Behavior

Seguimiento conductual y Neuromast proyección de imagen de mexicana Cavefish

Published: April 6, 2019 doi: 10.3791/59099

McLean Worsham¹, Vânia Filipa Lima Fernandes², Alexander Settle¹, Chantell Balaan², Kimberly Lactaoen², Lillian J. Tuttle^1,3, Motoko Iwashita¹, Masato Yoshizawa¹

¹Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, ²Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, ³Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Summary

Aquí, presentamos métodos para estudio de alto rendimiento de una serie de cavefish mexicano comportamientos y la coloración vital de un sistema de mechanosensory. Estos métodos utilizan scripts software libre y a medida, ofreciendo un método práctico y rentable para los estudios de comportamientos.

Abstract

Animales cavernícolas han evolucionado una serie de rasgos morfológicos y de comportamiento para adaptarse a sus entornos permanentemente oscuros y escaso de alimentos. Entre estos rasgos, comportamiento de alimentación es una de las ventanas útiles en ventajas funcionales de la evolución del rasgo de comportamiento. Aquí se presentan métodos actualizados para el análisis de comportamiento de atracción de vibraciones (VAB: un comportamiento de forrajeo adaptativo) y proyección de imagen de mechanosensors asociado de adaptado de cueva tetra, Astyanax mexicanus. Además, se presentan métodos para el rastreo de alto rendimiento de una serie de comportamientos cavefish adicional incluyendo hiperactividad y pérdida de sueño. Cavefish también muestra asociality, conducta repetitiva y mayor ansiedad. Por lo tanto, cavefish sirve como un modelo animal para comportamientos evolucionados. Estos métodos utilizan scripts software libre y a medida que se pueden aplicar a otros tipos de comportamiento. Estos métodos proporcionan alternativas prácticas y rentables de software de seguimiento disponibles en el mercado.

Introduction

El tetra mexicano, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), es único entre los peces por tener dos morfos alternativas radicalmente distintas - un morph vidente, de superficie y un ciego, cavernas morph consta de varios distintos las poblaciones¹. Aunque diferentes en morfología y fisiología, son interfértiles todavía²^,³. Estos morfos distintas parecen que han evolucionado rápidamente (~ 20.000 años)⁴, que los hace un sistema modelo ideal para el estudio de rápida adaptación. Cavefish es conocidos por tener una serie de divergentes características morfológicas y conductuales como aumento de densidad de brotes del gusto, aumento del número de mechanosensors, sintonizada a una frecuencia particular de un estímulo vibratorio, hiperactividad, conducta de forrajeo y falta de sueño. Muchos de estos comportamientos probablemente evolucionados simultáneamente, algunos de los cuales se han sugerido para ser ventajoso en la oscuridad de las cuevas para forrajeo⁵ y conservación de la energía en entornos oscuros y escasos alimentos⁶^,⁷.

En muchos sistemas del modelo evolutivo, es difícil adquirir conocimientos integrados en cambio cómo animal de morfología y comportamiento en respuesta al medio ambiente porque la mayoría de las especies se distribuye en un gradiente continuo en entornos complejos. Sin embargo, el contraste entre la cueva y morph superficial Astyanax que evolucionaron en ambientes delineados por un ecotono agudo altamente contrastantes ha llevado a Astyanax emerge como un excelente modelo para entender la evolución animal. Esto hace posible conectar más fácilmente los genes y procesos de desarrollo con características adaptativas y selección en el medio ambiente. Además, recientes investigaciones biomédicas de estos rasgos en Astyanax ha demostrado que estos rasgos pueden paralelo humano síntomas⁸^,⁹^,¹⁰. Por ejemplo, pérdida de sociabilidad y de sueño y aumento de la hiperactividad, comportamiento repetitivo y niveles de cortisol son similares a lo que se observa en los seres humanos con autismo espectro desorden⁸.

Para abordar la compleja coevolución de muchos comportamientos y rasgos morfológicos, es conveniente analizar a muchos de ellos para destacar las vías genéticas y moleculares subyacentes. Se presentan adjunto los métodos para caracterizar el grado de fenotipos conductuales cueva-tipo de superficie, cueva y híbrido morfos de Astyanax. Los comportamientos focales analizados para caracterizar el fenotipo son cueva adaptada alimentación comportamiento (vibración atracción, denominada en lo sucesivo VAB) y sueño hiperactividad duración¹¹^,¹². También es un método imagenológico para el sistema sensorial asociado con VAB¹³. Recientemente, muchos programas de seguimiento de código abierto para ejecutar ensayos de comportamiento se han convertido en disponibles¹⁴^,¹⁵. Éstos trabajan muy bien para videos cortos, de menos de 10 minutos de duración. Sin embargo, se convierte en problemática si el video es más largo debido a tiempo de seguimiento de computación intensos. Software disponible comercialmente capaz puede ser caro. Los métodos presentados principalmente usan freeware y por lo tanto se consideran métodos rentables y de alto rendimiento. También se incluyen resultados representativos basan en estos métodos.

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Protocol

Todos los procedimientos se realizan siguiendo las pautas descritas en "Principios de laboratorio Animal Care" (Instituto Nacional de salud publicación nº 85-23, revisada en 1985) y el aprobado por la Universidad de Hawai en Manoa institucional Animal cuidado y uso Protocolo de animales Comité 17-2560-3.

1. Análisis de comportamiento (VAB) de atracción vibración (≤ 10 minutos para el procedimiento de grabación entero)

Nota: Utilice una cámara de infrarrojos sensible o construir una cámara infrarroja modificando una webcam USB. Para modificar una webcam USB, ver una descripción detallada presentada por el laboratorio de Keene en esta edición de cavefish Jove (a partir de esta edición de a. mexicanus ) y una breve descripción de los materiales suplementarios.

Configuración de grabación
1. Para asegurarse de que la cámara permanece en posición, todavía y en la correcta distancia focal de la asignatura (s) que se registran, construir un marco de caja negra de cloruro de polivinilo tuberías (PVC), mide 120 cm H x 45 cm L x 90 cm w.
2. Después de la construcción de la estructura, cubierta con una cortina de plástico opacas como uno previsto para la agricultura hidropónica.
3. En la parte superior del marco, colocar un tablero de acrílico negro con una ventana para que la cámara infrarroja en el centro miden el mismo diámetro que el zoom ajustable montado en C. Dentro de esta caja, coloque el equipo de ensayo de VAB (figura 1).
Aparato de vibración
Nota: Las vibraciones se producen usando un generador de funciones pequeñas.
1. De los métodos siguientes, sintonizar las vibraciones en una amplitud de 0,15 mm y una frecuencia de 40 Hz, que es la frecuencia que produce una respuesta máxima de atracción⁵^,¹⁶.
2. Conecte el generador de funciones a un altavoz de orientación horizontal.
3. Instale una varilla de vidrio de 7,5 mm de diámetro 14 cm de longitud a la cubierta de polvo en la cara del altavoz usando pegamento caliente o un adhesivo de junta.
4. Perpendicular a esta vara y mirando hacia abajo, coloque otra varilla de vidrio de diámetro 7,5 mm 4 cm de longitud (figura 1).
Ensayo de comportamiento
1. Aclimatar una experimental a. mexicanus durante 4 días en una cámara de ensayo cilíndrico llenada de agua acondicionado (pH entre 6.8-7.0, conductividad aprox. 700 μs, temperatura aprox. 22 ° c) con un ciclo de 12/12 L/D. Compruebe si han aclimatado peces observando su latencia de forraje. Latencia más largo que en su casa tanque indica que se necesita más tiempo de aclimatación. A lo largo de aclimatación, se alimentan una vez al día con nauplios de Artemia Vives.
2. El día antes del día de la prueba (después de 3 días de aclimatación), reemplace el agua en la cámara de ensayo con agua acondicionada.
3. En el día del ensayo (después de 4 días de aclimatación), privar a experimentales peces de alimentos hasta después de completar el ensayo. Saciedad a cambiar su respuesta a las vibraciones.
4. Configurar los parámetros de grabación en el VirtualDub freeware¹⁷: 15 fotogramas/s, codec: x264vfw, duración de la grabación: 3 min 30 s.
5. Preparar el aparato de emisión de vibración (consulte el paso 1.2) templando a 40 Hz. Vea la figura 1 para la explicación del aparato. Enjuague la varilla vibratoria de vidrio con agua desionizada para eliminar cualquier producto químico soluble en agua.
6. Trabajando en la oscuridad, coloque el cilindro de ensayo en el escenario de grabación iluminado por una luz infrarroja en la caja negra y permitir los peces a aclimatar durante 3 minutos.
  1. Después de la aclimatación de 3 minutos, registrar 3 min 30 s de video. En el inicio de la grabación, inserte la varilla de vidrio vibra la columna de agua (aprox. 0.5 cm de profundidad).
  2. Evitar hacer cualquier ruido o vibraciones mientras coloca la varilla vibratoria de cristal en el agua como los peces puede sentido incluso las más pequeñas perturbaciones.
  3. Finalice este procedimiento dentro de los 30 s de comenzar la grabación de vídeo para asegurarse de que se registra más de 3 minutos del comportamiento.
7. Controlar el vídeo durante la grabación para asegurarse de que no se produzcan durante esta etapa.
8. Después de terminar la grabación, retire la varilla vibratoria del cristal de la cámara de ensayo cilíndricos y extraiga la cámara de ensayo de la etapa de grabación. Repetición de 1.3.5 para el siguiente pez.
Análisis de video
Nota: Convertir el códec en un formato que puede cargar ImageJ sólo funciona en Windows sistema operativo¹⁸ (tabla 1).
1. Convertir el vídeo de avi comprimido en un formato legible para ImageJ y parámetros de análisis conjunto.
  1. Instalar AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) y avfs ver1.0.0.5 o ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Tenga en cuenta que este método es programa/versión sensible. Los enlaces de la web siempre guiará a las versiones adecuadas (tabla 1).
  2. Ejecute el archivo haciendo doble clic en avs_creater.bat (archivo suplementario). Haga clic derecho sobre el archivo de vídeo avs a ser analizado (selección de los archivos avs creados por avs_creater.bat).
  3. Como análisis de vídeo usando el plugin del rastreador en ImageJ requiere una carga de la macro ImageJ (archivo suplementario Macro_VAB_moko.txt), cargar la macro por arrastrar y soltar en la GUI shell de ImageJ. Esta macro permite ciertas teclas de acceso rápido para el siguiente análisis.
  4. En el directorio de trabajo, crear una nueva carpeta titulada "Process_ImageJ".
  5. Haga clic derecho sobre el archivo .avs que analizaron (selección de los archivos avs creados por avs_creater.bat). Seleccione la opción de montaje rápido . Después de que el archivo avs se monta como un disco externo, abra el archivo avi en ImageJ (el archivo avi tiene nombre final con ".avi").
  6. Para establecer la escala de medición de la distancia, el diámetro de la cámara de ensayo dibujando una línea recta a través de la cámara utilizando la herramienta de selección lineal, seleccione análisis > Configurar escala función. Por ejemplo, entrada de 9,4 cm si se utiliza un plato cilíndrico con un diámetro interno de 9,4 cm. La casilla radio de mundial para estandarizar la escala en todos los siguientes análisis de videos.
2. Convertir a binario pila y análisis.
  1. Copiar el área de la cámara de ensayo mediante el uso de la herramienta de selección oval y luego haga clic derecho y seleccionar imagen > duplicar. En este momento, especificar el intervalo de fotogramas para mantener para su posterior análisis, por ejemplo, mantener los marcos primero 2.700 después la varilla vibratoria entraron al agua (a 15 fps es exactamente 3 minutos de video).
  2. Limpiar el exterior de la cámara de ensayo y convertir en una imagen binaria pulsando la tecla 7 en la barra de números del teclado.
  3. Después de que el fondo se borra y aparece un mensaje, añadir un punto negro en el centro para indicar la posición de la varilla vibratoria del cristal mediante la herramienta de selección oval ya configurada en negro con la función de relleno . Haga clic en Aceptar y aparecerá un indicador para pasar al ajuste de umbral.
  4. Establecer el umbral para crear una imagen binaria (todo blanco y negro) de los peces. Ajuste el umbral para que los peces pueden verse en todos videoclips y seleccione aplicar.
  5. Ejecutar el plugin de "Tracker" golpeando la llave caliente 8 en la barra número. Establecer el tamaño de píxel mínimos a 100 cuando se le solicite y golpe OK, generar la distancia entre la varilla vibratoria y el pez cada fotograma para todos 3 min del video binario.
  6. Ajustar el seguimiento mal generado por el ruido en vídeo. Para ello, Compruebe la ventana de resultados para identificar los fotogramas que devuelven el objeto número 3 o mayor indicando objetos extras en los marcos (por ejemplo, las partículas en el agua o la sombra del brazo transparente de la barra) además de la "barra" y "pez" el marco. Quitar objetos adicionales utilizando la herramienta pincel.
  7. Golpear la llave caliente 9 en la barra número exportar una pila binario de imágenes del video completo (en caso de que es necesario volver a analizar) y un archivo .xls con coordenadas y datos de la distancia (archivos complementarios CF01.xls, Threshold_CF01.tif y Trac_CF01.tif ). Clave caliente 9 también se cerrará todos los archivos asociados con el vídeo actual. Repita pasos 1.4.2.1 a través 1.4.2.6 todo repeticiones.
  8. Ejecute el script de la macro (archivo suplementario JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) para consolidar varios archivos de resultado Tracker (.xls) en una hoja de cálculo y contar el número y la duración de los enfoques en un área de 1.5 cm de la varilla. Enfoques no dura por lo menos 0,5 s voluntad no será contado. Cambiar los parámetros de distancia y el tiempo como un enfoque según preguntas particulares de interés.
3. Liberar espacio de disco de la PC después de terminar todos los análisis. Eliminar archivos montados para liberar espacio en disco - avi.avi y. avi.avs archivos (extensiones generadas por el software)-ejecutando un lote archivo multiunmountdel.bat en la misma carpeta donde avs_creater.bat dirigía en la sección 1.4.1.2.

2. sueño y ensayo de hiperactividad (grabación 24 h)

Ensayo de comportamiento
1. Aclimatar peces experimentales cinco durante 4 días o más en cada compartimiento de un acuario de acrílico grabación de diseño personalizado 10 L (45,9 x 17,8 cm x 17,8 cm; longitud x ancho x profundidad, respectivamente) con agua acondicionada (ver paso 1.3.1).
  1. Separar cada cámara individual con tableros de acrílico negro haciendo cámaras iguales en tamaño, mide 88.9 mm x 177,8 x 177,8 mm (figura 2). Asegúrese de cubrir cada tanque para evitar que los peces saltando entre cámaras.
  2. Ajustar el temporizador programable automáticamente enciende LED blanco luz de 12 h, y apagado por 12 h todos los días durante el período de aclimatación (por ejemplo, la luz en 7:00 y apagado en 19:00). Esto será arrastrar el ritmo circadiano de pescado (si es susceptible al arrastre).
  3. Utilice tableros de acrílico blanco, opacos de dimensión similar al tanque de 10 L como difusores para pasar luz blanca e infrarroja a través para proporcionar luz difusa con intensidad uniforme a través de todos los tanques.
  4. A lo largo de aclimatación, se alimentan una vez al día con nauplios de Artemia en vivo y proporcionar aireación a través de filtros de esponja en cada acuario.
    Nota: Asegúrese de peces son alimentados en tiempos coherentes (es decir, 1 x por día a las 9:00), hora de la comida puede también afectar el arrastre de los ritmos circadianos¹⁹.
  5. Comprobar si los peces han se aclimate observando su latencia de forraje. Una latencia más largo que en su casa tanque indica que se necesita más tiempo de aclimatación.
2. El día previo al día de la prueba (3 días o más de la aclimatación), reemplazar el agua en la cámara de ensayo con recién acondicionado agua (ver paso 1.3.1).
3. Defina el parámetro de registro en el VirtualDub software¹⁷: 15 fotogramas/s, codec: x264vfw, duración de la grabación: 86.400 s (24 h).
4. Activar la retroiluminación infrarrojo detrás del escenario de la grabación (ver figura 2). Observando la imagen viva de VirtualDub en pantalla, ajuste la posición de cada acuario para hacerlos frente la cámara USB.
5. En el día de la grabación, cada pescado la alimentación con nauplios de Artemia Vives, quitar todos los filtros de esponja y encender la luz infrarroja.
6. Comenzar 24 h de grabación en la mañana (por ejemplo, la hora de salida es 9:00 y el tiempo final es de 9:00 del día siguiente). Empezar a capturar el vídeo y el lugar para evitar una perturbación seguro. Compruebe periódicamente que el registro se está ejecutando.
7. Después de 24 h, asegúrese de que el vídeo se guarda correctamente. Transferir el vídeo a la plataforma de PC para rastrear y analizar el comportamiento de los peces.
Análisis de video
1. En primer lugar, Compruebe la calidad del video mirando la iluminación. Compruebe si hay un pez en cada sección, y si hay cualquier movimiento de extranjeros que puede causar mal seguimiento.
2. Preparar la mascarilla para evitar el mal seguimiento fuera del acuario. Hacer dos máscaras: uno para 'incluso' y uno para pescado 'impar', basado en su orden de secuencia en los tanques.
3. Hacer dos carpetas llamadas "impares" y "" para las máscaras descritas anteriormente. Mover el seguimiento archivo de parámetro de SwisTrack en cada una de estas carpetas.
4. Abrir el seguimiento archivo de parámetro de SwisTrack tracking software (archivo suplementario de Tracking_odd.swistrack o Tracking_even.swistrack). Especifique la ruta al archivo de vídeo y archivo de la máscara, luego guardar y salir del seguimiento de archivo de parámetros. Ajustar número de blob y parámetros de píxeles máximo en "Blob detección" y "Vecino más cercano seguimiento" componentes, respectivamente, según los experimentos.
5. Haga doble clic para ejecutar una secuencia de comandos win-de software de automatización que se abrirá automáticamente SwisTrack software (archivo complementario swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe o swistrack_4.exe- son los mismos archivos ejecutables), que SIDA en la actualización de la sustracción del fondo adaptación en SwisTrack.
6. Abra Tracking_odd.swistrack o Tracking_even.swistrack en SwisTrack software para el seguimiento de la carga archivo de parámetros. Después de cargar los parámetros, pulse el botón ejecutar para iniciar el seguimiento.
7. En el marco inicial de 9.000 (600 s, es decir, primero 10 minutos de video grabado), compruebe si está trabajando pescado seguimiento accediendo a la substracción del fondo adaptación, máscara binaria y vecino más cercano en la lista de componentes de SwisTrack (véase rastreo video que lo acompaña). Fondo adaptable seleccione en la lista de componentes.
8. Pulsa el botón R en el teclado para volver a ganar-automatización y dejar la PC a la pista. Seguimiento llevará a 5-7 h por 24 h para un ordenador de sobremesa con CPU de 4 núcleos y 8 GB de memoria. Necesidades, ejecutar múltiples procesos SwisTrack (incluyendo arenas pares e impares de un solo archivo de vídeo) hasta el número de núcleos de la CPU. Por ejemplo, 4 núcleos pueden manejar 4 videos a la vez.
9. Durante este seguimiento, evite usar esta PC para otros fines porque programa de win-automatización automáticamente mueve el puntero del ratón. Los marcos de 9.000 iniciales se descartarán en el procedimiento siguiente.
10. Asignar 3 archivos de script de Perl (1.fillupGaps2.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust y 3.pl) a la carpeta que contiene los archivos de seguimiento generados por SwisTrack en las carpetas '' e 'impares' (ver paso 2.2.3).
11. Clip un fotograma del vídeo desde el archivo de vídeo con VirtualDub e importar este clip como una foto en ImageJ. Seleccione la longitud del acuario (45,9 cm) en ImageJ y calcular la proporción de píxeles/cm. Escriba la relación pixel/cm en 1.fillGaps2.pl en un programa de editor de texto y guardar.
12. Inicie CygWin programa, un emulador de Unix. Busque la carpeta SwisTrack que contiene los scripts de Perl 3 mediante el uso de cd en la línea de comandos.
13. Ejecute el script de Perl tecleando Perl 1.fillGaps.pl. Estas tres secuencias de comandos Perl asignará cada archivo de seguimiento a una única cámara del acuario y analizar la distancia de natación y duración del sueño, mientras que el pescado estaba despierto. Tardará 1-2 h para terminar el análisis.
14. Evaluar el archivo de texto denominado Summary_Sleep.txt para determinar si el número de fotogramas de los análisis es aceptablemente bajo; falta menos de un 15% de los marcos se considera aceptable.
15. Copiar y pegar los resultados analizados de Summary_Sleep.txt a una hoja de cálculo con la macro (archivo suplementario Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
16. Ejecute la macro para extraer los datos de Resumen de archivos de seguimiento.

3. teñido de mechanosensory neuromasts DASPMI o DASPEI

Nota: DASPMI y DASPEI de tinción es sensible a la luz y debe hacerse en condiciones de oscuridad. Siguiendo el protocolo es para DASPMI y DASPEI mediante DASPMI por ejemplo.

Protocolo de tinción
1. Para un total de 1 L de la coloración de la solución madre (25 μg/mL), añadir a 1 L de dH₂O 0,025 g de cristales DASPEI o DASPMI y dejar disolver durante la noche. Mantener la solución almacenada a 4 ° C y protegido de la luz.
2. Sumerja el pescado en 2,5 μg/mL DASPMI o DASPEI disuelto en el agua acondicionada (ver paso 1.3.1) durante 45 minutos en un ambiente oscuro a 22 ° C.
3. Después de 45 minutos, retirar el pescado de la solución DASPMI o DASPEI y anestesiar por inmersión en un baño de hielo de agua acondicionada con 66,7 μg/mL de sal de sulfonato de metano etílico intermedia 3-aminobenzoato (MS222).
4. Coloque el pescado en una placa de Petri y fotografía bajo un microscopio de fluorescencia. Z-stack de imágenes y guardar archivos de .tif para el siguiente análisis.
Análisis de imagen con ImageJ
1. Dentro de la carpeta que contiene archivos .tif, pegar una plantilla del archivo de macro ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) y crear una nueva carpeta titulada "Process_ImageJ". En el archivo de macro ImageJ, definir la ruta al directorio actual.
2. Lanzamiento de ImageJ y abrir la macro arrastrando el archivo de macro en la GUI o haciendo clic en archivo > abrir y seleccionando el archivo macro.
3. Ejecutar la macro haciendo clic en Macros > ejecutar Macro. La macro entonces abrirá automáticamente un archivo de imagen a ser analizada. Si no se abre el archivo de imagen, haga clic en Macro > archivo recoger.
4. Para la cuantificación de Neuromast, seleccione la región de interés utilizando la Herramienta polígono.
5. Golpe caliente clave 5 duplicados región de interés.
6. Utilice la Herramienta de pintura para quitar o añadir puntos para neuromast adicional o faltante de la imagen anterior y luego presione 6. Después de golpear 6, aparecerán dos nuevas ventanas: esquema de puntos numerados neuromasts y una mesa con neuromasts total cuantificado.
7. Golpe 7 para guardar ambos archivos: un archivo se almacena como un archivo de imagen .tif y la otra se guarda como un archivo .xls. Después de que estos archivos se almacenan, se abrirá un nuevo archivo de imagen para el análisis.
8. Consolidar las cuentas de neuromast de cada pescado en una hoja de cálculo mediante la ejecución de la secuencia de comandos de macro (SN_Number_Diameter.xlsm).

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Representative Results

Los resultados presentados en este documento son ejemplos representativos de lo que puede ser adquirido con los métodos presentados. Por lo tanto, resultados pueden diferir ligeramente de los presentados aquí para peces superficie dependiendo de las condiciones experimentales y cavefish.

Comportamiento de atracción de vibraciones

Resultados representativos para VAB pueden encontrarse en la figura 3 para la cueva y peces de superficie. Tenga en cuenta el comportamiento de borde siguientes en los peces de superficie (Figura 3A; un atributo compartido con cavefish) y la fuerte atracción de cavefish a la varilla vibratoria (figura 3B). El nivel de atracción de pico se observó cerca de 35 Hz para cavefish (figura 3D) pero el pescado no superficial (figura 3), que representa una diferencia clave en los fenotipos conductuales de los dos morfos. El pico de atracción alrededor de esta frecuencia representa probablemente la frecuencia de las vibraciones por presas o alimento artículos²⁰^,²¹.

Ensayo de sueño e hiperactividad

Los criterios utilizados en este documento para definir el sueño ajustar los umbrales de respuesta previamente determinados para ser eficaz para Astyanax¹¹. Sueño se caracteriza por largos períodos de quietud y se define como inmovilidad de > 60 s y elevada respuesta umbral¹²^,²²^,²³. En comparación con los peces de superficie, duraciones más cortas de sueño ocurren en larvas y adultos cavefish¹¹^,¹², por lo tanto, sueño ensayos son una manera eficaz a su comportamiento fenotipo Astyanax de todas las edades. Cavefish mostró menos sueño (Figura 4B, menor duración del sueño en cavefish), ellos también son hiperactivos (Figura 4A).

Teñido de mechanosensory neuromasts DASPMI o DASPEI

Neuromasts están compuestos por células sensoriales que pueden ser fácilmente teñidas con DASPEI o DASPMI y observadas en vivo debajo de un microscopio de fluorescencia. El resultado presentado fue el resultado de la tinción de DASPMI. El número de neuromasts superficial es mayor en la región craneal de la cavefish en comparación con los peces de superficie (figura 5, D) y tanto el tamaño, un proxy el número de las células de pelo mechanosensory- y número de neuromasts superficiales son correlacionó positivamente con el nivel de comportamiento de atracción de vibración (número de acercamientos a la varilla vibratoria: figura 5A,B).

Software	Análisis	Versión	sitio web
AVFs	Actividad/sueño	Versión 1.0.0.6	http://turtlewar.org/AVFs/
AviSynth	VAB	Versión 2.6.0	http://avisynth.nl/index.php/main_page
Cygwin	Actividad/sueño	Versión 2.11.0	https://www.Cygwin.com/
ImageJ	VAB y DASPEI	Versión 1.52e	https://ImageJ.nih.gov/ij/
pfmap	Actividad/sueño	Construir 178	http://pismotec.com/download/ (en el enlace "Descargar archivo" en la parte inferior)
SwisTrack	Actividad/sueño	Versión 4	https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
WinAutomation	Actividad/sueño	Versión 8	https://www.Winautomation.com/ (aplicación gratuita independiente para este procedimiento)
Sistema operativo Windows	VAB y actividad/sueño	7, 8 o 10	https://www.Microsoft.com/en-US/Windows
x264vfw	Todos los análisis	NA	https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Tabla 1. Lista de freeware utilizado en estos análisis y la Página Web de la fuente.

Figura 1 : Esquemático del equipo experimental de análisis conductual de atracción de vibración. Una varilla de vidrio conectada a un altavoz es sintonizada a una frecuencia de 40 Hz y sumergida a una profundidad de aproximadamente 0,5 cm en el inicio de grabación de vídeo. Esta cifra se modifica de Yoshizawa et al⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Esquemático del equipo experimental de análisis de sueño. Los tanques son a medida de tableros acrílico transparente espesor 0.7 cm; los septos son 0.3 cm gruesa completamente opaco acrílico tableros negros. Tableros de acrílico negro opacos se utilizan para esta parte de los tanques para que los peces no ven mutuamente. (A) vista superior: nota que las cámaras de exteriores del tanque han inclinado tabiques hacia el interior para dar cabida a las diferencias en ángulo. (B, C) Frontal y lateral de vistas, respectivamente. (D) arreglo de tres tanques retroiluminado con luz infrarroja pasa a través de un difusor para homogeneizar la intensidad de la luz a través de todos los tanques. Tenga en cuenta que la orientación de cada tanque se ajusta para que todos los movimientos de cada pez en su respectivo compartimiento son visibles. Panel (C) y (D) se modifican de¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Resultados representativos de un 3- minutos ensayo de comportamiento de atracción de vibraciones. (A, B) Vista superior de la ruta de la natación de los peces de superficie (A) y cavefish (B); líneas rojas son los rastros del camino que llevaron a los peces durante el video de 3 min. El punto negro en el centro indica la ubicación de la varilla vibra de vidrio. wrMtrck plugin de ImageJ fue utilizado para visualizar los peces rastros²⁴. (C, D) Comparación de los resultados de los peces de superficie (C) y cavefish (D) expuestos a múltiples frecuencias de la vibración. Cada punto representa cada pescado. Las áreas sombreadas oscuras son rango intercuartil. Tenga en cuenta que a través de todas las frecuencias, peces de superficie no muestran notable atracción a la vibración mientras que cavefish mostrar un máximo de atracción cerca de 35 Hz. (C, D) modificado de ¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Representante de los resultados de varias medidas para el análisis de la actividad - Diurno patrones de actividad en los peces de superficie y cavefish. (A-B) Día (barras de color amarillo) y noche (barras negras) decenas de natación a distancia (m. por 10 min, un) y duración del sueño (1.000 h de s/12, B). Cada barra representa los errores de estándar de la media ± de media. Estrellas azules indican el nivel de significancia de las comparaciones estadísticas entre peces de superficie (Sf) y cavefish (Cf). Cavefish y superficie peces tienen significativamente diferentes actividades de día-noche. Estadísticas de ANOVA dos vías para cada fenotipo: para nadar la distancia (A) entre peces de superficie (Sf) y cavefish (Cf): F_1.399= 185.8, P < 0.001, entre día y noche: F_1.399 = 26.9, P < 0.001, la interacción entre la población y día-noche: F_1.399= 3.6, P = 0.060 (no significativo: n.s.); para la duración del sueño (B) entre Sf y Cf: F_1.399 = 237.9, P < 0.001, entre día y noche: F_1.399 = 164.1, P < 0.001, la interacción entre la población y día-noche: F_1.399= 26.5, P < 0.001. Para ambos análisis, N = 200 y 201 para pesca superficial y cavefish, respectivamente. La diferencia entre día y noche las actividades se analizaron post-hoc emparejado t-pruebas con correcciones de Bonferroni y se denota por asteriscos negros. denota P < 0.001. ** denota P < 0.01. Un subconjunto de los datos fue reutilizado y actualizado del ¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Resultados de la representante de la relación entre el VAB y neuromast. (A, B) La relación entre el VAB y neuromast el número y tamaño en cavefish, peces de superficie y la progenie de híbridos F1 de superficie peces x cavefish. Tenga en cuenta que las puntuaciones normalizadas de la atracción de vibraciones (raíz cuadrada del número de enfoques) se correlacionó positivamente con la abundancia de neuromast (coeficiente de correlación de Pearson r = 0.62, P < 0.001) y el diámetro de neuromast (correlación de Pearson coeficiente r = 0.31, P < 0.01). Panel A y B son modificadas de⁵. (C, D) DASPMI coloración de neuromasts en la región de la mejilla de (C) un pez de superficie y (D) un cavefish. Barra de escala en detalle (C) y (D) son 1,0 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materiales suplementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Estos métodos presentados son de fácil acceso pero pueden ser complicados de realizar debido a la naturaleza de sus orígenes de freeware. Por lo tanto, se recomienda realizar ensayos de prueba y análisis ante cualquier experimentación real.

La tasa de generación de datos puede ser rápida una vez que se establecen el marco experimental y analítico. Una vez establecida, es posible grabamos dos peces en 7 minutos para el ensayo de VAB, 30 peces en 24 h para el ensayo de actividad/sueño y un pez de 2.5 a 3 min de neuromast proyección de imagen, a partir de anestesia MS222 a captura de la imagen final. La duración de los análisis de vídeo e imagen puede variar considerablemente según el rendimiento del ordenador utilizado. Usando un PC con una CPU de 4 núcleos y 8 GB de RAM, análisis de VAB pueden tomar 5-7 min por pescado, análisis de actividad/sueño pueden tomar 6-8 h por grupo de 30 peces y análisis de imágenes neuromast pueden tomar 5 o 10 min por pescado (un solo lado o ambos lados de las imágenes de la región craneal, respectivamente). Comercialmente disponible (Tabla de materiales) el software de seguimiento es una alternativa para análisis de video. Es muy potente en seguimiento pero caras de animales (por ejemplo, la base software ~ USD$ 5, 000USD y multi-tracking de módulo ~ USD$ 4.000). En este momento, nuestros métodos de seguimiento parecen lograr precisión comparable de seguimiento, especialmente para el análisis de actividad/sueño, es decir, falta marcos son típicamente menores al 15% del total Marcos. Este método también demostró una alta reproducibilidad en cuatro repeticiones (complementario tabla 1). Sin embargo, debe reconocerse la dificultad en el desarrollo de este sistema sin una comprensión de la codificación básica en sistemas operativos Windows y Linux/Unix sistema operativo.

Durante los períodos de aclimatación de peces, antes y durante los ensayos de comportamiento, es esencial para proporcionar las mejores condiciones de vida posible y consistente para los pescados experimentales. Esto incluye alimentación alimentos de alta calidad a la vez y cantidad todos los días y mantener alta calidad del agua (amoníaco, nitratos, nitritos y compuestos orgánicos disueltos, de baja ~ conductividad 7 y similares de pH alrededor de 700 μs). También es importante realizar ensayos en una zona no perturbada por ruidos. Pasos ruidosos y estrepitosos sonidos pueden cambiar las respuestas del comportamiento y patrones de actividad/sueño. Para reducir el nivel de daño a unidades de mechanosensory mientras manejo de peces, es útil usar un pescado de malla fina neto durante la transferencia de peces; Esto ayudará a evitar daños en el cupula de moco de neuromasts.

Tinte DASPEI tiene efectos subletales en los peces, pero la exposición excesiva puede resultar en efectos tóxicos. Por ejemplo, sumergir el pescado en la solución DASPEI para 2 h aumentará la probabilidad de mortalidad durante la recuperación de la anestesia. DASPEI tinción es sensible a la luz y por lo tanto debe hacerse en condiciones de oscuridad.

En cuanto a instalación de freeware, software de AviSynth Avisynth Virtual File System (avfs) y Pismo File Mount Audit paquete (pfmap) requiere versiones específicas para trabajar juntos de forma coherente. Fue confirmado por el presente Protocolo que avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) y pfmap (puntos 1.7.8) trabajan juntos, pero al menos el último build de pfmap no funciona para el procedimiento de montaje de archivo. Por este motivo, preste atención a las versiones del programa (tabla 1). VirtualDub trabaja mejor bajo la versión de 32 bits en lugar de 64-bit. El ajuste de 15 cuadros por s proporciona una resolución de tiempo y no requiere volumen almacenamiento excesivo (1,6 GB para un ensayo de 24-h dormir video y 3 MB para un video de VAB). Para ImageJ, la mayor dificultad puede venir desde la creación de rutas de archivo en la macro. En el sistema operativo Windows, la ruta del archivo puede expresarse generalmente como "C:Document\my Document\...". La macro ImageJ se ejecuta bajo el entorno Java y necesita un extra "\" para la ruta del archivo, es decir, "C\:Document\\my Document\\...". Consulte el archivo de macro de ejemplo ImageJ. Además, puede ser necesario instalar dos plugins, removedor de la rebanada y objeto perseguidor²⁵, y asignar las teclas de acceso rápido (atajos de teclado) 6 y 8, respectivamente, por lo que funcionan perfectamente en los análisis (Plugins > atajos > Agregar Métodos abreviados de... ²⁶ ). SwisTrack tiene una función para definir los parámetros de seguimiento, pero es posible que un congelamiento o un accidente puede ocurrir mientras el ajuste de los parámetros de seguimiento. Es mejor editar el parámetro en una aplicación de editor de texto como Notepad ++. De configuración de los parámetros, véase²⁷. El instalador Cygwin (emulador de Unix) incluye un instalador de paquete para instalar el paquete de Perl, que no está incluido en la instalación predeterminada configuración. Se recomienda seleccionar específicamente el paquete Perl durante la instalación de Cygwin.

Aunque este procedimiento se limita a un comportamiento basado en la línea lateral (VAB) y natación actividad y sueño, este sistema seguimiento de animales pueden ser adaptado a otros comportamientos como comportamientos repetitivos estereotipados, interacciones sociales y el uso asimétrico ( izquierda/derecha) de neuromasts craneal durante el forrajeo (lateralidad)¹³, aunque estos métodos pueden requerir arenas poco profundas tales como las sugeridas por idTracker¹⁴. Con una serie de comportamientos evolucionados, uno puede aplicar diferentes scripts para analizar los datos de seguimiento - y ejes X Y y para investigar diferentes patrones de comportamiento. Este gasoducto de análisis está diseñado para proporcionar una base para resolver el mecanismo de la evolución de comportamientos múltiples, y también cómo comportamientos autismo comórbidos son reguladas por genética, epigenética y los factores ambientales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Yoshizawa incluyendo N. Cetraro, Simon N., C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, Lu L., J. Nguyen, S. Podhorzer, Hernandes H., J. Fong, Kato J. e I. Señor, para el cuidado de peces en los pescados experimentales utilizados en este manuscrito. También agradecemos a los miembros de lab A. Keene incluyendo Masek de P. para entrenar a mi montar cámara IR CCD. Por último, nos gustaría agradecer el Media Lab - Facultad de ciencias sociales - escuela de comunicaciones en la Universidad de Hawai ' i Mānoa su inestimable ayuda para hacer el video, especialmente B. Smith, J. Lam y blanco S. a. Este trabajo fue apoyado por Fundación comunitaria hawaiano (78919 16CON y 18CON 90818) e Instituto Nacional de salud NIGMS (P20GM125508) concede a mi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)	MilliporeSigma	D3418
880 nm wave length black light	Advanced Illumination	BL41192-880
avfs	freeware	Version 1.0.0.6	http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth	freeware	Version 2.6.0	http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin	freeware	Version 2.11.0	https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)	Corning	3140-100	10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	Version 14	https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black	Jardin (through Amazon.com)	NA	Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs	Brine shrimp direct	BSEA16Z
ImageJ	freeware	Version 1.52e	https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens	Toyo	NA	Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator	Seachem	NA
Optical cast plastic IR long-pass filter	Edmund optics	43-948	Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap	freeware	Build 178	http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt	Instant Ocean	RC15-10
SwisTrack	freeware	Version 4	https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)	Microsoft	Q2F-00013	Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation	freeware	Version 8	https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system	Microsoft	7, 8 or 10	https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw	freeware	NA	https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Behavior

Seguimiento conductual y Neuromast proyección de imagen de mexicana Cavefish

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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