Summary
本文提出了一种基于微流控剂的化学发光系统检测血清特异性免疫球蛋白 E 的方法, 并评价其在过敏诊断中的应用价值。
Abstract
过敏性疾病在成人和儿童中都很常见。病因过敏原的鉴定在疾病管理和预防中具有重要意义。然而, 中国大陆, 特别是初级保健医院, 缺乏具有较高性价比的特定免疫球蛋白 e (IgE) 测量系统。本文介绍了利用微流化物盒化学发光系统检测血清中过敏原特异性 IgE 的原理和操作步骤。并将结果与免疫 Cap (系统 1)、工业标准和该系统的重现性进行了比较, 以检测对常见过敏原敏感的患者。结果表明, 与免疫 Cap (系统 1) 相比, 生物 Ic 系统 (系统 2) 在检测血清特异性 IgE (Ige) 时具有较好的精度和灵敏度, 但成本要低得多。它可以作为中国大陆初级保健医院系统1的一个很好的替代方案, 因为这些医院的经济承受能力较低。
Introduction
在过去几十年里, 过敏的流行率稳步上升, 影响到全球人口的20% 至 30% 1。病因过敏原的鉴定对疾病的管理具有重要意义。在中国, 由于国内没有登记的体内皮肤刺试验, 体外测定血清特异性 IgE 是 i 型过敏诊断最重要、最常用的工具 2.这与西方世界的做法类似, 但尽管作为荧光酶联免疫吸附基系统的免疫 cap 系统 (系统 1) 被认为是体外过敏诊断的黄金标准 3, 但由于在中国, 其使用非常有限。其较高的设备和试剂价格。因此, 迫切需要一个具有较高性价比的新型替代过敏诊断系统。
BioIC 系统 (系统 2) 是一种基于化学发光原理的基于血清特定 ige 多路检测的微流体墨盒系统。微流体盒的尺寸为7厘米 x 4 厘米, 由三层注塑塑料组成。上部为3毫米厚的透明聚碳酸酯, 在热装配过程中具有良好的稳定性。它与由丙烯腈、丁烯和苯乙烯 (ABS) 的共聚物制成的3毫米厚的底层一起, 将由硅橡胶制成的0.5 毫米厚的中间层三明治。中间层是黑色的, 在化学发光检测过程中提供较低的背景。在硅胶的顶部, 在与反应区相对应的位置喷洒一层薄薄的硝化纤维素膜 (NC 膜), 从而可以发现不同的过敏性蛋白质。本研究的目的是评价微流体系统在血清中多联检测过敏原特异性 IgE 的临床性能。
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Protocol
本研究和人体血清样本的使用得到了广州医科大学第一附属医院伦理委员会 (GYYY-2016-73) 的批准。所有参与者都独立或通过其父母 (就儿童而言) 给予书面同意。
1. 研究小组的基本资料
注: 呼吸道疾病国家重点实验室 (AIR-SKLRD) 过敏信息库是在广州呼吸医院研究所 (GIRH) 内建立的大型血清库。Air-sklrd 在过去十年中启动, 已开始收集和储存过敏性疾病患者的血清样本及其临床信息 (表 1)4、5.目前的研究是用 AIR-SKLRD 的血清进行的。
- 在 AIR-SKLRD 的数据库中搜索2015年1月至2018年6月收集的血清, 并选择过敏性疾病患者, 他们被发现对该地区的常见过敏原敏感。
- 确保所有选定的患者都有过敏性相关疾病, 如过敏性鼻炎和/哮喘、过敏性皮炎和/或荨麻疹, 并且这些患者的血清中含有多种血清过敏原特异性免疫球蛋白 E (sIgE)该系统1检测到该地区常见过敏原的敏化。
- 排除医疗记录不完整的患者、因随访而丢失的患者、拒绝就血清样本用于科学目的提供知情同意的患者、已确定免疫缺陷的患者、目前正在接受免疫治疗的患者或免疫调节剂, 或那些被发现有寄生虫感染。
- 确保在采集血清之前不给予治疗或药物处方, 以最大限度地减少对实验室结果的干扰。所有不符合标准的血清样本均被拒绝。
2. 研究流程和测量感兴趣
注: 微流体系统需要100μl 的血清来测定19种过敏原。使用含有分离凝胶的真空血管从每个患者身上采集静脉血液 (5 毫升)。在 1, 000 x 克离心10分钟后, 收集上层进行测试。未使用血清储存在-80°c。在测试之前, 血清在室温下保持 30分钟, 并与涡旋混合器晃动。避免了重复的冻融循环。
- 主要检测 Sige 的血清样本对翼状肌病(d1) 的全过敏原.仙人掌 ( D1)、热带黑虫(d1)、猫皮草 (e1)、狗皮草 (e1)、百慕大草 (g2)、提莫西草 (g6)、蟑螂 (i6)、熏蒸曲霉 ( m3)、白色念珠菌(m5)、野草 (w1)、蛋清 (f1)、牛奶 (f1)、小麦 (f1)、花生 (f1)、大豆 (f1)、杏仁 (f1)、螃蟹 (f1) 和虾 (f1)。按照第3节中给出的说明进行操作。
注: sIgE 测定是用过敏原特异性 IgE 试剂盒 (见材料表) 进行的, 并由化学发光分析仪测量。 - 从有足够血清 (至少 900Μl) 的样品中随机选择三个样品, 以便进行重现性研究。保持所有条件不变, 连续9天每天测量过敏原 Sige 的三个血清 (即血清总长度为 100 x 9 = 900μl)。
3. 微流体系统的半自动化测试程序
注: 系统2是集成自动微流体技术, 蛋白质微阵列, 冷光分析, 并行 IgE 分析, 图像处理技术。测试协议分为四个部分: 设备的制备、样品加载、孵化和测量。
-
设备的准备
- 打开电脑和分析仪电源。
注: 电源开关位于底座的左侧。 - 在电脑上启动 LabIT 程序。如果弹出"暗帧" 警告窗口, 请单击 "确定"运行"泄漏测试"。然后, 单击中心徽标进入操作界面。
注: 如果用户空闲时间超过 24小时, 系统将提醒用户运行泄漏测试。 - 检查屏幕右下角的反应温度和 CCD (电荷耦合器件) 温度。反应温度应在大约10分钟内上升到 37°c±1°c, CCD 温度应下降到-15°c±1°c。
- 在 CCD 温度下降到-15°c±1°c 后, 运行Ak 测试。在运行张好测试之前, 请确保仪器内没有其他项目, 并关闭门。点击工具系统测试泄漏测试。在测试过程中不要开门。测试完成后, 将弹出报告窗口。
- 打开电脑和分析仪电源。
-
样品加载
- 添加620微米的洗涤缓冲液、120μl 的阻滞剂、60μl 的共轭 a 和 B、60μl 的基板 A 和 B, 以及100μl 的血清样品到微流体墨盒上相应的试剂罐中。
-
孵化
- 点击墨盒 id, 使用条形码扫描器扫描墨盒的序列号, 输入样品 id, 将墨盒放入分析仪并关闭门, 然后单击"分析器" 并运行以开始分析。
-
测量
- 测量后将结果导出到统计软件 (如 Excel)。
注: 孵育30分钟后, 分析仪会自动执行测量并报告结果。
- 测量后将结果导出到统计软件 (如 Excel)。
-
关闭分析仪
- 对于日常维护, 在完成测试后, 取出墨盒, 用75% 的酒精轻轻擦拭分析仪的内部加热铁和电磁铁。
注: 请勿用力按压或摇晃电磁铁。 - 关闭 "标签" 窗口。温度监测窗口将弹出。当 CCD 升温至5°C 保护模式时, 它将自动关闭。届时, 关闭分析仪和 PC 的电源将是安全的。
注: 在 CCD 温度上升到5°c 之前, 不要手动关闭温度监测窗口, 也不要在 CCD 预热期间关闭分析仪和 PC 的电源。
- 对于日常维护, 在完成测试后, 取出墨盒, 用75% 的酒精轻轻擦拭分析仪的内部加热铁和电磁铁。
4. sIgE 反应性的定义
注: 对于未稀释的血清标本, 系统2的检测范围为 0.21–100 iu l。
- 根据 0.35 iu/ml 的阈值, 认为超过 0.35 iuml 的 sige 水平为正 6,7。将 sIgE 测试的反应性评为8: 第1类 (≥0.35 和 lt;0.70 Iu/ml)、第2类 (≥0.70 和 lt;3.50 iu/ml)、第3类 (≥3.50 和 & lt;17.50 Iu/ml)、第4类 (≥17.50 和 lt;50.00 iu/ml)、第5类 (≥50.00 和 Lt;100.00 iu/ml)和第6类 (≥100.00 Iu/ml)。
5. 统计分析
- 使用直方图显示19种过敏原的阳性率 (图 1), 并使用 Levey-Jennings 曲线来演示检测系统的可重复性 (图 2)9。
- 选择三种最常见的吸入过敏原和食物过敏原 (共六种过敏原), 并将结果与 I System 1 进行比较, 以评估其临床诊断性能10,11。以一致性率、灵敏度、特异性、正负预测值和接收器操作特性 (AUC) 曲线 (AUC) 下的面积为评价标准。
- 应用斯皮尔曼的相关分析12来描述两个系统之间的相关性, 并使用 kappa 值进行一致性。将 kappa 值归类为几乎完美 (0.8–1.0)、实质性 (0.6–0.8)、中等值 (0.4-0.6)、公平 (0.2-0.4) 或差 (lt;0.2)13。使用 SPSS 23.0 和 MedCalc 11.0 统计分析, 并将p < 0.05 定义为统计意义。
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Representative Results
19种常见过敏原的阳性率
293 sera 的结果如图 3所示。在所有吸入过敏原中, d. farinae的阳性率最高 (80.89, 271-293), 其次是d.翼状鼻窦炎(78.84, 231/293)。在食物过敏原中, 螃蟹的阳性率最高 (20.48, 60/293), 其次是 13.65 (40/293)。吸入性过敏原的总阳性率高于食物过敏原。
微流体系统的重复性
根据9轮试验, 猫皮屑、狗屑和蟑螂的重复性分别为32.88±8.94、1.61±0.48 和 0.76±0.18, 一致性水平为 100% (99)、100% (9/9) 和 67% (69月)。结果的分布用图2中的列维-詹宁斯曲线显示。所有数据都在 x±2 x SD 的范围内, 这与允许的最大临床错误14 一致.
两种系统的比较
定性结果表明, 猫皮屑与系统1的一致性最高 (95, 33%, 24 150)。对虾的一致性最低 (40.75, 88/216)。吸入性过敏原的总体一致性从92.00 到953.33% 不等。对于食物过敏原, 一致性范围为 404.74%-72.39。吸入剂的敏感性最高的是金银花 ( 93.94), 特异性为100%。在食物过敏原中, 花生的敏感性最高 (54.55), 特异性为80.65。表 2还显示, 对吸入性过敏原的所有评价结果均优于食物过敏原。由于 AUC 值的范围在0.613 至0.613 之间, 三种吸入过敏原的 AUC 大于 0.950, 因此可以得出结论, 与系统1相比, 系统2具有较高的准确性。
这两个系统的一致性分析表明, 这三种吸入剂的 kappa 值在0.727–0.876 之间, 其中最高值为 0.727 (95% CI, 0.786-0.965)。它们都比食物过敏原的卡帕值要好, 而一般来说, 食物过敏原的含量下降了 & lt;0.400。对虾的最低 kappa 值为 0.112 (95% CI, 0.062 –0.162) (表 3)。斯皮尔曼的相关分析表明, 花生和猫皮屑的相关性最好, 相关系数为r = 0.942 (95% ci, 0.9007–0.965;p < 0.0001) 和r = 0.0001 (95% ci, 0.900–0.947;p < 0.0001)。
在图 3中, 用系统2沿x轴的结果和系统1沿y轴的结果构造散点图, 以显示 d . 翼状肌的两个系统的 sige 浓度分布. 法丽娜、猫皮屑、牛奶、虾和花生。在一致性和不和谐性分析中, 显示±1类差异的过敏原为d. 翼状突(91.60, 229 vs. 250), d. farinae (81.25, 91 vs. 112), 猫皮屑 (98.00%, 147 对 150), 牛奶 (81.25, 112 对 134), 虾 (5972%,129 vs. 216) 和花生 (765.56%, 49vs 64)。总协调率为 81.75 (757 对 926)。
图 1: 用微流体法检测19种常见过敏原的阳性率.d1-翼状突,d2-dermatoididefinae ,D1- blomiatropicalis, e1-猫皮屑, e1-狗皮屑, g2-百慕大草, g6-timoh 草, i6-蟑螂, m3-comleglemsin, m5- 白色念珠菌, w1-大麻, f1-蛋清, f1-牛奶, f1-小麦, f1-花生, f1-大豆, f1-杏仁, f23只-螃蟹, 和 f1-虾。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 微流体系统反复检测到的三种过敏原的左旋-詹宁斯图.(A) 选择猫毛、(b) 狗毛和 (c) 蟑螂进行重复性评价。黑色、绿色、黄色和红色线分别表示多个测量值的平均值 (X)、平均值±标准偏差 (x±sd)、平均值 + 标准偏差乘以 2 (x±2sd) 和平均值 + 标准偏差乘以 3 (x±3sd)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 按测量的6个过敏原 sIgE 浓度的散点图系统 1.系统 1 (y轴) 和系统 2 (x轴)。图中的每一行代表类截止 (类 0:0.35, 类 1:0.35–0.7, 类 2:0.7–3.5, 类 3:3.5–17.5, 类: 17.5-50, 类5:50–100和 gt;100 Iu/ml)。阴影框是集中类中的一致区域。请点击这里查看此图的较大版本.
| 特征 | 否 (%) |
| 性别, n (%) | |
| 女性 | 123 (41.98) |
| 男性 | 170 (50.02%) |
| 年龄, 年份, n (%) | |
| 中位数 (25%, 75%) | 23 (8, 36) |
| ≤10 | 97 (33.11%) |
| 11-20 | 37 (12.63) |
| 21-40 | 101 (34.47%) |
| >41 | 58 (19.80) |
| 诊断, n (%) | |
| 性 鼻炎 | 92 (31.40%) |
| 过敏性哮喘 | 117 (39.93%) |
| 过敏性鼻炎与哮喘 | 36人 (12.29) |
| 别人 | 48 (16.38) |
表 1: 患者人口特征.总共发现293名受试者符合纳入标准, 中位年龄为 23岁 (四分位数范围从8岁到36岁不等)。其中170人 (50.02%)男性和123人 (41.98)都是女性此外, 92 (31.40%)其中有过敏性鼻炎, 117 (39.93%)有过敏性哮喘, 36 (12.29)有鼻炎和哮喘的合并症, 48 例 (16.38)有其他过敏性疾病, 如食物过敏或皮肤过敏。
| 样品尺寸 | CAP + | 联合呼吁程序- | 协议共计 | 硒 | Sp | Ppv | Npv | AUC(95%, CI) | |||
| 生物集成电路 + | 生物- | 生物集成电路 + | 生物- | ||||||||
| d1 | 250人 | 196 | 20 | 0 | 34 | 9.00% | 901.74% | 100.0% | 100.0% | 62.96 | 0.975 (0.975 至 0.975) |
| d2 | 112 | 93 | 6 | 0 | 13 | 944% | 93.94 | 100.0% | 100.0% | 684.12% | 0.984 (0.984 至 0.999) |
| e1 | 150人 | 34 | 5 | 2 | 109 | 95.33 | 87.18 | 98.20% | 944% | 95.61 | 0.968 (0.968 至 0.968) |
| f2 | 134 | 16 | 27 | 10 | 81 | 7.39% | 37.21% | 890% | 61.54 | 75 5.00% | 0.744 (0.744 至 0.744) |
| f13 | 64 | 18 | 15 | 6 | 25 | 671.19% | 54.55 | 80.65 | 75 5.00% | 62.50 | 0.731 (0.606 至 0.731) |
| f24 | 216 | 36 | 127 | 1 | 52 | 40.74 | 22.09 | 98.11% | 97.30% | 29.5% | 0.613 (0.545 至 0.613) |
| d1-der. p1, d2-der. f1, e1-cat 身屑, f2-mer, F13-花生, f1-虾。Cap-vococap, + 阳性,-阴性, se 敏感性, sp 特异性, ppv 阳性预测值, npv 阴性预测值, roc 曲线下的 aoc 面积。对于 AUC 值, 表中还显示95% 的间隔值 (95%, CI)。 | |||||||||||
表 2: 两个系统之间的临床性能.d1-d . 翼状虫、d2-d .farina、e1-猫皮屑、f2-牛奶、f2-花生和 f2-虾。CAP-免疫 Cap, +-阳性,-阴性, SE 敏感性, SP-特异性, PPV 阳性预测值, NPV-阴性预测值, AUC-区域下的 ROC 曲线。对于 AUC 值, 表中还显示95% 的间隔值 (95%, CI)。
| Kappa(95%,CI) | Spearman'rho(95%,CI) | |
| d1 | 0.27 (0.617 至 0.727) | 0.896 (0.896 至 0.896) |
| d2 | 0.783 (0.783 至 0.783) | 0.731 (0.631 至 0.731) |
| e1 | 0.876 (0.876 至 0.876) | 0.927 (0.900 至 0.927) |
| f2 | 0.293 (0.293 至 0.293) | 0.681 (0.579 至 0.681) |
| f13 | 0.349 (0.349 至 0.349) | 0.969 (0.969 至 0.969) |
| f24 | 0.112 (0.112 至 0.112) | 0.833 (0.833 至 0.833) |
表 3: 两个系统之间的相关性和协议.d1-d . 翼状虫、d2-d .farina、e1-猫皮屑、f2-牛奶、f2-花生和 f2-虾。对于 kappa 和 Spearman 的 Rho 值, 表中还显示了95% 的间隔值 (95%, CI)。
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Discussion
与许多其他研究 15、16、17的结果类似, 基于293名过敏患者血清的微流控系统的结果显示, 室内尘螨 (包括d. 翼状肌瘤), D. farinae和b. tropicalis) 是导致中国南方过敏性疾病的主要吸入性过敏原, 而对于食物、牛奶、花生、虾和螃蟹来说, 则是导致过敏性症状的最常见的过敏原。关于对三种过敏原进行的重现性研究, 均显示出良好的结果, 总重复率为 88.89, 这意味着它达到了最大允许误差。
本研究以系统1为参考, 对系统2的临床诊断效果进行了评价。以血清 sIgE 水平 0.35 uuml 为截止点 2, 带有 sige > 0.35 iuml 的样本意味着患者对过敏原敏感, 滴度越高, 与患者症状的相关性越好 18.结果表明, 三种吸入过敏原的一致性率均在 9 0% 以上。除了食物过敏原的结果, 有约 40.74-72.39 的一致性, 总一致性为 81.75 (757 926)。Pteronyssinus、 d. farina和 cat 笔皮的 kappa 值分别为0.778、0.778 和 0.778 (p < 0.001)。食物过敏原的卡帕值都低于0.4。对于三种主要的吸入剂和食物过敏原, 这两个系统之间的定量结果有显著的相关性 (rspearman约 0.681-0.969, p < 0.01)。
注意到花生的rs 系数为 0.969, 一致性评价指标的 kappa 值仅为 0.349 (95% ci, 0.129-0.69)。这种差异可能是由于该区域花生敏感性较低, 因此, 大多数被招募的血清对这一特定的 IgE 呈阴性反应。许多研究表明, 在 sIgE 滴度和食物过敏原的临床症状之间可以看到显著的差异。使用不同的检测系统进行食物特异性 IgE 的测定也会产生很大的变异19。这可能是由于引发过敏症状的不是生食食品, 而是烹饪或消化过程中产生的改性成分。不同的厂家使用不同的原料使过敏原也会造成结果差异 20。
微流体盒由五个主要部分组成: 5个储罐、5个试剂输送通道、5个单向泵、一个可固定过敏原提取物的单一反应区和一个收集所有反应副产物的废物罐。根据检测需要, 可在反应区上点点多达40种过敏原提取物。在 PC 的控制下, 五台单向泵引导和协调血清样本、洗涤缓冲液、阻滞剂、共轭和减法的流动, 完成两步酶联免疫吸附法。反应完成后, 用低分辨率冷却 CCD 摄像机采集化学发光反应图像, 用 PC 机对信号进行处理, 建立标定曲线, 计算定量和半定量的光谱结果。
目前的研究表明, 这两个系统表现出良好的一致性。但是, 与系统1相比, 系统2更易于使用, 对操作员培训的需求也较低。由于每个微流体墨盒都有自己的质量控制曲线, 因此系统的可靠性大大提高。该系统的其他优点包括占地面积小、可扩展的模块化设置以及易于连接到 PC 进行操作控制。所有这些优点大大降低了设置和运行成本, 同时也不损害日常临床实践中的准确性和速度要求, 这使得该系统特别适合于初级保健医院的过敏筛查在中国。然而, 微流体系统的一个主要缺点是它不是一个全自动系统, 在操作过程中需要频繁的干预。它仍然不能取代每天需要处理大量样品的系统。
由于缺乏足够的阳性血清来治疗某些过敏原, 这项研究没有涵盖微流控墨盒中的所有19种过敏原, 但只有6种常见的过敏原在中国南方。需要进行更多的研究, 以详细说明评估是否也适用于其他过敏原。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢梅江教授在统计分析方面的帮助, 并感谢徐哈默先生在手稿的编写方面的帮助。本研究得到了广州科学技术基金会 (201804020043) 和国家自然科学基金 (国家自然科学基金81572063和国家自然科学基金 81572063) 的支持。供资小组同意研究设计、数据分析、手稿准备和出版决定。没有收到这项研究的其他资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agnitio BioIC Analyzer | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | BA-G2000 | |
| BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | DR17A12 | |
| BioIC Cartrideg Placement plate | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | T20SET | |
| BioIC Reagent Dispenser | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | DS-1 | |
| Image two-dimensional barcode machine | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | NLS-HR200 | |
| Software Package, LabIT | Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) | Version 2.4.12 | |
| VORTEX-5 Vortex Mixer | Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd. | VORTEX-5 |
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