Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Beteendemässiga spårning och Neuromast avbildning av mexikanska släktet

Published: April 6, 2019 doi: 10.3791/59099

Summary

Här presenterar vi metoder för hög genomströmning studie av en serie av den mexikanska släktet beteenden och vitala färgning av ett mechanosensory system. Dessa metoder använder fri programvara och skräddarsydda skript, som ger en praktisk och kostnadseffektiv metod för att studera beteenden.

Abstract

Grottboende djur har utvecklats en rad morfologiska och beteendemässiga egenskaper anpassas till deras ständigt mörka och mat-sparse miljöer. Bland dessa egenskaper är födosökande beteende en av de användbara windows in funktionella fördelar av beteendemässiga drag evolution. Presenteras häri är uppdaterade metoder för att analysera vibrationer attraktion beteende (VAB: ett adaptivt födosökande beteende) och bildbehandling av associerade mechanosensors grotta anpassad Tetra, Astyanax mexicanus. Dessutom presenteras metoder för hög genomströmning spårning av en rad ytterligare släktet beteenden inklusive hyperaktivitet och sömn-förlust. Släktet visar också antisocialt beteende, repetitivt beteende och högre ångest. Därför tjäna släktet som en djurmodell för utvecklade beteenden. Dessa metoder använder fri programvara och skräddarsydda skript som kan tillämpas på andra typer av beteende. Dessa metoder ger praktiska och kostnadseffektiva alternativ till kommersiellt tillgänglig mjukvara.

Introduction

Den mexikanska tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), är unik bland fiskar för att ha två radikalt olika alternativa morphs - en seende, surface-bostad morph och en blind, grottboende morph består av flera olika populationer1. Även olika i morfologi och fysiologi, är de fortfarande cannabiskonsumtion2,3. Dessa cannabiskonsumtion morphs verkar ha utvecklats snabbt (~ 20.000 år)4, vilket gör dem ett perfekt modellsystem för att studera snabb anpassning. Släktet är kända för att ha en svit av avvikande morfologiska och beteendemässiga egenskaper inklusive ökad täthet av smaklökar, ökat antal mechanosensors, födosökande beteende inställd på en viss frekvens av en vibrerande stimulans, hyperaktivitet och sömnlöshet. Många av dessa beteenden som sannolikt utvecklats samtidigt, varav vissa har föreslagits vara fördelaktiga i mörkret av grottor för födosök5 och bevara energi i mörka och mat-sparse miljöer6,7.

I många evolutionära modellsystem är det svårt att förvärva integrerad kunskap om hur djurs morfologi och beteende förändring svar på miljön eftersom de flesta arter är fördelade över en kontinuerlig gradient i komplexa miljöer. I skarp kontrast mellan grotta och ytan morph Astyanax som utvecklats i starkt kontrasterande miljöer som avgränsas av en skarp ecotone har dock lett till Astyanax växer fram som en utmärkt modell att förstå djurens evolution. Detta gör det möjligt att lättare koppla gener och utvecklingsprocesser med adaptiva egenskaper och urval i miljön. Senaste biomedicinska undersökningar av dessa egenskaper i Astyanax har dessutom visat att dessa egenskaper kan parallella mänskliga symtom8,9,10. Till exempel liknar förlust av socialitet och sömn, och vinst av hyperaktivitet, repetitivt beteende och kortisolnivå vad som observerats hos människor med autism spectrum disorder8.

För att lösa komplexa co utvecklingen av många beteenden och morfologiska drag, är det fördelaktigt att assay många av dem att lyfta fram underliggande genetiska och molekylära vägar. Presenteras häri finns metoder för att karakterisera graden av grottan-typ beteendemässiga fenotyper av ytan, grottan och hybrid morphs av Astyanax. De fokala beteenden analyseras för att karakterisera fenotyp är grottan-anpassad födosökande beteende (vibration attraktion beteende, hädanefter kallad VAB) och hyperaktivitet/sömn varaktighet11,12. Presenterade också är en tänkbar metod för det sensoriska systemet som är associerad med VAB13. Nyligen, många öppen mjukvara för kör beteendemässiga analyser har blivit tillgängliga14,15. Dessa fungerar mycket väl för korta videor, mindre än 10 minuter lång. Dock blir det problematiskt om videon är längre på grund av intensiv uträkningen/spårning tid. Kan inköpt programvara kan vara dyra. De metoder som presenteras använda främst freeware och därför anses vara kostnadseffektiva och hög genomströmning metoder. Ingår också är representativa resultat baserade på dessa metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer utförs efter de riktlinjer som beskrivs i ”principer av Laboratory Animal Care” (National Institute of Health publikation nr 85-23, reviderades 1985) och den godkända av University of Hawaii på Manoa institutionella djur vård och användning Kommittén djur protokoll 17-2560-3.

1. vibration attraktion beteende (VAB) assay (≤ 10 min för hela inspelningen förfarande)

Obs: Använd en känslig värmekamera eller bygga en infraröd kamera genom att ändra en USB webbkamera. Om du vill ändra en USB webbkamera, se en detaljerad beskrivning som presenteras av Keene Lab i släktet frågan vid JoVE (från problemet A. mexicanus ), eller en kort beskrivning i den kompletterande material.

  1. Inspelning setup
    1. För att säkerställa att kameran kvar i position, fortfarande, och på rätt brännvidd från det ämne (n) som skall registreras, bygga en svart låda ram av polyvinylklorid (PVC) rör, mäter 120 cm H x 45 cm L x 90 cm W.
    2. Efter byggandet av ramen, täcka den med en plast mörkläggning gardin såsom avsedda för hydrokultur jordbruk.
    3. Ovanpå ramen, sätter en svart akryl styrelse med ett fönster för den infraröda kameran i centrum mäta samma diameter som C-monterad justerbar zoomobjektiv. Inuti denna ruta, placera VAB assay utrustningen (figur 1).
  2. Vibration apparater
    Obs: Vibrationer produceras med hjälp av en liten funktionsgenerator.
    1. För följande metoder, tune vibrationer till en amplitud av 0,15 mm och en frekvens på 40 Hz, vilket är den frekvens som framkallar ett maximalt svar attraktion5,16.
    2. Anslut funktionsgenerator till en horisontell framåtvänd högtalare.
    3. Bifoga en glasstav för 7,5 mm diameter 14 cm i längd till dammskyddet på framsidan högtalaren med hot-lim eller en packning lim.
    4. Vinkelrätt mot detta spö och nedåt, bifoga en annan 7,5 mm diameter glasstav 4 cm i längd (figur 1).
  3. Beteendevetenskaplig analys
    1. Acklimatiserar sig en experimentell A. mexicanus i 4 dagar i en cylindrisk assay kammare fylld med konditionerat vatten (pH mellan 6,8-7,0, ledningsförmåga ca 700 µS, temperatur ca 22 ° c) med en 12/12 L/D cykel. Kontrollera om fisken har anpassat sig genom att observera deras latens till foder. Längre svarstid än i deras hem tank anger behövs mer acklimatisering tid. Hela acklimatisering, mata en gång om dagen med levande Artemia följande.
    2. Dagen före dagen för analysen (efter 3 dagars acklimatisering), ersätta vatten i assay kammaren med luftkonditionerade färskvatten.
    3. På dagen för analysen (efter 4 dagars acklimatisering), beröva experimentella fisk mat tills när analysen är klar. Mättnadskänsla kommer att ändra sina svar på vibrationerna.
    4. Ange parametrarna inspelning i VirtualDub freeware17: 15 bildrutor/s, codec: x264vfw, inspelning varaktighet: 3 min 30 s.
    5. Förbereda vibration-avger apparaten (se steg 1.2) genom att trimma till 40 Hz. Se figur 1 för förklaringen av apparater. Skölj den vibrerande glasstaven med avjoniserat vatten för att avlägsna vattenlösliga kemikalier.
    6. Arbetar i mörkret, placera assay cylindern på inspelning scenen upplyst av en infraröd bakgrundsbelysning i den svarta lådan och låt fisken att acklimatisera för 3 min.
      1. Efter de 3 min acklimatisering, registrera 3 min 30 s video. I början av inspelningen, infoga den vibrerande glasstaven i vattenpelaren (ca 0,5 cm djup).
      2. Undvik att göra eventuella oljud eller vibrationer medan positionering vibrerande glasstaven i vattnet som fisken kan känsla även de mest mindre störningarna.
      3. Slutför proceduren inom 30 s för att starta videoinspelning för att säkerställa att mer än 3 min av beteende registreras.
    7. Övervaka av videoklippet under inspelning att säkerställa att inga fel inträffar under detta skede.
    8. Efter avslutad inspelning, ta bort vibrerande glasstaven från cylindriska assay kammaren och ta bort assay kammaren från inspelningen scenen. Upprepa från 1.3.5 för nästa fisken.
  4. Video analys
    Obs: Konvertera codec till ett format som ImageJ kan ladda endast fungerar på Windows operativsystem18 (tabell 1).
    1. Konvertera komprimerad avi video i ett läsbart format för ImageJ och set-analysparametrar.
      1. Installera AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap bygga 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/), och avfs ver1.0.0.5 eller ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Observera att denna metod är programversion känsliga. Den medföljande webbplatslänkar guidar till rätt versioner (tabell 1).
      2. Köra batch-fil genom att dubbelklicka på avs_creater.bat (kompletterande fil). Rätt klick på den avs video fil som skall analyseras (Välj från avs filer som skapats av avs_creater.bat).
      3. Som video analys använder Tracker plugin i ImageJ kräver lastning av makrot ImageJ (kompletterande fil Macro_VAB_moko.txt), belastning makrot genom att dra-och-släppa in den GUI-skalet av ImageJ. Detta makro kommer att aktivera vissa snabbtangenter för följande analys.
      4. I arbetskatalogen, skapa en ny mapp med titeln ”Process_ImageJ”.
      5. Högerklicka på den .avs fil som skall analyseras (Välj från avs filer som skapats av avs_creater.bat). Välj alternativet snabb fäste . Efter avs filen är monterad som en extern enhet, öppna avi-fil i ImageJ (avi-filen har namnet slut med ”.avi”).
      6. Ange omfattningen av avståndsmätning, Välj diameter assay kammaren genom att rita en rak linje i kammaren med hjälp av linjär markeringsverktyget, klicka Analyze > ställa in skalan för funktion. Till exempel ingång 9,4 cm om använder en cylindrisk maträtt med en 9,4 cm innerdiameter. Markera rutan radio Global för att standardisera skalan i samtliga av följande video analyser.
    2. Omvandla till binärt stack och kör analys.
      1. Kopiera området assay kammare med hjälp av verktyget oval markering och sedan högerklicka och välj Bild > Duplicera. Vid denna tid, ange ett intervall av bildrutor för att hålla för vidare analys, t.ex., hålla de första 2.700 bildrutorna efter den vibrerande staven in vattnet (vid 15 fps det är exakt 3 minuter video).
      2. Avmarkera utsidan av assay kammaren och konvertera till en binär bild genom att trycka snabbtangenten 7 på nummer baren på tangentbordet.
      3. Efter bakgrunden rensar visas en uppmaning, att lägga en svart prick vid center för att ange positionen för den vibrerande glasstaven med verktyget oval urval redan inställd på svart med funktionen Fyll . Klicka på OK och en prompt visas att gå vidare till justeringen tröskel.
      4. Ange tröskelvärde att göra en binär (alla svart och vitt) bild av fisk. Justera tröskeln så att fisken kan ses i hela videoklipp och välj sedan Verkställ.
      5. Kör ”Tracker” plugin genom att slå den heta nycklarna 8 i fältet nummer. Ange minsta pixelstorlek till 100 när du uppmanas och slå till OK, generera avståndet mellan vibrerande staven och fisken per bildruta för alla 3 min av binära videon.
      6. Justera mis spårningen genereras av buller i videon. Till gör så, kontrollera fönstret resultat för att identifiera de ramar som returnera objektnummer 3 eller högre-indikerande extra objekt i dessa ramar (t.ex. partiklar i vattnet eller i skuggan av transparent armen på staven) förutom ”rod” och ”fisk” den ram. Ta bort eventuella extra föremål med penselverktyget.
      7. Slå den heta nycklarna 9 på nummer baren för att exportera en binära trave bilder av hela videon (om det är nödvändigt att analysera igen) och en .xls-fil med koordinater och avståndsdata (kompletterande filer CF01.xls, Threshold_CF01.tif och, Trac_CF01.tif ). Hot key 9 stänger också alla filer som är associerade med den aktuella videon. Upprepa steg 1.4.2.1 genom 1.4.2.6 för alla replikat.
      8. Kör skriptet makro (kompletterande fil JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) om du vill konsolidera flera Tracker resultatet filer (.xls) i ett kalkylblad och räkna antalet och varaktigheten av strategier till ett 1,5 cm från stången. Närmar sig inte varar minst 0,5 s kommer inte att räknas. Ändra parametrarna för avstånd och tid räknas som en strategi enligt särskilda frågor av intresse.
    3. Släpp det PC diskutrymmet efter avslutad alla analyser. Ta bort monterade filer för att frigöra diskutrymme - avi.avi och. avi.avs filer (tillägg genereras av programvaran)-genom att köra en batch fil multiunmountdel.bat i samma mapp där avs_creater.bat kördes i avsnittet 1.4.1.2.

2. sömn och hyperaktivitet assay (24 h inspelning)

  1. Beteendevetenskaplig analys
    1. Acklimatiserar sig fem experimentella fisk i 4 dagar eller mer i varje kammare av en specialdesignad 10 L akryl inspelning akvarium (45,9 x 17,8 cm x 17,8 cm; längd x bredd x djup, respektive) fylld med konditionerat vatten (se steg 1.3.1).
      1. Separera varje individuella kammare med svart akryl styrelser att göra chambers lika i storlek, mäta 88,9 mm × 177,8 mm × 177,8 mm (figur 2). Var noga med att täcka varje tank för att förhindra att fisk från att hoppa mellan kamrarna.
      2. Ställa in programmerbara power timer att automatiskt slå på vitt LED ljus för 12 h och off för 12 h varje dag under acklimatiserings period (exempelvis ställa lampan på klockan 7 och off klockan 19.00). Detta kommer att dra in dygnsrytmen av fisk (om det är mottagliga för övningsprovet).
      3. Använd ogenomskinlig, vit akryl styrelser liknande dimension till 10 L tank som spridare för att passera vit och infrarött ljus genom för att ge diffust ljus även intensitet över alla tankar.
      4. Hela acklimatisering, mata en gång om dagen med live Artemia följande och ge luftning genom svamp filter i varje akvarium.
        Anmärkning: Se till att fisk utfodras på konsekvent gånger (dvs, 1 x per dag klockan 9:00) som matdags kan också påverka övningsprovet dygnsrytmen19.
      5. Kontrollera om fisken har bli acklimatiserad genom att observera deras latens till foder. En längre svarstid än i deras hem tank anger behövs mer acklimatisering tid.
    2. Dagen före dagen för haltbestämning (3 dagar eller mer av acklimatisering), byta vatten i assay kammaren med fräscha luftkonditionerade vatten (se steg 1.3.1).
    3. Ange parametern inspelning i VirtualDub programvara17: 15 bildrutor/s, codec: x264vfw, inspelning varaktighet: 86.400 s (24 h).
    4. Slå på IR bakom inspelningen scenen (se figur 2). Genom att observera VirtualDub live-avbilden på skärmen, justera positionen för varje akvarium att göra dem möta USB-kameran.
    5. På dagen för inspelning, mata varje fisk med levande Artemia följande, ta bort alla svamp filter och slå på IR.
    6. Börjar 24 h inspelning på morgonen (till exempel starttid är klockan 9 och sluttid är 9 på morgonen dagen efter). Börja spela in video och säkert på plats för att undvika störningar. Kontrollera regelbundet att inspelningen är igång.
    7. Efter 24 h, se till att videon sparas korrekt. Överföra video till PC arbetsstationen för att spåra och analysera fiskens beteende.
  2. Video analys
    1. Kontrollera först videokvaliteten genom att titta på belysningen. Kontrollera om det finns en fisk i varje avsnitt, och om det finns några utländska rörelser som kan orsaka mis spårning.
    2. Förbereda masken för att undvika felaktig spårning utanför akvariet. Gör två masker: en för 'även' och en 'udda' fisk, baserat på deras sekvens ordning i tankarna.
    3. Gör två mappar som heter ”udda” och ”även” för maskerna som beskrivs ovan. Flytta spårningen parameterfil av SwisTrack i var och en av dessa mappar.
    4. Öppna spårning parameterfil för SwisTrack mjukvara (kompletterande fil Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack). Ange sökvägen till den video filen och mask fil, och sedan spara och avsluta spårningen parameterfil. Justera blob nummer och maximal pixlar parametrar i ”Blob upptäckt” och ”närmaste granne Tracking” komponenter, respektive, enligt experimenten.
    5. Dubbelklicka för att köra ett skript för win-automation programvara som öppnas automatiskt SwisTrack programvara (kompletterande fil swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe eller swistrack_4.exe- dessa är alla samma körbara filer), som aids i uppdatera den adaptiva bakgrund subtraktionen i SwisTrack.
    6. Öppna Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack i SwisTrack programvara att ladda spårning parameterfil. Efter lastning parametrarna, tryck på knappen kör för att starta spårning.
    7. I de inledande 9.000 ramarna (600 s, dvs första 10 min på den inspelade videon), kontrollera om fisk spårning fungerar genom att titta på den adaptiva bakgrund subtraktionen, binärt mask, och närmaste granne spårning i med SwisTrack (se komponentlista medföljande video). Välj sedan adaptiv bakgrund subtraktion i komponentlistan.
    8. Tryck på R -knappen på tangentbordet för att återuppta win-automation och lämna datorn för att spåra. Spårning kommer att ta 5-7 h per 24 h video för en stationär dator med 4-CPU-kärnor och 8 GB minne. Enligt behov, kör flera SwisTrack processer (inklusive udda och jämna arenor i en enda videofil) upp till antalet kärnor i Processorn. Exempelvis kan 4-kärnor hantera 4 videos på en gång.
    9. Under denna spårning, undvika att använda denna dator för andra ändamål eftersom win-automation program automatiskt flyttar muspekaren. De inledande 9.000 ramarna kommer att slängas i följande procedur.
    10. Fördela 3 Perl script-filer (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, och 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) till mappen som innehåller de spårning-filer som genereras av SwisTrack i mapparna 'även' och 'udda' (se steg 2.2.3).
    11. Klipp en bildruta i videon från videofilen med VirtualDub och importera detta klipp som ett foto till ImageJ. Välj längden på akvariet (45,9 cm) i ImageJ och beräkna pixel cm baserat. Skriva pixel cm förhållandet i 1.fillGaps2.pl i ett textredigeringsprogram och spara.
    12. Starta CygWin program, en Unix-emulator. Leta upp mappen SwisTrack som innehåller de 3 Perl-skript med hjälp av cd på kommandoraden.
    13. Köra Perl-skript genom att skriva Perl 1.fillGaps.pl. Dessa tre Perl-skript kommer att tilldela varje spårning-fil till en unik avdelning av akvariet och analysera sömn varaktighet och simning avståndet medan fisken var vaken. Det tar 1-2 h att avsluta analysen.
    14. Bedöma den textfil som heter Summary_Sleep.txt att avgöra om antalet bildrutor tappas från analysen är acceptabelt låg; saknas färre än 15% av ramar anses godtagbart.
    15. Kopiera och klistra in analyseras resultaten från Summary_Sleep.txt till ett kalkylblad med makrot (kompletterande fil Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
    16. Kör makrot för att extrahera sammanfattningsdata spåra filer.

3. DASPMI eller DASPEI färgning av mechanosensory neuromasts

Obs: DASPMI och DASPEI färgning är ljuskänsliga och bör göras i mörka förhållanden. Följande protokoll är för både DASPMI och DASPEI genom att använda DASPMI som ett exempel.

  1. Färgning protokoll
    1. För sammanlagt 1 L av färgning stamlösning (25 µg/mL), tillsätt 0,025 g DASPEI eller DASPMI kristaller till 1 L dH2O och låt den lösas upp under natten. Håll lösningen lagras vid 4 ° C och skyddas från ljus.
    2. Doppa fisken i 2,5 µg/mL DASPMI eller DASPEI upplöst i konditionerat vatten (se steg 1.3.1) för 45 min i en mörk miljö vid 22 ° C.
    3. Efter 45 min, ta bort fisk från DASPMI eller DASPEI lösning och söva genom nedsänkning i ett isbad konditionerat vatten med 66,7 µg/mL buffrad-etyl 3-aminobensoat metan sulfonat salt (MS222).
    4. Montera fisk i en petriskål tallrik och fotografi i fluorescerande Mikroskop. Ta z-stack bilder och spara som TIF-filer för följande analys.
  2. Bildanalys med ImageJ
    1. Inuti den mappen som innehåller TIF-filer, klistra in en mall av filen ImageJ makro (Neuromast_ImageJ.txt) och skapa en ny mapp med titeln ”Process_ImageJ”. I ImageJ ange macro fil, sökvägen till den aktuella katalogen.
    2. Starta ImageJ och öppna makrot genom att dra filen makro till GUI eller klicka filen > Öppna och välja filen makro.
    3. Köra makrot genom att klicka makron > kör makrot. Makrot öppnas då automatiskt en bildfil som ska analyseras. Om bildfilen inte öppnas, klicka på makro > Fil plocka upp.
    4. För Neuromast kvantifiering, Välj intresse med hjälp av Verktyget Polygon-region.
    5. Slå den heta nycklarna 5 till dubbla region av intresse.
    6. Använda Paint verktyg för att ta bort eller lägga till prickar för extra eller saknas neuromast från föregående bild och tryck sedan på 6. Efter hitting 6, två nya windows visas: system av numrerade neuromasts prickar och ett bord med totala neuromasts kvantifieras.
    7. Tryck 7 för att spara både filer: en filen lagras som en TIF fil och den andra är sparad som en .xls-fil. Efter dessa filer lagras, öppnas en ny bildfil för analys.
    8. Konsolidera neuromast räkningarna av varje fisk i ett kalkylblad genom att köra skriptet makro (SN_Number_Diameter.xlsm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De resultat som presenteras häri är representativa exempel på vad kan förvärvas med de presenterade metoderna. Resultaten kan därför avvika något från de som presenteras här för både släktet och ytan fisk beroende på de experimentella förhållandena.

Vibration attraktion beteende

Representativa resultat för VAB kan hittas i figur 3 för både grottan och ytan fisk. Observera beteendet edge-följande i ytan fisken (figur 3A; ett attribut som delas med släktet) och stark attraktion av släktet till vibrerande staven (figur 3B). Den attraktion toppnivån observerades nära 35 Hz för släktet (figur 3D) men inte surface fisk (figur 3 c), som representerar en viktig skillnad i de beteendemässiga fenotyperna av de två morphs. Toppen i attraktion runt denna frekvens representerar sannolikt frekvensen av vibrationer genom byte eller mat objekt20,21.

Sömn och hyperaktivitet assay

De kriterier som används häri att definiera sömn passar de svar tröskelvärden fastställts tidigare vara effektivt för Astyanax11. Sömn är kännetecknas av långa perioder av rofylld och definieras som orörlighet av > 60 s och förhöjda svar tröskel12,22,23. I jämförelse med surface fisk, kortare sömn varaktighet förekommer i larver och vuxna släktet11,12, därför sömn analyserna är ett effektivt sätt att behaviorally fenotyp Astyanax i alla åldrar. Medan släktet visade mindre-sömn (figur 4B, kortare sömn varaktighet i släktet), är de också hyperaktiv (figur 4A).

DASPMI eller DASPEI färgning av mechanosensory neuromasts

Neuromasts består av sensoriska celler som lätt kan färgas med DASPEI eller DASPMI och observerade Invivo i fluorescerande Mikroskop. Presenterade resultatet blev resultatet av DASPMI färgning. Antalet ytliga neuromasts förstärks i kraniala regionen av släktet jämfört med surface fisk (figur 5 c, D), och båda storlek-en proxy av numrera av mechanosensory hårcellerna- och antal ytliga neuromasts är positivt korrelerade med nivå av vibrationer attraktion beteende (antal förhållningssätt till vibrerande staven: figur 5A,B).

Programvara Analys version webbplats
avfs Aktivitet/vila Version 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
AviSynth VAB Version 2.6.0 http://AviSynth.nl/index.php/main_page
Cygwin Aktivitet/vila Version 2.11.0 https://www.Cygwin.com/
ImageJ VAB och DASPEI Version 1.52e https://imagej.NIH.gov/IJ/
pfmap Aktivitet/vila Bygga 178 http://pismotec.com/download/ (på ”Download Archive” länk längst ner)
SwisTrack Aktivitet/vila Version 4 https://en.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack
WinAutomation Aktivitet/vila Version 8 https://www.WinAutomation.com/ (gratis fristående app för detta förfarande)
Windowsoperativsystem VAB och aktivitet/sömn 7, 8 eller 10 https://www.microsoft.com/en-us/Windows
x264vfw Alla analyser NA https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Tabell 1. Lista över freeware som används i dessa analyser, källa hemsida.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av vibrationer attraktion beteendemässiga assay försöksutrustning. En glasstav som bifogas en högtalare är inställd på en frekvens på 40 Hz och nedsänkt till ett djup av ca 0,5 cm vid uppkomsten av videoinspelning. Denna siffra är modifierad från Yoshizawa et al.5. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Schematisk av sömn assay försöksutrustning. Tankar är skräddarsydda från 0.7 cm tjock transparent akryl styrelser; septa är 0,3 cm tjock helt ogenomskinlig svart akryl styrelser. Ogenomskinlig svart akryl styrelser används för denna del av tankarna så att fisken inte kan se varandra. (A) Top view: Observera att yttre kamrarna av tanken har lutas inåt septa att rymma skillnader i kameran vinkel. (B, C) Front och sida visningar, respektive. (D) matris med tre tankar bakgrundsbelyst med infrarött ljus som passerar genom en diffusor för att homogenisera intensitet ljus över alla tankar. Observera att varje tankens orientering justeras så att alla rörelser av varje fisk i dess respektive kammare är synliga. Panelen (C) och (D) ändras från16. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 : Representativa resultat av en 3- minut vibration attraktion beteende analys. (A, B) Ovanifrån av simning sökvägen yta fisk (A) och släktet (B). redlines finns spår av sökvägen som fisken tog under 3 minuters video. Den svarta pricken i mitten anger placeringen av vibrerande glasstaven. wrMtrck ImageJ plugin användes för att visualisera den fisk spår24. (C, D) Jämförelse av resultat från surface fisk (C) och släktet (D) utsätts för flera frekvenser av vibrationer. Varje prick representerar varje fisk. Mörka skuggiga områden är interkvartilintervall. Observera att över alla frekvenser, yta fisk inte visar anmärkningsvärda attraktion till vibrationer medan släktet visar maximalt i attraktion nära 35 Hz. (C, D) den från 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 : Representativa resultat från flera åtgärder för verksamhetsanalys - Diurnal aktivitetsmönster i ytan fisk och släktet. (A-B) Dag (gula staplar) och natt (svarta staplar) noter av simning sträcka (m per 10 min, A), och sömn varaktighet (1000 s/12 h, B). Varje stapel representerar medelvärde ± standardfel av medelvärdet. Blå stjärnor indikerar signifikansnivå för statistiska jämförelser mellan surface fisk (Sf) och släktet (Cf). Släktet och ytan fisk har betydligt olika dag-natt aktiviteter. Tvåvägs ANOVA statistik för varje fenotyp är: för simning avstånd (A) mellan surface fisk (Sf) och släktet (Cf): F1 399 = 185,8, P < 0,001, mellan dag och natt: F1 399 = 26,9, P < 0,001, interaktion mellan befolkningen och dag-natt: F1 399 = 3,6, P = 0.060 (inte betydande: n.s.); för sömn varaktighet (B) mellan Sf och Cf: F1 399 = 237,9, P < 0,001, mellan dag och natt: F1 399 = 164,1, P < 0,001, interaktion mellan befolkningen och dag-natt: F1 399 = 26,5, P < 0,001. För båda analyser, N = 200 och 201 för surface fisk och släktet, respektive. Skillnaden mellan dag och natt aktiviteter testades av post-hoc-parat t-test med Bonferroni korrigeringar och betecknas med svart asterisker. betecknar P < 0,001. ** betecknar P < 0,01. En delmängd av informationen var återanvändas och uppdaterad från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 : Representant resultat av förhållandet mellan VAB och neuromast. (A, B) Förhållandet mellan VAB och neuromast antal och storlek i släktet, yta fisk och är F1 hybrid avkomma av surface fisk x släktet. Observera att de normaliserade poäng av vibrationer attraktion (kvadratroten ur antalet inflygningar) är positivt korrelerad med neuromast överflöd (Pearson korrelationskoefficient r = 0,62, P < 0,001) och neuromast diameter (Pearson korrelation koefficienten r = 0,31, P < 0,01). Panel A och B ändras från5(C, D) DASPMI färgning av neuromasts i regionen kinden i (C) en yta fisk och (D) en släktet. Skalstapeln i infälld (C) och (D) är 1,0 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. 

Kompletterande material. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dessa presenteras metoder är lätt-till-access men kan vara komplicerat att utföra på grund av dess freeware ursprung. Det rekommenderas därför starkt att utföra rättegång analyser och analyser innan några verkliga experiment.

Data generation kan vara snabb när den experimentella och analytiska ramen är etablerade. När etablerade, är det möjligt att spela in två fiskar i 7 min för VAB analysen, 30 fisk i 24 h för aktivitet/sleep analysen och en fisk i 2,5-3 min för neuromast imaging, start från MS222 anestesi till slutliga Bildinsamling. Varaktigheten för analyserna som video- och bildfiler kan variera avsevärt beroende på utförandet av den dator som används. Genom att använda en PC med en 4-core CPU och 8 GB RAM, VAB analys kan ta 5-7 min per fisk, aktivitet/sleep analys kan ta 6-8 h per grupp av 30 fisk och neuromast bildanalys kan ta 5 eller 10 min per fisk (enda sidan eller båda sidorna av bilder av den kraniella regionen, respektive). Kommersiellt tillgängliga spårning programvara (Tabell för material) är ett alternativ för videoanalys. Det är mycket kraftfull i animal tracking men dyra (t.ex. basera programvara ~ USD$ 5, 000USD och flera spårning modul ~ USD$ 4,000). Just nu, våra spårningsmetoder tycks uppnå jämförbar noggrannhet av spårning, särskilt för verksamhet/sleep analys, dvs, saknas ramar är vanligtvis lägre än 15% av totala ramar. Denna metod visade också en hög reproducerbarhet i fyra replikat (kompletterande Tabell1). Men måste svårigheten att utveckla detta system utan en förståelse för grundläggande kodning i Windows OS och Linux/Unix OS erkännas.

Det är viktigt att ge bästa möjliga och konsekvent levnadsvillkoren för experimentell fisk under fisk acklimatisering perioder, och innan och beteendemässiga analyser. Detta inkluderar utfodring mat av hög kvalitet vid samma tid och mängd varje dag och upprätthålla hög vattenkvalitet (låg ammoniak, nitrater, nitriter och upplöst organics, ~ pH 7 och liknande ledningsförmåga runt 700 µS). Det är också viktigt att utföra analyser i ett område som inte störs av ljud. Bullriga fotspår och skramlande ljud kan ändra beteendemässiga svaren och aktivitet/sömn-mönster. För att minska nivån på skadan till mechanosensory enheter medan hantering fisk, är det bra att använda en finmaskiga fisk netto när du överför fisk; Detta hjälper till att undvika att skada slem cupula av neuromasts.

DASPEI dye har subletala effekter på fisk, men överdriven exponering kan leda till toxiska effekter. Doppa fisken i den DASPEI lösningen för 2 h kommer exempelvis att öka risken för dödlighet under återhämtningen efter anestesi. DASPEI färgning är ljuskänsliga och därför bör göras i mörka förhållanden.

När det gäller freeware installation, AviSynth programvara, Avisynth Virtual File System (avfs) och Pismo fil Mount Audit paketet (pfmap) krävs specifika versioner att samarbeta sammanhållet. Det bekräftades av detta protokoll att avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) och pfmap (1.7.8) arbetar tillsammans, men åtminstone senast pfmap bygga fungerade inte för förfarandet för fil-montering. Av denna anledning uppmärksamma programvaruversioner (tabell 1). VirtualDub fungerar bättre under den 32-bitars versionen istället för 64-bitars. Inställningen av 15 bildrutor per s ger en bra tidsupplösning och kräver inte överdriven lagringsvolym (1,6 GB för en 24-h sömn analys video och 3 MB för en VAB-video). Den stora svårigheten kan komma från Ange sökvägar i makrot för ImageJ. I Windows OS, kan sökvägen till filen uttryckas generellt som ”C:Document\my Document\...”. ImageJ makrot körs under Java environment och behöver en extra ”\” för sökvägen till filen, det vill säga ”C\:Document\\my Document\\...”. Se filen exempel ImageJ makro. Dessutom kan det krävas att installera två plugins, Slice Remover och objektet Tracker25, och tilldela snabbtangenter (kortkommandon) 6 och 8, respektive, så att analyserna fungerar sömlöst (Plugins > genvägar > Lägg till Genvägar... 26 ). SwisTrack har en funktion för att ställa in spårning parametrar, men det är möjligt att en frysa eller krascha kan förekomma samtidigt fastställa spårning parametrar. Det är bättre att redigera parametern i en text editor app såsom Notepad ++. För detaljer om inställningar av parametrar, se27. Cygwin (Unix emulator) installationsprogrammet innehåller en paketet installer för att installera Perl paketet, som inte ingår i standard installera inställning. Det rekommenderas att välja specifikt det Perl-paketet under installationen av Cygwin.

Även om detta förfarande är begränsad till en sidolinje-baserade beteende (VAB) och simning aktivitet och sömn, kan detta djur spårningssystem anpassas till andra beteenden inklusive stereotypic repetitiva beteenden, sociala interaktioner och den asymmetriska användning ( vänster/höger) av kraniala neuromasts under födosök (lateralitet)13, även om dessa metoder kan kräva grunt arenor såsom de föreslås av idTracker14. Med en svit av utvecklade beteenden, kan man tillämpa olika skript för att analysera data som spårade X - och Y - axeln och undersöka olika beteendemönster. Denna analys rörledning är avsedd att ge en grund för att lösa mekanismen av utvecklingen i flera beteenden, och även hur komorbida autismliknande beteende regleras av genetiska, epigenetiska, och miljömässiga faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar alla medlemmar för Yoshizawa lab inklusive N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato och I. Herren för fisk vård på experimentell fisk som används i detta manuskript. Vi tackar också A. Keene lab medlemmar inklusive s. Masek för att träna min att montera IR CCD-kamera. Slutligen vill vi tacka Media Lab - College of Social Sciences - skola av kommunikationerna på den University of Hawaii Mānoa för deras ovärderliga hjälp med att göra videon, särskilt B. Smith, J. Lam och S. vitt. Detta arbete stöds av Hawaiian gemenskapen Foundation (16CON-78919 och 18CON-90818) och nationella institutet för hälsa NIGMS (P20GM125508) beviljar för MY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) MilliporeSigma D3418
880 nm wave length black light Advanced Illumination BL41192-880
avfs freeware Version 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth freeware Version 2.6.0 http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin freeware Version 2.11.0 https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) Corning 3140-100 10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT Noldus Information  Technology, Wageningen, The Netherlands Version 14 https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black Jardin (through Amazon.com) NA Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs Brine shrimp direct BSEA16Z
ImageJ freeware Version 1.52e https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens Toyo NA Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator Seachem NA
Optical cast plastic IR long-pass filter Edmund optics 43-948 Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap freeware Build 178 http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt Instant Ocean RC15-10
SwisTrack freeware Version 4 https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) Microsoft Q2F-00013 Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation freeware Version 8 https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system Microsoft 7, 8 or 10 https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw freeware NA https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  25. Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).

Tags

Beteende problem 146 beteende mechanosensory sidolinje stygobionts födosökande Astyanax autism dygnsrytm mexikanska tetra underjordiska gratis programvara freeware
Beteendemässiga spårning och Neuromast avbildning av mexikanska släktet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worsham, M., Fernandes, V. F. L.,More

Worsham, M., Fernandes, V. F. L., Settle, A., Balaan, C., Lactaoen, K., Tuttle, L. J., Iwashita, M., Yoshizawa, M. Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59099, doi:10.3791/59099 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter