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Behavior

व्यवहार ट्रैकिंग और मैक्सिकन Cavefish के Neuromast इमेजिंग

Published: April 6, 2019 doi: 10.3791/59099
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, 2Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, 3Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Summary

यहां, हम मैक्सिकन cavefish व्यवहार और एक यंत्रोसंवेदी प्रणाली के महत्वपूर्ण धुंधला की एक श्रृंखला के उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए तरीकों वर्तमान । इन विधियों का उपयोग मुफ्त सॉफ्टवेयर और कस्टम-लिपियों बनाया, व्यवहार के अध्ययन के लिए एक व्यावहारिक और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं ।

Abstract

गुफा में रहने वाले जानवरों ने अपने सदा अंधेरे और खाद्य-विरल वातावरण के अनुकूल बनाने के लिए रूपात्मक और व्यवहारिक लक्षण की एक श्रृंखला विकसित की है । इन लक्षणों के अलावा, foraging व्यवहार एक व्यवहार विशेषता विकास के कार्यात्मक लाभ में उपयोगी खिड़कियों में से एक है । प्रस्तुत इस के साथ साथ कंपन आकर्षण व्यवहार (VAB: एक अनुकूली foraging व्यवहार) और गुफा के संबद्ध यंत्रोन्सरों की इमेजिंग-अनुकूलित tetra, Astyanax mexicanus विश्लेषण के लिए तरीकों को अद्यतन कर रहे हैं । इसके अलावा, विधियों अतिसक्रियता और सोने के नुकसान सहित अतिरिक्त cavefish व्यवहार की एक श्रृंखला के उच्च थ्रपुट ट्रैकिंग के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । Cavefish भी ऐसोसिएलिटी, दोहराव व्यवहार और उच्च चिंता दिखा । इसलिए, cavefish विकसित व्यवहार के लिए एक पशु मॉडल के रूप में सेवा करते हैं । इन विधियों का उपयोग करें मुक्त-सॉफ़्टवेयर और कस्टम-बनाई गई स्क्रिप्ट जो अंय प्रकार के व्यवहार के लिए लागू किया जा सकता है । इन विधियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के लिए व्यावहारिक और लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करते हैं ।

Introduction

मैक्सिकन tetra, Astyanax mexicanus (teleostei: कैरेमिडी), दो मौलिक अलग वैकल्पिक morphs होने के लिए मछलियों के बीच अद्वितीय है-एक नज़र, सतह आवास morph और एक अंधे, गुफा आवास morph कई अलग शामिल आबादी1. हालांकि आकारिकी और शरीर विज्ञान में अलग है, वे अभी भी2,3interfertile हैं । इन interfertile morphs को तेजी से विकसित किया है प्रतीत होता है (~ २०,००० साल)4, जो उंहें तेजी से अनुकूलन के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाता है । Cavefish स्वाद कलियों की वृद्धि हुई घनत्व सहित अलग रूपात्मक और व्यवहार लक्षण के एक सुइट है जाना जाता है, यंत्रोंसरों की संख्या में वृद्धि, एक हिल उत्तेजना, सक्रियता की एक विशेष आवृत्ति को देखते foraging व्यवहार, और अनिद्रा. इनमें से कई व्यवहार की संभावना एक साथ विकसित की है, जिनमें से कुछ के लिए5 foraging और अंधेरे और खाद्य-विरल वातावरण6,7में ऊर्जा संरक्षण के लिए गुफाओं के अंधेरे में लाभप्रद होने का सुझाव दिया गया है ।

कई विकासवादी मॉडल प्रणालियों में, यह कैसे पर्यावरण के जवाब में पशु आकारिकी और व्यवहार में परिवर्तन पर एकीकृत ज्ञान प्राप्त करने के लिए मुश्किल है क्योंकि अधिकांश प्रजातियों जटिल वातावरण में एक सतत ढाल भर में वितरित कर रहे हैं । हालांकि, गुफा और सतह morph Astyanax कि अत्यधिक विषम एक तेज ecotone द्वारा delineated वातावरण में विकसित के बीच स्टार्क के विपरीत एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में उभरते astyanax के लिए नेतृत्व किया है पशु विकास को समझते हैं । यह संभव बनाता है और अधिक आसानी से लिंक जीन और विकासात्मक प्रक्रियाओं अनुकूली लक्षण और पर्यावरण में चयन के साथ । इसके अलावा, astyanax में इन लक्षण के हाल ही में जैव चिकित्सा जांच से पता चला है कि इन लक्षण समानांतर मानव लक्षण8,9,10हो सकता है । उदाहरण के लिए, सामाजिकता और नींद की हानि, और सक्रियता का लाभ, दोहराव व्यवहार, और कोर्टिसोल स्तर क्या autism स्पेक्ट्रम विकार के साथ मनुष्यों में मनाया जाता है के समान हैं8.

कई व्यवहार और रूपात्मक लक्षण के जटिल सह-विकास को संबोधित करने के लिए, अंतर्निहित आनुवंशिक और आणविक रास्ते को उजागर करने के लिए उनमें से कई परख करने के लिए लाभप्रद है । प्रस्तुत इस के साथ साथ गुफा की डिग्री की विशेषता के लिए तरीके हैं-सतह, गुफा, और Astyanaxके संकर morphs के व्यवहार phenotypes प्रकार. फोकल व्यवहार के लिए phenotype विशेषता का विश्लेषण कर रहे है गुफा-foraging व्यवहार अनुकूलित (कंपन आकर्षण व्यवहार, vab के रूप में अब से को संदर्भित), और hyperactivity/ भी प्रस्तुत संवेदी प्रणाली के लिए एक इमेजिंग विधि है13vab के साथ जुड़े । हाल ही में, व्यवहार assays चलाने के लिए कई खुले स्रोत ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर उपलब्ध14,15बन गए हैं । ये छोटे वीडियो के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं, 10 मिनट से भी कम समय । हालांकि, यह समस्याग्रस्त हो जाता है अगर वीडियो क्योंकि गहन गणना के लंबे समय/ सक्षम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर महंगा हो सकता है । प्रस्तुत तरीकों मुख्य रूप से फ्रीवेयर का उपयोग करें और इसलिए लागत प्रभावी और उच्च थ्रपुट तरीकों पर विचार कर रहे हैं । इसके अलावा इन विधियों के आधार पर प्रतिनिधि परिणाम भी शामिल हैं ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं "प्रयोगशाला पशु देखभाल के सिद्धांतों" में वर्णित दिशा निर्देशों के बाद किया जाता है (राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रकाशन no. 85-23, संशोधित १९८५ संस्थान) और Manoa संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग पर Hawai ' i विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित समिति पशु प्रोटोकॉल 17-2560-3 ।

1. कंपन आकर्षण व्यवहार (VAB) परख (पूरी रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के लिए ≤ 10 मिनट)

नोट: एक अवरक्त संवेदनशील कैमरे का उपयोग करें या एक USB वेब कैमरा को संशोधित करके एक अवरक्त कैमरा का निर्माण । एक यूएसबी वेब कैमरा को संशोधित करने के लिए, एक विस्तृत JoVE में इस cavefish मुद्दे (इस ए. mexicanus मुद्दे से), या पूरक सामग्री में एक संक्षिप्त वर्णन Keene लैब द्वारा प्रस्तुत विवरण देखें ।

  1. रिकॉर्डिंग सेटअप
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कैमरा स्थिति में है, फिर भी, और विषय (ओं) से उचित फोकल लंबाई में दर्ज किया जा रहा है, polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) पाइप से बाहर एक ब्लैक बॉक्स फ्रेम का निर्माण, १२० सेमी एच एक्स ४५ सेमी L x ९० सेमी डब्ल्यू मापने ।
    2. फ्रेम के निर्माण के बाद, यह एक hydroponic कृषि के लिए इरादा के रूप में एक प्लास्टिक अंधकार पर्दा के साथ कवर ।
    3. फ्रेम के शीर्ष पर, सी के रूप में एक ही व्यास को मापने केंद्र पर अवरक्त कैमरा के लिए एक खिड़की के साथ एक काले एक्रिलिक बोर्ड डाल समायोज्य ज़ूम लेंस घुड़सवार । इस बॉक्स के अंदर, VAB परख उपकरण प्लेस (चित्रा 1) ।
  2. कंपन उपकरण
    नोट: कंपन एक छोटे से समारोह जनरेटर का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं ।
    1. निम्नलिखित विधियों के लिए, ०.१५ मिमी की एक आयाम और ४० हर्ट्ज की एक आवृत्ति के लिए धुन कंपन, जो आवृत्ति है कि आकर्षण की एक अधिकतम प्रतिक्रिया elicits5,16.
    2. फ़ंक्शन जनरेटर को क्षैतिज फ़ेसिंग स्पीकर से कनेक्ट करें ।
    3. एक ७.५ मिमी व्यास ग्लास रॉड 14 सेमी लंबाई में गर्म गोंद या एक गैसकेट चिपकने का उपयोग करके स्पीकर के चेहरे पर धूल कवर करने के लिए संलग्न हैं ।
    4. इस छड़ और नीचे का सामना करने के लंबवत, एक और ७.५ मिमी व्यास ग्लास रॉड 4 सेमी लंबाई में संलग्न (चित्रा 1) ।
  3. व्यवहार परख
    1. एक प्रायोगिक एक बेलनाकार परख वातानुकूलित पानी से भरा चैंबर में 4 दिनों के लिए एक प्रयोगात्मक एक. mexicanus (६.८ के बीच पीएच-७.०, चालकता लगभग ७०० μs, तापमान लगभग 22 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक 12/12 एल/ जांच करें कि क्या मछली forage के लिए उनकी विलंबता देख कर आदत है । उनके घर टैंक की तुलना में अब विलंबता और अधिक acclimation समय की जरूरत है इंगित करता है । Acclimation भर में, एक बार रहने के साथ एक दिन फ़ीड Artemia nauplii ।
    2. दिन पहले परख के दिन (acclimation के 3 दिनों के बाद), ताजा वातानुकूलित पानी के साथ परख चैंबर में पानी की जगह ।
    3. परख के दिन (acclimation के 4 दिनों के बाद), भोजन की प्रयोगात्मक मछली से वंचित जब तक परख के बाद पूरा हो गया है । तुरही कंपन से उनकी प्रतिक्रिया बदल जाएगी.
    4. VirtualDub फ्रीवेयर में रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेट करें17: 15 फ्रेम्स/एस, कोडेक: x264vfw, रिकॉर्डिंग अवधि: 3 मिनट 30 एस ।
    5. कंपन-उत्सर्जक उपकरण तैयार (चरण १.२) ४० हर्ट्ज के लिए ट्यूनिंग द्वारा देखें । उपकरण के स्पष्टीकरण के लिए चित्रा 1 देखें । किसी भी पानी में घुलनशील रसायनों को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ हिल ग्लास रॉड कुल्ला ।
    6. अंधेरे में काम कर रहे, रिकॉर्डिंग मंच पर परख सिलेंडर काले बॉक्स में एक अवरक्त backlight द्वारा प्रबुद्ध और मछली 3 मिनट के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      1. 3 मिनट acclimation के बाद, रिकॉर्ड 3 मिनट वीडियो के 30 एस । रिकॉर्डिंग की शुरुआत में, पानी कॉलम (लगभग ०.५ सेमी गहराई) में हिल ग्लास रॉड डालें ।
      2. किसी भी शोर या कंपन बनाने से बचें, जबकि स्थिति हिल गिलास पानी में रॉड के रूप में मछली भी सबसे मामूली गड़बड़ी समझ सकते हैं ।
      3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि व्यवहार के 3 मिनट से अधिक रिकॉर्ड किया गया है वीडियो रिकॉर्डिंग प्रारंभ करने के 30 s के भीतर इस कार्यविधि को समाप्त करें ।
    7. यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस चरण के दौरान कोई त्रुटियां न हो, रिकॉर्डिंग करते समय वीडियो मॉनिटर करें ।
    8. रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद, बेलनाकार परख चैंबर से हिल ग्लास रॉड हटाने और रिकॉर्डिंग मंच से परख चैंबर हटा दें । अगली मछली के लिए 1.3.5 से दोहराएं ।
  4. वीडियो विश्लेषण
    नोट: एक प्रारूप है कि ImageJ लोड कर सकते है केवल विंडोज ऑपरेटिंग सिस्टम18 (तालिका 1) पर काम करता है में कोडेक परिवर्तित ।
    1. ImageJ और सेट विश्लेषण मापदंडों के लिए एक पठनीय प्रारूप में संपीड़ित avi वीडियो कंवर्ट ।
      1. AviSynth_260. exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap बिल्ड १७८ (http://pismotec.com/pfm/ap/), और avfs ver 1.0.0.5 या ver 1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/) स्थापित करें । ध्यान दें कि यह विधि प्रोग्राम/ उपलब्ध कराई गई वेबसाइट लिंक उचित संस्करणों के लिए मार्गदर्शन करेंगे (तालिका 1) ।
      2. Avs_creater. bat (पूरक फ़ाइल) डबल-क्लिक करके बैच फ़ाइल चलाएँ । Avs वीडियो फ़ाइल पर दायां क्लिक करें विश्लेषण किया जा करने के लिए (avs avs_creater. batद्वारा बनाई गई फ़ाइलों से चयन करें) ।
      3. ImageJ में ट्रैकर प्लगइन का उपयोग कर वीडियो विश्लेषण के रूप में ImageJ मैक्रो (पूरक फ़ाइल macro_vab_moko. txt) की लोडिंग की आवश्यकता है, खींचें द्वारा मैक्रो लोड और IMAGEJ के GUI खोल में ड्रॉप । यह मैक्रो निंन विश्लेषण के लिए कुछ हॉट कुंजियां सक्षम करेगा ।
      4. कार्यशील निर्देशिका में, "Process_ImageJ" हकदार एक नया फ़ोल्डर बनाएँ ।
      5. का विश्लेषण किया जा करने के लिए. avs फ़ाइल पर दायां क्लिक करें ( avs_creater. batद्वारा बनाई गई avs फ़ाइलों से चयन करें) । त्वरित माउंट विकल्प का चयन करें । Avs फ़ाइल एक बाहरी ड्राइव के रूप में रखा गया है के बाद, avi फ़ाइल ImageJ में (avi फ़ाइल ". avi" के साथ समाप्त नाम है) खोलें ।
      6. दूरी माप के पैमाने पर सेट करने के लिए, सीधे लाइन चयन उपकरणका उपयोग कर चैंबर भर में एक सीधी रेखा ड्राइंग द्वारा परख चैंबर के व्यास का चयन करें, तो विश्लेषण > सेट स्केल समारोह पर क्लिक. उदाहरण के लिए, इनपुट ९.४ सेमी अगर एक बेलनाकार पकवान का उपयोग कर एक ९.४ सेमी भीतरी व्यास के साथ । निंनलिखित वीडियो विश्लेषण के सभी भर में पैमाने को मानकीकृत करने के क्रम में वैश्विक के रेडियो बॉक्स की जांच करें ।
    2. बाइनरी स्टैक में कनवर्ट करें और विश्लेषण चलाएँ ।
      1. अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग करके परख चैंबर क्षेत्र की नकल और फिर ठीक क्लिक करें और छवि का चयन > डुप्लिकेट। इस समय, आगे विश्लेषण के लिए रखने के लिए फ्रेम की सीमा निर्दिष्ट, उदाहरण के लिए, पहले २,७०० फ्रेम रखने के बाद हिल रॉड पानी में प्रवेश किया (15 एफपीएस पर यह ठीक है वीडियो के 3 मिनट है) ।
      2. स्पष्ट परख चैंबर के बाहर और कीबोर्ड की संख्या पट्टी पर गर्म कुंजी 7 मार से एक द्विआधारी छवि को परिवर्तित ।
      3. पृष्ठभूमि स्पष्ट करता है और एक संकेत प्रकट होता है के बाद, एक काले डॉट जोड़ने के लिए अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग करके हिल कांच की छड़ की स्थिति को इंगित करने के लिए पहले से ही भरने के साथ काला करने के लिए सेट करें फ़ंक्शन । ठीक क्लिक करें और थ्रेशोल्ड समायोजन पर ले जाने के लिए एक प्रॉंप्ट दिखाई देगा ।
      4. एक द्विआधारी (सभी काले और सफेद) मछली की छवि बनाने के लिए दहलीज सेट करें । थ्रेशोल्ड समायोजित करें ताकि मछली पूरे वीडियो क्लिप्स में देखा जा सकता है, और उसके बाद का चयन करेंलागू ।
      5. संख्या पट्टी पर गर्म कुंजी 8 मार द्वारा "ट्रैकर" प्लगइन चलाएँ. १०० के लिए ंयूनतम पिक्सेल आकार सेट करें जब संकेत दिया और ठीकमारा, हिल रॉड और बाइनरी वीडियो के सभी 3 मिनट के लिए प्रति फ्रेम मछली के बीच की दूरी पैदा ।
      6. वीडियो में शोर से उत्पंन एमआईएस ट्रैकिंग समायोजित करें । ऐसा करने के लिए, परिणाम विंडो की जांच करने के लिए फ्रेम की पहचान करने के लिए कि वस्तु संख्या 3 या उच्चतर-उन फ्रेम में अतिरिक्त वस्तुओं का संकेत (जैसे, पानी में कणों या रॉड की पारदर्शी बांह की छाया) के अलावा में "छड़ी" और "मछली" फ्रेम. पेंटब्रश उपकरण का उपयोग कर किसी भी अतिरिक्त ऑब्जेक्ट्स को निकालें ।
      7. पूरे वीडियो की छवियों का एक द्विआधारी ढेर निर्यात करने के लिए संख्या पट्टी पर गर्म कुंजी 9 मारो (मामले में यह विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है) और निर्देशांक और दूरी डेटा के साथ एक. xls फ़ाइल (अनुपूरक फ़ाइलें CF01. xls, Threshold_CF01. Tif और, Trac_CF01. tif ). गर्म कुंजी 9 भी वर्तमान वीडियो के साथ जुड़े सभी फाइलों को बंद कर देंगे । सभी replicates के लिए 1.4.2.6 के माध्यम से 1.4.2.1 चरणों को दोहराएं ।
      8. एक स्प्रेडशीट में एकाधिक ट्रैकर परिणाम फ़ाइलें (. xls) को मजबूत करने के लिए मैक्रो स्क्रिप्ट (supplement file JoVE_2cmVAB_template_15fps. xlsm) चलाएँ और रॉड से एक १.५ सेमी क्षेत्र में संख्या और दृष्टिकोण की अवधि की गणना । सबसे कम ०.५ s नहीं स्थाई दृष्टिकोण गिना नहीं होगा । ब्याज के विशेष प्रश्नों के अनुसार एक दृष्टिकोण के रूप में गिना दूरी और समय के मापदंडों में परिवर्तन ।
    3. सभी विश्लेषणों को समाप्त करने के बाद PC डिस्क-स्थान छोड़ें । डिस्क स्थान-avi. avi और. avi. avs फ़ाइलें (सॉफ़्टवेयर द्वारा जनरेट किया गया एक्सटेंशन) को मुक्त करने के लिए माउंटेड फ़ाइलों को निकालें-एक बैच फ़ाइल को चलाकर multiunmountdel. bat एक ही फ़ोल्डर में जहां avs_creater. bat खंड 1.4.1.2 में चलाया गया था ।

2. नींद और सक्रियता परख (24 एच रिकॉर्डिंग)

  1. व्यवहार परख
    1. एक कस्टम डिजाइन 10 एल एक्रिलिक रिकॉर्डिंग मछलीघर के प्रत्येक चैंबर में 4 दिन या अधिक के लिए पांच प्रयोगात्मक मछली Acclimate (४५.९ सेमी x १७.८ सेमी x १७.८ सेमी; लंबाई x चौड़ाई x गहराई, क्रमशः) वातानुकूलित पानी से भरा (1.3.1 कदम देखें) ।
      1. काले एक्रिलिक बोर्डों आकार में बराबर कक्षों बनाने के साथ प्रत्येक व्यक्ति के चैंबर अलग, ८८.९ मिमी × १७७.८ मिमी × १७७.८ मिमी को मापने (चित्रा 2). प्रत्येक टैंक को कवर करने के लिए कक्षों के बीच कूद से मछली को रोकने के लिए सुनिश्चित करें ।
      2. प्रोग्राम शक्ति टाइमर सेट स्वचालित रूप से 12 एच के लिए सफेद एलईडी लाइट चालू करने के लिए, और 12 ज के लिए बंद acclimation अवधि के दौरान हर दिन (उदाहरण के लिए, पर प्रकाश सेट 7 बजे और बंद पर 7 बजे) । यह मछली की circadian ताल चढ़ना (यदि यह entrainment के लिए अतिसंवेदनशील है) होगा ।
      3. सभी टैंकों में भी तीव्रता के साथ फैलाना प्रकाश प्रदान करने के लिए के माध्यम से सफेद और अवरक्त प्रकाश पारित करने के लिए डिफ्यूज़र के रूप में 10 एल टैंक के लिए समान आयाम के अपारदर्शी, सफेद एक्रिलिक बोर्डों का प्रयोग करें ।
      4. Acclimation भर में, एक बार जीना artemia nauplii के साथ फ़ीड और प्रत्येक मछलीघर में स्पंज फिल्टर के माध्यम से वातन प्रदान करते हैं ।
        नोट: सुनिश्चित करें कि मछली लगातार समय पर खिलाया जाता है (यानी, 9:00 बजे प्रति दिन 1x) खिलाने के रूप में भी circadian लय19की entrainment को प्रभावित कर सकते हैं ।
      5. जांच करें कि क्या मछली forage के लिए उनकी विलंबता देख कर आदत हो गए हैं । उनके घर टैंक की तुलना में एक लंबी विलंबता अधिक acclimation समय की जरूरत है इंगित करता है ।
    2. दिन परख के दिन से पहले (3 दिन या acclimation के अधिक), नए सिरे से वातानुकूलित पानी के साथ परख चैंबर में पानी की जगह (1.3.1 कदम देखें) ।
    3. VirtualDub सॉफ्टवेयर में रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेट करें17: 15 फ़्रेंस/s, कोडेक: x264vfw, रिकॉर्डिंग अवधि: ८६,४०० s (24 h) ।
    4. रिकॉर्डिंग चरण के पीछे अवरक्त backlight पर बारी ( चित्रा 2देखें) । स्क्रीन पर VirtualDub लाइव छवि देख कर, उन्हें यूएसबी कैमरा चेहरा बनाने के लिए प्रत्येक मछलीघर की स्थिति को समायोजित ।
    5. रिकॉर्डिंग के दिन, लाइव आर्टेमिया nauplii के साथ प्रत्येक मछली फ़ीड, सभी स्पंज फिल्टर को हटाने, और अवरक्त backlight पर बारी.
    6. सुबह में 24 h रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें (उदाहरण के लिए, प्रारंभ समय 9 A.M. है और समाप्ति समय है 9 A.M. अगले दिन) । वीडियो कैप्चर करना और किसी गड़बड़ी से बचने के लिए स्थान सुरक्षित करना प्रारंभ करें. आवधिक रूप से जांचें कि रिकॉर्डिंग चल रही है ।
    7. 24 h के बाद, सुनिश्चित करें कि वीडियो सही रूप से सहेजा गया है । ट्रैक और मछली के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए पीसी कार्य केंद्र के लिए वीडियो स्थानांतरण ।
  2. वीडियो विश्लेषण
    1. सबसे पहले, प्रकाश व्यवस्था को देखते हुए वीडियो की गुणवत्ता की जांच करें । यदि प्रत्येक अनुभाग में एक मछली है की जांच करें, और अगर वहां किसी भी विदेशी आंदोलनों कि गलत कारण ट्रैकिंग कर सकते हैं ।
    2. मछलीघर से बाहर ट्रैकिंग एमआईएस से बचने के लिए मुखौटा तैयार करें । दो मास्क बनाओ: एक ' के लिए भी ' और ' के लिए एक अजीब ' मछली, टैंक में उनके अनुक्रम आदेश के आधार पर ।
    3. ऊपर वर्णित मुखौटों के लिए "विषम" और "सम" नाम के दो फोल्डर बनाएं । प्रत्येक इन फ़ोल्डरों में SwisTrack की ट्रैकिंग पैरामीटर फ़ाइल ले जाएँ ।
    4. SwisTrack ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर (अनुपूरक फ़ाइल tracking_odd. swistrack या tracking_even. swistrack) की ट्रैकिंग पैरामीटर फ़ाइल खोलें. वीडियो फ़ाइल और मास्क फ़ाइल का पथ निर्दिष्ट करें, फिर ट्रैकिंग पैरामीटर फ़ाइल से बाहर निकलें और बाहर आएं । प्रयोग के अनुसार ब्लॉब संख्या और अधिकतम पिक्सल पैरामीटर "ब्लॉब डिटेक्शन" और "निकटतम पड़ोसी ट्रैकिंग" घटकों में क्रमशः समायोजित करें ।
    5. डबल-क्लिक करें जो स्वचालित रूप से SwisTrack सॉफ़्टवेयर (अनुपूरक फ़ाइल swistrack_1. exe, swistrack_2. exe, swistrack_3. exe या swistrack_4.exe-ये सभी एक ही निष्पादन योग्य फ़ाइलें हैं) को खोलने जाएगा जो win-स्वचालन सॉफ़्टवेयर की स्क्रिप्ट चलाने के लिए SwisTrack में अनुकूली पृष्ठभूमि घटाव अद्यतन करने में एड्स ।
    6. Tracking_odd. swistrack या tracking_even. swistrack ट्रैकिंग पैरामीटर फ़ाइल को लोड करने के लिए Swistrack सॉफ़्टवेयर में खोलें । पैरामीटर लोड करने के बाद, ट्रैकिंग प्रारंभ करने के लिए चलाएँ बटन दबाएँ.
    7. प्रारंभिक ९,००० फ्रेम के भीतर (६०० एस, अर्थात्, दर्ज वीडियो के पहले 10 मिनट), जांच करें कि क्या मछली ट्रैकिंग अनुकूली पृष्ठभूमि घटाव, द्विआधारी मुखौटा, और निकटतम पड़ोसी SwisTrack के घटक सूची में ट्रैकिंग को देखकर काम कर रहा है (देखें संलग्न वीडियो) । फिर घटक सूची में अनुकूली पृष्ठभूमि घटाव का चयन करें ।
    8. जीत-स्वचालन फिर से शुरू करने और ट्रैक करने के लिए पीसी छोड़ने के लिए कीबोर्ड पर आर बटन मारो. ट्रैकिंग 4-CPU कोर और 8 GB स्मृति के साथ डेस्कटॉप के लिए 5-7 h प्रति 24 h वीडियो ले जाएगा । आवश्यकताओं के अनुसार, CPU में कोर की संख्या तक (एक एकल वीडियो फ़ाइल के विषम और यहां तक कि एरेनस सहित) कई SwisTrack प्रक्रियाओं चलाते हैं । उदाहरण के लिए, 4-कोर एक बार में 4 वीडियो हैंडल कर सकते हैं ।
    9. इस ट्रैकिंग के दौरान, अन्य उद्देश्यों के लिए इस PC का उपयोग करने से बचें क्योंकि विन-स्वचालन प्रोग्राम माउस सूचक को स्वचालित रूप से ले जाता है. प्रारंभिक ९,००० फ़्रेंस निंन कार्यविधि में छोड़ दिया जाएगा ।
    10. आवंटित 3 Perl स्क्रिप्ट फ़ाइलें (1.fillupGaps2.pl, 2. calc_fish_id_moko_robust, और 3.pl, 3. Sleep_summary_4cm_movingWindow. pl) ट्रैकिंग फ़ाइलों को ' सम ' और ' अजीब ' फ़ोल्डर्स में SwisTrack द्वारा उत्पंन युक्त फ़ोल्डर के लिए (कदम 2.2.3 देखें) ।
    11. वीडियो से वीडियो के एक फ्रेम क्लिप VirtualDub का उपयोग कर और ImageJ में एक तस्वीर के रूप में इस क्लिप आयात करें । ImageJ में मछलीघर (४५.९ सेमी) की लंबाई का चयन करें और पिक्सेल/ 1.fillGaps2.pl में एक पाठ संपादक कार्यक्रम में पिक्सेल/Cm अनुपात लिखें और सहेजें ।
    12. लॉंच CygWin कार्यक्रम, एक यूनिक्स emulator है । SwisTrack फ़ोल्डर जिसमें 3 Perl स्क्रिप्ट आदेश पंक्ति पर cd का उपयोग कर की स्थिति जानें ।
    13. Perl स्क्रिप्ट टाइप करके चलाएं पर्ल 1.fillGaps.pl। इन तीन Perl लिपियों मछलीघर के एक अद्वितीय चैंबर के लिए प्रत्येक ट्रैकिंग फ़ाइल आवंटित और नींद की अवधि और तैराकी दूरी का विश्लेषण करेंगे, जबकि मछली जाग गया था । यह विश्लेषण समाप्त करने के लिए 1-2 h ले जाएगा ।
    14. यह निर्धारित करने के लिए summary_sleep. txt नामक पाठ फ़ाइल का आकलन करें कि क्या विश्लेषण से ड्रॉप की गई फ़्रेंस की संख्या स्वीकार्य रूप से कम है; 15% से कम फ़्रेम अनुपलब्ध स्वीकार्य माना जाता है ।
    15. की प्रतिलिपि बनाएँ और विश्लेषित परिणाम summary_sleep. txt से किसी स्प्रेडशीट के लिए मैक्रो (अनुपूरक फ़ाइल Sleep_12hr12hr_TEMPLATE. xlsm) के साथ चिपकाएँ ।
    16. ट्रैकिंग फ़ाइलों का सारांश डेटा को निकालने के लिए मैक्रो चलाएँ ।

3. डसपेमी या मशीनोसंवेदी न्यूरोमैस्ट के डसपेि धुंधला

नोट: DASPMI और DASPEI धुंधला करना प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और अंधेरे की स्थिति में किया जाना चाहिए । निंनलिखित प्रोटोकॉल DASPMI और DASPEI दोनों के लिए एक उदाहरण के रूप में DASPMI का उपयोग करके है ।

  1. अभिरंजक संधि
    1. धुंधला स्टॉक समाधान के 1 एल के कुल के लिए (25 μg/एमएल), DASPEI या DASPMI क्रिस्टल के ०.०२५ जी dH2ओ के 1 एल और इसे रात भर भंग करने के लिए जोड़ें । 4 ° c पर संग्रहित समाधान रखें और प्रकाश से रक्षित करें ।
    2. २.५ में मछली विसर्जित μg/मिलीलीटर DASPMI या DASPEI वातानुकूलित पानी में भंग (1.3.1 कदम देखें) ४५ मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे वातावरण में ।
    3. ४५ मिनट के बाद, DASPMI या DASPEI समाधान और एक बर्फ में विसर्जन द्वारा anesthetize से मछली निकालें-६६.७ μg/मिलीलीटर buffered-एथिल 3-aminobenzoate मीथेन सल्फोनेट नमक (MS222) के साथ वातानुकूलित पानी की स्नान ।
    4. एक पेट्री डिश प्लेट और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीर में माउंट मछली । Z-स्टैक छवियां ले जाएं और निंन विश्लेषण के लिए. tif फ़ाइलों के रूप में सहेजें ।
  2. छवि विश्लेषण का उपयोग ImageJ
    1. . Tif फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर के अंदर, ImageJ मैक्रो फ़ाइल (neuromast_imagej. txt) का टेम्पलेट चिपकाएँ और "process_imagej" शीर्षक वाला नया फ़ोल्डर बनाएँ. ImageJ मैक्रो फ़ाइल में, वर्तमान निर्देशिका के लिए पथ सेट करें ।
    2. ImageJ लॉंच करें और मैक्रो फ़ाइल को GUI में खींचकर या फ़ाइल को खोलने और मैक्रो फ़ाइल का चयन > क्लिक कर के मैक्रोज़ खोलें ।
    3. मैक्रो चलाएँ ≫ मैक्रोज़पर क्लिक करके मैक्रो चलाएँ. इसके बाद मैक्रो विश्लेषण किए जाने के लिए किसी चित्र फ़ाइल को स्वचालित रूप से खोल देगा । यदि चित्र फ़ाइल नहीं खुलती है, तो मैक्रो ≫ फ़ाइल पिक-अपक्लिक करें ।
    4. Neuromast quantification के लिए, बहुभुज उपकरणका उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें.
    5. ब्याज की नकल क्षेत्र के लिए गर्म कुंजी 5 मारो ।
    6. पिछली छवि से अतिरिक्त या अनुपलब्ध neuromast के लिए डॉट्स निकालने या जोड़ने के लिए पेंट उपकरण का उपयोग करें और फिर 6दबाएं । 6से टकराने के बाद, दो नई खिड़कियां दिखाई देगा: क्रमांकित न्यूरोमैस्ट डॉट्स और कुल न्यूरोमैस्ट मात्रा के साथ एक मेज की योजना ।
    7. हिट 7 दोनों फ़ाइलों को बचाने के लिए: एक फ़ाइल. tif छवि फ़ाइल के रूप में संग्रहीत है और अंय एक. xls फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है । इन फ़ाइलों को संग्रहीत करने के बाद, विश्लेषण के लिए एक नई चित्र फ़ाइल खुलेगी ।
    8. मैक्रो स्क्रिप्ट (sn_number_diameter. xlsm) चलाकर एक स्प्रेडशीट में प्रत्येक मछली के neuromast गणना को समेकित ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत परिणाम क्या प्रस्तुत विधियों के साथ प्राप्त किया जा सकता है के प्रतिनिधि उदाहरण हैं । इसलिए, परिणाम थोड़ा प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर दोनों cavefish और सतह मछली के लिए यहां प्रस्तुत लोगों से विचलित कर सकते हैं ।

कंपन आकर्षण व्यवहार

VAB के लिए प्रतिनिधि परिणाम दोनों गुफा और सतह मछली के लिए चित्रा 3 में पाया जा सकता है । सतह मछली में बढ़त-निंनलिखित व्यवहार ध्यान दें (चित्रा 3a; एक विशेषता cavefish के साथ साझा) और हिल छड़ी (चित्रा 3a) के लिए cavefish के मजबूत आकर्षण । शिखर आकर्षण स्तर cavefish के लिए ३५ हर्ट्ज के पास मनाया गया (चित्रा 3 डी) नहीं बल्कि सतह मछली (चित्रा 3c), दो morphs के व्यवहार phenotypes में एक प्रमुख अंतर का प्रतिनिधित्व. इस आवृत्ति के आसपास आकर्षण में सबसे अधिक संभावना शिकार या खाद्य वस्तुओं20,21द्वारा बनाई गई कंपन की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है ।

नींद और सक्रियता परख

मानदंडों के साथ साथ इस्तेमाल किया सो परिभाषित प्रतिक्रिया थ्रेसहोल्ड पहले से निर्धारित करने के लिए प्रभावी होना Astyanax11। नींद की चमक की विस्तारित अवधि की विशेषता है और > 60 एस और ऊंचा प्रतिक्रिया सीमा12,22,23की गतिहीनता के रूप में परिभाषित किया गया है । सतह मछली की तुलना में, कम नींद durations लार्वा और वयस्क cavefish11,12में होते हैं, इसलिए, सो assays सभी उम्र के व्यवहार phenotype astyanax के लिए एक प्रभावी तरीका है । जबकि cavefish कम दिखाया-नींद (चित्रा 4B, cavefish में कम नींद की अवधि), वे भी अतिसक्रिय हैं (चित्र 4a).

मशीनोसंवेदी तंत्रिकोणों का डसपेमी या डसपेि धुंधला होना

Neuromasts संवेदी कोशिकाओं है कि आसानी से DASPEI या DASPMI के साथ दाग किया जा सकता है और vivo में एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया से बना रहे हैं । प्रस्तुत परिणाम डपमी धुंधला होने का परिणाम था । सतही न्यूरोमैस्ट की संख्या सतह मछली (चित्रा 5c, डी) के साथ तुलना में cavefish के कपाल क्षेत्र में बढ़ाया है, और दोनों आकार-यंत्रोसंवेदी बाल कोशिकाओं की संख्या की एक प्रॉक्सी-और सतही न्यूरोमैस्ट की संख्या कर रहे हैं सकारात्मक कंपन आकर्षण व्यवहार (हिल रॉड के लिए दृष्टिकोण की संख्या: चित्रा 5A,बी) के स्तर के साथ सहसंबद्ध ।

सॉफ्टवेयर विश्लेषण संस्करण वेबसाइट
avfs गतिविधि नींद/ संस्करण 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth वब संस्करण 2.6.0 http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin गतिविधि नींद/ संस्करण 2.11.0 https://www.cygwin.com/
इमेजेज वाब और DASPEI संस्करण 1.52 ई https://imagej.nih.gov/ij/
pfmap गतिविधि नींद/ निर्माण १७८ http://pismotec.com/download/(तल पर "डाउनलोड संग्रह" लिंक पर)
SwisTrack गतिविधि नींद/ संस्करण 4 https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
WinAutomation गतिविधि नींद/ संस्करण 8 https://www.winautomation.com/(इस प्रक्रिया के लिए स्वतंत्र स्टैंड-अलोन अनुप्रयोग)
विंडोज ऑपरेटिंग सिस्टम VAB और गतिविधि नींद/ 7, 8 या 10 https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw सभी िरा ना https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

तालिका 1. इन विश्लेषणों में प्रयुक्त फ्रीवेयर की सूची, और स्रोत वेबसाइट ।

Figure 1
चित्रा 1 : कंपन आकर्षण व्यवहार परख प्रयोगात्मक उपकरण के योजनाबद्ध । एक ग्लास रॉड एक वक्ता से जुड़ी ४० हर्ट्ज की एक आवृत्ति के लिए tuned है और वीडियो रिकॉर्डिंग की शुरुआत में लगभग ०.५ सेमी की गहराई से जलमग्न । यह आंकड़ा योशिज़ावा एट अल.5से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2 : नींद परख प्रयोगात्मक उपकरण के योजनाबद्ध । टैंक कस्टम ०.७ सेमी मोटी पारदर्शी एक्रिलिक बोर्डों से बने हैं; पट ०.३ सेमी मोटी पूरी तरह से अपारदर्शी काले एक्रिलिक बोर्डों हैं । टैंक के इस भाग के लिए अपारदर्शी ब्लैक एक्रिलिक बोर्डों का प्रयोग किया जाता है ताकि मछली एक दूसरे को देख न सके । (क) शीर्ष दृश्य: ध्यान दें कि टैंक के बाहरी कक्षों आवक पट झुका दिया है करने के लिए कैमरे के कोण में मतभेदों को समायोजित । (ख, ग) सामने और पक्ष विचार, क्रमशः । (घ) सभी टैंकों में प्रकाश की तीव्रता को समरूप करने के लिए विसारक के माध्यम से फ्रारेड प्रकाश से गुजरने वाले तीन टैंकों की सरणी बैकलिट । ध्यान दें कि प्रत्येक टैंक का ओरिएंटेशन इतना समायोजित किया जाता है कि इसके संबंधित चैंबर में प्रत्येक मछली के सभी आंदोलनों दिखाई देते हैं । पैनल (सी) और (डी) 16से संशोधित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्रा 3 : एक 3 के प्रतिनिधि परिणाम- मिनट कंपन आकर्षण व्यवहार परख। (क, ख) सतह मछली (A) और cavefish (B) के स्विमिंग पथ के शीर्ष दृश्य; नियमों पथ है कि मछली 3 मिनट के वीडियो के दौरान लिया के निशान हैं । केंद्र में ब्लैक डॉट हिल ग्लास रॉड के स्थान इंगित करता है । wrMtrck ImageJ प्लगइन मछली24निशान कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ग, घ) सतह मछली (सी) और cavefish (D) कंपन की एकाधिक आवृत्तियों को उजागर से परिणामों की तुलना । प्रत्येक डॉट प्रत्येक मछली का प्रतिनिधित्व करता है । डार्क शैडेड क्षेत्रों अंतश् चतुर्थक रेंज हैं । ध्यान दें कि सभी आवृत्तियों भर में, सतह मछली कंपन के लिए उल्लेखनीय आकर्षण नहीं दिखा जबकि cavefish ३५ हर्ट्ज के पास आकर्षण में एक अधिकतम दिखा । (ग, घ) 16से संशोधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 4
चित्रा 4 : गतिविधि विश्लेषण के लिए कई उपायों से प्रतिनिधि परिणाम - सतह मछली और cavefish में दैनिक गतिविधि पैटर्न । (A-B) दिन (पीली पट्टियां) और रात (काली पट्टियां) तैराकी दूरी के स्कोर (10 मिनट प्रति एम, ए), और नींद की अवधि (१,००० s/ प्रत्येक बार मतलब का मतलब ± मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करता है । नीले तारे सतह मछली (एस एफ) और cavefish (Cf) के बीच सांख्यिकीय तुलना के लिए महत्व के स्तर से संकेत मिलता है । Cavefish और सतह मछली काफी अलग दिन रात गतिविधियों है । प्रत्येक phenotype के लिए दो तरह ANOVA आँकड़े हैं: स्विमिंग दूरी के लिए (क) सतह मछली (एस एफ) और cavefish (Cf) के बीच: एफ१,३९९ = १८५.८, पी < ०.००१, दिन और रात के बीच: एफ१,३९९ = २६.९, पी < ०.००१, जनसंख्या के बीच बातचीत और दिन-रात: F१,३९९ = ३.६, P = ०.०६० (महत्वपूर्ण नहीं: एन एस); सोने की अवधि के लिए (B) एस एफ और Cf के बीच: f१,३९९ = २३७.९, p < ०.००१, दिन और रात के बीच: f१,३९९ = १६४.१, p < ०.००१, जनसंख्या और दिन-रात के बीच अन्योन्यक्रिया: f१,३९९ = २६.५, p < ०.००१ । दोनों के लिए विश्लेषण, N = २०० और २०१ सतह मछली और cavefish के लिए, क्रमशः । दिन और रात की गतिविधियों के बीच अंतर Bonferroni सुधार के साथ पोस्ट-हॉक युग्मित टीपरीक्षण द्वारा परीक्षण किया गया था और काले तारक द्वारा चिह्नित । पर्मालिंक P < ०.००१. * * अर्थ P < ०.०१. डेटा का एक सबसेट पुन: उपयोग किया गया और 11से अद्यतन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 : VAB और neuromast के बीच संबंधों के प्रतिनिधि परिणाम । (क, ख) VAB और neuromast संख्या और cavefish में आकार, सतह मछली, और सतह मछली एक्स cavefish के F1 संकर संतति के बीच संबंध । ध्यान दें कि कंपन आकर्षण के सामांयीकृत स्कोर (दृष्टिकोण की संख्या के वर्ग जड़) सकारात्मक neuromast बहुतायत के साथ सहसंबद्ध है (पियरसन सहसंबंध गुणांक आर = ०.६२, पी < ०.००१) और neuromast व्यास (pearson सहसंबंध गुणांक r = ०.३१, P < ०.०१) । पैनल ए और बी 5से संशोधित कर रहे हैं । (ग, घ) (ग) एक सतह मछली और (घ) एक cavefish के गाल क्षेत्र में न्यूरोमैस्ट के धुंधला डापमी । इनसेट में स्केल बार (ग) और (घ) १.० मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

अनुपूरक सामग्री । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

इन विधियों प्रस्तुत आसान करने के लिए उपयोग कर रहे हैं, लेकिन अपने फ्रीवेयर मूल की प्रकृति के कारण प्रदर्शन करने के लिए जटिल हो सकता है । इसलिए, यह उच्च किसी भी वास्तविक प्रयोग से पहले परीक्षण assays और विश्लेषण करने की सिफारिश की है ।

प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक ढांचे की स्थापना के बाद डेटा उत्पादन की दर तेजी से हो सकती है । एक बार स्थापित, यह VAB परख के लिए 7 मिनट में दो मछली रिकॉर्ड संभव है, 24 में 30 मछली गतिविधि के लिए/नींद परख, और २.५ में एक मछली neuromast इमेजिंग के लिए 3 मिनट के लिए, अंतिम छवि पर कब्जा करने के लिए MS222 anस्थेसिया से शुरू । वीडियो और छवि विश्लेषण के durations काफी अलग कंप्यूटर के प्रदर्शन के आधार पर इस्तेमाल कर सकते हैं । एक 4-कोर CPU और राम के 8 GB के साथ एक पीसी का उपयोग करके, VAB विश्लेषण मछली प्रति 5-7 मिनट ले सकते हैं, गतिविधि/नींद विश्लेषण 30 मछली के समूह के प्रति 6-8 एच ले सकते हैं, और neuromast छवि विश्लेषण मछली (एक पक्ष या छवियों के दोनों पक्षों के प्रति 5 या 10 मिनट लग सकते है कपाल क्षेत्र, क्रमशः) । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) वीडियो विश्लेषण के लिए एक विकल्प है । यह जानवर ट्रैकिंग लेकिन महंगी में बहुत शक्तिशाली है (जैसे, आधार सॉफ्टवेयर ~ USD $5, 000USD और बहु ट्रैकिंग मॉड्यूल ~ USD $4000) । इस समय, हमारे ट्रैकिंग तरीकों विशेष रूप से गतिविधि के लिए ट्रैकिंग की तुलना सटीकता, प्राप्त करने के लिए लगता है/नींद विश्लेषण, यानी, लापता तख्ते आम तौर पर कुल फ्रेम के 15% से कम कर रहे हैं । इस विधि भी चार प्रतिकृति (अनुपूरक तालिका 1) में एक उच्च reproducibility दिखाया । हालांकि, Windows OS और Linux/Unix OS में मूल कोडिंग की समझ के बिना इस प्रणाली को विकसित करने में कठिनाई स्वीकार किया जाना चाहिए ।

मछली acclimation अवधि के दौरान, और पहले और व्यवहार assays के दौरान, यह प्रयोगात्मक मछली के लिए सबसे अच्छा संभव है और लगातार रहने की स्थिति प्रदान करने के लिए आवश्यक है । यह एक ही समय में उच्च गुणवत्ता वाले भोजन और हर दिन राशि खिलाने और उच्च पानी की गुणवत्ता (कम अमोनिया, नाइट्रेट, nitrates, और भंग ऑर्गेनिक्स, ~ pH 7, और इसी तरह की चालकता को बनाए रखने शामिल है ७०० μS) । शोर-शराबे से परेशान न होकर किसी क्षेत्र में असेस प्रदर्शन करना भी जरूरी है । शोर चलीं, और ध्वनियों खड़खड़ाने व्यवहार प्रतिक्रियाओं और गतिविधि को बदल सकते है/ मछली को संभालने के दौरान यंत्रोचित इकाइयों को होने वाले नुकसान के स्तर को कम करने के लिए मछली का अंतरण करते समय फाइन-मेष फिश नेट का प्रयोग मददगार होता है; यह neuromasts के बलगम cupula को नुकसान पहुंचाने से बचने में मदद मिलेगी ।

DASPEI डाई मछली पर घातक प्रभाव है, लेकिन अत्यधिक जोखिम विषाक्त प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, 2 एच के लिए daspei समाधान में मछली विसर्जित के बाद-बेहोशी की वसूली के दौरान मृत्यु दर की संभावना बढ़ा देंगे । DASPEI धुंधला करना प्रकाश-संवेदनशील है और इसलिए अंधेरे परिस्थितियों में किया जाना चाहिए ।

फ्रीवेयर अधिष्ठापन के लिए के रूप में, AviSynth सॉफ्टवेयर, Avisynth आभासी फ़ाइल प्रणाली (avfs), और Pismo फाइल लेखा परीक्षा पैकेज (pfmap) विशिष्ट संस्करणों के साथ मिलकर काम करने के लिए आवश्यक है । यह इस प्रोटोकॉल द्वारा पुष्टि की है कि avfs (वी 1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) और pfmap (1.7.8) एक साथ काम करते हैं, लेकिन कम से नवीनतम pfmap बिल्ड फ़ाइल बढ़ते प्रक्रिया के लिए काम नहीं किया था । इस कारण से, सॉफ्टवेयर संस्करण (तालिका 1) पर ध्यान देना । VirtualDub ३२-बिट संस्करण के बजाय ६४-bit के तहत बेहतर काम करता है । 15 फ़्रेम प्रति s की सेटिंग एक अच्छा समय समाधान प्रदान करता है और अत्यधिक संग्रहण खंड (24-h स्लीप परख वीडियो के लिए १.६ GB और एक VAB वीडियो के लिए 3 MB) की आवश्यकता नहीं है । ImageJ के लिए, प्रमुख कठिनाई मैक्रो में फ़ाइल पथ की स्थापना से आ सकते हैं । Windows OS में, फ़ाइल पथ आम तौर पर "C:Document\my Document\..." के रूप में व्यक्त किया जा सकता है । ImageJ मैक्रो जावा पर्यावरण के तहत चलाता है और एक अतिरिक्त की जरूरत है "\" फ़ाइल पथ के लिए, कि है, "C \:D ocument\ \ कृपया उदाहरण ImageJ मैक्रो फ़ाइल देखें । इसके अलावा, यह दो plugins, स्लाइस हटानेवाला और वस्तु25ट्रैकर स्थापित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, और गर्म कुंजी (कुंजीपटल शॉर्टकट) 6 और 8, क्रमशः असाइन करें, ताकि विश्लेषण निर्बाध काम (plugins > शॉर्टकट जोड़ें > शॉर्टकट्स... 26 ). SwisTrack ट्रैकिंग पैरामीटर सेट करने के लिए एक फ़ंक्शन है, लेकिन यह संभव है कि एक फ़्रीज़ और/या क्रैश ट्रैकिंग पैरामीटर सेट करते समय हो सकता है । यह नोटपैड + + जैसे किसी पाठ संपादक अनुप्रयोग में पैरामीटर को संपादित करने के लिए बेहतर है । पैरामीटर सेटिंग्स के विवरण के लिए, कृपया27देखें । Cygwin (Unix एंयूलेटर) इंस्टॉलर Perl पैकेज, जो डिफ़ॉल्ट स्थापना सेटिंग में शामिल नहीं है स्थापित करने के लिए एक पैकेज इंस्टॉलर शामिल हैं । यह विशेष रूप से Cygwin की स्थापना के दौरान Perl पैकेज का चयन करने के लिए अनुशंसित है ।

हालांकि, इस प्रक्रिया को एक पार्श्व रेखा से सीमित है व्यवहार (VAB) और तैराकी गतिविधि और नींद, इस जानवर ट्रैकिंग प्रणाली stereotypic दोहराव व्यवहार, सामाजिक बातचीत सहित अंय व्यवहार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और असममित उपयोग ( बाएं/दाएं) कपाल न्यूरोमैस्ट के foraging (लेटरलिटी)13के दौरान, हालांकि इन विधियों उथले एरेनस जैसे idtracker14द्वारा सुझाए गए उन के रूप में की आवश्यकता हो सकती है । विकसित व्यवहार के एक सूट के साथ, एक अलग लिपियों लागू करने के लिए ट्रैक एक्स का विश्लेषण कर सकते है और Y-अक्ष डेटा और विभिंन व्यवहार पैटर्न की जांच । इस विश्लेषण पाइपलाइन के लिए एक नींव प्रदान करने के लिए एक से अधिक व्यवहार में विकास के तंत्र को सुलझाने का इरादा है, और यह भी कैसे comorbid autism-जैसे व्यवहार आनुवंशिक, epigenetic द्वारा विनियमित रहे हैं, और पर्यावरणीय कारकों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम एन सहित योशिजावा लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । Cetraro, एन साइमन, सी Valdez, सी Macapac, जे Choi, एल लू, जे गुयेन, एस Podhorzer, एच Hernandes, जे फोंग, जे काटो, और मैं इस पांडुलिपि में प्रयुक्त प्रायोगिक मछली पर मछली की देखभाल के लिए भगवान । हम भी P. Masek सहित एक. Keene लैब सदस्यों को प्रशिक्षित करने के लिए मेरे IR सीसीडी कैमरा इकट्ठा करने के लिए धंयवाद । अंत में, हम मीडिया प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते है-सामाजिक विज्ञान के कॉलेज-वीडियो, विशेष रूप से बी स्मिथ, जे लाम, और एस व्हाइट बनाने के साथ उनकी अमूल्य मदद के लिए Hawai ' i Mānoa के विश्वविद्यालय में संचार के स्कूल । इस काम के हवाई समुदाय फाउंडेशन द्वारा समर्थित (16CON-७८९१९ और 18CON-९०८१८) और स्वास्थ्य NIGMS के राष्ट्रीय संस्थान (P20GM125508) मेरे लिए अनुदान था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) MilliporeSigma D3418
880 nm wave length black light Advanced Illumination BL41192-880
avfs freeware Version 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth freeware Version 2.6.0 http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin freeware Version 2.11.0 https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) Corning 3140-100 10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT Noldus Information  Technology, Wageningen, The Netherlands Version 14 https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black Jardin (through Amazon.com) NA Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs Brine shrimp direct BSEA16Z
ImageJ freeware Version 1.52e https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens Toyo NA Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator Seachem NA
Optical cast plastic IR long-pass filter Edmund optics 43-948 Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap freeware Build 178 http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt Instant Ocean RC15-10
SwisTrack freeware Version 4 https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) Microsoft Q2F-00013 Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation freeware Version 8 https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system Microsoft 7, 8 or 10 https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw freeware NA https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

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References

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