Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

doi: 10.3791/59100 Published: April 21, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Abstract

Allergische ziekte komt voor bij zowel volwassenen als kinderen. Identificatie van de oorzakelijke allergenen is belangrijk in het beheer van de ziekte en preventie. Een specifieke immunoglobulin E (IgE) meetsysteem met een hoge prijs / prestatie verhouding ontbreekt echter in vasteland China, vooral in de eerstelijnszorg ziekenhuizen. Deze paper beschrijft de procedures van het beginsel en de werking van het gebruik van een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic te detecteren allergeen-specifieke IgE in het serum. De resultaten werden vergeleken met die van ImmunoCAP (systeem 1), de industriële standaard, en de reproduceerbaarheid van het systeem voor het detecteren van patiënten voor deze gemeenschappelijke allergenen gesensibiliseerde personen wordt geëvalueerd. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met ImmunoCAP (systeem 1), het BioIC systeem (systeem 2) heeft goede precisie en gevoeligheid voor het opsporen van serum specifieke IgE tegen verschillende inhalant en voedsel allergenen, maar met een aanzienlijk lagere kosten. Het kan dienen als een goed alternatief voor System 1 in eerstelijnszorg ziekenhuizen in vasteland China hebben lagere financiële betaalbaarheid.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De prevalentie van allergieën in de afgelopen decennia gestaag is toegenomen en 20% - 30% van de wereldbevolking1treft. Identificatie van de oorzakelijke allergenen heeft grote betekenis bij het beheer van de ziekten. In China, aangezien geregistreerde in vivo huid lul proeven niet beschikbaar in het land zijn, in vitro bepaling van serum specifieke IgE de belangrijkste is en meest gebruikte hulpmiddel voor type ik allergie diagnoses2. Dit is vergelijkbaar met praktijken in de westerse wereld, maar hoewel ImmunoCAP systeem (systeem 1), een enzyme-linked immunosorbent basissysteem van fluorescentie, wordt beschouwd als de gouden standaard voor in vitro allergie diagnose3, het gebruik ervan in China is zeer beperkt wegens om de hoge prijs van apparatuur en reagens. Vandaar is een nieuwe alternatieve anti diagnose systeem met een hoge prijs / prestatie verhouding hard nodig.

Het BioIC systeem (systeem 2) is een microfluidic cartridge gebaseerde systeem gebaseerd op het beginsel van de Chemoluminescentie voor multiplexed testen van serum specifieke IgE. Met een grootte van 7 cm x 4 cm, de microfluidic-cartridge bestaat uit drie lagen van injectie-gegoten kunststof. Het bovenste deel is 3 mm dik transparant Polycarbonaat die draagt goede stabiliteit tijdens thermische assemblage processen. Samen met de 3 mm dikke onderlaag opgebouwd uit een copolymeer van acrylonitril, butadieen en styreen (ABS), sandwiches het de 0,5 mm dikke middelste laag gemaakt van siliconen rubber. Zwart van kleur biedt, de middelste laag lagere achtergrond tijdens Chemoluminescentie-detectie. Op de top van de silica gel, is een dun laagje nitrocellulose membraan (NC membraan) gespoten op de positie die overeenkomt met de zone van de reactie, waarmee het spotten van verschillende allergene eiwitten. Het doel van deze studie is om de klinische prestaties van het systeem van de microfluidic voor de multiplexed bepaling van allergeen-specifieke IgE in het serum te evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze studie en het gebruik van menselijk serummonsters werden goedgekeurd door de ethische commissie van de eerste aangesloten ziekenhuis van Guangzhou medische universiteit (GYYY-2016-73). Alle deelnemers hebben hun schriftelijke toestemming gegeven, onafhankelijk of via hun ouders (in het geval van kinderen).

1. basisgegevens van de studiegroep

Opmerking: Het allergie informatie-archief van de Braziliaanse sleutel laboratorium van respiratoire aandoeningen (lucht-SKLRD) is een grote serumbank opgericht binnen het Guangzhou Instituut van respiratoire ziekenhuis (GIRH). In de afgelopen tien jaar werd begonnen, de lucht-SKLRD reeds is begonnen te verzamelen en opslaan van serummonsters van patiënten met allergische aandoeningen, samen met hun klinische informatie (tabel 1)4,5. De huidige studie werd uitgevoerd met de sera van de lucht-SKLRD.

