Summary
Burada, davranışları ve hayati bir mechanosensory sistem boyama yöntemleri için yüksek üretilen iş çalışma Meksika cavefish bir dizi mevcut. Bu yöntemler davranışları çalışmaları için pratik ve düşük maliyetli bir yöntem sağlayan ücretsiz yazılım ve özel komut dosyalarını kullanın.
Abstract
Mağaralarda yaşayan hayvanlar sürekli karanlık ve gıda seyrek ortamlarına adapte morfolojik ve davranışsal özellikleri bir dizi gelişmiştir. Bu özellikler arasında yiyecek davranış yararlı pencere eşiği içine işlevsel davranış özelliği evrim avantajları biridir. Burada sunulan titreşim cazibe davranışını çözümlemede Güncellenme Zamanı yöntemlerdir (VAB: edinilmiş bir yiyecek davranış) ve görüntüleme tetra, mağara adapte ilişkili mechanosensors Astyanax mexicanus. Buna ek olarak, yöntemler ek cavefish davranışlar hiperaktivite ve uyku kaybı da dahil olmak üzere bir dizi yüksek üretilen iş takibi için sunulmaktadır. Cavefish asosyal, tekrarlayan davranış ve yüksek anksiyete de gösterilir. Bu nedenle, cavefish gelişmiş davranışları için hayvan bir model olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemler davranış, diğer türleri için uygulanabilir ücretsiz yazılım ve özel komut dosyalarını kullanın. Bu yöntemleri piyasada bulunan izleme yazılımı pratik ve düşük maliyetli alternatifler sağlar.
Introduction
Meksika tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), iki kökten farklı alternatif morphs - görüşlü, yüzey-konut morph ve farklı birkaç oluşan bir kör, mağaralarda yaşayan morph sahip balıklar arasında benzersizdir nüfus1. Farklı morfoloji ve Fizyoloji, hala interfertile2,3olmakla birlikte. Bu interfertile morphs (~ 20.000 yıl)4onları hızlı adaptasyon çalışması için bir ideal modeli sistemi yapar, hızla geliştiğini görünmektedir. Cavefish bir süit artan yoğunluk tat tomurcukları, mechanosensors, titreşimli bir uyarıcı, hiperaktivite, belirli bir frekansa ayarlı yiyecek davranış sayısının artmasına da dahil olmak üzere farklı morfolojik ve davranışsal özelliklerin bilinmektedir ve uykusuzluk. Birçok bu davranışların büyük olasılıkla aynı anda gelişti bazıları mağara5 yiyecek arama ve karanlık ve gıda seyrek ortamlar6,7enerji tasarrufu için karanlıkta avantajlı olmak tavsiye ettiler.
Birçok evrimsel modeli sisteminde çoğu tür karmaşık ortamlarda sürekli degrade boyunca dağılmıştır çünkü nasıl hayvan morfolojisi ve davranış değişikliği yanıt çevreye entegre bilgi edinmelerine zordur. Ancak, mağara ve yüzey morph son derece keskin ecotone tarafından belirlenen ortamlar zıt gelişti Astyanax arasında tezat mükemmel bir model ortaya çıkan Astyanax hayvan evrim anlamaya yol açmıştır. Bu genler ve gelişim süreçleri adaptif özellikleri ve seçim ortamı ile daha kolay bağlantı sağlar. Ayrıca, Astyanax bu özelliklerin son biyomedikal araştırmalar bu özellikler insan belirtiler8,9,10paralel göstermiştir. Örneğin, sociality ve uyku kaybı ve kazancı hiperaktivite, tekrarlayan davranış ve kortizol düzeyi ile otizm spektrum bozukluğu8insanlarda gözlenen için benzer.
Birçok davranışları ve Morfolojik özellikleri karmaşık işbirliği evrimi adrese, pek çoğu altta yatan genetik ve moleküler yolları vurgulamak için tahlil daha avantajlıdır. Burada Astyanaxyüzey, mağara ve hibrid morphs mağara tipi davranış fenotipleri derecesini karakterize yöntemleri sunulur. Fenotip karakterize etmek için analiz odak davranışları yiyecek davranış (titreşim cazibe davranış, bundan böyle VAB anılacaktır) mağara uyarlanmış ve hiperaktivite/uyku süresi11,12vardır. Ayrıca VAB13ile ilişkili duyu sistemi için bir görüntüleme yöntemidir. Son zamanlarda, davranış testleri çalıştırmak için birçok açık kaynak izleme yazılımı mevcut14,15haline gelmiştir. Bunlar çok iyi kısa videolar için daha az 10 dakikalık iş. Ancak, yoğun hesaplama/izleme zaman nedeniyle video uzunsa sorunlu olur. Yetenekli ticari yazılım pahalı olabilir. Sunulan yöntemleri çoğunlukla ücretsiz kullanın ve bu nedenle düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi yöntemleri olarak kabul edilir. Da dahil temsilcisi sonuçları bu yöntemlere temel alır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları "İlkeleri laboratuvar hayvan bakımı" (Ulusal Sağlık Enstitüsü yayın No 85-23, 1985 revize) ve onaylı Manoa kurumsal hayvan bakım ve kullanım Hawai'i Üniversitesi tarafından açıklanan yönergeleri izleyerek gerçekleştirilir Komitesi hayvan iletişim kuralı 17-2560-3.
1. titreşim cazibe davranış (VAB) tahlil (≤ tüm kayıt yordamı için 10 dk)
Not: bir kızılötesi hassas kamera kullanabilir veya bir kızılötesi kamera USB webcam değiştirerek oluşturabilirsiniz. Bir USB web kamerası değiştirmek için bkz: Jüpiter (sayısından bu A. mexicanus ) bu cavefish konusu Keene laboratuarda tarafından sunulan ayrıntılı bir açıklama veya ek materyalleri içinde kısa bir açıklama.
- Kayıt kurulum
- Kamera pozisyonda kalmasını sağlamak için hala ve kaydedilen subject(s) dan uygun odak uzaklığı bir kara kutu çerçeve dışarı Polivinil klorür (PVC) boru, 120 cm H x 45 ölçme inşa cm L x 90 cm W.
- Sonra inşaat çerçeve ile bir plastik blackout perde gibi bir amaçlanan hydroponic tarım için yeterli.
- Çerçevenin üst kısmında siyah akrilik kurulu kızılötesi kamera için bir pencere ile ayarlanabilir zoom C monte objektif olarak aynı Çap ölçüm Merkezi koymak. Bu kutunun içinde VAB tahlil donatımı (şekil 1) yerleştirin.
- Titreşim aparatı
Not: Titreşim küçük işlevi jeneratör kullanılarak üretilmektedir.- Aşağıdaki yöntemleri için cazibe5,16en fazla yanıt aydınlığa çıkartıyor frekans olduğu bir genlik titreşimler 0.15 mm ve frekans 40 Hz ile ayarlayın.
- İşlev üreteci yatay bir karşılıklı hoparlör bağlayın.
- 7.5 mm çapında cam çubuk uzunluğu 14 cm hoparlör yüzünde toz kapak sıcak tutkal ya da bir conta yapıştırıcı kullanarak ekleyin.
- Bu çubuk ve aşağıya doğru bakacak şekilde dik eklemek başka bir 7.5 mm çapında cam çubuk 4 cm uzunluğunda (şekil 1).
- Davranışsal tahlil
- Bir deneysel A. mexicanus 4 gün boyunca şartına su (pH 6.8-7.0, iletkenlik yaklaşık 700 µS, sıcaklık yaklaşık 22 ˚C arasında) 12/12 L/D döngüsü ile dolu bir silindirik tahlil odasında alışmana. Balık yem için onların gecikme gözlemleyerek iklime alıştırılacağı olup olmadığını kontrol edin. Daha uzun gecikme içinde onların ev tank daha fazla calıştıkları zaman gerektiğini gösterir. Calıştıkları, günde bir kez canlı Artemia nauplii ile beslenir.
- Gün (3 gün sonra calıştıkları), testin gün önce tahlil odasında su temiz klimalı su ile değiştirin.
- Tahlil tamamlandıktan sonra tahlil (calıştıkları 4 gün sonra) günü, deneysel balık yiyecek kadar mahrum. Doyma titreşimler onların yanıt değişecek.
- VirtualDub freeware17' kayıt parametrelerini ayarla: 15 kare/sn, codec: x264vfw, kayıt süresi: 3 dk 30 sn.
- (Bkz. Adım 1.2) titreşim yayan cihazlar için 40 Hz ayarlama tarafından hazırlayın. Şekil 1 aparatı açıklaması için bkz:. Titreşimli cam çubuk ile suda eriyen herhangi bir kimyasal temizlemek için deiyonize suyla durulayın.
- Karanlıkta çalışma, kızılötesi bir arka ışık kara kutusuna tarafından aydınlatılmış kayıt sahne tahlil silindir yerleştirin ve balık 3 dakikadır alışmana izin.
- 3 dk. calıştıkları sonra 3 dk 30 sn video kaydetmek. Kayıt başlangıcında, titreşimli cam çubuk su sütunu (yaklaşık 0.5 cm derinlik) yerleştirin.
- Mantıklı olabilir herhangi bir ses veya titreşimli cam çubuk su balık konumlandırma süre titreşimleri bile en küçük bozuklukları yapmamak.
- Bu yordamı 30 içinde bitirmek s emin olmak için video kaydı başlamaktan daha--dan 3 dk davranışının kaydedilir.
- Herhangi bir hata bu dönemde ortaya emin olmak için kayıt sırasında video izlemek.
- Kayıt bitirdikten sonra titreşimli cam çubuk silindirik tahlil odasından kaldırın ve tahlil odası kayıt Sahne Alanı'ndan kaldırın. Üzerinden 1.3.5 sonraki balık için yineleyin.
- Video analiz
Not: codec ImageJ yükleyen bir format dönüştürme yalnızca Windows işletim sistemi18 tarihinde (Tablo 1) çalışır.- Sıkıştırılmış AVI video ImageJ ve set analiz parametrelerini için okunabilir bir biçime dönüştürmek.
- AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap yapı 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) ve avfs ver1.0.0.5 veya ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/) yükleyin. Bu yöntem program/sürüm duyarlı olduğunu unutmayın. Sağlanan Web sitesi bağlantıları uygun sürümleri (Tablo 1) yol gösterecektir.
- Toplu iş dosyası avs_creater.bat (tamamlayıcı dosyasını) çift tıklatarak çalıştırın. Doğru tıkırtı olmak avs video eğe (seçim avs_creater.battarafından oluşturulan avs dosyalarından) analiz.
- Video analiz ImageJ içinde izci eklentisi kullanarak ImageJ makro (ek dosya Macro_VAB_moko.txt) yüklenmesini gerektirir gibi makro sürükle ve bırak tarafından ImageJ GUI kabuk içine yükleyin. Bu makroyu belirli tuşları aşağıdaki analizi için olanak sağlar.
- Çalışma dizinini "Process_ImageJ" başlıklı yeni bir klasör oluşturun.
- .Avs dosyası üzerinde sağ tıklayın (seçim avs_creater.battarafından oluşturulan avs dosyalarından) analiz. Hızlı montaj seçeneği seçin. Avs dosya harici bir sürücü olarak bağlandıktan sonra belgili tanımlık AVI eğe ImageJ içinde açın (AVI dosya adı son vardır ".avi" ile).
- Uzaklık ölçü ölçeği ayarlamak için tahlil odası çapı normal amortisman seçim aracınıkullanarak odası arasında düz bir çizgi çizerek seçin, ardından Analiz > ayarla ölçek işlev. Örneğin, 9,4 cm silindirik bir tabak 9,4 cm iç çapında ile kullanıyorsanız girdi. Ölçeğin tüm aşağıdaki video analizler arasında standartlaştırmak amacıyla küresel radyo kutuyu işaretleyin.
- İkili yığınına dönüştürmek ve analizler.
- Oval seçim aracı kullanarak tahlil odası alanı kopyalayın ve o zaman doğru tıkırtı ve seçme Görüntü > yinelenen. Şu anda, daha fazla çözümleme için örneğin tutun, titreşimli çubuk (vasıl 15 fps video tam olarak 3 dakika bu) su girdikten sonra ilk 2700 kare tutmak için çerçeve aralığını belirtin.
- Tahlil odasının dış açık ve klavye sayı çubuğundaki kısayol tuşu 7 vurarak ikili bir görüntüye dönüştürme.
- Arka plan temizler ve bir istemi görüntülendikten sonra siyah dolgu fonksiyonu ile ayarlanmış oval seçim aracı kullanarak titreşimli cam çubuk konumunu belirtmek için ortasındaki siyah bir nokta ekleyin. Tamam ' ı tıklatın ve bir eşik ayarlamaya devam etmek için bir ileti kutusu gösterilir.
- Balık ikili (tüm siyah ve beyaz) görüntüsünü oluşturmak için eşik ayarlayın. Balık içinde tüm video kırpmak-ebilmek var olmak seen ve Uygulaseçin eşik ayarlayın.
- "İzci" eklenti sıcak anahtar 8 sayı çubuğu basarak çalıştırın. Ne zaman-e sevketmek ve vurmak OKtitreşimli çubuk ve ikili video tüm 3 min için çerçeve başına balık arasındaki mesafe üreten, 100'e en az piksel boyutunu ayarlayın.
- Video gürültü tarafından oluşturulan mis izlemeyi ayarlamalı. Bunu yapmak için nesne sayısı 3 veya daha yüksek gösteren fazla nesneleri çerçeveleri (örneğin, su ya da çubuk şeffaf kol gölgesine parçacıklar) dönmek çerçeveleri tanımlamak için sonuçları penceresinde "çubuk" ve "Balık" ek olarak check-in çerçeve. Boya Fırçası aracını kullanarak herhangi bir fazla nesneleri kaldırın.
- Sıcak anahtar 9 (Yeniden Çözümle gereklidir diye) ikili bir yığın tüm video görüntüleri dışa aktarmak için numara bar ve bir .xls dosyası koordinatları ve uzaklığı veri (ek dosyaları CF01.xls, Threshold_CF01.tif ve Trac_CF01.tif ile vurmak ). Sıcak anahtar 9 da geçerli video ile ilişkili tüm dosyaları kapanacak. Adımları 1.4.2.1 1.4.2.6 aracılığıyla tüm çoğaltır için yineleyin.
- Bir elektronik tabloya birden çok izci sonuç dosyalarını (.xls) birleştirmek ve bir 1,5 cm alana yaklaşımlardan çubuk süresi ve numarası saymak için makro komut (ek dosya JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) çalıştırın. En az 0,5 s kalıcı değil yaklaşımlar sayılmaz. Mesafe ve zaman ilgi belirli sorulara göre bir yaklaşım olarak sayılır parametrelerini değiştirin.
- Tüm analizleri bitirdikten sonra PC disk alanı serbest bırakmak. Disk alanı açmak - bağlı dosyaları kaldırmak avi.avi ve. avi.avs dosyaları (yazılım tarafından oluşturulan uzantıları)-çalıştırarak bir toplu iş dosyası multiunmountdel.bat avs_creater.bat çalıştırdığı bölümünde 1.4.1.2 aynı klasörde.
- Sıkıştırılmış AVI video ImageJ ve set analiz parametrelerini için okunabilir bir biçime dönüştürmek.
2. uyku ve hiperaktivite tahlil (24 saat kayıt)
- Davranışsal tahlil
- 4 gün boyunca ya da daha özel olarak tasarlanmış 10 L akrilik kayıt akvaryum her odasında beş deneysel balık alışmana (45.9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm; uzunluk x genişlik x derinlik, sırasıyla) şartına su (bkz. Adım 1.3.1).
- Chambers'ı boyutu, 88.9 ölçme bakımından eşit hale siyah akrilik Komiteler ile bireysel her odası ayrı mm x 177.8 mm × 177.8 mm (Şekil 2). Her tank balık odaları arasında atlama önlemek için kapak emin olun.
- Otomatik olarak beyaz LED için 12 h ışık ve kapalı için programlanabilir güç fırının saatini kurdu 12 h calıştıkları süresi boyunca her gün için (örneğin, sabah 7'de ışığı ayarlayabilir ve kapalı 7'da). (Eğer sürüklenme için duyarlı) bu balık sirkadiyen ritim trene binmek.
- Opak, beyaz akrilik kurulları benzer boyut 10 L tank için tüm tankları bile yoğunluğu ile diffüz ışık sağlamak beyaz ve kızılötesi ışık aracılığıyla geçmek Difüzörler kullanır.
- Bir kez bir gün ile Artemia nauplii yaşamak ve her akvaryumda sünger filtrelerden havalandırma sağlamak calıştıkları besle.
Not: balık tutarlı zaman beslenen olun (yani, 1 x günlük 9: 00'da) beslenme saati de sirkadiyen ritim19sürüklenme etkileyebilir gibi. - Balık yem için onların gecikme gözlemleyerek iklime alıştırılacağı haline olup olmadığını kontrol edin. Daha uzun bir gecikme içinde onların ev tank daha fazla calıştıkları zaman gerektiğini gösterir.
- Önceki gün (3 gün veya daha fazla calıştıkları), testin yerini su ile tahlil odasında taze şartına gün (bkz. Adım 1.3.1) su.
- VirtualDub yazılım17' kayıt parametresini ayarlayın: 15 kare/sn, codec: x264vfw, kayıt süresi: 86.400 s (24 saat).
- Kayıt sahne arkasında kızılötesi aydınlatma açın (bkz. Şekil 2). Ekrandaki VirtualDub canlı görüntü gözlemleyerek, USB kamera karşısında olmaları için her akvaryum konumunu ayarlamak.
- Kayıt canlı Artemia nauplii ile her balık yemi, günü bütün sünger filtreleri kaldırın ve kızılötesi backlight üstünde açın.
- 24 h sabah kayıt başlar (örneğin, başlangıç saati 9'da ve bitiş saat 9'da ertesi gün). Video yakalamayı başlatmak ve bir karışıklık önlemek için konum güvenli. Düzenli olarak kayıt çalışır durumda olduğunu kontrol edin.
- 24 saat sonra video doğru kaydedilmiş emin olun. Transfer video izlemek ve balık'ın davranış analiz için PC iş istasyonu.
- 4 gün boyunca ya da daha özel olarak tasarlanmış 10 L akrilik kayıt akvaryum her odasında beş deneysel balık alışmana (45.9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm; uzunluk x genişlik x derinlik, sırasıyla) şartına su (bkz. Adım 1.3.1).
- Video analiz
- Öncelikle, video kalitesi, aydınlatma bakarak kontrol edin. Her bölümde bir balık varsa ve eğer neden olabilir herhangi bir yabancı hareketleri yanlış izleme kontrol edin.
- Akvaryum dışında mis izleme önlemek için maske hazırlayın. İki maskeleri: 'hatta' diğeri 'tuhaf' Balık için sıra sıralarına Tanklardaki dayalı.
- "Tek" ve "çift" maskeler için yukarıda açıklanan adında iki klasör olun. İzleme hareket SwisTrack parametre dosyası her bu klasördeki.
- İzleme açın takip yazılımı (ek dosya Tracking_odd.swistrack veya Tracking_even.swistrack) SwisTrack dosya parametresi. Video dosyası ve dosya maskesi, yolunu belirtin sonra kaydedin ve çıkın dışarı izleme parametre dosyası. BLOB sayısı ve en fazla piksel parametrelerinde ayarlamak "Blob algılama" ve "En yakın komşu izleme" bileşenleri, sırasıyla, deneyler göre.
- SwisTrack yazılım otomatik olarak açan kazanmak-otomasyon yazılımı çalıştırmak için onları çift tıklatın (ek dosya swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe veya swistrack_4.exe- bunlar aynı yürütülebilir dosyaları), hangi AIDS edinilmiş arka plan çıkarma SwisTrack içinde güncellenmesinde.
- Tracking_odd.swistrack veya Tracking_even.swistrack izleme yüklemek için SwisTrack yazılımında açın dosya parametresi. Parametreleri yükledikten sonra izlemeyi başlatmak için çalıştırma düğmesine basın.
- İlk 9.000 çerçeveler içinde (600 s, yani, kaydedilen videoyu ilk 10 dk), izleme balık adaptif arka plan çıkarma, ikili maskesi, bakarak çalışıp çalışmadığını kontrol edin ve en yakın komşu SwisTrack (bkz: bileşen listesinde izleme beraberindeki video). Sonra edinilmiş arka plan çıkarma bileşen listesinde seçin.
- Kazanmak-otomasyon devam etmek ve izlemek için PC ayrılmak için klavyedeki R tuşuna bas. İzleme 5-7 h 24 h günlük video 4-CPU çekirdeği ve 8 GB bellek ile bir masaüstü için alacak. İhtiyaçlarına göre çekirdek CPU sayısı kadar (tek ve çift arenalarda tek bir video dosyasının dahil) birden çok SwisTrack işlem çalıştırın. Örneğin, 4-çekirdek 4 videoları aynı anda işleyebilir.
- Bu izleme sırasında kazanmak-otomasyon programı otomatik olarak fare işaretçisini hareket nedeniyle bu PC başka amaçlar için kullanmaktan kaçının. İlk 9.000 çerçeveler aşağıdaki yordamda atılır.
- 3 Perl komut dosyalarını (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust ve 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) SwisTrack (bkz. Adım 2.2.3) 'hatta' ve 'tuhaf' klasörlerinde tarafından oluşturulan izleme dosyalarını içeren klasör için ayrılamadı.
- VirtualDub kullanarak video dosyası videodan bir kare küçük ve bu küçük bir fotoğraf ImageJ alabilirsiniz. ImageJ içinde belgili tanımlık akvaryum (45.9 cm) uzunluğunu seçin ve piksel/cm oranını hesaplamak. 1.fillGaps2.pl bir metin düzenleyicisi programında piksel/cm oranı yazmak ve kaydedin.
- CygWin programını, bir UNIX emülatörü başlatın. Komut satırında cd kullanarak 3 Perl betikleri içeren SwisTrack klasörünü bulun.
- Perl komut dosyasını Perl 1.fillGaps.plyazarak çalıştırın. Bu üç Perl komut dosyalarını her izleme dosyasının benzersiz bir akvaryum odasına atamak ve balık uyanık iken uyku süresi ve yüzme mesafe çözümleyebilirsiniz. O-ecek almak 1-2 h analizi bitirmek için.
- Çözümleme dışı bırakılan çerçeve sayısı çalışarak düşük olup olmadığını belirlemek için Summary_Sleep.txt adlı metin dosyasına değerlendirmek; az %15 kare eksik kabul edilebilir olarak kabul edilir.
- Kopyalayabilir ve Summary_Sleep.txt analiz sonuçlarından makro (ek dosya Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm) ile bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
- Dosya izleme Özet veri ayıklamak için makro çalıştırın.
3. DASPMI veya DASPEI mechanosensory neuromasts boyama
Not: DASPMI ve DASPEI boyama ışığa duyarlı ve karanlık koşullarda yapılmalıdır. Protokol sonrası hem DASPMI hem de DASPEI için DASPMI örnek olarak bkz.
- İletişim kuralı boyama
- Hisse senedi çözüm (25 µg/mL) Boyama 1 L olmak üzere toplam, DASPEI veya DASPMI kristallerinin 0.025 g 1 litre dH2O ekleyin ve gecede geçiyoruz. 4 ° C'de depolanan ve ışıktan korunan çözüm tutmak.
- 2,5 µg/mL DASPMI balıkta maddeler yerleştirmeye çalışmayın ya DASPEI şartına suda çözünmüş (bkz. Adım 1.3.1) için 45 dk 22 ° C'de karanlık bir ortamda
- 45 dakika sonra balık DASPMI veya DASPEI çözümden kaldırmak ve şartına su 66.7 µg/mL arabelleğe alınmış etil 3-aminobenzoate metan Sülfonat tuz (MS222) ile bir buz banyosu daldırma tarafından anestezi.
- Balık bir Petri kabına plaka ve floresan mikroskop altında fotoğraf bağlayın. Z-yığın görüntü alabilir ve aşağıdaki analiz için .tif dosyaları olarak kaydedebilirsiniz.
- ImageJ kullanarak görüntü analizi
- İç belgili tanımlık ağıl, .tif dosyalarını içeren bir şablon ImageJ makro dosyası (Neuromast_ImageJ.txt) / yapıştırın ve "Process_ImageJ" başlıklı yeni bir klasör oluşturun. ImageJ makro dosyası yolu geçerli dizine ayarlayın.
- ImageJ denize indirmek ve GUI makro dosyaya sürükleyerek veya tıklatarak makroyu açık Dosya > Aç ve makro dosyası seçerek.
- Tıklatarak makro çalıştırma makrolar > Makro Çalıştır. Makroyu daha sonra otomatik olarak çözümlenmesi için bir resim dosyası açılacaktır. Resim dosyası açılmazsa tıklatın makro > dosya almak.
- Neuromast miktar için Çokgen aracınıkullanarak ilgi bölgeyi seçin.
- Yinelenen bölge ilgi için sıcak anahtar 5 vurdu.
- Kaldırmak veya nokta fazla veya eksik neuromast için önceki görüntü Ekle ve 6vurmak için Boya aracı kullanın. 6isabet sonra iki yeni pencere-ecek gözükmek: düzeni numaralı neuromasts nokta ve bir tablo ile toplam neuromasts sayılabilir.
- Her iki dosya kaydetmek için 7 isabet: bir dosya bir .tif görüntü dosyası olarak saklanır ve diğer bir .xls dosyası olarak kaydedilir. Bu dosyalar sonra yeni bir resim dosyası analiz için açılır.
- Bir elektronik tabloya her balık neuromast sayar (SN_Number_Diameter.xlsm) makro komut dosyası çalıştırarak birleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçları burada sunulan ne sunulan yöntemleri ile elde edilebilir temsilcisi örnekleridir. Bu nedenle, sonuçlar biraz olanlar burada cavefish ve deneysel şartlarına bağlı olarak yüzey balık için sunulan sapma.
Titreşim cazibe davranış
VAB için temsil edici sonuçlar şekil 3 ' te mağara ve yüzey balık için bulunabilir. Yüzey balık (şekil 3A; cavefish ile paylaşılan bir öznitelik) ve cavefish titreşimli çubuk (şekil 3B) güçlü cazibe kenar-aşağıdaki davranış dikkat edin. En yüksek cazibe düzeyi 35 Hz cavefish (şekil 3D) ama değil yüzey balık (şekil 3 c) için iki morphs davranış fenotipleri bir anahtar fark temsil eden yakınındaki gözlendi. Bu frekans etrafında cazibe içinde en yüksek olasılıkla av veya gıda öğeleri20,21tarafından yapılan titreşimler sıklığı temsil eder.
Uyku ve hiperaktivite tayini
Daha önce Astyanax11için etkili olduğu belirlenen yanıt eşikleri burada uyku tanımlamak için kullanılan ölçütlere uyan. Uyku sendika tarafından uzun bir süre ile karakterizedir ve hareketsizlik tanımlanır > 60 s ve yükseltilmiş yanıt eşik12,22,23. Yüzey balık ile karşılaştırıldığında daha kısa uyku süreleri larva ve yetişkin cavefish11',12oluşur, bu yüzden, uyku deneyleri her yaştan davranışsal fenotip Astyanax için etkili bir yol. Cavefish daha az-uyku (şekil 4B, cavefish cinsinden kısa uyku süresi) gösterdi, onlar da hiperaktif (şekil 4A) vardır.
DASPMI veya DASPEI mechanosensory neuromasts boyama
Neuromasts kolayca DASPEI ya da DASPMI ile lekeli ve içinde floresan mikroskop altında vivo gözlenen duyu hücreleri oluşur. DASPMI boyama sonucu sunulan sonucuydu. Yüzeysel neuromasts sayısı cavefish ile karşılaştırıldığında yüzey balık (şekil 5C, D) kafatası bölge ve her iki boyutu bir proxy mechanosensory saç hücrelerinin sayısının gelişmiş- ve yüzeysel neuromasts vardır olumlu titreşim cazibe davranış düzeyi ile ilişkili (titreşimli çubuk yaklaşımlar sayı: şekil 5A,B).
| Yazılım | Analiz | Sürüm | Web sitesi |
| avfs | Etkinlik/uyku | Versiyon 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| AviSynth | VAB | Sürüm 2.6.0 | http://AviSynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Etkinlik/uyku | Sürüm 2.11.0 | https://www.Cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB ve DASPEI | Sürüm 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| pfmap | Etkinlik/uyku | Yapı 178 | http://pismotec.com/Download/ (alt "Download arşiv" bağlantıdan) |
| SwisTrack | Etkinlik/uyku | Sürüm 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Etkinlik/uyku | Sürüm 8 | https://www.WinAutomation.com/ (Bu yordam için ücretsiz tek başına app) |
| Windows işletim sistemi | VAB ve etkinlik/uyku | 7, 8 veya 10 | https://www.microsoft.com/en-us/Windows |
| x264VFW | Tüm analizleri | NA | https://sourceforge.net/projects/x264VFW/ |
Tablo 1. Bu analizler ve kaynak Web sitesi kullanılan freeware listesi.
Resim 1 : Titreşim cazibe davranış tahlil deneysel ekipman şematik. Bir hoparlör için bağlı bir cam çubuk 40 Hz frekans için ayarlanmış ve video kaydı başlangıcı yaklaşık 0.5 cm derinliğe sular altında. Bu rakam Yoshizawa vd.5' ten değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Uyku tahlil deneysel ekipman şematik. Tanklar 0.7 cm kalın Şeffaf Akrilik panolardan ısmarlama; septa 0,3 cm kalınlığında tamamen opak siyah akrilik kurulları vardır. Balık birbirimizi göremeyiz opak siyah akrilik panoları tankları bu bölümü için kullanılır. (A) Top görünümü: tank dış odaları karşılamak için içe septa eğik Not farklılıkları kamera açısı. (B, C) Ön ve yan hit, anılan sıraya göre. (D) üç dizi kızılötesi ışık bir difüzör ışığın şiddetini tüm tankları homojenize için geçen ile arkadan aydınlatmalı tankları. Not her balık onun kendi odasında tüm hareketleri görünecek şekilde her tankın yönlendirme ayarlanır. Paneli (C) ve (D) 16' dan değiştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : 3 - temsilcisi sonuçları dakika titreşim cazibe davranış tahlil. (a, B) Üstten Görünüm Yüzme yolun yüzey balık(a)ve cavefish (B); redlines balık 3-dak video sırasında aldı yol izleri vardır. Ortasındaki siyah nokta titreşimli cam çubuk konumunu gösterir. wrMtrck ImageJ eklenti balık izlemeler24görselleştirmek için kullanıldı. (C, D) Yüzey balık (C) ve cavefish (D) titreşim birden fazla frekanslara maruz sonuçlarından karşılaştırılması. Her nokta her balık temsil eder. Koyu gölgeli alanlarda interquartile aralığı vardır. Cavefish cazibe 35 Hz. yakınındaki en gösterir, ancak tüm frekanslar arasında yüzey balık titreşim için önemli cazibe gösterme Not (C, D) 16' dan değiştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Etkinlik analizi için çeşitli önlemler temsilcisi sonuçları - Diurnal etkinlik modellerinde yüzey balık ve cavefish. (A-B) Gün (sarı Bar) ve gece (siyah çubuklar) puanları in yüzme mesafe (m) başına 10 dk, Ave uyku süresi (1.000 s/12 h, B). Her çubuk ortalama ± standart hataları değerlerin ortalamasının temsil eder. Mavi yıldız yüzey balık (Sf) ve cavefish (Cf) arasında istatistiksel karşılaştırmalar için önemini düzeyini gösterir. Cavefish ve yüzey balık önemli ölçüde farklı gündüz-gece faaliyetleri var. Her fenotip için iki yönlü ANOVA istatistiklerini nelerdir: yüzey balık (Sf) ve cavefish (Cf) mesafe (A) yüzme için: F1399 185.8, P = < 0,001, gece ve gündüz arasında: F1399 26,9, P = < 0,001, nüfus arasındaki etkileşim ve gündüz-gece: F1399 3.6, P = 0.060 = (değil önemli: NS); uyku süresi (B) Sf ve Cf için: F1399 237.9, P = < 0,001, gece ve gündüz arasında: F1399 164.1, P = < 0,001, nüfus ve gündüz-gece arasındaki etkileşimi: F1399 26,5, P = < 0,001. Her iki analizleri, N = 200 ve 201 yüzey balık ve cavefish, anılan sıraya göre. Gündüz ve gece aktiviteleri arasındaki farkı post-hoc eşleştirilmiş ttarafından test edildi-testleri ile Bonferroni düzeltmeleri ve siyah yıldız tarafından gösterilir. P gösterir < 0,001. ** P gösterir < 0,01. Verilerin bir alt kümesini yeniden ve 11' den güncelledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Temsilcisi sonuçlarını VAB ve neuromast ilişkisi. (a, B) VAB ve neuromast numarası ve boyut cavefish, yüzey balık ve F1 melez döl yüzey balık ilişkisi cavefish x. Normalleştirilmiş Puanlar titreşim cazibe (yaklaşımların sayının kare kökü) olumlu neuromast bereket ile ilişkili Not (Pearson korelasyon katsayısı r 0.62, P = < 0.001) ve neuromast çapı (Pearson korelasyon katsayısı r 0.31, P = < 0,01). Masası'A ve B 5güncelleme. (C, D) Neuromasts ve (C) bir yüzey balık ve (D) bir cavefish yanak bölgesinde, DASPMI boyama. Ölçek çubuğu iç metin içinde (C) ve (D) ' dir. 1.0 mm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek materyalleri. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunulan yöntemler kolay erişim ama freeware kökeni yapısı nedeniyle gerçekleştirmek karmaşık olabilir. Bu nedenle, deneme deneyleri ve herhangi bir gerçek deneme önce analizleri gerçekleştirmek için önerilir.
Deneysel ve analitik çerçevesi kurulan bir kez veri üretme oranı hızlı olabilir. Kez kurulan VAB tahlil için 7 dakika içinde rekor iki balık, etkinlik/uyku tahlil için 24 h 30 balık ve görüntüleme, son görüntü yakalamak için MS222 anesteziden başlayan neuromast için 2,5-3 dakika içinde bir balık için mümkündür. Video ve görüntü analizleri sürelerini önemli ölçüde kullanılan bilgisayarın performansını bağlı olarak değişebilir. Bir 4 çekirdekli CPU ve 8 GB RAM ile bir PC kullanarak VAB analizi 5-7 dk balık başına alabilir, etkinlik/uyku analizi 6-8 h 30 balık grup başına alabilir ve neuromast görüntü analizi 5 veya 10 min başına balık alabilir (tek yan veya görüntüleri her iki Kafatası bölge, sırasıyla). Video analiz için bir alternatif izleme yazılımı (Tablo reçetesi) ticari olarak kullanılabilir. Ama pahalı izleme hayvan çok güçlüdür (örneğin, yazılım temel ~ USD$ 5, 000USD ve çok izleme modülü ~ USD$ ile 4.000 $). Şu anda, bizim izleme yöntemleri Yani izleme, özellikle etkinlik/uyku analizi için karşılaştırılabilir doğruluk elde etmek gibi görünüyor, kayıp çerçeveleri genellikle toplam çerçeve % 15 düşüktür. Bu yöntem aynı zamanda yüksek bir tekrarlanabilirlik dört çoğaltır gösterdi (ek tablo 1). Ancak, bu sistem ezelî pencere eşiği OS ve Linux/Unix işletim sistemi temel kodlama bir anlayış geliştirme zorluk kabul edilmelidir.
Balık calıştıkları dönemlerde ve öncesi ve sırasında davranışsal deneyleri, deneysel balık için en iyi olası ve tutarlı yaşam koşulları sağlamak esastır. Bu yüksek-nitelik yiyecek besleme aynı zamanda ve tutar her gün ve bakımı yüksek su kalitesi içerir (düşük amonyak, nitrat, nitrites ve Çözünmüş organik, ~ pH 7 ve benzer iletkenlik 700 µS çevresinde). Sesler tarafından değil rahatsız bir alanda deneyleri gerçekleştirmek önemlidir. Gürültülü ayak sesleri ve ne sesler davranışsal tepkiler ve etkinlik/uyku-düzeni değişebilir. Handling balık ise mechanosensory birimlerine hasar düzeyini azaltmak için bir ince gözenekli balık Balık aktarma sırasında net kullanmak yararlıdır; Bu neuromasts mukus cupula zarar görmesini önlemek için yardımcı olacaktır.
DASPEI boya balık üzerinde sublethal etkileri vardır ama aşırı pozlama toksik etkileri neden olabilir. Örneğin, 2 h DASPEI üçün balıkta çeker olasılığını ölüm sonrası anestezi kurtarma sırasında arttıracak. DASPEI boyama ışığa duyarlı ve bu nedenle karanlık koşullarda yapılmalıdır.
Ücretsiz yükleme gelince AviSynth yazılım, Avisynth sanal dosya sistemi (avfs) ve Pismo eğe dağ denetim paketi (pfmap) birlikte çalışabilirliğe çalışmak için belirli sürümleri gerekli. Bu birlikte, ama en azından avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) ve pfmap (1.7.8) en son iş bu protokol tarafından teyit edildi pfmap yapı dosya-Montaj prosedürü için işe yaramadı. Bu nedenle, yazılım sürümleri (Tablo 1) dikkat edin. VirtualDub daha iyi yerine 64-bit 32-bit sürüm altında çalışır. 15 çerçevelemek-s ayar iyi zaman çözünürlüğü sağlar ve aşırı depolama birimi (24-h uyku tahlil video için 1.6 GB ve VAB video için 3 MB) gerektirmez. ImageJ için makro içinde dosya yolları ayarından büyük zorluk gelebilir. İçinde pencere eşiği OS, dosya yolu genellikle "C:Document\my Document\..." olarak ifade edilebilir. ImageJ makro Java ortamı altında çalışır ve dosya yolunu, diğer bir deyişle, "C\:Document\\my Document\\..." fazladan "\" ihtiyacı. Lütfen örnek ImageJ makro dosyasına bakın. Analizleri sorunsuz bir şekilde çalışmasını sağlayacak şekilde buna ek olarak, iki eklentileri, dilim çıkarmak ve nesne İzleyicisi'ni25, yüklemek ve sıcak anahtar taşı (klavye shortcuts) 6 ve 8, sırasıyla, atamak gerekli olabilir (Eklentiler > kısayollar > Ekle Kısayolları... 26 ). SwisTrack izleme parametreleri ayarlamak için bir işlevi vardır, ama bir donma ve/veya kilitlenme izleme parametreleri ayarlanırken oluşabilir mümkün. Bir metin düzenleyici uygulaması gibi not etmek ++ parametresinde düzenlemek iyidir. Parametre ayarları ayrıntılarını27bakınız. Cygwin (UNIX emülatör) Yükleyici ayarlama öntanımlı kurulumda bulunmaz Perl paketini yüklemek için paketi yükleyicisi içerir. Bu özellikle Cygwin yüklenmesi sırasında Perl paketi seçmek için önerilir.
Bu yordamı bir davranış (VAB) sonradan içini kaplamak tabanlı ve yüzme etkinliği ve uyku için sınırlı olmasına rağmen bu hayvan takip sistemi stereotipik tekrar eden davranışlar, sosyal etkileşim ve asimetrik kullanım (dahil olmak üzere diğer davranışları için adapte edilebilir / Kafatası neuromasts (laterality)13, yiyecek arama sırasında bu yöntemler bu idTracker14tarafından önerilen gibi sığ arenalarda gerektirebilir, ancak sol). Gelişmiş davranışları paketi ile bir izlenen X - ve Y - axes verileri çözümlemek ve farklı davranış kalıpları araştırmak için farklı komut dosyaları geçerli olabilir. Bu analiz boru hattı içinde birden çok davranışları, hem nasıl Nedenleri Otizm gibi davranışları genetik tarafından düzenlenmektedir evrim mekanizması gidermek için bir temel sağlamak amaçlanmaktadır, epigenetik ve çevresel faktörler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato ve ı. Lord bu el yazması kullanılan deneysel balık Balık bakımı için de dahil olmak üzere Yoshizawa laboratuvar tüm üyeleri teşekkür ediyoruz. S. IR CCD kamera montajı MY eğitmek için Masek dahil A. Keene laboratuvar üyeleri ayrıca teşekkür ederiz. Son olarak, Media Lab - Sosyal Bilimler üniversite - İletişim Fakültesi Hawai'i Üniversitesi Mānoa video yapma konusunda onların çok değerli yardım özellikle d. Smith, J. Lam ve S. beyaz için de teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Hawaiian Toplum Vakfı (16CON-78919 ve 18CON-90818) tarafından desteklenen ve Ulusal Sağlık Enstitüsü NIGMS (P20GM125508) benim için verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
