæmpning = 0.
- Fyld den plast kuvette med 1 mL af nanopartikel suspension og start måling.
- Rapporter den målte størrelse afhængigt af opløsningsmidlet anvendes (vand eller PBS).
Bemærk: Måling i PBS er lavet til har en omtrentlig idé om størrelsen på cellerne i mediet, ved behandling af cellerne. Celle behandling vil ske med nanopartikler opløst i vand. - Gentage målinger 24 h efter syntese, at kontrollere for partikel sammenlægning.
3. celle behandling
- Vokse hMSCs i minimum afgørende medium (MEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin, i en humified kammer ved 37° C med 5% CO2.
Forsigtig: Arbejde i den sterile Laminar Flow Hood for trin 3.1, 3.2 og 3.3. - Frø ca 50.000 celler til at opnå en celle massefylde på ca 30% af tidligere absolutte-EtOH-steriliseret #1.5 coverslips placeret i 6-godt plader. Tilføje MEM for at have en endelige mængden af 3 mL i hver brønd. Der inkuberes i 24 timer under de samme betingelser som i trin 3.1. Frø celler 24 timer før behandling.
Bemærk: Det er kritisk cellerne udsås mindst 24 timer før nanopartikel behandling, for at sikre at cellerne er i en passende sammenløb. - Uden at fjerne mediet, tilføje 3 µL af nanopartikel løsningen, for en afsluttende falcarindiol koncentration på 5 µM. Incubate for 24 h under samme betingelser som i trin 3.1.
Bemærk: Nanopartikler forberedelse blev udført dag i celle behandling, at undgå partikel sammenlægning. - Efterfølgende, efter 24 timer behandling, vaske celler 2 x med PBS, ordne dem i 4% formaldehyd i 10 min. ved stuetemperatur, og gemme dem i PBS ved 4° C i op til flere måneder, indtil afbildet.
Forsigtig: Dette skal ske i et stinkskab.- Alternativt, efter fiksering, en 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nukleare farvning kan udføres. For dette, efter om fastsættelse af cellerne, permeabilize dem med 0,1% Triton X-100 for 30 min, vaske dem 2 x med PBS, og bejdse dem med 250 µL af 300 nM DAPI i 5 minutter, beskyttet mod lys.
4. mikroskopi
-
Fluorescens mikroskopi
- Brug en widefield fluorescens mikroskop udstyret med en elektron-ganges CCD kamera til at erhverve billeder. Bruge 150 x NA 1,45 olieobjektiv og normal god landbrugspraksis LP-kanal.
-
Konfokal mikroskopi
- Erhverve konfokalmikroskopi billeder, ved hjælp af 63 x NA 1.4 olieobjektiv, en Argon laser (514 nm) for DiI og en to-foton laser (780 nm) for DAPI, til at kontrollere udnyttelsen af nanopartikler ind i cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To forskellige typer af nanopartikler var opdigtet, nemlig ren falcarindiol nanopartikler og lipid-belagt falcarindiol nanopartikler. Forskellige koncentrationer af lipider og kolesterol blev testet. Som vist i tabel 1, havde ubestrøget nanopartikler dannet i vand og målt i PBS en diameter på 71 ± 20,3 nm med en polydispersity indeks (PDI) af 0.571. Disse parametre blev målt på en DLS analyzer. De lipid-belagt nanopartikler af falcarindiol anvendt i forsøgene, og herunder den fluorescerende farvestof, DiI, var af samme størrelse, nemlig 74,1 ± 6.7 nm; men de blev anset for at være relativt monodispersed og havde en lavere PDI af 0.182, som indikerer en mindre fordeling af partikelstørrelser, da PDI beskriver størrelse fordeling af befolkningens nanopartikel. Generelt ønskes et PDI under 0,3 når opdigte nanopartikler til farmaceutiske formål.
Efter fabrikation, partikelstørrelsen blev målt efter 3 timer og 24 h, gange baseret på forsinkelsen kræves for tilsætning af nanopartikler til cellekultur. Ingen akkumulering blev observeret efter 24 timer, men data ikke er vist i dette håndskrift, som rapporteres det i en anden undersøgelse, og det anbefales at teste for partikel stabilitet efter 24 timer. Efter at have bekræftet den størrelse stabilitet af lipid-belagt nanopartikler, var DiI-mærket, lipid-belagt nanopartikler fremstillet ved at følge protokollen og i sidste ende, anvendes til optagelse undersøgelse. For hver undersøgelse, blev en frisk nanopartikel prøve udarbejdet. En skematisk af endelige falcarindiol nanopartikler struktur er vist i figur 3, og den partikel størrelse data efter fabrikation er vist i tabel 1, samt måling tages 3 h efter fabrikation.
Som en første observation af nanopartikler inde i cellerne, blev epifluorescensmikroskop mikroskopi billeder erhvervet efter 24 timer behandling. Nanopartikler blev visualiseret som hvide lyse prikker, og det kunne være en hypotese, at nanopartikler var placeret inde i cellerne omkring kernen (figur 4A).
For at kontrollere, at falcarindiol nanopartikler havde indtastet cellerne, konfokalmikroskopi blev udført på hMSCs behandlet for 24 h. Confocal bekræftet billeder at nanopartikler havde indtastet i celler, og et stort antal af nanopartikler blev spredt i cytoplasma i hver celle (fig. 4B-D). Disse resultater viser, at nanopartikler fungere som en stabil drug delivery system for falcarindiol.
Figur 1 : Nanopartikler forberedelse setup viser forsamling injektionsvæske under omrøring27. Opsætningen består af en autopipette med en 1 mL glas sprøjte fyldt med 1 mL af opløsningen ethanoliske indeholdende nanopartikler komponenter. Hætteglasset indeholder 9 mL vand og den magnetiske loppe er placeret på magnetomrøreren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk af en blanding af opløsningsmidler i metoden hurtig injektion af opløsningsmiddel shifting27. Paneler viser injektion af 1 mL af ethanoliske fase indeholdende nanopartikler komponenter med en hastighed på 833 µL/s til 9 mL vand under omrøring på 500 rpm. Den hurtige injektion med kaotiske blanding af de ethanoliske løsning indeholdende nanopartikler komponenter (falcarindiol, DSPC, kolesterol, DSPE PIND 2000, DiI) i antisolvent (vand), leadd til dannelsen af nanopartikler. Farven er givet af DiI. Det kan ses, hvordan de ethanoliske løsning er blandet, hastigt stigende koncentration og nanopartikler er dannet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skematisk af endelige falcarindiol nanopartikler struktur. Nanopartikel struktur, herunder DSPC, DSPE PIND 2000, kolesterol, DiI og falcarindiol. De forskellige komponenter er skaleret efter deres koncentrationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Billeder af lipid-belagt falcarindiol nanopartikler i humane mesenkymale stamceller. (A) epifluorescensmikroskop mikroskopi billede af hMSCs behandles med falcarindiol nanopartikler i 24 timer. De følgende paneler viser konfokalmikroskopi billeder af hMSCs behandles med falcarindiol nanopartikler til 24 h: (B) DAPI pletten af kerner, (C) DiI nanopartikler, og (D) en overlejring af både billeder, kerner er vist med blåt og den nanopartikler i rød. Skala barer er 10 µm. nanopartikler er visualiseret som hvide lyse prikker i cellen cytoplasma. De billeder viser at et stort antal af nanopartikler har indtastet cellerne efter 24 timers inkubation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Type af nanopartikler | Opløsningsmiddel | Nanopartikel størrelse (nm) | Polydisperisty (nm) | Polydispersity indeks (PDI) |
| Ubestrøget Falcarindiol | Vand | 83,9 | ± 23,9 | 0.571 |
| PBS | 71 | ± 20,3 | 0.571 | |
| Lipid coated Falcarindiol | PBS | 91,6 | ± 6,4 | 0.141 |
| PBS efter 3h | 93,5 | ± 5,7 | 0.122 | |
| Lipid belagt Falcarindiol + DiI | PBS | 74,1 | ± 6,7 | 0.182 |
Tabel 1: forskellige udformninger af de fremstillede nanopartikler. Størrelse og polydispersity indeks af syntetiserede falcarindiol nanopartikler, afhængigt af hvilken opløsningsmiddel og nanopartikler. Falcarindiol nanopartikler med og uden en lipid frakke var opdigtet. Forskellige koncentrationer af komponenterne frakke blev testet. Partikel sammenlægning blev testet efter 3 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljeret protokol for at fabrikere lipid-belagt nanopartikler til medicinafgivelse med simpelt, hurtige, reproducerbare og skalerbar hurtig injektion metode af opløsningsmiddel shifting blev fulgt27,28 og præsenteres i dette papir, som anvendes til falcarindiol. Ved at kontrollere hastigheden på injektion af den organiske fase i vandfasen og ved hjælp af belægning lipider i passende koncentrationer til pels falcarindiol core kunne partikel i sub-100 nm rækkevidde opnås med held. Muligheden for induceret polydispersity på grund af inddragelse af turbulent blanding falcarindiol fældningen alene var kontrolleret af tilstedeværelsen af belægning lipider. Strukturen af disse lipid-belagt nanopartikler lignede low-density lipoprotein med undtagelse af udelukkelsen af de indfødte 500.000 kDa ApoB100 og ekstra tilstedeværelsen af PEG-lipider for sterisk stabilitet). Denne passivt målrettede drug delivery system giver mulighed for indkapsling af en bred vifte af især hydrofobe narkotika og diagnostiske materialer18,19, mindske den immunologiske reaktion og øge ophobning i kræft væv16,18. Desuden, afhængig af narkotika nedbrydning reaktioner (fx hydrolyse, enzymolysis), drug delivery system beskytter stoffet fra nedbrydning under sin in vivo cirkulation.
Derfor, falcarindiol nanopartikler, med en indkapsling af lipid éncellelag indeholdende en ren kerne af renset stoffet, var designet og fremstillet. Lipid éncellelag belægning bestod af DSPC, cholesterol og DSPE-PIND 2000, med fluorescerende etiketten DiI. Fabrikation af partikler blev udført ved hjælp af metoden hurtig injektion af opløsningsmiddel shifting, som består af en hurtig injektion af en ethanoliske løsning indeholdende nanopartikler komponenter i et overskud af vandig fase (1:9). Størrelsen af nanopartikler blev målt ved hjælp af DLS, og udbredelse af nanopartikler blev undersøgt i hMSCs og afbildet ved hjælp af fluorescens og konfokal mikroskopi.
Ubestrøget nanopartikler kan også fås med størrelser af 71 ± 20,3 nm. Men efter at have fulgt den protokol, der er beskrevet ovenfor, nanopartikler af 74,1 nm ± 6.7 nm, med polydispersity værdier af 0.182, blev fabrikeret. Således, efter modificerer nanopartikler ved at tilføje lipid frakke, størrelse og PDI af nanopartikler blev reduceret, gør dem mere velegnede til narkotika levering.
Det er vigtigt at være meget opmærksom på de kritiske trin i protokollen, såsom vigtigheden af positionen sprøjte når indsprøjte den organiske fase, forberedelse af nanopartikler på samme dag i behandling at undgå sammenlægning, og såning af celler dagen før at sikre passende sammenløb. Faktisk kan alle trin i den første del af protokollen betragtes kritisk, da de enten påvirker størrelsen af nanopartikler eller den endelige koncentration af det aktive stof og belægning lipider. Overvejer 'koncentration' som en vigtig parameter, er trin 1.2, 1.4, 1.6, 1,15 og 1.16 kritisk. I betragtning af 'nanopartikel størrelse' som en vigtig parameter er trin 1.7, 1.11 og 1.12 kritisk.
Fluorescens og konfokal mikroskopi viste, at nanopartikler havde indtastet i celler, og et stort antal af nanopartikler blev spredt i cytoplasma af hver celle. Disse resultater tyder på, at nanopartikler designet i denne undersøgelse kan fungere som en ny og stabil drug delivery system for falcarindiol.
Denne teknik giver en enkel, hurtig og reproducerbare tilgang for at indkapsle forskellige kræft narkotika, og begrænsninger af metoden er vurderet med lipid frakke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Danmark) for de humane mesenkymale stamceller. Forfatterne takke Dansk medicinsk Bioimaging Center for adgang til deres mikroskoper. Forfatterne takke Carlsberg og Villum grundlaget for økonomisk støtte (til E.A.C.). Forfatterne anerkende den finansielle støtte fra Niels Bohr professorat award fra Danmarks Grundforskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
References
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).
- Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228 (2017).
- Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).
- Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
- dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).
- Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).
- Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).
- Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
- Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).
- Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).
- Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).
- Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).
- Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).
- Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).
- Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).
- Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
- Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
- Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. , (2018).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).
- Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).
- Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).
- Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).
- Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
- Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
- Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). , (2018).
- Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , Stockholm, Sweden. (2017).
