Summary
Denna artikel beskriver inkapsling av falcarindiol i lipid-belagd 74 nm nanopartiklar. Cellulära upptaget av nanopartiklarna av mänskliga stamceller i lipid droppar övervakas av lysrör och confocal imaging. Nanopartiklar är tillverkade av metoden snabb injektion av lösningsmedel skiftande och deras storlek mäts med dynamisk ljusspridning tekniken.
Abstract
Nanopartiklar är i fokus för ett ökat intresse för drogen leveranssystem för cancerbehandling. Lipid-belagd nanopartiklar är inspirerade i struktur och storlek av low-density lipoproteins (LDLs) eftersom cancerceller har ett ökat behov av kolesterol att föröka sig, och detta har utnyttjats som en mekanism för att leverera cytostatika för cancer celler. Dessutom beroende på drogen kemi, kan kapsla in drogen vara fördelaktigt att undvika nedbrytning av läkemedlet under cirkulationen invivo. Därför i denna studie, är denna design används för att tillverka lipid-belagd nanopartiklar av den anticancer läkemedel falcarindiol, som tillhandahåller en potentiella nya leveranssystem för falcarindiol för att stabilisera dess kemiska struktur mot nedbrytning och förbättra dess upptag av tumörer. Falcarindiol nanopartiklar, utformades med en fosfolipid och kolesterol enskiktslager encapsulating renat drog kärnan av partikeln. Lipid enskiktslager beläggningen består av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC) kolesterol (Chol) och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) tillsammans med fluorescerande etiketten DiI (molar förhållandet mellan 43:50:5:2). Nanopartiklarna är tillverkade med hjälp av metoden snabb injektion, vilket är en snabb och enkel teknik att fällningen nanopartiklar av bra lösningsmedel för anti lösningsmedel utbyte. Den består av en snabb injektion av etanol lösning som innehåller nanopartiklar beståndsdelar till en vattenfas. Storleken på de fluorescerande nanopartiklarna mäts med dynamisk ljusspridning (DLS) vid 74,1 ± 6,7 nm. Upptaget av nanopartiklarna är testad i humana mesenkymala stamceller (hMSCs) och avbildas med hjälp av fluorescens och konfokalmikroskopi. Upptaget av nanopartiklarna observeras i hMSCs, vilket tyder på en potential för ett sådant stabila drug delivery system för falcarindiol.
Introduction
Lipid-belagd nanopartiklar ser ett ökat intresse när det gäller deras funktion som drog leveranssystem för cancer behandling1. Cancer har en förändrad lipid-metabola omplanering2 och ett ökat behov av kolesterol föröka3. De överuttrycka LDLs1 och ta i mer LDLs än normala celler, i den utsträckning som en cancer patients LDL räkna kan även gå ner4. LDL-upptag främjar aggressiva fenotyper5 resulterar i spridning och invasion i bröst cancer6. Ett överflöd av LDL-receptorer (LDLRs) är en prognostisk indikator av metastaserande potentiella7. Inspirerad av LDL och dess upptag av cancerceller, en ny strategi har kallats: göra läkemedlet se ut cancer's mat8. Således dessa nya nanopartiklar drogen leverans mönster8,9,10 har inspirerats av core - och lipid-stabiliserad utformningen av naturliga LDLs11 som en mekanism för att leverera cytostatika cancerceller. Denna passiva inriktning leverans systemet stöder encapsulating av, särskilt, hydrofoba droger, som vanligen ges i oral dosering formulär men ger endast en liten mängd av droger i blodet, så begränsa deras förväntade effekt12. Som med stealth liposomer13en polyetylenglykol (PEG) beläggning hjälper till att reducera någon immunologisk reaktion och utökar cirkulationen i blodomloppet för optimal tumör upptag genom den påstådda förbättrad genomträngning och retention (EPR) effekt 14 , 15. i tillägg till, i vissa instanser, instabilitet i cirkulationen och oönskade distribution i system16, vissa hinder kvarstår dock olösta, till exempel hur och i vilken utsträckning sådana nanopartiklar tas av celler och vad är sitt intracellulära öde. Det är här att denna uppsats behandlar nanopartiklar upptaget av ett visst hydrofoba anticancer läkemedel falcarindiol, använder confocal och epifluorescence imaging tekniker.
