Summary
Her presenterer vi metoder for høy gjennomstrømming av en rekke meksikanske cavefish atferd og viktig farging av et mechanosensory system. Disse metodene bruker fri programvare og skreddersydd, gir en praktisk og kostnadseffektiv metode for studier av atferd.
Abstract
Hule-bolig dyr har utviklet en rekke morfologiske og atferdsmessige egenskaper til å tilpasse seg sine stadig mørke og mat-sparsom miljøer. Blant disse trekkene er foraging atferd en nyttig Vinduer i funksjonelle fordelene opptreden personlighetstrekk evolusjon. Presenteres her er oppdatert metoder for å analysere vibrasjon attraksjon atferd (VAB: en adaptiv foraging atferd) og bildebehandling av tilknyttede mechanosensors grotten-tilpasset Tetra, Astyanax mexicanus. I tillegg presenteres for høy gjennomstrømming sporing av en serie av flere cavefish inkludert hyperaktivitet og søvn-tap. Cavefish viser også sosiale, repeterende atferd og høyere angst. Derfor tjene cavefish som en dyremodell for utviklet atferd. Disse metodene bruker fri programvare og skreddersydd skript som kan brukes på andre typer atferd. Disse metodene gir praktiske og kostnadseffektive alternativer til kommersielt tilgjengelige for sporing.
Introduction
Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus (egentlige beinfisker: Characidae), er unik blant fisk for å ha to radikalt forskjellige alternativ morphs - en seende, overflate-bolig morph og en blind, hule-bolig morph består av flere forskjellige bestander1. Men forskjellige i morfologi og fysiologi, er de fortsatt interfertile2,3. Disse interfertile morphs synes å ha utviklet seg raskt (~ 20.000 år)4, noe som gjør dem en ideell modellsystem for studiet av rask tilpasning. Cavefish er kjent for å ha en rekke forskjellige morfologiske og atferdsmessige egenskaper inkludert økt tetthet smak knopper, økt antall mechanosensors, foraging atferd innstilt til en bestemt frekvens av en vibrerende stimulans, hyperaktivitet, og søvnløshet. Mange av disse virkemåtene trolig utviklet seg samtidig, noe som har blitt foreslått for å være fordelaktig i mørke huler foraging5 og Strømsparing i mørke og mat-sparsom6,7.
I mange evolusjonære modellsystemer er det vanskelig å skaffe integrert kunnskap om hvordan dyr morfologi og atferd endre svar for miljøet fordi de fleste arter er fordelt på en kontinuerlig forløpning i komplekse miljøer. Imidlertid har sterk kontrast mellom den hule og overflate morph Astyanax som utviklet seg i svært ulike miljøer som er preget av en skarp ecotone ført til Astyanax fremstår som en utmerket modell å forstå dyr evolusjon. Dette gjør det mulig å koble lettere gener og utviklingsprosesser adaptive trekk og utvalg i miljøet. Videre siste biomedisinsk undersøkelser av disse trekkene i Astyanax har vist at disse trekkene kan parallell menneskelige symptomer8,9,10. For eksempel er tap av sosialitet og søvn, og få hyperaktivitet, repeterende atferd og kortisol-nivået lik hva er observert hos mennesker med autisme spektrum lidelse8.
For å løse komplekse samtidig evolusjon av mange atferd og morfologiske egenskaper, er det fordelaktig å analysen mange av dem til å markere underliggende genetiske og molekylære trasé. Presenteres her er metoder for karakteriserer graden av hule-type atferdsmessige fenotyper av overflaten, hulen og hybrid morphs av Astyanax. Fokal atferd analysert betegner fenotypen er hule-tilpasset foraging atferd (vibrasjon attraksjon atferd, referert til heretter som VAB) og hyperaktivitet/hvile varigheten11,12. Også presentert er en bildebehandling metode for sensorisk systemet knyttet VAB13. Nylig mange åpen kildekode sporingsprogramvare for å kjøre atferdsmessige analyser har blitt tilgjengelig14,15. Disse fungerer godt for korte videoer, mindre enn 10 minutter. Det blir imidlertid problematisk Hvis videoen er lengre på grunn av intens beregning/sporing tid. Dugelig kommersielt tilgjengelig programvare kan være dyrt. Metodene presentert hovedsaklig freeware og derfor anses kostnadseffektivt og høy gjennomstrømming. Også inkludert er representativt resultater basert på disse metodene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer blir utført følge retningslinjene beskrevet i "Prinsipper for laboratoriet Animal Care" (National Institute of Health publikasjonen nummer 85-23, revidert 1985) og godkjent av University of Hawaii Manoa institusjonelle Animal Care og bruk Komiteen dyr protokollen 17-2560-3.
1. vibrasjon attraksjon atferd (VAB) analysen (≤ 10 min for hele innspillingen prosedyre)
Merk: Bruk infrarødt følsom kamera eller bygge et infrarødt kamera ved å endre en USB webcam. Hvis du vil endre en USB webcam, kan du se en detaljert beskrivelse presentert av Keene Lab i dette cavefish problemet ved JoVE (fra problemet A. mexicanus ) eller en kort beskrivelse i supplerende materiale.
- Opptak oppsett
- For å sikre at kameraet er i posisjon, fortsatt, og på riktig brennvidde fra motivet (r) registreres, bygge en svart boks ramme av polyvinylklorid (PVC) rør, måle 120 cm H x 45 cm L x 90 cm W.
- Etter byggingen av rammen, dekke det med en plast blackout gardin som tiltenkt for hydroponic landbruk.
- På toppen av rammen, sette en svart akryl bord med et vindu for av infrarødt kamera i sentrum måle samme diameter som C-montert justerbar zoomobjektiv. Inne i denne boksen, kan du plassere VAB analysen utstyret (figur 1).
- Vibrasjon apparater
Merk: Vibrasjoner er produsert med en liten funksjonsgenerator.- De følgende metodene, tune vibrasjoner til en amplituden av 0.15 mm og en frekvens på 40 Hz, som er frekvensen som utløser en maksimal respons attraksjon5,16.
- Koble funksjonsgenerator til en horisontal mot høyttaler.
- Knytte en 7,5 mm diameter glass stang 14 cm i lengde til støvdeksel på høyttaleren ved hjelp av hot-lim eller en pakning lim.
- Vinkelrett på denne stang og vender nedover, knytte en annen 7,5 mm diameter glass stang 4 cm i lengde (figur 1).
- Atferdsdata analyse
- Acclimate en eksperimentell A. mexicanus for 4 dager i en sylindrisk analysen kammer fylt med betinget vann (pH mellom 6.8 7.0, ledningsevne ca. 700 µS, temperatur ca 22 grader) med en 12/12 L/D-syklus. Sjekk om fisk har acclimated ved å observere deres ventetid å forage. Lengre ventetid enn deres hjem tank angir mer Akklimatisering tid er nødvendig. Gjennom acclimation, mate en gang om dagen med live Artemia nauplii.
- Dagen før dagen i analysen (etter 3 dager av acclimation), erstatte vann i analysen kammer med betinget ferskvann.
- På dagen for analysen (etter 4 dager av acclimation), frata eksperimentelle fisk mat til når analysen er fullført. Satiation vil endre deres svar vibrasjoner.
- Angi opptaksparametere for i virkelig freeware17: 15 rammer/s, kodeken: x264vfw, innspilling varighet: 3 min 30 s.
- Klargjør vibrasjon-emitting apparatet (se trinn 1.2) ved tuning til 40 Hz. Se figur 1 for forklaring av apparatet. Skyll den vibrerende stav glass med deionisert vann for å fjerne noen vannløselige kjemikalier.
- Jobbe i mørket, plassere analysen sylinderen på opptak scenen opplyst av en infrarød bakgrunnsbelysningen i den svarte boksen og la fisk å acclimate i 3 minutter.
- Etter 3 min acclimation, registrere 3 min 30 s video. Ved utbruddet av innspillingen, setter du inn vibrerende glass stangen i vannsøylen (ca 0,5 cm dybde).
- Unngå å gjøre noen støy eller vibrasjoner mens posisjonering vibrerende glass stangen i vannet som fisken kan forstand selv de mest mindre forstyrrelser.
- Fullfør denne fremgangsmåten innen 30 s starte videoinnspillingen slik at mer enn 3 minutter av registreres.
- Overvåke videoen under opptak å sikre at ingen feil oppstår i denne fasen.
- Når innspillingen, Fjern den vibrerende stav glass fra sylindriske analysen kammeret og fjern analysen kammeret fra opptak scenen. Gjenta fra 1.3.5 for neste fisken.
- Video analyse
Merk: Konvertere kodeken til et format som ImageJ kan laste fungerer bare på Windows operativsystem18 (tabell 1).- Konvertere komprimert avi video i et lesbart format for ImageJ og angi analyseparametrene.
- Installere AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap bygge 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) og avfs ver1.0.0.5 eller ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Merk at denne metoden program/versjon følsom. Forutsatt nettstedet koblingene vil lede til riktige versjoner (tabell 1).
- Kjøre batch-fil ved å dobbeltklikke avs_creater.bat (ekstra fil). Høyreklikk på avs video arkiv å bli analysert (Velg fra avs-filer som er opprettet av avs_creater.bat).
- Som video analyse bruker Tracker plugin i ImageJ krever lasting av makroen ImageJ (ekstra fil Macro_VAB_moko.txt), laste inn makroen ved å dra-og-slipp i det GUI skallet av ImageJ. Denne makroen kan visse hurtigtaster for følgende analyse.
- I arbeidsmappen, oppretter du en ny mappe kalt "Process_ImageJ".
- Høyreklikk på .avs filen som skal analyseres (Velg fra avs-filer som er opprettet av avs_creater.bat). Velg rask montering . Når filen avs er montert som en ekstern stasjon, åpne avi-filen i ImageJ (avi-filen har navnet slutter med "AVI").
- Sette omfanget av avstandsmåling, Velg diameteren for analysen kammeret ved å tegne en rett linje over kammeret lineær markeringsverktøyetog velger analyser > Angi skala funksjon. For eksempel inn 9,4 cm hvis bruker en sylindrisk rett 9.4 cm indre diameter. Merk radio i Global for å standardisere skalaen på tvers av alle de følgende video analysene.
- Konvertere binære bunke og Kjør analyse.
- Kopiere analysen kammeret området ved hjelp av verktøyet ellipse markering og deretter høyreklikk og velg bilde > Dupliser. På denne tiden, angi rammer å holde analyser, f.eks, holde først 2700 rammene etter den vibrerende stav inn vannet (ved 15 fps dette er nøyaktig 3 minutters video).
- Fjern utsiden av analysen kammeret og konvertere til en binære bilder ved å trykke hurtigtasten 7 i feltet Antall på tastaturet.
- Når bakgrunnen forsvinner og en melding vises, legger du til en svart prikk på senteret for å angi plasseringen av den vibrerende glass stav ved hjelp av markeringsverktøyet ovale allerede satt til svart med Fyll -funksjonen. Klikk OK og en melding vil vises for å gå videre til terskelverdi-justeringen.
- Angi terskelen å lage en binær (alle svart og hvitt) bilde av fisken. Juster terskelen slik at fisken kan sees i hele videoklipp, og velg deretter Bruk.
- Kjør "Tracker" plugg ved å treffe hot nøkkel 8 i nummer-feltet. Angi minste piksel til 100 når bedt om og trykk OK, genererer avstanden mellom den vibrerende stav og fisken per ramme for alle 3 min av binære video.
- Justere mis sporing generert av støy i videoen. For å gjøre så, når resultatvinduet for å identifisere rammene som returnerer objektnummeret 3 eller høyere indikerer ekstra objekter i disse rammene (f.eks partikler i vannet eller skyggen av gjennomsiktig armen av stangen) i tillegg til "stang" og "fisk" den ramme. Fjerne alle ekstra objekter ved hjelp av pensel verktøyet.
- Hit varm nøkkelen 9 på nummeret for å eksportere en binær bunke bilder av hele videoen (i tilfelle det er nødvendig å analyser på nytt) og en XLS-fil med koordinater og avstanden data (supplerende filer CF01.xls, Threshold_CF01.tif og Trac_CF01.tif ). Het nøkkel 9 vil også lukke alle filer knyttet til gjeldende video. Gjenta trinn 1.4.2.1 gjennom 1.4.2.6 for alle replikater.
- Løpe makroen skriften (supplerende fil JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) å konsolidere flere Tracker resultat-filene (XLS) i ett regneark og telle antall og varighet av tilnærminger i en 1,5 cm område fra stangen. Tilnærminger varer ikke minst 0,5 s vil ikke telles. Endre parameterne for avstand og tid regnet som en tilnærming etter bestemt spørsmål av interesse.
- Slipp PC-diskplass etter alle analyser. Fjerne monterte filer å frigjøre diskplass - avi.avi og. avi.avs filer (extensions generert av programvaren)-ved å kjøre en satsvis fil multiunmountdel.bat i den samme mappen der avs_creater.bat ble kjørt i delen 1.4.1.2.
- Konvertere komprimert avi video i et lesbart format for ImageJ og angi analyseparametrene.
2. søvn og hyperaktivitet analysen (24 timer opptak)
- Atferdsdata analyse
- Acclimate fem eksperimentelle fisk i 4 dager eller mer i for en tilpasset designet 10 L akryl opptak akvariet (45.9 cm x gjennomsnitt 17,8 cm x 17,8 cm, lengde x bredde x dybde, henholdsvis) fylt med betinget vann (se trinn 1.3.1).
- Skiller hvert individuelle kammer med svart akryl styrene gjør kamre lik størrelse, måler 88.9 mm × 177.8 mm × 177.8 mm (figur 2). Pass på å dekke hver tanken å forhindre fisken fra hoppe mellom kamre.
- Angi programmerbare timer for å automatisk slå hvit LED lys for 12 h, og av 12 h hver dag under acclimation perioden (for eksempel sette lys på kl 7 og av klokken 7 PM). Dette vil entrain døgnrytmen fisk (hvis det er utsatt for entrainment).
- Bruke ugjennomsiktig, hvit akryl styrene i samme dimensjon til 10 L tanken som diffusorer for å passere hvite og infrarøde lyset gjennom for å gi diffus lys med intensitet over alle tanker.
- Gjennom acclimation, mate når en dag med live Artemia nauplii og gir lufting gjennom Svamp filterene inne hver akvariet.
NOTE Sikre fisk fôres konsekvent ganger (dvs. 1 x per dag på 9:00) som Foringstid kan også påvirke entrainment døgnrytme19. - Sjekk om fisken har blitt acclimated ved å observere deres ventetid å forage. En lengre ventetid enn i deres hjem tank angir mer Akklimatisering tid er nødvendig.
- Dagen før dagen i analysen (3 dager eller mer av acclimation), erstatte vann i analysen kammer med fersk betinget vann (se trinn 1.3.1).
- Sett parameteren opptak i virkelig programvare17: 15 rammer/s, kodeken: x264vfw, innspilling varighet: 86400 s (24 timer).
- Aktivere infrarød bakgrunnsbelysningen bak scenen opptak (se figur 2). Ved å observere virkelig levende bilde på skjermen, Juster plasseringen av hver akvariet å gjøre dem ansikt USB kameraet.
- På dagen for opptaket, feed hver fisk med live Artemia nauplii, fjerne alle Svamp filterene og aktivere infrarød baklyset.
- Starte 24 timer i morgen (for eksempel starttidspunktet er 9 am og sluttiden er 9 am dagen). Start fange video og sikre plasseringen for å unngå en forstyrrelse. Periodisk sjekk at innspillingen kjører.
- Etter 24 timer, sørge for at video lagret riktig. Overføre video til PC-arbeidsstasjonen til spore og analysere fiskens atferd.
- Acclimate fem eksperimentelle fisk i 4 dager eller mer i for en tilpasset designet 10 L akryl opptak akvariet (45.9 cm x gjennomsnitt 17,8 cm x 17,8 cm, lengde x bredde x dybde, henholdsvis) fylt med betinget vann (se trinn 1.3.1).
- Video analyse
- Først, sjekk videoen kvaliteten ved å se på belysning. Sjekk Hvis det er en fisk i hver del, og hvis det er noen utenlandske bevegelser som kan forårsake mis sporing.
- Forberede masken å unngå mis sporing utenfor akvariet. Gjøre to masker: én for 'selv' og én for "rare" fisk, basert på sekvens rekkefølgen i tankene.
- Gjøre to brosjyre benevnt "rart" og "selv" for maskene beskrevet ovenfor. Flytte sporingskoden parameterfil av SwisTrack i hver av disse mappene.
- Åpne sporing parameterfil av SwisTrack sporing (supplerende filen Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack). Angi banen til videofilen og maske-filen, og lagre og avslutte sporing parameterfil. Justere blob tall og maksimal piksler parametere i "Blob oppdagelsen" og "Nærmeste nabo sporing" komponenter, henholdsvis, ifølge eksperimenter.
- Dobbeltklikk for å kjøre et skript seier-automatisering programvare som automatisk åpner SwisTrack programvare (supplerende fil swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe eller swistrack_4.exe- dette er alle de samme kjørbare filene), som hjelpemidler i å oppdatere adaptive bakgrunn subtraksjon i SwisTrack.
- Åpne Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack SwisTrack programvare for å laste inn sporingskoden parameterfil. Etter lasting parameterne, trykker du på Kjør-knappen til å finne.
- I de første 9000 rammene (600 s, dvs. første 10 min på den innspilte videoen), sjekk om fisk sporing fungerer ved å se på adaptive bakgrunn subtraksjon, binære maske, og nærmeste nabo sporing i komponentlisten av SwisTrack (se tilhørende video). Velg tilpasset bakgrunn subtraksjon i komponentoversikten.
- Trykk på R -knappen på tastaturet for å gjenoppta seier-automatisering og la PC å spore. Sporing vil ta 5-7 h 24 timer video for en stasjonær PC med 4 CPU kjerner og 8 GB minne. Etter behov, kan du kjøre flere SwisTrack prosesser (inkludert oddetalls- og arenaer i en enkelt video arkiv) opp antall kjerner i CPU. For eksempel kan 4 kjerner håndtere 4 videoer samtidig.
- Under sporing, unngå å bruke denne PCen til andre formål fordi seier-automasjon programmet automatisk flytter musepekeren. Første 9000 rammer forkastes i fremgangsmåten nedenfor.
- Tildele 3 Perl script-filer (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, og 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) til mappen som inneholder sporing filer generert av SwisTrack i 'like' og "merkelig" (se trinn 2.2.3).
- Klippet en ramme med video fra video arkiv bruker virkelig og importere dette klippet som et bilde til ImageJ. Velg lengden på akvariet (45.9 cm) i ImageJ og beregne piksler/cm forholdet. Skrive piksler/cm forholdet i 1.fillGaps2.pl i et tekstredigeringsprogram og lagre.
- Lansere CygWin program, en Unix-emulator. Finn mappen SwisTrack som inneholder de 3 Perl-skriptene ved hjelp av cd på kommandolinjen.
- Kjøre Perl-skript ved å skrive Perl 1.fillGaps.pl. Disse tre Perl-skript vil tilordne hver sporing-fil til en unik kammer av akvariet og analysere søvn varighet og svømming avstand mens fisken var våken. Det tar 1-2 h å fullføre analysen.
- Vurdere tekstfil kalt Summary_Sleep.txt å avgjøre om videobilder fra analysen er akseptabel lav; mangler færre enn 15% av rammer anses akseptabelt.
- Kopier og lim analysert resultatene fra Summary_Sleep.txt til et regneark med makroen (supplerende fil Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Kjør makroen for å trekke ut sammendragsdataene å spore filer.
3. DASPMI eller DASPEI farging av mechanosensory neuromasts
Merk: DASPMI og DASPEI flekker er lys-sensitive, og bør gjøres i mørke forhold. Etter protokollen er både DASPMI og DASPEI ved hjelp av DASPMI som et eksempel.
- Fargeprotokoll
- Totalt 1 L flekker lagerløsning (25 µg/mL), legge 0.025 g av DASPEI eller DASPMI krystaller til 1 L dH2O og la den løses over natten. Holde løsning lagret i 4 ° C og beskyttet mot lyset.
- Legg fisken i 2,5 µg/mL DASPMI eller DASPEI oppløst i betinget vann (se trinn 1.3.1) for 45 min i et mørkt miljø på 22 ° C.
- Etter 45 minutter, Fjern fisken fra DASPMI eller DASPEI løsning og bedøve ved nedsenkning i en isbadet betinget vann med 66.7 µg/mL bufret-etyl 3-aminobenzoate metan sulfonate salt (MS222).
- Montere fisk i en Petriskål plate og fotografi under fluorescerende mikroskop. Ta z-stakk bilder og bevare idet TIF-filer for følgende analyse.
- Bildeanalyse med ImageJ
- I mappen som inneholder TIF-filer, lim inn en mal med ImageJ makrofilen (Neuromast_ImageJ.txt) og opprette en ny mappe kalt "Process_ImageJ". I filen ImageJ makro, angir du banen til gjeldende katalog.
- Starte ImageJ og åpner makroen ved å dra makrofilen i GUI eller ved å klikke Fil > Åpne og velge makrofilen.
- Kjøre makroen ved å klikke makroer > Kjør makro. Makroen vil da automatisk åpne en bildefil som skal analyseres. Hvis bildefilen ikke åpnes, klikker du makro > fil plukke opp.
- For Neuromast kvantifisering, Velg området rundt bruker Polygonverktøyet.
- Finne den varme nøkkel 5 like regionen rundt.
- Bruke Maling verktøyet å fjerne eller legge til prikker for ekstra eller manglende neuromast fra forrige bildet og trykk 6. Etter å ha åpnet 6, to nye windows vises: ordningen med nummererte neuromasts prikker og en tabell med totalt neuromasts kvantifisert.
- Trykk 7 for å lagre både filer: en fil lagres som en TIF image arkiv og den andre er lagret som en .xls-fil. Når disse filene er lagret, åpnes en ny bildefil for analyse.
- Konsolidere neuromast teller hver fisk i ett regneark ved å kjøre makro-skript (SN_Number_Diameter.xlsm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene presenteres her er representative eksempler på hva som kan oppnås med metodene presentert. Derfor kan resultatene avvike litt fra de presenteres her for både cavefish og overflate fisk avhengig av eksperimentelle forhold.
Vibrasjon attraksjon atferd
Representant resultater for VAB finnes i Figur 3 for både hulen og overflate fisk. Merk kanten-følgende virkemåten overflate fisk (figur 3A, attributtet delt med cavefish) og sterk tiltrekningen av cavefish til den vibrerende stav (figur 3B). Attraksjon toppnivået ble observert i nærheten 35 Hz i cavefish (figur 3D), men ikke overflate fisk (Figur 3 c), som representerer en viktig forskjell i de atferdsmessige fenotyper av de to morphs. Toppen i attraction rundt denne frekvensen mest sannsynlig representerer frekvensen av vibrasjoner laget av byttedyr eller mat elementer20,21.
Søvn og hyperaktivitet analysen
Kriteriene brukes her til å definere søvn passer svar tersklene tidligere fastslått å være effektive for Astyanax11. Søvn er preget av lengre gågaten og er definert som ubevegelighet av > 60 s og forhøyet svar terskelen12,22,23. I forhold til overflate fisk, kortere søvn varighet oppstår i larver og voksne cavefish11,12, derfor søvn analyser er en effektiv måte å behaviorally fenotypen Astyanax i alle aldre. Mens cavefish viste mindre-søvn (figur 4B, kortere søvn varighet i cavefish), er de også hyperaktiv (figur 4A).
DASPMI eller DASPEI farging av mechanosensory neuromasts
Neuromasts består av sensoriske celler som kan være lett farget med DASPEI eller DASPMI og observert i vivo under fluorescerende mikroskop. Presentert resultatet var resultatet av DASPMI flekker. Antall overfladisk neuromasts forbedres i skallen regionen cavefish med overflate fisk (figur 5C, D), og både størrelsen-en proxy av antall hårcellene mechanosensory- og antall overfladisk neuromasts positivt korrelert med nivået av vibrasjon attraksjon atferd (mange tilnærminger til den vibrerende stav: figur 5A,B).
| Programvare | Analyse | versjon | nettsted |
| avfs | Aktivitet/hvilemodus | Versjon 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| AviSynth | VAB | Versjon 2.6.0 | http://AviSynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Aktivitet/hvilemodus | Versjon 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB og DASPEI | Versjon 1.52e | https://ImageJ.nih.gov/IJ/ |
| pfmap | Aktivitet/hvilemodus | Bygge 178 | http://pismotec.com/download/ (på "Last ned arkivet" linken nederst) |
| SwisTrack | Aktivitet/hvilemodus | Versjon 4 | https://en.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Aktivitet/hvilemodus | Versjon 8 | https://www.WinAutomation.com/ (gratis frittstående program for denne prosedyren) |
| Windows-operativsystemet | VAB og aktivitet/hvilemodus | 7, 8 eller 10 | https://www.Microsoft.com/en-us/Windows |
| x264vfw | Alle analyser | NA | https://sourceforge.net/Projects/x264vfw/ |
Tabell 1. Liste over freeware brukes i disse analyser og source nettstedet.
Figur 1 : Skjematisk av vibrasjon attraksjon atferdsdata analyse eksperimentelt utstyr. Glass stang festet til en høyttaler er stilt inn på en frekvens på 40 Hz og senkes til en dybde på ca 0,5 cm ved utbruddet av video innspillingen. Dette tallet er endret fra Yoshizawa et al.5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk av søvn analysen eksperimentelt utstyr. Tanker er skreddersydd fra 0,7 cm tykk gjennomsiktig akryl brett; septa er 0,3 cm tykk helt ugjennomsiktig svart akryl styrene. Ugjennomsiktig svart akryl styrene brukes for denne delen av tankene slik at fisken ikke se hverandre. (A) sett ovenfra: Merk at den ytre kammer av tanken har skråstilt innover septa til forskjeller i kameraet vinkel. (B, C) Front og side synspunkter, henholdsvis. (D) rekke tre tanker bakgrunnsbelyst med infrarødt lys passerer gjennom en diffuser for å homogenize intensiteten av lys over alle tanker. Merk at hver tankens orientering er justert slik at alle bevegelsene til hver fisk i sine respektive kammer er synlige. Panel (C) og (D) er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representant resultatene av 3- minutt vibrasjon attraksjon atferd analysen. (A, B) Ovenifra svømming banen til overflate fisk (A) og cavefish (B); redlines er spor av banen som fisken tok under 3 minutters video. Den svarte prikken på center viser av vibrerende glass stangen. wrMtrck ImageJ plugin ble brukt til å visualisere de fisk spor24. (C, D) Sammenligning av resultatene fra overflate fisk (C) og cavefish (D) utsatt for flere frekvenser av vibrasjon. Hvert punkt representerer hver fisk. Mørk skyggelagte områder er interquartile rekkevidde. Merk at over alle frekvenser, overflate fisk ikke viser kjente tiltrekning til vibrasjoner mens cavefish vise maks i attraksjon nær 35 Hz. (C, D) endret fra 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant resultater fra flere tiltak for aktivitetsanalyse - Diurnal aktivitet mønstre i overflate fisk og cavefish. (AB) Dag (gul barer) og natt (striper) score av avstand (m per 10 min, et) og søvn varighet (1000 s/12 h, B). Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± standardfeil betyr. Blå stjerner indikerer nivået av betydning for statistiske sammenligninger mellom overflate fisk (Sf) og cavefish (Cf). Cavefish og overflate fisk har signifikant forskjellig dag-natt-aktiviteter. Toveis VARIANSANALYSE statistikk for hver fenotypen: for bading avstand (A) mellom overflate fisk (Sf) og cavefish (Cf): F1,399 = 185.8, P < 0,001, dag og natt: F1,399 = 26,9, P < 0,001, samspillet mellom befolkningen og dag-natt: F1,399 = 3.6, P = 0.060 (ikke signifikant: født); for søvn varighet (B) mellom Sf og Cf: F1,399 = 237.9, P < 0,001, dag og natt: F1,399 = 164.1, P < 0,001, samspillet mellom befolkningen og dag-natt: F1,399 = 26,5, P < 0,001. For begge analyser, N = 200 og 201 for overflate fisk og cavefish, henholdsvis. Forskjellen mellom dag og natt aktiviteter ble testet av post-hoc koblet t-tester med Bonferroni rettelser og merket med svart stjerner. Angir P < 0,001. ** Angir P < 0,01. Et delsett av dataene var på nytt og oppdatert fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant resultatene av forholdet mellom VAB og neuromast. (A, B) Forholdet mellom VAB og neuromast og størrelse i cavefish, overflate fisk og F1 hybrid avkommet overflate fisk x cavefish. Merk at de normaliserte poengsummene vibrasjon attraksjon (kvadratroten av antall tilnærminger) er positivt korrelert med neuromast overflod (Pearson korrelasjonskoeffisient r = 0,62, P < 0,001) og neuromast diameter (Pearson korrelasjon koeffisient r = 0.31, P < 0,01). Panelet A og B er endret fra5. (C, D) DASPMI farging av neuromasts i kinnet regionen (C) en overflate fisk og (D) en cavefish. Skala bar i rammemarg (C) og (D) er 1,0 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende materiale. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene presentert er lett tilgjengelig, men kan være komplisert å utføre på grunn av sin freeware opprinnelse. Derfor anbefales å utføre prøve analyser og analyser før noen faktiske eksperimentering.
Frekvensen av data generasjon kan være rask når eksperimentelle og analytiske rammen er etablert. Når etablert, er det mulig å registrere to fisk i 7 min for VAB analysen, 30 fisk i 24 for analysen aktivitet/sove og en fisk i 2,5 til 3 min for neuromast tenkelig, starter fra MS222 anestesi til siste bildeoppløsning. Varighetene for video og bilde analysene kan variere betydelig avhengig av ytelsen til datamaskinen som ble brukt. Ved hjelp av en PC med 4-kjerne CPU og 8 GB RAM, VAB analyse kan ta 5-7 min per fisk, aktivitet/sove analyse kan ta 6-8 h per gruppe av 30 fisk og neuromast bildeanalyser kan ta 5 eller 10 minutter per fisk (enkelt side eller begge sider av bilder av den skallen regionen, henholdsvis). Kommersielt tilgjengelige sporing (Tabell for materiale) er et alternativ for video analyse. Det er veldig kraftig i dyr sporing men dyre (f.eks base programvare ~ USD$ 5, 000USD og flere sporing modul ~ USD$ 4000). I dette øyeblikk, våre oppfølgingsmetoder synes å oppnå sammenlignbare nøyaktigheten av sporing, spesielt for analysen aktivitet/sove, dvs, mangler rammer er vanligvis lavere enn 15% av totalt antall rammer. Denne metoden viste også en høy reproduserbarhet i fire gjentak (supplerende tabell 1). Imidlertid må vanskeligheten i å utvikle denne system uten en forståelse av grunnleggende koding i Windows OS og Linux/Unix-operativsystemet anerkjennes.
I fisk acclimation perioder, og før og under atferdsmessige analyser er det viktig å gi best mulig og konsekvent levekår for eksperimentell fisk. Dette inkluderer fôring mat av høy kvalitet på samme tid og beløpet hver dag og opprettholde høy vannkvalitet (lav ammoniakk, nitrat, nitritt og oppløste organiske ~ pH 7 og lignende ledningsevne rundt 700 µS). Det er også viktig å utføre analyser i et område ikke forstyrret av støy. Støyende fotspor og klirrende lyder kan endre atferdsmessige responser og aktivitet/sove-mønstre. For å redusere nivået av skade mechanosensory enheter mens håndtering fisk, er det nyttig å bruke en finmasket fisk netto ved overføring fisk; Dette vil bidra til å unngå å skade Slim Cúpula av neuromasts.
DASPEI dye har sublethal effekter på fiskens, men overdreven eksponering kan føre toksiske effekter. For eksempel vil fordyper fisken i den DASPEI løsningen for 2t øke sjansen for dødelighet under utvinning av etter anestesi. DASPEI flekker er lys-sensitive og derfor bør gjøres i mørke forhold.
Som for freeware installasjon, AviSynth programvare, Avisynth virtuelle filsystem (avfs) og Pismo arkiv montere tilsynet pakke (pfmap) kreves bestemte versjoner samarbeide sammenheng. Det ble bekreftet av denne protokollen at avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) og pfmap (1.7.8) arbeide sammen, men minst nyeste pfmap bygge ikke fungerte fil-montering prosedyren. Derfor ta hensyn til programvareversjoner (tabell 1). Virkelig fungerer bedre under den 32-biters versjonen i stedet for 64-biters. Innstillingen for 15 bilder per s gir en god tid løsning og krever ikke overdreven lagringsvolum (1,6 GB for en 24-h søvn analysen video og 3 MB en VAB video). For ImageJ, kan store problemer komme fra å sette filbaner i makroen. Inne Vinduer OS, kan banen til filen vanligvis uttrykkes som "C:Document\my Document\...". ImageJ makroen kjøres under Java-miljøet og trenger en ekstra "\" for banen til filen, som er "C\:Document\\my Document\\...". Se eksempel ImageJ makrofilen. I tillegg kan det være nødvendig å installere to plugins, Slice Remover og objektet bane25, og tilordne hurtigtaster (tastatur snarvei) 6 og 8, henholdsvis slik at analysene fungerer sømløst (Plugins > snarveier > Legg til Snarveier... 26 ). SwisTrack har en funksjon for å angi sporing parametere, men det er mulig at en fryse og/eller krasj kan oppstå under angivelse av sporingsparametre. Det er bedre å redigere parameteren i en tekst editor app som Notepad ++. Beskrivelse av parameterinnstillingene, kan du se27. Cygwin (Unix etterligner) installasjonsprogrammet inneholder en pakke installert å installere Perl pakken, som ikke er inkludert i standard installert innstilling. Det anbefales å velge spesielt Perl pakken under installasjonen av Cygwin.
Selv om denne fremgangsmåten er begrenset til en lateral linje-baserte atferd (VAB) og svømming aktivitet og søvn, kan dette dyret sporingssystem tilpasses til annet opptreden inkludert stereotypic repeterende atferd, sosial interaksjon og asymmetriske bruk ( venstre/høyre) av skallen neuromasts under foraging (laterality)13, selv om disse metodene krever grunne arenaer som foreslått av idTracker14. Med en rekke utviklet atferd, kan en bruke ulike skript for å analysere den merkede X - og Y - aksene data og undersøke forskjellige atferdsmønster. Denne analysen rørledningen er ment å gi et grunnlag for å løse mekanismen av utviklingen i flere atferd, og også hvordan komorbide autisme-lignende atferd er regulert av genetisk, epigenetic, og miljømessige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av Yoshizawa laboratoriet inkludert N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato og I. Herren for fisk pleie på eksperimentell fisken i dette manuskriptet. Vi takker også A. Keene lab medlemmer, inkludert P. Masek å trene meg å montere IR CCD kamera. Til slutt, vi ønsker å takke Media Lab - College samfunnsfag - School of Communications på University of Hawaii-Mānoa for deres uvurderlig hjelp med å lage videoen, spesielt B. Smith, J. Lam og S. hvitt. Dette arbeidet ble støttet av Hawaii-fellesskapet stiftelse (16CON-78919 og 18CON-90818) og National Institute for Health NIGMS (P20GM125508) gir meg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
