Summary
Здесь мы представляем методы для изучения высок объём серии мексиканской cavefish поведения и жизненно важных окрашивание mechanosensory системы. Эти методы используют сценарии свободного программного обеспечения и по индивидуальному заказу, обеспечивая практическим и экономически эффективным методом для исследования поведения.
Abstract
Местонахождения троглофильных животные эволюционировали ряд морфологических и поведенческих признаков адаптироваться к их вечно темных и продовольствия разреженные средах. Среди этих черт пищевое поведение является одним из полезных windows в функциональные преимущества поведенческих черта эволюции. Здесь представлены обновленные методы для анализа поведения притяжения вибрации (VAB: нагула адаптивной) и изображений из связанного mechanosensors пещера адаптированных тетра, Астианакт гракл. Кроме того методы представляются для отслеживания высок объём целого ряда дополнительных cavefish поведения, включая гиперактивности и потеря сна. Cavefish также показывают асоциальность, повторяющимся поведением и выше тревога. Таким образом cavefish служить животной модели для эволюционировали поведения. Эти методы используют свободного программного обеспечения и заказные сценарии, которые могут быть применены к другим видам поведения. Эти методы предоставляют практических и рентабельных альтернатив для коммерчески доступных отслеживания программного обеспечения.
Introduction
Мексиканский tetra, Астианакт гракл (Костистые рыбы: Харациновые), является уникальной среди рыб за два радикально различных альтернативных морф - зрячим, поверхность жилище морфинг и слепой, местонахождения троглофильных морфинг, состоит из нескольких отдельных население1. Хотя разные по морфологии и физиологии, они по-прежнему interfertile2,3. Эти interfertile морф, как представляется, быстро развивались (~ 20000 лет)4, что делает их идеальной модели системы для изучения быстрой адаптации. Cavefish, как известно, имеют набор различных морфологических и поведенческих признаков, включая увеличение плотности вкусовых рецепторов, увеличение количества mechanosensors, пищевое поведение настроены на определенной частоте вибрации стимул, гиперактивность, и бессонница. Многие из этих поведений, вероятно превратилась одновременно, некоторые из которых были предложены выгодным в темноте пещер для нагула5 и сохранение энергии в темные и продовольствия разреженные среды6,7.
Во многих системах Эволюционная модель это трудно приобрести комплексные знания о как животных морфологии и поведение изменения в ответ на окружающую среду, поскольку большинство видов распределены непрерывный градиент в сложных средах. Однако разительный контраст между пещеры и поверхности морфинг Астианакт , превратилась в весьма контрастные среды, проведенная путем резкого ЭКОТОН привело к Астианакт , возникающих как отличную модель для понимания эволюции животных. Это делает возможным более легко связать генов и процессы развития с адаптивной черты и выделения в окружающую среду. Кроме того недавние биомедицинские исследования эти черты в Астианакт показал, что эти черты могут параллельно человека симптомы8,9,10. Например потеря социальности и сна и получить гиперактивность, повторяющимся поведением и уровень кортизола похожи на то, что наблюдается у людей с аутизмом спектра расстройства8.
Для решения сложных коэволюции многих поведения и морфологических признаков, это выгодно для анализа многих из них, чтобы осветить основные генетические и молекулярные пути. Здесь представлены методы, характеризующих степень поведенческих фенотипы пещера тип поверхности, пещеры и гибридные морф Астианакт. Пещера адаптированных нагула поведение (поведение притяжения вибрации, отныне именуется VAB) и гиперактивности/сна продолжительность11,12фокуса поведения, проанализированы характеризовать фенотип. Также представлен метод визуализации для сенсорные системы, связанной с VAB13. В последнее время многие открытым исходным кодом отслеживания программного обеспечения для запуска поведенческих анализов стали доступны14,15. Они работают очень хорошо для коротких видеороликов, менее чем в 10 минут. Однако он становится проблематичным, если из-за интенсивных вычислений/отслеживания времени длиннее видео. Способных коммерчески доступное программное обеспечение может быть дорогим. Представленные методы главным образом использовать freeware и поэтому считаются экономически эффективных и высокопроизводительных методов. Также включены представитель результаты основаны на этих методах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры выполняются следующие руководящие принципы, описанные в «Принципы лабораторных животных ухода» (Национальный институт здравоохранения публикация № 85-23, пересмотренный 1985 года) и утверждены Гавайев в Маноа институциональный уход животных и использования Комитет животных протокол 17-2560-3.
1. вибрации притяжения поведение (VAB) пробирного (≤ 10 мин для всей записи процедуры)
Примечание: Используйте чувствительной инфракрасной или построить инфракрасной камеры, изменяя USB веб-камера. Чтобы изменить веб-камера USB, увидеть подробное описание представлено в Keene лаборатории в этом выпуске cavefish в JoVE (из этого выпуска A. гракл ), или краткое описание в разделе дополнительных материалов.
- Настройка записи
- Чтобы убедиться, что камера остается в положении, еще и на надлежащей Фокусное расстояние от предмета (ов) записывается, построить кадр черный ящик из поливинилхлорида (ПВХ) трубы, длиной 120 см H x 45 см L x 90 см.
- После строительства кадра накройте пластиковой занавес как один предназначен для гидропоники сельское хозяйство.
- На верхней части кадра Положите черный акриловой доски с окном для инфракрасной камеры в центре измерения того же диаметра как регулируемый зум-объектив C-монтируется. Внутри корпуса место VAB пробирного оборудование (рис. 1).
- Вибрации аппарата
Примечание: Вибрации производятся с использованием небольшой функции генератора.- Для следующих методов Настройка вибрации амплитудой 0,15 мм и частотой 40 Гц, который является частоту, которая вызывает максимальный ответ притяжения5,16.
- Подключение функции генератора к горизонтальной облицовочная спикера.
- С помощью горячего клея или клея прокладка приложите чехла на лице спикера стеклянный стержень диаметром 7,5 мм 14 см в длину.
- Перпендикулярно к этот стержень и вниз, прикрепить другой 7,5 мм Диаметр стеклянной палочкой 4 см в длину (рис. 1).
- Поведенческого анализа
- Акклиматизироваться экспериментальный A. гракл за 4 дня в цилиндрических Пробирной палаты, заполнены с кондиционерами воды (рН между 6,8-7,0, около 700 МКС проводимости, температуры приблизительно 22 ˚C) с 12/12 L/D циклом. Проверьте ли рыбы акклиматизировались, наблюдая их задержку для комбикорма. Дольше задержка в их дома танк чем указывает, требуется больше времени адаптационного. Течение адаптационного кормите один раз в день с живой науплий артемии .
- За день до дня проба (после 3 дней acclimation), заменить воду в Пробирной палате с пресной водой с кондиционерами.
- В день анализа (после 4 дней acclimation) лишить экспериментальной рыбы пищи до после завершения анализа. Насыщение изменит их реакции на вибрации.
- Задать параметры записи в VirtualDub бесплатная17: 15 кадров/сек, кодек: x264vfw, продолжительность записи: 3 мин 30 s.
- Подготовьте излучающих вибрации аппарата (см. шаг 1.2), тюнинг до 40 Гц. Смотрите Рисунок 1 для объяснения аппарата. Промойте вибрирующий Стеклодрот дейонизированной водой для удаления растворимых в воде химических веществ.
- Работая в темноте, место assay цилиндра на стадии записи, освещенный инфракрасной подсветки в черный ящик и позволяют рыбы, чтобы акклиматизироваться на 3 мин.
- После 3 минут acclimation запись 3 мин 30 s видео. В начале записи Вставьте вибрирующий стеклянной палочкой в толщу воды (примерно 0,5 см Глубина).
- Избегайте любой шум или вибрации позиционируя вибрирующий стеклянной палочкой в воде как рыбы могут смысле даже самые незначительные неудобства.
- Завершить эту процедуру в течение 30 s начала записи видео, чтобы убедиться, что регистрируется более чем на 3 мин поведения.
- Монитор видео во время записи, чтобы ошибки не происходит во время этой стадии.
- После окончания записи, удалите вибрирующий стеклянной палочкой из цилиндрических Пробирной палаты и пробирной палаты от этапа записи. Повторяйте от 1.3.5 для следующей рыбы.
- Видео анализ
Примечание: Преобразование в формат, который может загрузить ImageJ кодек работает только на Windows операционной системы18 (Таблица 1).- Преобразуйте сжатые avi видео в читаемый формат ImageJ и анализ набора параметров.
- Установка AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) и avfs ver1.0.0.5 или ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Обратите внимание, что этот метод является чувствительным версия программы. Указанный сайт ссылки приведут к правильной версии (Таблица 1).
- Запустите пакетный файл, дважды щелкнув avs_creater.bat (дополнительный файл). Щелкните правой кнопкой мыши на файле avs видео, чтобы быть проанализированы (выберите из avs файлов, созданных avs_creater.bat).
- Как видео-анализа с помощью плагина Tracker в ImageJ требует загрузки ImageJ макроса (дополнительный файл Macro_VAB_moko.txt), загрузите макрос, drag-and-drop в оболочке GUI ImageJ. Этот макрос будет включить некоторые горячие клавиши для следующих анализа.
- В рабочем каталоге создайте новую папку под названием «Process_ImageJ».
- Щелкните правой кнопкой мыши на файл .avs, чтобы быть проанализированы (выберите из avs файлов, созданных avs_creater.bat). Выберите параметр Быстрый горе . После avs файл подключен как внешний диск, откройте файл avi в ImageJ (avi-файл имеет имя окончание с «.avi»).
- Чтобы задать масштаб измерения расстояния, выберите диаметр Пробирной палаты, Рисование прямой линии через камеры, используя инструмент выделения в прямолинейного, а затем нажмите Анализ > задать масштаб функции. Например ввод 9,4 см , если с помощью цилиндрических блюдо с внутренним диаметром 9,4 см. Установите флажок радио Глобал с целью стандартизировать шкалы во всех следующих видео анализов.
- Преобразовать в двоичный стека и выполнения анализа.
- Скопируйте Пробирной палаты области, используя инструмент выделения овальной формы и затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите изображение > дублировать. В это время укажите диапазон кадров, чтобы сохранить для дальнейшего анализа, например, сохранить первый 2700 кадров после вибрирующей стержень вошли в воду (на 15 fps, это точно 3 минут видео).
- Очистить вне Пробирной палаты и преобразовать в двоичное изображение нажатием горячей клавиши 7 на номер панели клавиатуры.
- После того, как фон очищает и появляется, добавьте черная точка в центре, чтобы указать положение вибрирующий стеклянная палочка, используя средство выбора овал , уже установлен черный с функцией заполнения . Нажмите кнопку ОК, и появится запрос перейти на порог регулировки.
- Установите порог сделать двоичный (все черные и белые) изображения рыб. Отрегулируйте порог, так что рыбы можно увидеть в видео-клипов, а затем выберите Применить.
- Запустите модуль «Tracker» нажатием горячих ключей 8 на панели номер. Задайте минимальный пиксел размер 100, когда потребуется и нажмите кнопку OK, генерации расстояние между вибрирующий стержня и рыбы в кадре для всех 3 мин Бинарные видео.
- Отрегулируйте неправильного отслеживания, созданный шум в видео. Чтобы сделать это, проверить окно результаты , чтобы определить рамки, которые возвращают объект номер 3 или выше, с указанием дополнительных объектов в этих кадрах (например, частицы в воде или в тени прозрачной руку стержня) помимо «стержень» и «рыба» кадр. Удалите любые дополнительные объекты, используя инструмент «кисть».
- Хит горячих ключей 9 на номер бара экспортировать двоичные стек изображений всего видео (в случае, если это необходимо повторить анализ) и XLS-файл с координатами и расстояния данных (дополнительные файлы CF01.xls, Threshold_CF01.tif и Trac_CF01.tif ). Горячие ключевые 9 также будет закрыть все файлы, связанные с текущим видео. Повторите шаги 1.4.2.1 через 1.4.2.6 для всех реплицирует.
- Запустите сценарий макроса (дополнительный файл JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) для консолидации нескольких файлов результат трекер (.xls) в одну таблицу и подсчитать количество и продолжительность подходов в зону 1,5 см от стержня. Подходы, не продолжительностью по крайней мере 0.5 s будет не будут учитываться. Измените параметры расстояния и времени, считаются подход согласно конкретных вопросов, представляющих интерес.
- Освободить пространство диска PC после окончания всех анализов. Удалить подключенные файлы, чтобы освободить вверх космос диска - avi.avi и. avi.avs файлы (расширения, порожденных программного обеспечения)-, запустив пакетный файл multiunmountdel.bat в той же папке, где avs_creater.bat был запущен в разделе 1.4.1.2.
- Преобразуйте сжатые avi видео в читаемый формат ImageJ и анализ набора параметров.
2. сон и гиперактивность assay (запись 24 h)
- Поведенческого анализа
- Акклиматизироваться пяти экспериментальных рыбы на 4 дня или более в каждой палате аквариума специально 10 Л акриловые записи (45,9 см x 17,8 см x 17,8 см; Длина x ширина x глубина, соответственно) с кондиционерами водой (см. шаг 1.3.1).
- Отдельные каждый индивидуальный камеры с черная акриловые плиты, делая камеры одинакового размера, измерения 88.9 мм × 177,8 мм × 177,8 мм (рис. 2). Убедитесь в том охватить каждый танк, чтобы предотвратить рыбы от прыжков между камерами.
- Установите питания программируемые таймер автоматически включите белый LED свет для 12 h, и выключить для 12 h каждый день во время адаптационного периода (например, установить свет на 7 утра и выключается в 7 часов вечера). Это будет увлекают Циркадный ритм рыбы (если он подвержен воздействию волн).
- Используйте непрозрачные, белые акриловые плиты аналогичные измерения в 10 Л бак как диффузоры для передачи белый и инфракрасный свет через для того, чтобы предоставить даже интенсивности рассеянного света во всех танков.
- Течение адаптационного кормите один раз в день с живой науплий артемии и аэрации через Губка фильтры в каждом аквариуме.
Примечание: Убедитесь, рыбы кормятся на последовательное раз (то есть, 1 x в день 9:00 утра) как время кормления может также повлиять на увлечения циркадные ритмы19. - Проверьте ли рыбы стали акклиматизировались, наблюдая их задержку для комбикорма. Дольше задержка чем в их дома танк указывает, требуется больше времени адаптационного.
- День до дня проба (3 дня или более acclimation), заменить воду в Пробирной палате с свежезаваренным кондиционерами воды (см. шаг 1.3.1).
- Установите для параметра записи в VirtualDub программного обеспечения17: 15 кадров/сек, кодек: x264vfw, продолжительность записи: 86400 s (24 ч).
- Включите ИК подсветка позади на стадии записи (см. Рисунок 2). Наблюдая живой изображение на экране VirtualDub, отрегулируйте положение каждого аквариума, чтобы сделать их сталкиваются с USB-камеры.
- В день записи, кормить каждой рыбы с живой науплий артемии удалить все фильтры, губки и включите инфракрасной подсветки.
- Начать запись в первой половине дня 24 h (например, время начала 9 утра и заканчиваются в 9 часов утра следующего дня). Начать захват видео и защищенном месте, чтобы избежать нарушения. Периодически проверяйте, что выполняется запись.
- После 24 часов убедитесь, что видео сохранен правильно. Передавать видео на ПК, чтобы отслеживать и анализировать поведение рыб.
- Акклиматизироваться пяти экспериментальных рыбы на 4 дня или более в каждой палате аквариума специально 10 Л акриловые записи (45,9 см x 17,8 см x 17,8 см; Длина x ширина x глубина, соответственно) с кондиционерами водой (см. шаг 1.3.1).
- Видео анализ
- Во-первых проверьте качество видео, посмотрев на освещение. Проверьте, если в каждом разделе есть одна рыба, и если есть любые иностранные движений, которые могут привести к неправильной отслеживания.
- Подготовьте маску, чтобы избежать неправильного слежения за пределами аквариума. Создать две маски: один для «даже» и один для «странно» рыбы, основанный на их последовательности в цистернах.
- Сделайте две папки с именем «лишними» и «даже» для маски описано выше. Переместить отслеживания параметров файла SwisTrack в каждой из этих папок.
- Откройте отслеживания параметров файла SwisTrack, отслеживания программного обеспечения (дополнительный файл Tracking_odd.swistrack или Tracking_even.swistrack). Укажите путь к видео и маску файла, затем сохраните и выйдите из отслеживания параметров файла. Регулировать количество BLOB-объектов и параметры максимального пикселей в «Blob обнаружение» и «Ближайший сосед отслеживания» компоненты, соответственно, по данным экспериментов.
- Дважды щелкните, чтобы запустить сценарий победа автоматизации программного обеспечения, которое будет автоматически открывать SwisTrack программного обеспечения (дополнительный файл swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe или swistrack_4.exe- это все те же исполняемые файлы), которые СПИД в обновлении вычитание адаптационного фон в SwisTrack.
- Открыть Tracking_odd.swistrack или Tracking_even.swistrack в SwisTrack программное обеспечение для отслеживания загрузки файла параметров. После загрузки параметров, нажмите кнопку "запустить", чтобы начать отслеживать.
- В рамках первоначальной 9000 (600 s, т.е. в первые 10 минут записанного видео), проверьте, работает ли отслеживание рыбы, глядя на адаптивной фон вычитание, двоичные маска и ближайший сосед отслеживания в списке компонент SwisTrack (см. сопровождающие видео). В списке компонентов выберите вычитание адаптационного фон .
- Хит кнопку R на клавиатуре, чтобы возобновить победа Автоматизация и оставить PC для отслеживания. Отслеживание займет 5-7 ч в сутки видео для рабочего стола с 4-Процессорных ядер и 8 ГБ памяти. Согласно потребностям запустите несколько процессов SwisTrack (включая четных и нечетных Аренас одного видео файла) до количество ядер в Процессоре. Например 4-ядер может одновременно обрабатывать 4 видео.
- Во время этой отслеживания, Избегайте использовать этот компьютер для других целей, потому что победа Автоматизация программа автоматически перемещает указатель мыши. Первоначальный 9000 кадры будут удалены в следующей процедуре.
- Выделяют 3 файлы сценариев Perl (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust и 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) в папку, содержащую файлы отслеживания, созданных SwisTrack в папках «даже» и «странно» (см. шаг 2.2.3).
- Клип один кадр видео из видео файла, используя VirtualDub и импортируйте этот клип как фото в ImageJ. Выберите длину аквариум (45,9 см) в ImageJ и рассчитать коэффициент пикселей/см. Написать соотношением пикселя/см в 1.fillGaps2.pl в текстовый редактор и сохраните.
- Запустите программу CygWin, эмулятор Unix. Найдите папку SwisTrack, которая содержит 3 Perl-скриптов с помощью компакт-диска , в командной строке.
- Запустите сценарий Perl, введя Perl 1.fillGaps.pl. Эти три скрипты Perl назначить уникальный палаты аквариума каждый файл отслеживания и анализа сна продолжительность и плавание расстояние, в то время как рыба проснулся. Это займет 1-2 ч до завершения анализа.
- Оценить текстовый файл с именем Summary_Sleep.txt , чтобы определить, если число кадров упала от анализа приемлемо низка; хватает меньше чем на 15% кадров считается приемлемым.
- Скопируйте и вставьте проанализированы результаты от Summary_Sleep.txt в электронную таблицу с макросом (дополнительный файл Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Запустите макрос для извлечения сводных данных отслеживания файлов.
3. DASPMI или DASPEI окрашивание mechanosensory neuromasts
Примечание: DASPMI и DASPEI окрашивание светочувствительных и должно быть сделано в условиях темноты. После протокол предназначен для DASPMI и DASPEI с использованием DASPMI в качестве примера.
- Окрашивание протокол
- В общей сложности 1 Л окрашивания Стоковый раствор (25 мкг/мл) добавить 0,025 г DASPEI или DASPMI кристаллы в 1 Л dH2O и дайте ему раствориться в одночасье. Держите решение хранить при 4 ° C и защищены от света.
- Погрузить рыбу в 2,5 мкг/мл DASPMI или DASPEI растворяют в воде с кондиционером (см. шаг 1.3.1) 45 мин в темноте при температуре 22 ° C.
- После 45 минут удалить рыбы из DASPMI или DASPEI раствора и анестезировать путем погружения в ледяной ванне с кондиционерами воды с 66,7 мкг/мл в буфер этил 3-аминобензоат метан сульфонат соли (MS222).
- Смонтируйте рыбы в Петри блюдо тарелку и фотографию под микроскопом флуоресцентные. Z стек изображения и сохранить как файлы TIF для следующих анализа.
- Анализ изображений с помощью ImageJ
- Внутри папки, содержащей файлы TIF вставить шаблон файла макроса ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) и создайте новую папку под названием «Process_ImageJ». В файле макроса ImageJ задайте путь к текущему каталогу.
- Запуск ImageJ и открыть макрос, перетащив файл макроса в GUI или нажав Файл > открыть и выбрав файл макроса.
- Запустите макрос, нажав макросы > выполнить макрос. Макрос автоматически откроет файл рисунка для анализа. Если файл изображения не открывается, нажмите Макрос > файл забрать.
- Для количественной оценки Neuromast выберите регион интерес с помощью Инструмента «Многоугольник».
- Хит горячего ключа 5 до повторяющиеся области интереса.
- Используйте Инструмент Paint для удаления или добавления точек на дополнительные или отсутствующие neuromast от предыдущего изображения, а затем ударил 6. После удара 6, появятся два новых окна: схема neuromasts пронумерованных точек и таблица с общей neuromasts количественно.
- Нажмите 7 , чтобы сохранить оба файла: один файл хранится в виде файла изображения .tif и другой сохраняется в виде XLS-файла. После того, как хранятся эти файлы, новый файл будет открыт для анализа.
- Консолидация neuromast отсчеты каждого рыбу в одну таблицу, запустив сценарий макроса (SN_Number_Diameter.xlsm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель примерами чего могут быть приобретены с представленных методов являются результаты, представленные в настоящем документе. Таким образом результаты могут отличаться немного от тех, которые представлены здесь для cavefish и поверхности рыбы в зависимости от экспериментальных условий.
Вибрации притяжения поведение
Представитель результаты VAB можно найти на рис. 3 для пещеры и поверхности рыбы. Обратите внимание на края следующее поведение в поверхности рыбы (Рисунок 3А; атрибут совместно с cavefish) и сильное влечение cavefish вибрирующий стержня (рис. 3B). Пиковый уровень привлекательности был замечен вблизи 35 Гц для cavefish (рис. 3D), но не поверхности рыбы (рис. 3 c), представляющих ключевое различие в поведенческих фенотипов двух морф. Пик в привлечении вокруг этой частоты скорее представляет частоты колебаний, сделанные добычу или продукты питания Товары20,21.
Сна и гиперактивности пробирного
Критерии, используемые здесь для определения сна подходит ответ порогов, ранее решимости быть эффективным для Астианакт11. Сна характеризуется продолжительных периодов покоя и определяется как неподвижность > 60 s и повышенных ответ порог12,22,23. По сравнению с поверхности рыбы короче продолжительность сна происходят в личинок и взрослых cavefish11,12, таким образом, сон анализов являются эффективным способом для поведенчески фенотип Астианакт всех возрастов. В то время как cavefish показали менее сон (рис. 4б, короче продолжительность сна в cavefish), они также являются гиперактивный (рис. 4A).
DASPMI или DASPEI окрашивание mechanosensory neuromasts
Neuromasts состоят из Сензорные клетки, которые могут быть легко витражи с DASPEI или DASPMI и наблюдается в естественных условиях под микроскопом флуоресцентные. Представлен результат был результатом DASPMI окрашивание. Количество поверхностных neuromasts усиливается в регионе черепной cavefish по сравнению с поверхности рыбы (рис. 5 c, D) и оба размер а прокси количество волосковых клеток mechanosensory- и количество поверхностных neuromasts положительно коррелирует с уровнем вибрации притяжения поведения (количество подходов к вибрируя стержень: Рисунок 5A,B).
| Программное обеспечение | Анализ | Версия | веб-сайт |
| avfs | Деятельность/сна | Версия 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| AviSynth | VAB | Версия 2.6.0 | http://AviSynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | Деятельность/сна | Версия 2.11.0 | HTTPS://www.Cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB и DASPEI | Версия 1.52e | HTTPS://ImageJ.nih.gov/ij/ |
| pfmap | Деятельность/сна | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (на ссылку «Скачать архив» внизу) |
| SwisTrack | Деятельность/сна | Версия 4 | HTTPS://EN.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Деятельность/сна | Версия 8 | HTTPS://www.WinAutomation.com/ (свободный автономный app для этой процедуры) |
| Операционная система Windows | Деятельность/сна и VAB | 7, 8 или 10 | HTTPS://www.Microsoft.com/en-US/Windows |
| x264VFW | Все анализы | NA | HTTPS://SourceForge.NET/Projects/x264VFW/ |
Таблица 1. Список бесплатных программ, используемых в этих анализов и источник веб-сайт.
Рисунок 1 : Схема вибрации притяжения поведенческих пробирного экспериментального оборудования. Стеклянная палочка, прилагается к громкоговорителю настроена с частотой 40 Гц и погружать на глубину 0,5 см в начале записи видео. Эта цифра будет изменен с Йошизава et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема сна пробирного экспериментального оборудования. Танки на заказ от 0,7 см толщиной прозрачной акриловой доски; Септы 0,3 см толщиной полностью непрозрачный черный Акриловые плиты. Непрозрачный черный Акриловые плиты используются для этой части танков, так что рыбы не могут видеть друг друга. Вид сверху (A) : Обратите внимание, что внешних камер цистерны наклонены внутрь перегородками для размещения различия в камеру угол. (B, C) И боковые просмотров, соответственно. (D) массив из трех танков с подсветкой с инфракрасного света, проходящего через диффузор для гомогенизации интенсивность света во всех танков. Обратите внимание, что каждый танк ориентации корректируется таким образом, что видны все движения каждой рыбы в его соответствующей палаты. Группа (C) и (D) изменяются от16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель результаты 3- минута вибрации притяжения поведение анализа. (A, B) Вид сверху пути плавательный поверхности рыбы (A) и cavefish (B); redlines следы путь, что рыбы в течение 3 мин видео. Черная точка в центре указывает расположение вибрирующий стеклянной палочкой. wrMtrck плагинов ImageJ был использован для визуализации Рыба следов24. (C, D) Сравнение результатов от поверхности рыбы (C) и cavefish (D) подвергается несколько частоты вибрации. Каждая точка представляет каждой рыбы. Темные тени области являются межквартильный диапазон. Следует отметить, что во всех частот, поверхности рыбы не заметные влечение к вибрации cavefish показать максимум в привлечении около 35 Гц., в то время как (C, D) от 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель результаты из нескольких мер для анализа активности - Дневной деятельности шаблоны в поверхности рыбы и cavefish. (A-B) День (жёлтые столбики) и ночной (черные полосы) десятки плавание (м за 10 мин, A) и продолжительность сна (1000 s/12 h, B). Каждый бар представляет среднее ± среднеквадратические ошибки означают. Голубые звезды указывают уровень значимости для статистических сопоставлений между поверхности рыбы (Sf) и cavefish (Cf). Cavefish и поверхности рыбы имеют существенно различные мероприятия день ночь. Двусторонний ANOVA статистические данные для каждого фенотипа являются: для купания расстояние (A) между поверхности рыбы (Sf) и cavefish (Cf): F1399 185,8, P = < 0,001, между днем и ночью: F1399 = 26,9, P < 0,001, взаимодействие между населением и день ночь:1399 F = 3,6, P = 0,060 (не значительные: н.с.); для продолжительность сна (B) между Sf и Cf: F1399 237.9, P = < 0,001, между днем и ночью: F1399 164.1, P = < 0,001, взаимодействие между населением и день ночь: F1399 26,5, P = < 0,001. Для обоих анализов, N = 200 и 201 для поверхности рыбы и cavefish, соответственно. Разница между дневной и ночной деятельности были протестированы пост hoc паре t-тесты с Бонферрони исправления и обозначается черным звездочками. обозначает P < 0,001. ** обозначает P < 0.01. Подмножество данных был повторно и обновляется с 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель результаты отношения между VAB и neuromast. (А, Б) Взаимосвязь между VAB и neuromast номер и размер в cavefish, поверхности рыбы и гибридного потомства F1 поверхности рыбы x cavefish. Обратите внимание, что нормализованные показатели притяжения вибрации (квадратный корень из числа подходов) положительно коррелирует с обилием neuromast (коэффициент корреляции Пирсона r = 0,62, P < 0,001) и neuromast диаметра (корреляции Пирсона Коэффициент r = 0,31, P < 0.01). Группа A и B изменяются от5. (C, D) DASPMI окрашивание neuromasts в регионе щеку поверхности рыбы (C) и (D) cavefish. Линейки в врезные (C) и (D) — 1,0 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эти представленные методы легк к доступа, но может быть сложным для выполнения из-за характера его происхождение freeware. Поэтому настоятельно рекомендуется выполнить пробную анализов и анализов до любого фактического экспериментов.
Скорость генерации данных может быть быстрым, как только будут созданы экспериментальные и аналитических рамок. После того, как установлено, возможна запись две рыбы в 7 мин для VAB assay, 30 рыб в течение 24 часов для анализа активности/сна и одной рыбы в 2,5 – 3 мин для neuromast изображений, начиная с MS222 анестезии для захвата изображения. Длительность видео и изображения анализов может значительно изменяться в зависимости от производительности компьютера, используемый. С помощью ПК с 4-ядерный процессор и 8 ГБ ОЗУ, VAB анализ может занять 5-7 мин на рыб, анализ деятельности/сна может занять 6-8 ч в группе 30 рыб и neuromast анализ изображений может занять 5 или 10 мин на рыбу (одной или обеих сторон изображения черепной региона, соответственно). Коммерчески доступных, отслеживания программного обеспечения (Таблица материалов) является альтернативой для анализа видео. Это очень мощный в животных, отслеживание но дорого (например, базы программы ~ USD$ 5, 000USD и мульти отслеживания модуль ~ USD$ 4000). В этот момент наши методы отслеживания, как представляется, достигнуть сопоставимой точности слежения, особенно для анализа активности/сна, то есть, недостающие кадры обычно ниже, чем 15% всего кадров. Этот метод также показали высокую воспроизводимость в четыре реплицирует (Дополнительная таблица 1). Однако необходимо признать трудности в разработке этой системы без понимания основных кодирования в ОС Windows и ОС Linux/Unix.
Периоды адаптационного рыбы и до и во время поведенческих анализов важно обеспечить лучшие условия жизни возможно и совместимо для экспериментальной рыбы. Это включает в себя кормит качественных продуктов питания в то же время и суммы, каждый день и поддерживая высокое качество воды (низкий аммиак, нитраты, нитриты и растворенных органических веществ, ~ рН 7 и аналогичные проводимости вокруг 700 МКС). Это также важно для выполнения анализов в районе не беспокоит шумы. Шумные стопам и Гремящий звуки могут измениться поведенческих реакций и активности сон. Чтобы уменьшить уровень повреждения mechanosensory единиц во время обработки рыбы, это полезно использовать мелкоячеистое рыбы чистой при передаче рыбным; Это поможет избежать повреждения слизь куполом neuromasts.
DASPEI краска имеет Сублетальное воздействие на рыб, но чрезмерное воздействие может привести к токсические эффекты. Например погружая рыбы в DASPEI растворе втечение 2 ч поднимет шанс смертности во время восстановления после анестезии. Окрашивание DASPEI светочувствительные и поэтому должно быть сделано в условиях темноты.
Что касается установки freeware AviSynth и программного обеспечения, Avisynth, виртуальная файловая система (avfs), Pismo Файл горе Аудит пакет (pfmap) требуется конкретных версий слаженно работать вместе. Этим протоколом было подтверждено, что avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) и pfmap (1.7.8) работать вместе, но по крайней мере последние pfmap строить не работает для файлов монтажные процедуры. По этой причине Обратите внимание на версии программного обеспечения (Таблица 1). VirtualDub работает лучше в 32-разрядной версии вместо 64-бит. 15 кадров в s обеспечивает хорошее время резолюции и не требуют чрезмерный объем (1,6 ГБ для 24-ч сна assay видео и 3 МБ для видео VAB). Для ImageJ основная трудность может исходить от настройки путей к файлам в макросе. В ОС Windows путь к файлу может быть как правило выражено как «C:Document\my Document\...». ImageJ макрос запускается в среде Java и потребностей дополнительную «\» путь к файлу, то есть, «C\:Document\\my Document\\...». Смотрите пример файла ImageJ макрос. Кроме того, это может быть необходимо установить два плагинов, ломтик Remover и объект Tracker25и назначить горячие клавиши (сочетания клавиш) 6 и 8, соответственно, так что анализы работать плавно (плагины > ссылки > Добавить Ярлыки... 26 ). SwisTrack имеет функцию для задания отслеживания параметров, но вполне возможно, что замораживание или аварии могут возникнуть при настройке параметров отслеживания. Это лучше для редактирования параметров в приложении редактор текста, например Notepad ++. Подробности настройки параметров смотрите27. Cygwin (Unix эмулятор) установщик включает установщик пакетов для установки пакета Perl, который не входит в установку по умолчанию настройки. Рекомендуется специально выбрать пакет Perl во время установки Cygwin.
Хотя эта процедура ограничивается на основе боковая линия поведения (VAB) и плавательный активности и сна, это животное, система отслеживания может быть адаптирована к другие поведения, включая стереотипное поведение повторяющихся, социальные взаимодействия и асимметричное использование ( влево/вправо) из черепной neuromasts во время нагула (плоскости)13, хотя эти методы могут потребовать мелкой Аренас такие предложенные idTracker14. С набором эволюционировали поведения один может применять различные сценарии для анализа данных, отслеживаемые X - и Y - оси и расследовать различные поведенческие модели. Этот анализ конвейер предназначен для обеспечения основы для разрешения механизм эволюции в нескольких поведения, а также как Коморбидные аутизма как поведения регулируются генетических, эпигенетических и экологические факторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим всех членов Йошизава лаборатории, включая N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Чой, L. Lu, J. Нгуен, S. Подхорзера, H. Эрнандес, J. Фонг, J. Като и I. Лорд для рыб уход на экспериментальной рыб, используемых в этой рукописи. Мы также благодарим членов A. Keene лаборатории, включая P. Масек обучить мой собрать ИК CCD камеры. И наконец мы хотели бы поблагодарить Media Lab - факультет социальных наук - школа коммуникаций в Маноа Гавайев за их неоценимую помощь с созданием видео, особенно б. Смит, J. Lam и S. белый. Эта работа была поддержана Гавайский Фонд местного сообщества (16CON-78919 и 18CON-90818) и национального института здравоохранения NIGMS (P20GM125508) предоставляет MY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