Syftet med studien är att fabricera lipid-belagd nanopartiklar av falcarindiol och studera deras intracellulära upptaget i hMSCs. Därmed skulle kunna stabilisera sin administration, att övervinna de utmaningar som förknippas med leverans och förbättrar biotillgängligheten. Således att bedöma ett nytt leveranssystem för detta anticancer läkemedel. Tidigare har falcarindiol varit administreras oralt via en hög koncentration renat falcarindiol som en mat tillägg17. Dock finns det behov av ett mer strukturerat sätt att leverera denna lovande läkemedel. Därför utformades falcarindiol nanopartiklar, med en fosfolipid och kolesterol encapsulating enskiktslager med renat drogen som utgör kärnan av partikeln. Metoden snabb injektion av lösningsmedel växling, som nyligen utvecklats av Needham et al. 8, används i denna studie att kapsla in den polyacetylen falcarindiol.
Metoden har tidigare använts för tillverkning av lipid nanopartiklar att kapsla in diagnostisk avbildning agenter18,19, samt testa molekyler (triolein)27 och droger (orlistat, niclosamide stearat)8 ,27,28. Det är en relativt enkel teknik när de utförs med rätt molekylerna. Nanosized partiklar, på gränsen till deras kritiska kärnbildning (~ 20 nm i diameter), bildar av mycket olösligt hydrofoba koncentrationsfördelningen upplöst i polära lösningsmedel. Lösningsmedel utbyte sker genom en snabb injektion av organiska lösningen i ett överskott av antisolvent (vanligtvis en vattenfas i en 1:9 ekologisk: vattenlösning volymförhållandet)20,21.
Nanopartiklarna kompositionella utformning ger upphov till flera fördelar. DSPC:Chol komponenter ger en mycket stram, nästan ogenomtränglig, biokompatibla och biologiskt nedbrytbara enskiktslager. PEG ger en koalisera stabiliserande gränssnitt som fungerar som en sköld från opsonization av immunsystemet, sakta någon upptag av retikuloendoteliala systemet (lever och mjälte) och skydda mot mononukleära fagocytsystemet systemet, hindrar deras kvarhållande och nedbrytning av immunsystemet, och därmed öka sin omsättning halvtid i blod22. Detta tillåter partiklarna att cirkulera tills de extravasate på sjuka platser, såsom tumörer, där det vaskulära systemet är läckande, möjliggör EPR-effekt för att ge upphov till passiv ackumulering av partiklarna. Dessutom gör lipid pälsen att man kan ha bättre kontroll över de nanopartiklar storlek av kinetiskt svällning kärnan dess kritiska nucleus dimension27,28. Lipider framkalla olika ytegenskaper (inklusive peptid inriktning, som ännu inte var tillgänglig för detta projekt), en ren drog kärna och en låg polydispertion22,27,28. Den metod som används för partikel storlek analys är DLS, en teknik som tillåter forskare att mäta storleken på ett stort antal partiklar samtidigt. Dock kan denna metod bias mätningarna till större storlekar, om nanopartiklarna inte monodispersed23. Problemet bedöms med lipid pälsen samt. Mer detaljer om dessa grundläggande mönster och kvantifiering av alla egenskaper ges i andra publikationer27,28.
Läkemedlet inkapslade i nanopartiklarna är falcarindiol, en kosten polyacetylen som finns i växter från familjen flockblommiga växter. Det är en sekundär metabolit från alifatiska C17polyacetylenes typ som har befunnits Visa hälsofrämjande effekter, inklusive anti-inflammatorisk aktivitet, antibakteriella effekter och cytotoxicitet mot ett brett spektrum av cancer cellinjer. Dess höga reaktivitet är relaterad till dess förmåga att interagera med olika biomolekyler, agerar som en mycket reaktiv alkylerare mot mercapto och amino grupper24. Falcarindiol har tidigare visats minska antalet av neoplastiska lesioner i kolon17,25, även om de biologiska mekanismerna är fortfarande okänd. Det är dock tanken att det interagerar med biomolekyler som NF-κB, COX1, COX-2, och cytokiner, hämma deras tumör progression och cell spridning processer, leder till arresterar cellcykeln, endoplasmatiska nätverket (ER) stress och apoptos 17,26 i cancerceller. Falcarindiol används i denna studie som ett exempel anticancer läkemedel på grund av dess anticancer potential och mekanism studeras för närvarande, och eftersom det visar lovande anticancer effekter. Cellulära upptaget av nanopartiklarna är testad i hMSCs och avbildas med hjälp av epifluorescence och konfokalmikroskopi. Denna celltyp valdes på grund av dess storlek, vilket gör dem idealiska för mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanopartiklar syntes genom snabb växling teknik
- Konfigurera följande för de nanopartiklar beredning: ett block värmare/prov koncentrator, exsickator, en digital dispenseringssystem med en 1 mL spruta av glas, en 12 mL injektionsflaska av glas, en magnetisk omrörare, en magnetisk loppa (15 mm x 4,5 mm, i en cylindrisk form med polytetrafluoreten [PTFE] beläggning) inuti glasflaskan, och en roterande indunstare.
- Fördela 2,4 mL av 250 µM falcarindiol lager löses i 70% EtOH vatten blandning i en injektionsflaska av scintillation.
- Indunsta den flytande fraktionen, använda Platskoncentratorn prov för ungefär 4 h, att få torra falcarindiol.
- Infoga scintillation injektionsflaskan i block; Platskoncentratorn prov levererar gas över det prov som använder rostfria nålar, koncentrera provet. Avdunsta vid rumstemperatur; Använd inte värme.
- När torkat, Lägg till följande komponenter av lipid beläggningen i injektionsflaskan med ovannämnda scintillation: 16,3 µL av 31.64 mM DSPC kloroform stamlösning, 3,4 µL av 17.82 mM DSPE PEG 2000 kloroform stamlösning, 24 µL av 25 mM kolesterol kloroform lager lösning och 6 µL av 4 mM DiI kloroform stamlösning. Ren sprutan med kloroform efter att lägga till varje komponent för att undvika korskontaminering.
Varning: Stäng omedelbart i injektionsflaskor innehållande lipider så att vätskan inte avdunsta och, därmed, ändra koncentrationen. Arbeta i dragskåp.
Obs: Kloroform lager lösningars koncentrationer kan variera, beroende på den kemiska leverantör eller spädningar som gjorts i labbet. - Wrap injektionsflaskan med aluminiumfolie ljuskänsligt DiI. Lämna provet över natten i exsickatorn avdunsta i kloroform.
- Upplösning av desiccated provet i absolut etanol till en slutlig volym av 1,2 mL, vilket ger slutliga koncentrationer av DSPC, DSPE PEG 2000, kolesterol och DiI 0,43 mM, 0,05 mM, 0.5 mM och 0,02 mM, respektive. Denna lösning representerar den organiska fasen.
- Ta den 12 mL injektionsflaskan av glas, Fyll på med 9 mL renat vatten och lägga till magnetiska loppan i injektionsflaskan med 9 mL vatten. Förvara injektionsflaskan på magnetomröraren, omrörning på 500 rpm (figur 1).
- Bifoga en 1 mL spruta av glas till doseringssystemet och rengör med kloroform att undvika. Detta genom, långsamt dra av kloroform i glassprutan och dispenseras manuellt i en insamlare minst 10 tiems.
Varning: Detta måste göras i dragskåp. - Prime sprutan med etanol. Priming ersätter gamla lösningsmedlet, samt tar bort eventuella luftbubblor.
Varning: Detta måste göras i dragskåp. - Med hjälp av sprutan, aspirera 1 mL av den organiska fasen.
- Sätt in sprutan i glasflaskan, fram till mitten av 9 mL vattenmärken, och underhålla den stadigt mitt i injektionsflaskan (som visas i figur 1).
- Injicera lösningen i valda hastigheten för injektion (833 µL/s) genom att trycka på knappen dispensering på doseringssystemet (figur 2). Detta genererar 10 mL 50 µM lipid-belagd nanopartiklar av falcarindiol i 10% etanol-innehållande vatten.
Obs: Denna injektion hastighet har konstaterats för att uppnå de finaste partiklarna, erhålla en smala partikelstorleksfördelning. Det är viktigt att kontrollera att sprutan är i centrum, steady och raka när dispensering lösningen. - Omedelbart efter injektion, ta bort injektionsflaskan från omröraren och överför provet till en 50 mL runda-botten kolv (RBF).
- Bifoga RBF till rotationsindunstaren och avdunsta 1 mL av organiska lösningsmedel, med rotationsindunstaren vid rumstemperatur. Undvika överskott bubbla bildas.
Obs: Detta steg tar ~ 5 min. - Överföra nanopartiklar fjädringen från RBF till en annan 12 mL injektionsflaska av glas. Se till att volymen är 9 mL. Dela upp provet i två 12 mL injektionsflaskor av glas (put 4,5 mL vardera).
- Tillsätt 0,5 mL ultrarent vatten till en av injektionsflaskorna och 0,5 mL 10 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till andra injektionsflaskan. Ta ut 1 mL av varje prov för partikel storlek mätning.
2. partikel storlek analys med hjälp av DLS-tekniken
Obs: Storlek mätningar utfördes med hjälp av en DLS analyzer som bestämmer partikel storlek distributioner. Den är utrustad med 100 mW laser som är verksam vid en våglängd på 662.2 nm och med en lavin fotodiod detektor placeras i 90° vinkel mot den infallande vinkeln. Strålen är spridda av nanopartiklarna och upptäcks av fotodetektor.
- Slå på instrumentet DLS och ställa in önskad temperatur på 20 ° C, tills det stabiliserar.
- Ange parametrarna instrumentet enligt följande: data förvärv tid = 4 s, antal förvärv = 30, auto-dämpning funktion = på, och auto-dämpning tidsfristerna = 0.
- Fyll den plast kyvetten med 1 mL nanopartiklar suspension och starta mätningen.
- Rapportera den uppmätta storleken beroende på lösningsmedel används (vatten eller PBS).
Obs: Mätningen i PBS är gjord att ha en ungefärlig uppfattning om storleken på cellerna i medlet vid behandling av cellerna. Cell behandling kommer att ske med de nanopartiklar upplöst i vatten. - Upprepa mätningarna 24 h efter syntesen, att kontrollera för partikel aggregering.
3. cell behandling
- Odla hMSCs i minsta viktigt medium (MEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin, i en humified kammare vid 37° C med 5% CO2.
FÖRSIKTIGHET: Arbeta i den sterila LAF för steg 3.1, 3.2 och 3.3. - Utsäde ungefärligt 50.000 celler att erhålla en cell densiteten på cirka 30% på tidigare absoluta-EtOH-steriliseras #1.5 coverslips placeras i 6-väl plattor. Lägg till MEM för att få en slutlig volym av 3 mL i varje brunn. Inkubera under 24 h på samma villkor som i steg 3.1. Utsäde cellerna 24 h innan behandlingen.
Obs: Det är kritiska cellerna är seedade minst 24 h innan nanopartiklar behandling, se till att cellerna finns i en adekvat sammanflödet. - Utan att ta bort mediet, tillsätt 3 µL av nanopartiklar lösningen, för en sista falcarindiol koncentration av 5 µM. Inkubera i 24 h på samma villkor som steg 3.1.
Obs: De nanopartiklar förberedelse genomfördes dagen cell behandling, för att undvika partikel aggregering. - Därefter, efter 24 h behandling, tvätta cellerna 2 x med PBS och fixa dem i 4% formaldehyd i 10 min i rumstemperatur, och lagra dem i PBS vid 4° C i upp till flera månader tills avbildas.
Varning: Detta måste göras i dragskåp.- Alternativt efter fixering, en 4′, kan 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) nukleär färgning utföras. För detta, efter fastställande av cellerna, permeabilize dem med 0,1% Triton x-100 för 30 min, tvätta dem 2 x med PBS, och färga dem med 250 µL av 300 nM DAPI för 5 minuter, skyddas från ljus.
4. mikroskopi
-
Fluorescensmikroskopi
- Använda en widefield fluorescens Mikroskop utrustat med en elektron-multiplicerade CCD-kamera för att förvärva bilder. Använd 150 x NA 1,45 olja mål och kanalen GFP LP.
-
Konfokalmikroskopi
- Förvärva konfokalmikroskopi bilder, med hjälp av 63 x NA 1.4 olja mål, en Argon laser (514 nm) för DiI och en två-photon-laser (780 nm) för DAPI, att kontrollera spridningen av nanopartiklarna i cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två olika typer av nanopartiklar var fabricerade, nämligen ren falcarindiol nanopartiklar och lipid-belagd falcarindiol nanopartiklar. Olika koncentrationer av lipider och kolesterol testades. I tabell 1visas obestruket nanopartiklar bildas i vatten och mätt i PBS hade en diameter av 71 ± 20,3 nm med en polydispertion index (PDI) på 0.571. Dessa parametrar mättes på en DLS analyzer. De lipid-belagd nanopartiklarna av falcarindiol används i experiment, och så även den fluorescerande färgämnen, DiI, var av liknande storlek, nämligen 74,1 ± 6,7 nm. men de befanns vara relativt monodispersed och hade en lägre PDI av 0.182, vilket indikerar en mindre fördelning av partikelstorlekar, eftersom PDI beskriver storleksfördelning av nanopartiklar befolkningen. I allmänhet önskas en PDI nedanför 0,3 när fabricera nanopartiklar för farmaceutiska ändamål.
Efter tillverkning, partikelstorlek mättes efter 3 h och 24 h, gånger baserat på förseningen krävs för tillägg av nanopartiklar för cellkulturen. Ingen aggregering observerades efter 24 h, men data inte visas i detta manuskript som det kommer att rapporteras i en annan studie, och det rekommenderas att testa för partikel stabilitet efter 24 h. Efter att ha bekräftat de lipid-belagd nanopartiklarna storlek stabilitet, var DiI-märkt, lipid-belagd nanopartiklar fabricerade genom att följa protokollet och, så småningom, används för upptag studien. För varje studie, var en färsk nanopartiklar provet beredd. En schematisk bild av de slutliga falcarindiol nanopartiklar struktur visas i figur 3, och den partikelns storlek data efter fabrication visas i tabell 1, samt mätning tagit 3 h efter tillverkning.
Som en första observation av nanopartiklarna inuti cellerna förvärvades epifluorescence mikroskopi bilder efter 24 h behandling. Nanopartiklarna var visualiserat som vita ljusa prickar, och det kunde vara en hypotes om att nanopartiklar fanns inne i cellerna, kring kärnan (figur 4A).
Kontrollera att falcarindiol nanopartiklar hade gått in i cellerna, konfokalmikroskopi utfördes på hMSCs behandlas för 24 h. Confocal bekräftade bilder att nanopartiklar hade angett cellerna, och ett stort antal nanopartiklar var spridda i cytoplasman i varje cell (figur 4B-D). Dessa resultat visar att nanopartiklar fungera som en stabil drog leveranssystem för falcarindiol.
Figur 1 : Nanopartiklar förberedelse setup visar montering för injektion under omrörning27. Installationen består av autopipette med en 1 mL spruta av glas fyllda med 1 mL av den enprocentig lösning innehållande de nanopartiklar komponenter. Glasflaskan innehåller 9 mL vatten och magnetiska loppan är placerad på magnetomröraren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk av blandning av lösningsmedel i metoden snabb injektion av lösningsmedel skiftande27. Paneler visar injektion av 1 mL enprocentig fas som innehåller nanopartiklar komponenter med en hastighet av 833 µL/s i 9 mL vatten under omrörning på 500 rpm. Snabb injektion med kaotisk blandning av enprocentig lösning innehållande de nanopartiklar komponenter (falcarindiol, DSPC, kolesterol, DSPE PEG 2000, DiI) till antisolvent (vatten), leadd till bildandet av nanopartiklarna. Färgen ges av DiI. Det kan observeras hur etanollösning blandas, snabbt ökande dess koncentration och nanopartiklarna bildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Schematisk av de slutliga falcarindiol nanopartiklar struktur. Nanopartiklar struktur, inklusive DSPC, DSPE PEG 2000, kolesterol, DiI och falcarindiol. De olika komponenterna skalas enligt deras koncentrationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bilder av lipid-belagd falcarindiol nanopartiklar i humana mesenkymala stamceller. (A) Epifluorescence mikroskopi bilden av hMSCs behandlas med falcarindiol nanopartiklar för 24 h. Följande paneler visar konfokalmikroskopi bilder av den hMSCs som behandlats med falcarindiol nanopartiklar för 24 h: (B) DAPI fläcken av atomkärnor, (C) DiI nanopartiklar, och (D) en överlagring av både bilder, kärnor visas i blått och nanopartiklar i rött. Skala barerna är 10 µm. nanopartiklar visualiseras som vita ljusa prickar i cellens cytoplasma. De bilder visar att ett stort antal nanopartiklar har angett cellerna efter 24 h inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Typ av nanopartiklar | Lösningsmedel | Nanopartiklar storlek (nm) | Polydisperisty (nm) | Polydispertion Index (PDI) |
| Obestruket Falcarindiol | Vatten | 83,9 | ± 23,9 | 0.571 |
| PBS | 71 | ± 20,3 | 0.571 | |
| Lipid belagda Falcarindiol | PBS | 91,6 | ± 6,4 | 0.141 |
| PBS efter 3h | 93,5 | ± 5,7 | 0.122 | |
| Lipid belagda Falcarindiol + DiI | PBS | 74,1 | ± 6,7 | 0.182 |
Tabell 1: olika konstruktioner av de fabricerade nanopartiklarna. Storlek och polydispertion index för de syntetiserade falcarindiol nanopartiklarna, beroende på vätska och nanopartiklar. Falcarindiol nanopartiklar med och utan en lipid kappa var fabricerade. Olika koncentrationer av pälsen komponenter testades. Partikel sammanläggning testades efter 3 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett detaljerat protokoll för fabricera lipid-belagd nanopartiklar för drogen leverans med enkelt, snabbt, reproducerbar och skalbar snabb injektion metod för lösningsmedel skiftande var följt27,28 och presenteras i detta papper, som tillämpas på falcarindiol. Genom att kontrollera hastigheten på injektion av den organiska fasen i vattenfasen och genom beläggning lipider på lämpliga koncentrationer för att belägga falcarindiol kärnan, kunde partikel i intervallet sub-100 nm erhållas framgångsrikt. Möjligheten att inducerade polydispertion på grund av inblandning av turbulenta blandning för falcarindiol nederbörden ensam kontrollerades av närvaron av beläggning lipider. Strukturen på dessa lipid-belagd nanopartiklar liknade de low-density Lipoproteinerna med undantag av uteslutandet av den infödda 500.000 kDa ApoB100 och ytterligare förekomsten av PEG-lipider för sterisk stabilitet). Detta passivt riktade drogen leveranssystem tillåter inkapsling av en rad speciellt hydrofoba läkemedel och diagnostiska material18,19, minska den immunologisk reaktionen och öka ackumulering i cancervävnader16,18. Dessutom beroende på de nedbrytning läkemedelsreaktioner (hydrolys, enzymolysis) skyddar drogen leveranssystemet läkemedlet från nedbrytning under dess cirkulation invivo.
Därför falcarindiol nanopartiklar, med en lipid-encapsulating enskiktslager som innehåller en ren kärna av renat drogen, designades och fabricerade. Lipid enskiktslager beläggningen bestod av DSPC, kolesterol och DSPE-PEG 2000, med fluorescerande etikett DiI. Tillverkning av partiklarna genomfördes med metoden snabb injektion av lösningsmedel växling, som består av en snabb injektion av en enprocentig lösning som innehåller nanopartiklar komponenterna i ett överskott av vattenfasen (1:9). Storleken på nanopartiklarna mättes med DLS och upptaget av nanopartiklarna undersöktes i hMSCs och avbildas med hjälp av fluorescens och konfokalmikroskopi.
Obestruket nanopartiklar kan också erhållas, med storleken på 71 ± 20,3 nm. Dock efter följande det protokoll som beskrivs ovan, var nanopartiklar av 74,1 nm ± 6,7 nm, med polydispertion värden av 0.182, fabricerade. Således, när du har ändrat nanopartiklarna genom att lägga till lipid pälsen, storlek och PDI av nanopartiklar var reducerad, vilket gör dem mer lämpade för narkotika leverans.
Det är viktigt att vara mycket medveten om de kritiska steg i protokollet, såsom vikten av att spruta position när du injicerar den organiska fasen, beredningen av nanopartiklarna på samma dag som behandling för att undvika aggregering och odling av celler dagen innan att säkerställa adekvat sammanflödet. Alla steg i den första delen av protokollet kan i själva verket anses vara kritisk, eftersom de antingen påverkar storleken på nanopartiklarna eller slutliga koncentration av aktiv förening och beläggning lipider. Med tanke på ”koncentration” som en viktig parameter, är steg 1.2, 1.4, 1.6, 1,15 och 1.16 kritiska. Med tanke på 'nanopartiklar storlek' som en viktig parameter är steg 1,7, 1.11 och 1.12 kritiska.
Fluorescens och konfokalmikroskopi visade att nanopartiklar hade angett cellerna, och ett stort antal nanopartiklar var spridda i cytoplasman i varje cell. Dessa resultat tyder på att nanopartiklar utformad i denna studie kan fungera som en ny och stabil drog leveranssystem för falcarindiol.
Denna teknik ger en enkel, snabb och reproducerbar metod för att kapsla in olika cancerläkemedel och begränsningarna av metoden bedöms med lipid pälsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Moustapha Kassem (Odense universitetssjukhus, Danmark) för de humana mesenkymala stamcellerna. Författarna vill tacka den danska Medical Bioimaging Center för tillgång till deras Mikroskop. Författarna vill tacka Carlsberg och Villum grunden för ekonomiskt stöd (till E.A.C.). Författarna erkänner det ekonomiska stödet vid Niels Bohr professur utmärkelsen från danska National Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
References
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).
- Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228 (2017).
- Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).
- Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
- dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).
- Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).
- Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).
- Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
- Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).
- Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).
- Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).
- Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).
- Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).
- Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).
- Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).
- Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
- Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
- Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. , (2018).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).
- Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).
- Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).
- Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).
- Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
- Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
- Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). , (2018).
- Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , Stockholm, Sweden. (2017).