  1. De lucht-SKLRD database voor sera verzameld van januari 2015 tot juni 2018 zoeken en selecteren van de patiënten met allergisch ziekte, die bleken te zijn gevoelig voor de gemeenschappelijke allergenen in de regio.
  2. Ervoor zorgen dat alle geselecteerde patiënten allergisch-gerelateerde ziekten, zoals allergische rhinitis en astma, allergische dermatitis, en/of urticaria, en dat het serum van deze patiënten bevat meerdere serum allergeen-specifieke immunoglobuline (sIgE) sensitizations van gemeenschappelijke allergenen in deze regio, gedetecteerd door het systeem-1.
  3. Uitsluiten van patiënten met onvolledige medische dossiers, die verloor van follow-up, degenen die weigeren te geven geïnformeerde toestemming ten aanzien van het gebruik van hun serummonsters voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, die met een geïdentificeerde immunodeficiëntie, die momenteel op immunotherapie of immunomodulerende agenten, of die gevonden te hebben van parasitaire infecties.
  4. Ervoor zorgen dat geen behandeling of medicijn voorschrift kreeg voorafgaand aan de serum-collectie om te minimaliseren van de storing van de bevindingen van het laboratorium. Alle serummonsters die de criteria niet vervullen verworpen.

2. studie van de stroming en metingen van belang

Opmerking: Het microfluidic-systeem moet 100 µL van de serum voor het bepalen van de 19 allergenen. Veneuze bloed (5 mL) werd bijeengezocht uit elke patiënt met behulp van een vacuüm bloedvat bevattende scheiden gel. Na centrifugeren voor 10 min op 1000 x gwordt werd de bovenste laag verzameld voor het testen. Ongebruikte serum werd opgeslagen bij-80 ° C. Vóór het testen, het serum werd gehouden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en was geschokt met een vortex-mixer. Herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien werden vermeden.

  1. Vooral het serum testopnames voor sIgEs op hele allergenen van de huismijt pteronyssinus (d1), huismijt farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), kat dander (e1), hond huidschilfers (e5), Bermuda gras (g2), timothy grass) G6), kakkerlakken (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), ragweed (w1), eiwit (f1), melk (f2), tarwe (f4), pinda (f13), sojabonen (f14), amandel (f20), krab (f23) en garnalen (f24). Volg de instructies die zijn gegeven in punt 3.
    Opmerking: sIgE bepaling werd gedaan met het allergeen-specifieke IgE assay kit (Zie de Tabel van materialen) en gemeten door een chemiluminescentie-analysator.
  2. Willekeurig selecteren drie monsters uit de monsters met genoeg serum (ten minste 900 µL) voor een studie van de reproduceerbaarheid. Houden van alle voorwaarden ongewijzigd, meten de drie sera voor allergeen sIgEs dagelijks voor 9 opeenvolgende dagen (dat wil zeggen, een totaal van 100 x 9 = 900 µL van de serum).

3. semi-automatisering testprocedure van het microfluidic-systeem

Opmerking: De systeem-2 is de integratie van automatische microfluidic technologie, eiwit microarray analyse van koude licht, parallelle IgE analyse en beeld processing technologie. Het test protocol is verdeeld in vier delen: voorbereiding van de apparatuur, monster laden incubatie en meting.

  1. Voorbereiding van de apparatuur
    1. Zet de PC en de macht van de analyzer.
      Opmerking: De aan-uitknop is op de links van de nullijn.
    2. Start het LabIT programma op de PC. Als de Donkere Frame waarschuwingsvenster opduikt, klik op OK als u wilt uitvoeren van de Test van de lek. Daarna, klik op het logo van de center voor het invoeren van de interface van de operatie.
      Opmerking: Het systeem herinnert de gebruiker lekkage Test uitvoeren als deze niet gebruikt gedurende meer dan 24 uur wordt.
    3. Controleer de Temp van de reactie en de CCD (charge - coupled apparaat) Temp in de rechteronderhoek van het scherm. De Temp van de reactie moet stijgen tot 37 ° C ± 1 ° C in ongeveer 10 minuten, en de CCD-Temp moeten dalen tot-15 ° C ± 1 ° C.
    4. Voer de Test van de lek na de CCD-Temp is gedaald tot-15 ° C ± 1 ° C. Voordat u de test van de lek, Controleer of er zijn geen andere objecten achtergelaten in het instrument en de deur dicht. Klik op extra | Systeem Test | Test van de lek. Niet open de deur tijdens het testen. Wanneer de test is voltooid, wordt het venster zal verschijnen.
  2. Monster laden
    1. Voeg 620 µL van was buffer, 120 µL van buffer met blokkerend, 60 µL van geconjugeerde A en B, 60 µL van substraat A en B, en 100 µL van de serummonsters aan de bijbehorende reagens tank op de microfluidic-cartridge.
  3. Incubatie
    1. Klik op Cartridge-ID, de barcodescanner kunt scannen van het serienummer van de cartridge, steken naar de voorbeeld Legitimatiebewijs, zet de cartridge in de analyzer en sluit de deur en op Analyzer en Voer om te beginnen met de analyse.
  4. Meting
    1. Exporteer de resultaten naar statistische software (bijvoorbeeld Excel) na de meting.
      Opmerking: Na 30 min van incubatie, de analyzer automatisch voert de meting en rapporteert het resultaat.
  5. Schakelen tussen off van de analyzer
    1. Voor routineonderhoud, na het beëindigen van de test, verwijder de cassette en veeg de analyzer van interne verwarming ijzer en elektromagneet lichtjes met 75% alcohol.
      Opmerking: Niet hard drukken of schudden van de elektromagneet.
    2. Sluit het venster LabIT. De temperatuur controle venster zal verschijnen. Het zal automatisch sluiten wanneer de CCD tot de 5 ° C protectie modus opwarmt. Tegen die tijd zal het uitschakelen van de kracht van de analysator en PC.
      Opmerking: Sluit niet handmatig de temperatuur waterkanon van venster voordat de CCD-Temp is gestegen tot 5 ° C en zet niet uit de macht van de analyzer, noch de PC tijdens de CCD-warming-up.

4. definitie van sIgE reactiviteit

Opmerking: Voor een onverdund serum specimen, het detectiebereik van de systeem-2 is 0.21-100 IU/mL.

  1. Gebaseerd op de drempelwaarde voor 0.35 IU/mL, rekening houden met een sIgE meer dan 0,35 IU/mL te positieve6,7. Stem op de reactiviteit van de sIgE tests als8: klasse 1 (≥0.35 en < 0.70 IU/mL), klasse 2 (≥0.70 en < 3,50 IU/mL), klasse 3 (≥3.50 en < 17,50 IU/mL), klasse 4 (≥17.50 en < 50.00 IU/mL), klasse 5 (≥50.00 en < 100.00 IU/mL) , en klasse 6 (≥100.00 IU/mL).

5. statistische analyse

  1. Gebruik een histogram te tonen de positieve tarief van de 19 allergenen (Figuur 1) en de curve Levey-Jennings gebruiken om aan te tonen van de herhaalbaarheid van de detectie systeem (Figuur 2)9.
  2. De drie meest voorkomende inhalant allergenen en voedselallergenen (in totaal zes allergenen) selecteren en vergelijken de resultaten naar de I System 1 te evalueren van de klinische diagnostische prestaties10,11. Omvatten de stemmen concordance, gevoeligheid, specificiteit, positieve en negatieve voorspellende waarden en het gebied onder de ontvanger karakteristiek (ROC) curve (AUC) fungeert als de beoordelingscriteria.
  3. Toepassing van Spearman correlatie analyse12 om correlaties tussen de twee systemen beschrijven en gebruiken van kappa waarde van consistentie. Categoriseren van de kappa waarde als bijna perfect (0.8-1.0), ingrijpende (0,6-0,8), matig (0,4-0,6), fair (0,2-0,4) of armen (< 0.2)13. Gebruik PASW 23,0 en MedCalc 11.0 statistische analyse en definiëren van P < 0.05 als statistische significantie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Positieve tarieven voor 19 gemeenschappelijke allergenen
De resultaten op 293 sera zijn afgebeeld in Figuur 3. Onder alle inhalant allergenen, D. farinae had de hoogste positieve percentage (80.89%, 273/293), gevolgd door D. pteronyssinus (78.84%, 231/293). Onder de voedselallergenen, krab heeft het hoogste percentage van de positieve (20.48%, 60/293), gevolgd door 13.65% (40/293) voor garnalen. De totale positieve tarief voor inhalant allergenen was hoger dan die voor voedselallergenen.

Herhaalbaarheid van het microfluidic-systeem
Herhaalbaarheid resultaten voor kat huidschilfers, huidschilfers van de hond en kakkerlak, gebaseerd op negen rondes van het testen, werden 32.98 ± 8.94, 1.61 ± 0,48 en 0,76 ± 0.18, respectievelijk, en de consistentie niveaus 100 waren % (9/9), 100% (9/9), en 67% (6/9). Verspreiding van de resultaten wordt weergegeven met de Levey-Jennings curve in Figuur 2. Alle gegevens zijn binnen het bereik van X ± 2 x SD, die strookt met de maximale toegestane klinische fout14.

Vergelijking van twee systemen
Kwalitatieve resultaten toonden aan dat kat huidschilfers had de hoogste concordantie op systeem 1 (95.33%, 243/150). De laagste concordantie was te zien in het garnaal (40.75%, 88/216). De totale overeenstemming tussen inhalant allergenen varieerden van 92,00% tot 95.33%. Het bereik van de concordantie was voor voedselallergenen, 40.74-72.39%. De hoogste gevoeligheid voor inhaleer werd gezien in de huismijt farinae (93.94%), met een 100% specificiteit. Onder voedselallergenen, werd de hoogste gevoeligheid gezien in pinda (54,55%), met een specificiteit van 80.65%. Tabel 2 toont ook aan dat alle resultaten van de evaluatie voor inhalant allergenen superieur aan voedselallergenen waren. Omdat de waarden van de AUC een bereik van 0.613 tot 0.984 toonde en de AUC voor de drie inhalant allergenen groter dan 0.950 was, kan worden geconcludeerd dat de systeem-2 een hoge nauwkeurigheid met betrekking tot System 1 heeft.

Consistentie analyse voor de twee systemen is gebleken dat de kappa-waarden voor de drie inhaleer tussen 0.727-0.876, met de hoogste waarde in kat huidschilfers gezien als 0.876 (95% CI, 0.786-0.965 waren). Ze waren allemaal beter dan de kappa-waarden voor voedselallergenen die, in het algemeen viel < 0.400. De laagste waarde van de kappa was 0.112 in garnalen (95% CI, 0.062-0.162) (tabel 3). Spearman de correlatie analyse toonde aan dat de beste correlatie werd gezien in pinda en kat huidschilfers, met correlatiecoëfficiënten als r = 0.942 (95% CI, 0.907-0.965; p < 0.0001) en r = 0.927 (95% CI, 0.900-0.947; p < 0.0001), respectievelijk.

In Figuur 3, een scatterplot is gebouwd met systeem 2's resultaten langs de x-as en System 1 langs de y-as naar de verdeling van de sIgE concentratie resultaten tonen van de twee systemen voor D. pteronyssinus, D. Farina, kat dander, melk, garnalen en pinda. Voor een analyse van overeenstemming en blijven, waren de allergenen die ± 1 klasse verschil toonde D. pteronyssinus (91.60%, 229 vs. 250), D. farinae (81.25%, 91 vs. 112), kat dander (98,00%, 147 vs. 150), melk (83.58%, 112 vs. 134) garnalen (59.72%, 129 vs. 216) en pinda (76.56%, 49 vs. 64). De gecombineerde totale concordance bedroeg 81.75% (757 vs. 926).

Figure 1
Figuur 1: de positiviteit tarieven van de detectie van 19 gemeenschappelijke allergenen door de bepaling van microfluidic. D1 - huismijt pteronyssinus, d2 - huismijt farinae, d201 - Blomia tropicalis, e1 - kat huidschilfers, e5 - hond huidschilfers, g2 - Bermuda gras, g6 - timothy grass, i6 - kakkerlakken, m3 - Aspergillus fumigatus, m5 - Candida albicans, w1 - ragweed, f1 - eiwit, f2 - melk, f4 - tarwe, f13 - pinda, f14 - soja, f20 - amandel, f23 - krab, en f24 - garnalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Levey-Jennings grafieken van de drie allergenen herhaaldelijk gedetecteerd door het systeem microfluidic. (A) kat haar, (B) hond haar en (C) kakkerlak werden geselecteerd voor de evaluatie van de herhaalbaarheid. De zwarte, groene, gele en rode lijnen geven het gemiddelde (X), de gemiddelde ± standaardafwijking (X ± SD), de gemiddelde + de standaarddeviatie keer twee (X ± 2SD), en het gemiddelde + de standaarddeviatie keer drie (X ± 3SD) van meerdere metingen, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Scatter percelen van zes allergeen sIgE concentraties gemeten door Systeem 1. Systeem 1 (Y-as) en het systeem 2 (X-as). Elke regel in het proefvlak vertegenwoordigt klasse cutoffs (klasse 0: 0.35, klasse 1: 0.35 – 0,7, klasse 2: 0,7 – 3.5, klasse 3: 3.5-17,5, klasse 4: 17,5-50, klasse 5:50 – 100 en klasse 6: > 100 IU/mL). Gearceerde vakken zijn concordante gebieden in de concentratie-klasse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Karakteristiek No.(%)
Geslacht, n(%)
Vrouw 123(41.98%)
man 170(58.02%)
Leeftijd, jaar, n(%)
Mediaan (25%, 75%) 23(8,36)
≤10 97(33.11%)
11-20 37(12.63%)
21-40 101(34.47%)
> 41 58(19.80%)
Diagnose, n(%)
Allergische rhinitis 92(31.40%)
Allergische astma 117(39.93%)
Allergische rhinitis met astma 36(12.29%)
Anderen 48(16.38%)

Tabel 1: patiënt demografische kenmerken. In totaal werden 293 onderwerpen gevonden die voldoet aan de criteria van de integratie, met een mediane leeftijd van 23 (interkwartielafstand van 8 tot 36 jaar oud). Onder hen, 170 (58.02%) waren mannelijk en 123 (41.98%) waren vrouwelijke. Ook, 92 (31.40%) van hen had allergisch rhinitis, 117 (39.93%) had van allergisch astma, 36 (12.29%) had comorbiditeit van rhinitis, astma en 48 (16.38%) had andere allergische ziekten, zoals een voedselallergie of huidallergieën.

Steekproefgrootte CAP + GLB- Totale overeenkomst SE SP PPV NHW AUC (95% CI)
BioIC + BioIC- BioIC + BioIC-
D1 250 196 20 0 34 92,00% 90.74% 100,00% 100,00% 62.96% 0,975 (0.947 naar 0.991)
D2 112 93 6 0 13 94.64% 93.94% 100,00% 100,00% 68.42% 0.984 (0.941 aan 0.999)
E1 150 34 5 2 109 95.33% 87.18% 98.20% 94.44% 95.61% 0.968 (0.925 op 0.990)
F2 134 16 27 10 81 72.39% 37.21% 89.01% 61.54% 75,00% 0.744 (0.661 op 0.815)
F13 64 18 15 6 25 67.19% 54,55% 80.65% 75,00% 62,50% 0.731 (0.606 op 0.834)
F24 216 36 127 1 52 40.74% 22.09% 98.11% 97.30% 29.05% 0.613 (0.545 op 0.678)
D1-Der. p1 d2-Der. f1, e1-Cat dander, f2-melk, f13-Peanut, f24-garnalen. CAP-ImmunoCAP, +-positieve, –-negatieve, SE-gevoeligheid, SP-specificiteit, predictieve waarde van de PPV-positieve, NHW-negatief voorspellende waarde, AUC-oppervlak onder de ROC curve. Voor de waarden van de AUC, wordt de intervalwaarde van 95% (95% CI) ook weergegeven in de tabel.

Tabel 2: klinische prestaties tussen de twee systemen. D1 - D. pteronyssinus, d2 - D. farina, e1 - kat huidschilfers, f2 - melk, f13 - pinda, en f24 - garnalen. CAP - ImmunoCAP, + -positieve – - negatieve, SE - gevoeligheid, SP - specificiteit, PPV - positief voorspellende waarde, NHW - negatieve voorspellende waarde, AUC - oppervlak onder de ROC curve. Voor de waarden van de AUC, wordt de intervalwaarde van 95% (95% CI) ook weergegeven in de tabel.

Kappa(95%,CI) Spearman'rho(95%,CI)
D1 0.727 (0.617 op 0.838) 0.896 (0.869 op 0.918)
D2 0.783 (0.617 op 0.948) 0.731 (0.631 op 0.807)
E1 0.876 (0.786 op 0.965) 0.927 (0.900 op 0.947)
F2 0,293 (0.122 aan 0.463) 0.681 (0.579 op 0.763)
F13 0.349 (0.129 aan 0.569) 0.969 (0.949 op 0.981)
F24 0.112 (0.062 naar 0.162) 0.833 (0.788 op 0.870)

Tabel 3: correlatie en overeenkomst tussen de twee systemen. D1 - D. pteronyssinus, d2 - D. farina, e1 - kat huidschilfers, f2 - melk, f13 - pinda, en f24 - garnalen. Voor kappa en Spearman van Rho waarden, wordt de intervalwaarde van 95% (95% CI) ook weergegeven in de tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vergelijkbaar met de resultaten van veel andere studies15,16,17, de resultaten van het systeem van de microfluidic gebaseerd op sera van 293 allergische patiënten bleek dat huis huisstofmijt (met inbegrip van D. pteronyssinus, D. farinae, en B. tropicalis) zijn de belangrijkste inhalant allergenen leiden tot allergische aandoeningen in Zuid-China, terwijl voor voedsel, melk, pinda, garnalen en krab zijn de meest voorkomende allergenen die allergische symptomen veroorzaken. Met betrekking tot de reproduceerbaarheid studie gedaan over drie allergenen, toonde ze allemaal goede resultaten, met een totale herhaling tarief van 88.89%, wat betekent dat het voldeed aan de maximaal toelaatbare fout.

Met behulp van System 1 als referentie, evalueerde de huidige studie de werkzaamheid van de klinische diagnose van het systeem-2. Met een serum sIgE 0.35 IU/mL als cutoff2betekent een monster met sIgE > 0.35 IU / mL dat de patiënt gevoelig voor het allergeen, en hoe hoger de titer, de betere correlatie met de patiënt symptomen18 is. De resultaten tonen dat de stemmen concordance van de drie inhalant allergenen al meer dan 90 werden %. Naast de resultaten voor voedselallergenen, die had een concordantie van ~40.74%-72.39%, was de totale overeenstemming 81.75% (757/926). De kappa waarde van kat huidschilfers, D. pteronyssinusen D. farinawaren 0.778, 0.663 en 0.860 (p < 0.001), respectievelijk. De kappa-waarden voor voedselallergenen waren alle onder 0.4. Voor de drie grote inhalant en voedselallergenen, werd een significante correlatie van kwantitatieve resultaten gezien tussen de twee systemen (rSpearman ≈ 0.681-0.969, p < 0,01).

Er werd gemerkt dat terwijl de coëfficiënt rS voor pinda 0.969 was, de kappa waarde van de evaluatie-index van consistentie alleen was 0.349 (95% CI, 0.129-0.569). Deze discrepantie kan te wijten zijn aan de lage prevalentie van pinda gevoeligheid in de regio en, vandaar, allermeest naar de aangeworven sera waren negatief voor dat specifieke IgE. Vele studies hebben aangegeven dat een significante discrepantie tussen sIgE titer en klinische symptomen van voedselallergenen kan worden gezien. Het gebruik van verschillende assay systemen voor voedsel-specifieke IgE bepaling kan ook grote variaties19maken. Dit is wellicht te wijten aan het feit dat het is niet de rauwkost gegeten die triggers van de allergische symptomen, maar de gewijzigde onderdelen gegenereerd tijdens het koken of spijsvertering. Het gebruik van verschillende grondstoffen door verschillende fabrikanten om de allergenen kan ook bijdragen aan het resultaat discrepantie20.

De microfluidic-cartridge is samengesteld uit vijf belangrijke delen: vijf opslagtanks, vijf reagens distributiekanalen, vijf unidirectionele pompen, een enkele reactie zone in welke allergeen extracten kunnen worden geïmmobiliseerd en een afgewerkte tank voor het verzamelen van alle bijproducten van de reactie. Gebaseerd op de noodzaak een bepaling, tot 40 allergeen extracten kunnen worden verspreid op de zone van de reactie. Gecontroleerd door de PC, de vijf unidirectionele pompen begeleiden en coördineren van de stroom van het serummonster, wassen buffer, blokkerende reagens, geconjugeerde en afgetrokken, om te eindigen een tweestaps enzym-verbonden immunosorbent analyse. Nadat de reactie is voltooid, de Chemoluminescentie reactie beelden worden vastgelegd door een gekoelde CCD-camera met een lage resolutie en de signalen worden verwerkt door de PC vast te stellen van de kalibratiekromme en om kwantitatieve en semikwantitatieve sIgE resultaten te berekenen.

De huidige studie toont aan dat de twee systemen goede consistentie tonen. Echter, vergeleken met de System-1, de systeem-2 is gemakkelijker te gebruiken en heeft een lagere vraag naar operator opleiding. Aangezien elke cartridge microfluidic zijn eigen kwaliteitscontrole kromme heeft, is de betrouwbaarheid van het systeem aanzienlijk verbeterd. Andere voordelen van het systeem zijn een licht en ruimtebesparend, een uitbreidbaar modulaire installatie en het gemak waarmee het is verbonden met een PC voor controle van de operatie. Al deze voordelen aanzienlijk verminderen de setup en de lopende kosten, en op hetzelfde moment, doen ze niet in gevaar brengt de nauwkeurigheid en snelheid vereisten in de dagelijkse klinische praktijk, waardoor het systeem bijzonder geschikt voor allergie screening in eerstelijnszorg ziekenhuizen in China. Een groot nadeel van het microfluidic-systeem is echter dat het is niet een volautomatische systeem, en frequente interventie nodig is tijdens de operatie. Het nog steeds vervangen niet de systemen die moeten verwerken dagelijks een groot aantal monsters.

Als gevolg van het ontbreken van voldoende positieve sera voor bepaalde allergenen, heeft deze studie geen betrekking op alle 19 allergenen die beschikbaar zijn in de microfluidic-cartridge, maar slechts zes gemeenschappelijke fragmenten beschikbaar in zuidelijk China. Meer onderzoek is nodig om te werken op of de evaluatie is ook van toepassing op andere allergenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Professor Mei Jiang voor haar hulp bij de statistische analyse en Mr. Hammer Tsui bij de voorbereiding van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de Guangzhou Science en technologie Foundation (201804020043) en de nationale Natural Science Foundation van China (NSFC 81572063 en NSFC 81802076). De financiering van de fracties overeengekomen met de studie ontwerp, gegevensanalyse, manuscript voorbereiding en besluit te publiceren. Geen andere financiering werd ontvangen voor deze studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agnitio BioIC Analyzer Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) T20SET
BioIC Reagent Dispenser Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DS-1
Image two-dimensional barcode machine Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) NLS-HR200
Software Package, LabIT Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd. VORTEX-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46, (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53, (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121, (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9, (5), e94776 (2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25, (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78, (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74, (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14, (1), 145 (2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327, (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22, (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37, (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38, (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66, (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72, (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64, (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32, (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100, (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108, (1), 82-88 (1995).
Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).More

Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter