Summary
מאמר זה מתאר את ומגעים falcarindiol ב מצופים השומנים חלקיקים nm 74. ספיגת הסלולר של חלקיקים באמצעות תאי גזע אנושי לתוך טיפות השומנים מנוטרת על ידי הדמיה פלורסנט, קונפוקלי. חלקיקים מיוצרים בשיטת הזרקת מהירה של הממס הסטה, הגודל שלהם נמדד עם טכניקה פיזור אור דינאמי.
Abstract
חלקיקים הם מוקד עניין מוגבר מערכות לטיפול בסרטן. חלקיקים מצופים השומנים הינם בהשראת מבנה וגודל ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLs) כי התאים הסרטניים יש צורך מוגבר כולסטרול להתרבות, זו נוצלה כמנגנון להעברת תרופות לסרטן תאים. יתר על כן, בהתאם סמים כימיה, לבצע את התרופה יכול להיות יתרון כדי למנוע השפלה של התרופה במהלך מחזור ויוו. לפיכך, במחקר זה, עיצוב זה משמש כדי לפברק השומנים מצופים חלקיקי של falcarindiol תרופה נגד סרטן, מתן מערך פוטנציאל משלוח חדש של falcarindiol כדי לייצב את המבנה הכימי שלו נגד השפלה ולשפר שלה ספיגת על ידי גידולים. Falcarindiol חלקיקים, עם טפט פוספוליפיד וכולסטרול לבצע הליבה סמים מטוהרים של החלקיק, עוצבו. ציפוי טפט השומנים מורכב 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) כולסטרול (חול), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (2000 פג DSPE) יחד עם פלורסנט תווית DiI (שן טוחנת יחסי של 43:50:5:2). חלקיקים מיוצרים בשיטת הזרקת מהירה, אשר היא טכניקה פשוטה ומהירה, כדי לזרז חלקיקים על ידי ממיס טוב לחילופי הממס אנטי. זה מורכב של זריקה מהירה של פתרון אתנול המכיל את הרכיבים nanoparticle לתוך שלב מימית. גודל חלקיקים פלורסנט נמדד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) 74.1 ± 6.7 ננומטר. ספיגת של חלקיקים נבחנה האנושי בתאי גזע mesenchymal (hMSCs), עם תמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית. ספיגת של חלקיקים נצפית ב- hMSCs, מציעה את פוטנציאל סמים יציב משלוח מערכת כזו עבור falcarindiol.
Introduction
חלקיקים מצופים השומנים רואים שהאיחוד לגבי תפקידם כמו מערכות עבור סרטן טיפול1. סרטן התיכנות השומנים-מטבולי2 שונה ויש צורך מוגבר כולסטרול להתרבות3. הם overexpress LDLs1 , לקחת LDLs יותר מאשר תאים נורמליים, כך ספירת LDL של חולה סרטן יכולים ליפול אפילו4. ספיגת LDL מקדם פנוטיפים אגרסיבי5 והתוצאה היא התפשטות ופלישה סרטן השד6. שפע של רצפטורים LDL (LDLRs) הוא מחוון prognostic של פוטנציאל גרורתי7. בהשראת LDL ואת ספיגת שלה על ידי התאים הסרטניים, אסטרטגיה חדשה כבר נקרא: להפוך את הסם נראה מזון שהסרטן8. לכן, אלה nanoparticle סמים משלוח עיצובים חדשים8,9,10 בהשראת העיצוב הליבה ואת השומנים-מיוצב של ה LDLs טבעי11 כמנגנון להעברת תרופות נגד סרטן תאים סרטניים. זה פסיבי מיקוד מערכת משלוח תומך לבצע, במיוחד, סמים הידרופוביות, אשר ניתנות בדרך כלל בצורת מינון אוראלי אלא לספק רק כמות קטנה של התרופות למחזור הדם, אז הגבלת שלהם היעילות הצפוי12. כמו עם ליפוזומים התגנבות13, ציפוי פוליאתילן גליקול (PEG) מסייעת להפחית כל תגובה אוטואימונית, מרחיב את זרימת הדם במחזור הדם עבור ספיגת גידול אופטימלי באמצעות כביכול משופרת הסתננות ותוצאה השמירה (EPR) 14 , 15. עם זאת, בנוסף לכך, כמה מופעים, יציבות במחזור והפצה בלתי רצויות של מערכת16, כמה מכשולים נותרו לא פתורים, כגון כיצד, באיזו מידה חלקיקים כאלה נופלים בפח על ידי תאים מה הוא גורלם תאיים. . זה כאן כי מאמר זה עוסק ספיגת ננו-חלקיק של מסוים תרופה נגד סרטן הידרופוביות falcarindiol, באמצעות וידאו, epifluorescence הדמיה טכניקות
מטרת המחקר היא לפברק השומנים מצופים חלקיקי של falcarindiol ללמוד ספיגת תאיים שלהם ב- hMSCs. ובכך, פוטנציאלית ייצוב הניהול שלה, התגברות על האתגרים הקשורים המשלוח ושיפור הביולוגית. לפיכך הערכת מערכת משלוח חדשה על תרופה נגד סרטן. בעבר, falcarindiol יש כבר המתקדם אורלית ויה falcarindiol ריכוז גבוה מטוהרים בתור תוסף מזון17. עם זאת, אין צורך שיטה מובנית יותר לספק את התרופה מבטיח. לכן, חלקיקים falcarindiol, עם פוספוליפיד, כולסטרול לבצע חד שכבתי עם התרופה מטוהרים המהווים את הליבה של החלקיק, עוצבו. השיטה זריקה מהירה של הממס הסטה, שפותחה לאחרונה נידהם. et al. 8, משמש במחקר זה לתמצת את falcarindiol polyacetylene.
השיטה כבר בעבר בשימוש על הזיוף של חלקיקים השומנים לתמצת אבחון הדמיה סוכנים18,19, כמו גם מבחן מולקולות (triolein)27 וסמים (orlistat, niclosamide stearate)8 27, ,28. זה טכניקה פשוטה יחסית כאשר מתבצעת עם מולקולות הנכון. היא יוצרת חלקיקים nanosized, על גבול שלהם התגרענות קריטי (~ 20 ננומטר קוטר), של מומסים בגבול הידרופובי מסיסים מאוד מומס עם הממס קוטביים. ההחלפה הממס מושגת על ידי זריקה מהירה של הפתרון אורגניים לתוך עודף של antisolvent (בדרך כלל, שלב מימית 1:9 אורגני: יחס נפח מימית)20,21.
העיצוב ההלחנה של חלקיקים להצמיח יתרונות מרובים. הרכיבים DSPC:Chol מספקים של טפט מאוד חזק, כמעט אטום, מסתיימים ו מתכלה. יתדות מספק ממשק sterically המייצב אשר פועל כמגן מפני opsonization על ידי המערכת החיסונית, האטת ספיגת כל על ידי מערכת reticuloendothelial (כבד, טחול), הגנה נגד המערכת פגוציט תאי, מניעת שלהם השמירה והשפלה על ידי המערכת החיסונית, ומכאן, והגברת זרימת הדם שלהם בחצי משרה דם22. זה מאפשר את החלקיקים לזרום עד שהם בורחת באתרים נגועים, כגון גידולים, שבו מערכת כלי הדם היא דולפת, ומאפשר EPR-אפקט כדי להצמיח הצטברות פסיבי של החלקיקים. בנוסף, המעיל השומנים מאפשרת לקיים בקרה טובה יותר על הגודל של חלקיקים ע י kinetically לכידת את הליבה שלה גרעין קריטי ממד27,28. ליפידים זירוז מאפייני משטח שונים (כולל פפטיד מיקוד, אשר היה לא עדיין זמין עבור פרויקט זה), ליבה של הסמים טהור ו27,22,polydispersity נמוך28. השיטה המשמשת לניתוח גודל החלקיקים היא DLS, טכניקה המאפשרת לחוקרים למדוד את הגודל של מספר רב של חלקיקים באותו זמן. עם זאת, שיטה זו ניתן הטיה המדידות ועד מידות גדולות, אם חלקיקים אינם monodispersed23. בעיה זו שקובעת עם המעיל השומנים גם כן. עוד פרטים על עיצובים יסוד אלה, כימות של כל המאפיינים ניתנת אחר פרסומים27,28.
התרופה במארז חלקיקים היא falcarindiol, polyacetylene תזונתיים נמצאו צמחים ממשפחת סוככיים. זה מטבוליט משני מסוג אליפטיות C17polyacetylenes אשר נמצא כדי להציג אפקטים מקדמת בריאות, לרבות פעילות אנטי דלקתית, אנטי-בקטריאלי אפקטים cytotoxicity נגד מגוון רחב של שורות תאים סרטן. תגובתיות גבוהה שלה קשורה יכולתה כדי אינטראקציה עם מולקולות שונות, מתנהג כמו סוכן מסוכן מאוד תגובתי נגד mercapto, קבוצות אמינו24. Falcarindiol בעבר הוכח כדי להקטין את מספר הנגעים אמצעים17,הגס25, למרות המנגנונים הביולוגיים הם עדיין לא ידוע. זאת, חשבתי שבגלל זה מקיים אינטראקציה עם מולקולות כגון NF-κB, COX1, COX-2 ומתחים ציטוקינים, מעכבים גידול התקדמות ותא התפשטות מתהליכי שלהם, שמוביל עוצר את מחזור התא, תוך-פלזמית (ER), אפופטוזיס 17,26 בתאים סרטניים. Falcarindiol משמש במחקר זה כמו תרופה נגד סרטן למשל בשל הפוטנציאל נגד סרטן שלה מנגנון הם נחקר כעת, כי זה מראה מבטיח אפקטים נגד סרטן. ספיגת הסלולר של חלקיקים נבדק ב hMSCs, עם תמונה באמצעות epifluorescence ומיקרוסקופיה קונפוקלית. סוג התא זה נבחר בגלל הגודל שלה גדול, הופכות אותה לאידיאלית עבור מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanoparticle סינתזה על ידי ממיס מהיר הסטה טכניקה
- להגדיר את הפריטים הבאים עבור ההכנה של חלקיקים: בלוק חימום/דוגמת רכז, desiccator, מערכת שחולק דיגיטלי עם מזרק זכוכית 1 מ"ל, בקבוקון זכוכית 12 מ ל, פגים, פרעוש מגנטי (15 מ"מ x 4.5 מ מ, בצורת גליל עם ציפוי טפלון [PTFE]) בתוך המבחנה זכוכית, ואת המאייד על כל ההזמנות.
- לוותר על 2.4 mL 250 מניות falcarindiol של מיקרומטר, מומס 70% EtOH תערובת המים בבקבוקון נצנוץ.
- להתנדף השבר נוזלי, באמצעות דגימת במסוע במשך כ 4 שעות, כדי להשיג falcarindiol יבש.
- הכנס את המבחנה נצנוץ החימום בלוק; במסוע מדגם מספק גז על המדגם באמצעות מחטים פלדת אל-חלד, ריכוז המדגם. להתאדות בטמפרטורת החדר; אל תשתמש חום.
- ברגע מיובש, להוסיף את הרכיבים הבאים של ציפוי השומנים לתוך המבחנה נצנוץ הנ ל: µL 16.3 מ מ 31.64 DSPC כלורופורם פתרון מניות, µL 3.4 בפתרון מניות כלורופורם 17.82 מ מ 2000 פג DSPE, µL 24 25 מ מ כולסטרול כלורופורם מניות הפתרון, 6 µL של 4 מ מ DiI כלורופורם פתרון מניות. לנקות את המזרק עם הכלורופורם לאחר הוספת כל רכיב כדי למנוע זיהום לחצות.
התראה: לסגור מיד את הבקבוקונים שמכילה ליפידים כך הממס לא להתאדות ולשנות, ובכך, הריכוז. לעבוד בשכונה fume.
הערה: ריכוזי פתרונות מניות כלורופורם יכול להשתנות, בהתאם הספק כימית או דילולים שנעשו במעבדה. - לעטוף את המבחנה עם רדיד אלומיניום על DiI מפני אור. השאירו את הדגימה בן לילה desiccator מתמוססות ההרדמה.
- להמיס את הדגימה מיובש באתנול מוחלטת באמצעי אחסון הסופי של 1.2 מ ל, אשר נותן הסופי ריכוזי DSPC, 2000 פג DSPE, כולסטרול ו- DiI של 0.43 מ מ, מ מ 0.05, 0.5 מ מ מ מ 0.02 נקודות, בהתאמה. פתרון זה מייצג את השלב אורגני.
- לקחת את המבחנה זכוכית 12 מ ל, למלא אותו 9 מיליליטר מים מטוהרים ולהוסיף, הפרעושים מגנטי לתוך המבחנה המכילה 9 מ ל מים. לשמור את הצנצנת על פגים, זע ב 500 סל ד (איור 1).
- לצרף את המזרק זכוכית 1 מ"ל למערכת שחולק ולנקות את זה עם הכלורופורם כדי למנוע כל זיהום. זה על-ידי, לאט לאט למשוך את הכלורופורם לתוך המזרק זכוכית dispensing ידנית לתוך tiems אספן פסולת לפחות 10.
התראה: זה חייב להתבצע תחת ברדס fume. - פריים את המזרק עם אתנול. לקרקע מחליף הממס הישן, כמו גם מסיר כל בועות האוויר.
התראה: זה חייב להתבצע תחת ברדס fume. - באמצעות המזרק, תשאף 1 מ"ל של שלב אורגני.
- הכנס את המזרק לתוך המבחנה זכוכית, עד אמצע סימן המים 9 מ ל, ולשמור על זה יציב באמצע המבחנה (כפי שמוצג באיור1).
- להזריק את הפתרון במהירות הנבחר של הזרקה (833 µL/s) על-ידי לחיצה על לחצן dispense על מערכת שחולק (איור 2). זה יוצר 10 מ"ל של 50 מיקרומטר השומנים מצופים חלקיקי של falcarindiol ב- 10% אתנול המכילים מים.
הערה: מהירות הזרקת זו נמצאה כדי להשיג את החלקיקים המשובח, קבלת התפלגות גודל החלקיקים צרים. זה חיוני כדי לוודא כי המזרק הוא במרכז, יציב, ישר כאשר מחלק את הפתרון. - מיד לאחר ההזרקה להסיר את המבחנה מערבב ולהעביר את הדגימה אל בקבוק עגול-התחתון 50 מ ל (RBF).
- לצרף את RBF המאדה, מתאדים 1 מ"ל של הממס האורגני, תוך שימוש על המאדה בטמפרטורת החדר. למנוע היווצרות בועה עודף.
הערה: שלב זה תוביל ~ 5 דקות. - להעביר את המתלים nanoparticle RBF בקבוקון זכוכית 12 מ ל אחר. ודא כי אמצעי האחסון 9 מ. פיצול הדגימה ב שתי מבחנות זכוכית 12 מ ל (put 4.5 מ ל כל אחד).
- להוסיף 0.5 מיליליטר מים הנדסה גנטית באחת מהמבחנות ו 0.5 מיליליטר 10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) למבחנה אחרים. להוציא 1 מ"ל של כל דגימה עבור מדידת גודל חלקיקים.
2. חלקיקים בגודל הניתוח בטכניקה DLS
הערה: מדידות גודל בוצעו באמצעות מנתח DLS הקובע הפצות גודל החלקיקים. הוא מצויד לייזר mW 100 הפועלת על אורך גל של 662.2 ננומטר, עם גלאי פוטודיודה מפולת שלגים להציב בזווית של 90° זווית התקרית. הקרן מפוזרים על ידי חלקיקים, שזיהה את photodetector.
- להפעיל DLS המכשיר ולהגדיר לטמפרטורה הרצויה ב 20 מעלות צלזיוס, עד זה מייצבת.
- הגדר את פרמטרי כלי כדלקמן: נתוני רכישת זמן = 4 s, מספר רכישות = 30, פונקציית auto-הנחתה =, על גבולות הזמן אוטומטי-הנחתה = 0.
- למלא את cuvette פלסטיק 1 מ"ל של ננו-חלקיק השעיה ולהתחיל את המדידה.
- מדווחים את גודל נמדד בהתאם הממס בשימוש (מים או PBS).
הערה: המדד ב- PBS עשוי שיש לי מושג משוער של גודל התאים בטווח הבינוני בטיפול התאים. הטיפול התא ייעשה עם חלקיקים מומס במים. - חזור על המדידות 24 שעות לאחר הסינתזה, כדי לבדוק אם אגרגציה.
3. טיפול תא
- יגדלו hMSCs בינונית מזערי חיוני (מאמ) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין, בתוך תא humified ב 37° C עם 5% CO2
התראה: לעבוד את סטרילי למינארי על שלבים 3.1, 3.2 ו- 3.3. - זרע כ 50,000 תאים כדי להשיג צפיפות התאים של-30% על coverslips #1.5 בעבר המוחלט-EtOH-עיקור להציב לוחות 6-. טוב. הוסף MEM כדי לקבל נפח סופי של 3 מ ל כל היטב. תקופת דגירה של 24 שעות תחת באותם התנאים כמו שלב 3.1. הזרע התאים 24 שעות לפני הטיפול.
הערה: זה קריטי שהתאים הם נזרע לפחות 24 שעות לפני הטיפול ננו-חלקיק, כדי לוודא כי התאים נמצאים זרימה נאותה. - מבלי להסיר את המדיום, להוסיף 3 µL של הפתרון ננו-חלקיק, ריכוז falcarindiol הסופי של 5 מיקרומטר. Incubate במשך 24 שעות ביממה, באותם התנאים כמו שלב 3.1.
הערה: ההכנה של חלקיקים בוצע ביום של הטיפול התא, כדי להימנע אגרגציה. - לאחר מכן, לאחר 24 שעות של טיפול, לשטוף את התאים 2 x עם PBS, לתקן אותן בפורמלין 4% 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחסן אותם ב- PBS ב 4° C עבור אפילו מספר חודשים עד עם תמונה.
התראה: זה חייב להתבצע תחת ברדס fume.- לחלופין, לאחר קיבוע, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת גרעינית יכולה להתבצע. בשביל זה, לאחר תיקון התאים, permeabilize אותם עם 0.1% טריטון X-100 במשך 30 דקות, לשטוף אותם 2 x עם PBS, כתם אותם עם µL 250 300 ננומטר דאפי למשך 5 דקות, מוגן מפני אור.
4. מיקרוסקופ
-
מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
- השתמש במיקרוסקופ זריחה widefield מצויד עם מצלמת CCD כפול-אלקטרון כדי לרכוש תמונות. השתמש את 150 x נה 1.45 שמן המטרה וערוץ GFP LP.
-
מיקרוסקופיה קונפוקלית
- לרכוש תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית, שימוש של 63 x 1.4 נה שמן אובייקטיבי, ללייזר (514 ננומטר) DiI, שני הפוטונים לייזר (780 ננומטר) עבור דאפי, כדי לוודא את ספיגת של חלקיקים לתוך התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני סוגים שונים של חלקיקים היו חלקיקים מפוברק, כלומר טהור falcarindiol falcarindiol מצופים השומנים חלקיקים. ריכוזים שונים של שומנים וכולסטרול נבדקו. כפי שמוצג בטבלה 1, ללא ציפוי חלקיקי שנוצר במים ונמדד ב PBS היה בקוטר של 71 nm ± 20.3 עם מדד polydispersity (PDI) 0.571. פרמטרים אלה נמדדו על מנתח DLS. חלקיקים מצופים השומנים של falcarindiol משמשת את הניסויים, והיא כל כך כולל את הפלורסנט, DiI, היו בגודל דומה, כלומר 74.1 ננומטר ± 6.7; עם זאת, הם כנראה יחסית monodispersed והיה PDI התחתון של 0.182, אשר מצביע על התפלגות קטנים יותר של גודל החלקיקים, מאז PDI מתאר את התפלגות האוכלוסייה nanoparticle. באופן כללי, רצוי PDI מתחת 0.3 כאשר בדיית חלקיקים למטרות התרופות.
בעקבות ייצור, גודל החלקיקים נמדדה לאחר 3 שעות, 24 שעות ביממה, פעמים בהתבסס על העיכוב נדרש עבור התוספת של חלקיקים לתרבות תא. אין צבירת נצפתה לאחר 24 שעות, אולם הנתונים אינה מוצגת בכתב היד כפי זה ידווחו במחקר אחר, מומלץ לבצע בדיקה ליציבות חלקיק אחרי 24 שעות. לאחר שאישרת את יציבות גודל חלקיקים מצופים השומנים, חלקיקים התווית על-ידי DiI, מצופים השומנים היו מפוברק על ידי ביצוע הפרוטוקול ומשמשת, בסופו של דבר, לצורך המחקר ספיגת. על כל מחקר, הוכן מדגם nanoparticle טריים. שרטוט של המבנה של חלקיקים falcarindiol הסופי מוצג באיור 3ונתונים בגודל של החלקיק לאחר ייצור מוצגת טבלה 1, כמו גם את המדידה לקח 3 שעות לאחר פבריקציה נוספת.
כמו אבחנה הראשון של חלקיקים בתוך התאים, תמונות מיקרוסקופ epifluorescence נרכשו לאחר 24 שעות של טיפול. חלקיקים היו דמיינו כנקודות בהיר לבן, זה יכול להיות שיערו כי חלקיקים היו ממוקמים בתוך התאים המקיפים את הגרעין (איור 4א).
כדי לוודא כי חלקיקים falcarindiol נכנסו התאים, מיקרוסקופיה קונפוקלית בוצעה hMSCs טיפול 24 ה Confocal תמונות אישר כי חלקיקים נכנסו התאים, מספר רב של חלקיקים היו מפוזרים בציטופלסמה ב בכל תא (איור 4B-D). תוצאות אלו מראות כי חלקיקים לפעול כמערכת משלוח סמים יציב עבור falcarindiol.
איור 1 : חלקיקים הכנת ההתקנה מציג מכלול להזרקה תחת זע27. ההגדרה כוללת autopipette עם מזרק זכוכית 1 מ"ל מלא 1 מ"ל של הפתרון ethanolic המכיל הרכיבים של חלקיקים. המבחנה זכוכית מכיל 9 מ ל מים, הפרעושים מגנטי מושם על פגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : סכימטי של ערבוב של ממיסים בשיטה מהירה הזרקה של הממס הסטה27. לוחות הצג ההזרקה של 1 מ"ל של שלב ethanolic המכיל הרכיבים של חלקיקים במהירות של 833 µL/s לתוך 9 מיליליטר מים תוך כדי ערבוב במהירות של 500 סל ד. זריקה מהירה עם ערבוב כאוטי של הפתרון ethanolic המכיל הרכיבים של חלקיקים (falcarindiol, DSPC, כולסטרול, פג DSPE 2000, DiI) לתוך antisolvent (מים), leadd את היווצרות של חלקיקים. הצבע ניתנת על-ידי DiI. זה יכול להיות שנצפו איך הפתרון ethanolic הוא מעורב, והולך הריכוז שלו, חלקיקים נוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סכימטי של המבנה של חלקיקים falcarindiol הסופי. ננו-חלקיק מבנה, כולל DSPC, 2000 פג DSPE, כולסטרול, DiI ו- falcarindiol. הרכיבים השונים ישנו את גודלם לפי ריכוזים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תמונות של חלקיקים falcarindiol מצופים השומנים בתוך גזע אנושי mesenchymal. (א) Epifluorescence תמונת מיקרוסקופ של hMSCs שטופלו falcarindiol חלקיקים במשך 24 שעות ביממה. הלוחות הבאים מציגים מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של hMSCs מטופלים עם חלקיקים falcarindiol עבור 24 ח': (B) דאפי כתם של גרעינים, גרעינים חלקיקים, ותמונות (D) כיסוי של שניהם, DiI (ג) מוצגים בכחול ו חלקיקים באדום. פסי בקנה מידה הם 10 מיקרומטר. חלקיקים הם דמיינו כנקודות בהיר לבן בציטופלסמה של התא. הצג תמונות כי מספר רב של חלקיקים הזנת התאים לאחר 24 שעות של דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סוג של חלקיקים | תמיסה # הממס | ננו-חלקיק בגודל (אן אם) | Polydisperisty (אן אם) | Polydispersity אינדקס (PDI) |
| Falcarindiol ללא ציפוי | מים | 83.9 | ± 23,9 | 0.571 |
| PBS | 71 | ± 20,3 | 0.571 | |
| השומנים מצופה Falcarindiol | PBS | 91.6 | ± 6,4 | 0.141 |
| PBS לאחר 3 שעות | 93.5 | ± 5,7 | 0.122 | |
| השומנים מצופה Falcarindiol + DiI | PBS | 74.1 | ± 6.7 | 0.182 |
טבלה 1: עיצובים שונים של חלקיקים מפוברק. אינדקס polydispersity וגודל חלקיקים falcarindiol מסונתז, בהתאם לסוג הממס, ננו-חלקיק. Falcarindiol חלקיקים עם ובלי מעיל השומנים זוייפו... ריכוזים שונים של הרכיבים המעיל נבדקו. אגרגציה נבדקה לאחר 3 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט עבור בדיית מצופים השומנים חלקיקים למשלוח סמים עם התם, זריקה מהירה מהר, הדירים מדרגי שיטה של הסטה הממס היה בעקבות27,28 , כפי שהוצגו במאמר זה, להחיל על falcarindiol. על ידי שליטה המהירות של ההזרקה של השלב אורגני לשלב מימית, באמצעות ציפוי ליפידים בריכוזים המתאימים כדי מעיל המרכזי falcarindiol, חלקיק בטווח תת-100 ננומטר יכולה להיות מושגת בהצלחה. האפשרות של polydispersity המושרה בשל מעורבותם של ערבוב הסוערים של משקעים falcarindiol לבד היה נשלט על ידי הנוכחות של ציפוי שומנים. המבנה של חלקיקים אלה מצופים השומנים דמה של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה עם חריגה של הכללת kDa 500,000 יליד ApoB100, נוכחות נוספים של פג-ליפידים ליציבות הסטריים). להזרקת סם פסיבי יישוב זה מאפשר את ומגעים במגוון רחב של חומרים אבחון18,19, הפחתת התגובה אוטואימונית והגברת ההצטברות ב וסמים במיוחד הידרופובי רקמות סרטניות16,18. יתר על כן, בהתאם סמים השפלה התגובות (למשל, הידרוליזה, enzymolysis), מערכת משלוח סמים מגן הסם השפלה במהלך הזרימה ויוו.
לכן, חלקיקים falcarindiol, עם טפט לבצע השומנים המכילים גרעין טהור של התרופה מטוהרים, היו תוכנן, מפוברק. ציפוי טפט השומנים כללה DSPC, כולסטרול, DSPE-יתד 2000, עם התווית פלורסנט DiI. הזיוף של חלקיקי בוצע שימוש בשיטת הזרקת מהירה במעלות הממס, אשר מורכב של זריקה מהירה של פתרון ethanolic המכיל את הרכיבים חלקיקים לתוך עודף פאזה מימית (1:9). גודל חלקיקים נמדדה באמצעות DLS, ואת ספיגת של חלקיקים נבדק ב hMSCs עם תמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
חלקיקים ללא ציפוי ניתן להשיג, עם הגודל של 71 ± 20.3 ננומטר. עם זאת, לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר לעיל, חלקיקי של 74.1 nm ± 6.7 nm, בערכים polydispersity של 0.182, היו מפוברק. לפיכך, לאחר שינוי חלקיקים על-ידי הוספת את המעיל השומנים, גודל ואת PDI של חלקיקים היה מופחת, הפיכת סמים אותם מתאימים יותר עבור משלוח.
זה חשוב להיות מאוד מודעים לשלבים הקריטיים בפרוטוקול, כגון חשיבות המיקום מזרק כאשר הזרקת שלב אורגני, הכנת חלקיקים באותו יום של טיפול כדי למנוע צבירת, זריעה של תאים יום לפני כדי להבטיח רמת זרימה נאותה. למעשה, בכל השלבים של החלק הראשון של הפרוטוקול יכול להיחשב ביקורתי הם משפיעים גם הגודל של חלקיקים או הריכוז הסופי של מתחם פעיל ושומנים ציפוי. בהתחשב "ריכוז" בתור פרמטר חשוב, שלבים 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 ו- 1.16 הם קריטיים. בהתחשב 'גודל ננו-חלקיק' בתור פרמטר חשוב, שלבים 1.7, 1.11, ו- 1.12 הם קריטיים.
קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיה קונפוקלית הראה כי חלקיקים נכנסו התאים, מספר רב של חלקיקים היו מפוזרים בציטופלסמה של כל תא. תוצאות אלו מראים כי חלקיקים תוכנן במחקר זה יכול לשמש מערכת משלוח חדש, יציב סמים עבור falcarindiol.
טכניקה זו מספקת גישה פשוטה, מהירה, לשחזור כדי לכמס תרופות סרטן שונים, המגבלות של השיטה הם העריכו עם המעיל השומנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה ד ר קאסם Moustapha (בית החולים של אוניברסיטת אודנסה, דנמרק) גזע mesenchymal האנושית. המחברים תודה המרכז Bioimaging הרפואי דנית לגישה מיקרוסקופים שלהם. המחברים תודה את היסודות קרלסברג ובירה Villum התמיכה הכספית (E.A.C.). המחברים להכיר את התמיכה הכספית שסופקו על-ידי בפרס נילס בוהר פרופסורה של קרן המחקר הלאומית הדנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
References
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).
- Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228 (2017).
- Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).
- Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
- dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).
- Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).
- Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).
- Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
- Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).
- Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).
- Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).
- Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).
- Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).
- Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).
- Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).
- Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
- Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
- Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. , (2018).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).
- Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).
- Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).
- Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).
- Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
- Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
- Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). , (2018).
- Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , Stockholm, Sweden. (2017).
