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Medicine

Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)

doi: 10.3791/59100 Published: April 21, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll zum Nachweis von Serum-spezifische Immunglobulin E mit einem mikrofluidischen Patrone-basierte Chemilumineszenz-System und die Bewertung der Nützlichkeit Allergie Diagnosen.

Abstract

Allergische Erkrankungen ist häufig bei Erwachsenen und Kindern. Identifikation der auslösenden Allergene ist bedeutsam in Disease-Management und Prävention. Jedoch fehlt einem spezifischen Immunglobulin E (IgE)-Mess-System mit einem hohen Preis-Leistungs-Verhältnis in der Volksrepublik China, vor allem in den Krankenhäusern der Grundversorgung. Dieses Whitepaper beschreibt Verfahren der Grundsatz und Betrieb mit einem mikrofluidischen Chemilumineszenz Patrone-basierten System, um Allergen-spezifischen IgE im Serum zu erkennen. Die Ergebnisse wurden verglichen mit denen von ImmunoCAP (System 1), der Industrie-Standard und die Reproduzierbarkeit des Systems zu erkennen, Patienten zu häufigen Allergenen sensibilisiert wird ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich mit ImmunoCAP (System 1), das BioIC System (System 2) gute Präzision und Feingefühl bei der Aufdeckung von Serum-spezifischen IgE gegen verschiedene Inhalat und Lebensmittel-Allergene, aber mit deutlich niedrigeren Kosten hat. Es dient als eine gute Alternative zum System 1 in Krankenhäusern der Grundversorgung in der Volksrepublik China, die geringere finanzielle Erschwinglichkeit haben.

Introduction

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Die Prävalenz von Allergien hat in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen und 20-30 % der Weltbevölkerung1betrifft. Identifikation der auslösenden Allergene hat wichtige Bedeutung bei der Bewältigung von Krankheiten. In China da registrierte in-vivo Hauttests Prick nicht in dem Land stehen, in-vitro-Bestimmung des Serum-spezifischen IgE das wichtigste ist und häufig verwendetes Werkzeug für Typ-I-Allergie diagnostiziert2. Dies ist vergleichbar mit Praktiken in der westlichen Welt, aber obwohl ImmunoCAP System (System 1), ein Fluoreszenz-Enzym-linked Immunosorbentprobe Grundsystem, als der Goldstandard für in-vitro-Allergie Diagnose3wahrgenommen wird, ist seine Verwendung in China sehr begrenzt aufgrund zu seiner Ausrüstung und Reagenz Höchstkurs. Ein neues alternative Allergie-Diagnose-System mit einem hohen Preis-Leistungs-Verhältnis ist daher dringend erforderlich.

Das BioIC System (System 2) ist ein mikrofluidischen Patrone-basiertes System basiert auf dem Prinzip der Chemilumineszenz für Multiplex-Assays der Serum-spezifischen IgE. Mit einer Größe von 7 cm x 4 cm, besteht die mikrofluidischen Patrone aus drei Schichten aus Spritzguss-Kunststoff. Der obere Teil ist 3 mm starkem transparentem Polycarbonat, das guten Stabilität während der thermischen Montageprozesse trägt. Zusammen mit der 3 mm dicken Bodenschicht besteht aus einem Copolymer aus Acrylnitril, Butadien und Styrol (ABS) sandwiches es 0,5 mm starken Mittelschicht aus Silikon-Kautschuk. In der Farbe Schwarz bietet, die mittlere Schicht niedriger Hintergrund während der Chemilumineszenz-Detektion. Auf der Oberseite der Silica-Gel wird eine dünne Schicht aus Nitrozellulose-Membran (NC-Membran) gesprüht, an der Position entsprechend der Reaktionszone, wodurch das Auffinden verschiedener Allergene Proteine. Der Zweck dieser Studie ist es, die klinische Leistung des mikrofluidischen Systems zur gemultiplexten Bestimmung der Allergen-spezifischen IgE im Serum zu bewerten.

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Protocol

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Diese Studie und die Verwendung von humanem Serumproben wurden von der Ethikkommission der erste Affiliated Hospital von Guangzhou Medical University (GYYY-2016-73) genehmigt. Alle Teilnehmer haben ihr schriftliche Einverständnis gegeben, selbständig oder durch ihre Eltern (bei Kindern).

1. grundlegende Informationen der Study group

Hinweis: Die Allergie-Informations-Repository von der State Key Labor von Atemwegserkrankungen (Luft-SKLRD) ist eine große Serumbank innerhalb des Guangzhou Institut of Respiratory Krankenhauses (GIRH) gegründet. In den letzten zehn Jahren initiiert, hat die Luft-SKLRD bereits begonnen zu sammeln und speichern Serumproben von Patienten mit allergischen Erkrankungen, zusammen mit ihre klinische Informationen (Tabelle 1)4,5. Die vorliegende Studie wurde mit Seren aus der Luft-SKLRD durchgeführt.

  1. Suchen Sie in der Luft-SKLRD Datenbank für Sera von Januar 2015 bis Juni 2018 gesammelt und wählen Sie die Patienten mit allergischen Erkrankungen, die empfindlich auf die häufigen Allergenen in der Region gefunden wurden.
  2. Sicherstellen Sie, dass alle ausgewählte Patienten allergisch bedingte Krankheiten wie Heuschnupfen und Asthma, allergische Dermatitis oder Urtikaria, und enthält das Serum der Patienten mehrere Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE) Sensibilisierungen der häufigen Allergenen in dieser Region von System 1 erkannt.
  3. Patienten mit unvollständigen medizinischen Aufzeichnungen, die verlorenen zu verfolgen, wer sich weigert, Einwilligung hinsichtlich der Verwendung ihrer Serumproben für wissenschaftliche Zwecke, die mit einer festgestellten Immunschwäche, die derzeit auf Immuntherapie ausschließen oder immunmodulatorische Agenten oder diejenigen gefunden, um parasitäre Infektionen haben.
  4. Stellen Sie sicher, dass keine Behandlung oder ein Medikament Rezept vor der Serum-Sammlung gegeben wurde, um Interferenzen mit der Laborbefunde zu minimieren. Alle Serumproben, die nicht die Kriterien erfüllen, wurden abgelehnt.

2. Studie fließen und Messungen von Interesse

Hinweis: Das mikrofluidischen System braucht 100 µL Serum zur Bestimmung 19 Allergene. Venöses Blut (5 mL) wurde von jedem Patienten mit einem Blut-Vakuumbehälter mit trennenden Gel gesammelt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 1000 X g, war die obere Schicht zu Testzwecken gesammelt. Nicht verwendete Serum wurde bei-80 ° c gelagert. Vor der Prüfung, das Serum bei Raumtemperatur für 30 min gehalten wurde und wurde mit einem Vortex-Mixer erschüttert. Wiederholte Frost-Tau-Zyklen wurden vermieden.

  1. In erster Linie testen die Serumproben für sIgEs auf ganze Allergene Dermatophagoides Pteronyssinus (d1), Dermatophagoides Farinae (d2), Blomia Tropicalis (d201), Katze Dander (e1), Hund Hautschuppen (e5), Bermudagras (g2), Timothy grass) G6), Schaben (i6), Aspergillus Fumigatus (m3), Candida Albicans (m5), Ambrosia (w1), Eiweiß (f1), Milch (f2), Weizen (f4), Erdnuss (f13), Sojabohne (f14), Mandel (f20), Krabben (f23) und Garnelen (f24). Folgen Sie den Anweisungen in Abschnitt 3.
    Hinweis: sIgE Bestimmung erfolgte mit der Allergen-spezifischen IgE Assay kit (siehe die Tabelle der Materialien) und gemessen durch ein Chemilumineszenz-Analyzer.
  2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Proben aus den Reihen der Proben mit genügend Serum (mindestens 900 µL) für eine Reproduzierbarkeit-Studie. Halten alle Bedingungen unverändert, die drei Sera für Allergen-sIgEs an 9 aufeinander folgenden Tagen täglich messen (d. h. insgesamt 100 x 9 = 900 µL Serum).

(3) Teilautomatisierung Testverfahren des mikrofluidischen Systems

Hinweis: Das System 2 ist die Integration der automatischen mikrofluidischen Technologie, Protein Microarray Kaltlicht-Analyse, parallele IgE Analyse und Image-Processing-Technologie. Das Prüfprotokoll gliedert sich in vier Teile: Vorbereitung der Ausrüstung, Probenbeladung, Inkubation und Messung.

  1. Vorbereitung der Ausrüstung
    1. Schalten Sie den PC und die Analyzer macht.
      Hinweis: Der ein-/Ausschalter ist auf der linken Seite der Basis.
    2. Starten Sie das LabIT-Programm auf dem PC. Wenn die Dunklen Rahmen Warnungsfenster sich öffnet, klicken Sie auf "OK" , um die Dichtheitsprüfungausgeführt. Danach klicken Sie auf die Center-Logo um die Betriebsschnittstelle zu öffnen.
      Hinweis: Das System erinnert den Benutzer Dichtheitsprüfung ausgeführt, wenn im Standby-für mehr als 24 h Modus.
    3. Überprüfen Sie die Reaktion Temp und CCD (Charge – Coupled Device) Temp an der unteren rechten Ecke des Bildschirms. Die Reaktion Temp sollte 37 ° C ± 1 ° C in ca. 10 Minuten steigen, und die CCD-Temp sollte fallen-15 ° C ± 1 ° C.
    4. Die Dichtheitsprüfung ausgeführt, nachdem die CCD-Temp-15 ° C gesunken ± 1 ° C. Stellen Sie bevor Sie die Dichtheitsprüfung ausführen sicher, es gibt keine anderen Gegenstände im Inneren des Gerätes und schließen Sie die Tür. Klicken Sie auf Extras | Systemtest | Dichtheitsprüfung. Öffnen Sie die Tür nicht während der Prüfung. Wenn der Test abgeschlossen ist, wird das Berichtsfenster angezeigt.
  2. Probenaufnahme
    1. Den entsprechenden Reagensbehälter auf der Patrone mikrofluidischen 620 µL Waschpuffer, 120 µL blocking-Puffer, 60 µL Konjugate A und B, 60 µL Substrat A und B und 100 µL Serum Proben hinzufügen.
  3. Inkubation
    1. Klicken Sie auf Cartridge ID, verwenden Sie den Barcode-Scanner zu scannen die Seriennummer der Patrone, die Proben-ID eingeben, setzen Sie die Patrone in den Analysator und schließen Sie die Tür, und klicken Sie auf Analyzer und führen Sie , um die Analyse zu starten.
  4. Messung
    1. Nach der Messung die Ergebnisse statistischer Software (z. B. Excel) exportieren.
      Hinweis: Nach 30 min Inkubation der Analyzer automatisch führt die Messung und das Ergebnis berichtet.
  5. Abschaltung des Analyzers
    1. Entfernen Sie für die routinemäßige Wartung, nach Beendigung des Tests die Patrone und wischen Sie des Analyzer interne Heizung Eisen und Elektromagneten leicht mit 75 % Alkohol.
      Hinweis: Nicht drücken Sie stark oder schütteln Sie der Elektromagnet.
    2. Schließen Sie das Fenster LabIT. Die Temperatur-monitoring-Fenster öffnet sich. Es wird automatisch geschlossen, wenn der CCD auf den Schutzmodus 5 ° C erwärmt. Bis dahin wird es sicher zu schalten Sie den Analyzer und PC sein.
      Hinweis: Schließen Sie nicht manuell die Temperaturüberwachung Fenster, bevor die CCD-Temp auf 5 ° C gestiegen ist, und schalten Sie die Kraft der Analysator noch der PC nicht beim CCD Aufwärmen.

4. Definition der sIgE Reaktivität

Hinweis: Für ein unverdünntes Serum-Probe ist die Reichweite des Systems 2 0,21 – 100 IU/mL.

  1. Basierend auf den Schwellenwert von 0,35 IU/mL, betrachten Sie ein sIgE-Niveau mehr als 0,35 IU/mL positiv6,7sein. Bewerten Sie die Reaktivität der sIgE-Tests als8: Klasse 1 (≥0.35 und < 0,70 IU/mL), Klasse 2 (≥0.70 und < 3,50 IU/mL), Klasse 3 (≥3.50 und < 17,50 IU/mL), Klasse 4 (≥17.50 und < 50,00 IU/mL), Klasse 5 (≥50.00 und < 100,00 IU/mL) , und Klasse 6 (≥100.00 IU/mL).

5. statistische Analyse

  1. Verwenden Sie ein Histogramm zeigen die positive Rate der 19 Allergene (Abbildung 1) und Levey Jennings-Kurve um die Wiederholbarkeit der Detection System (Abbildung 2)9zeigen.
  2. Wählen Sie die drei häufigsten Inhalat Allergene und Lebensmittel-Allergene (insgesamt sechs Allergene) und vergleichen Sie die Ergebnisse, die ich System 1, seine klinische diagnostische Leistung10,11zu bewerten. Gehören Sie die Konkordanz-Rate, Empfindlichkeit, Spezifität, positiven und negativen prädiktiven Werte und die Fläche unter der Empfänger Betrieb Merkmal (ROC)-Kurve (AUC) als die Bewertungskriterien.
  3. Gelten Sie Spearman Korrelation Analyse12 um Korrelationen zwischen den beiden Systemen zu beschreiben und Kappa-Wert für Konsistenz. Kategorisieren den Kappa-Wert als fast perfekt (0,8-1,0), erhebliche (0,6-0,8), mäßig (0,4 – 0,6), Fair (0,2 – 0,4) oder Arm (< 0,2)13. Verwenden Sie SPSS 23,0 und MedCalc 11.0 statistische Analyse und definieren P < 0,05 als statistische Signifikanz.

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Representative Results

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Positive Sätze für 19 gemeinsame Allergene
Die Ergebnisse auf 293 Sera sind in Abbildung 3dargestellt. Unter den Schnüffelstoffen Allergene, D. Farinae hatte die höchste positive Rate (80.89 %, 273/293), gefolgt von D. Pteronyssinus (78,84 %, 231/293). Unter den Lebensmittel-Allergene, Krabbe hat die höchste positive Rate (20,48 %, 60/293), gefolgt von 13,65 % (40/293) für Garnelen. Die Gesamt-positive-Rate von Schnüffelstoffen Allergenen war höher als die für Lebensmittel-Allergene.

Wiederholbarkeit des mikrofluidischen Systems
Wiederholbarkeit Ergebnisse für Katze Dander, Hund Hautschuppen und Schabe, auf neun Testrunden, 32.98 ± 8.94, 1,61 ± beruhten 0,48 und 0,76 ± 0,18, beziehungsweise, und die Konsistenz 100 waren % (9/9), 100 % (9/9), und 67 % (6/9). Verbreitung der Ergebnisse wird mit der Levey Jennings-Kurve in Abbildung 2gezeigt. Alle Daten sind innerhalb des Bereichs der X ± 2 X SD, was im Einklang mit dem maximal zulässigen klinischen Fehler14steht.

Vergleich zweier Systeme
Qualitative Ergebnisse zeigten, dass Katze Dander hatte die höchste Übereinstimmung auf System 1 (95.33 %, 243/150). Die niedrigsten Konkordanz galt in Garnelen (40,75 %, 88/216). Die totale Übereinstimmung unter Schnüffelstoffen Allergene zwischen 92.00 % und 95.33 %. Für Lebensmittel-Allergene war die Konkordanz 40,74 % – 72,39 %. Die höchste Empfindlichkeit für Schnüffelstoffe verzeichnete Dermatophagoides Farinae (93.94 %), mit 100 % Spezifität. Unter Lebensmittel-Allergene war die höchste Empfindlichkeit in Erdnuss (54.55 %), mit einer Spezifität von 80.65 % gesehen. Tabelle 2 zeigt auch, dass die Auswertungsergebnisse für Inhalat Allergene Lebensmittel-Allergene überlegen waren. Da die AUC-Werte eine Reihe von 0.613 zur 0.984 zeigten und die AUC für die drei Inhalat Allergene größer als 0.950 war, kann geschlossen werden, dass das System 2 eine hohe Genauigkeit mit Bezug auf System 1 hat.

Konsistenz-Analyse für die beiden Systeme zeigte, dass die Kappa-Werte für die drei Schnüffelstoffe zwischen 0.727 – 0.876, mit dem höchsten Wert in Katze Dander wie 0.876 (95 % CI, 0,786 – 0.965) gesehen. Sie waren alle besser als die Kappa-Werte für Lebensmittel-Allergene, die in der Regel fiel < 0,400. Der niedrigste Wert der Kappa war 0.112 in Garnelen (95 % CI, 0,062 – 0.162) (Tabelle 3). Spearmans Korrelationsanalyse zeigte, dass die beste Korrelation gesehen wurde in Erdnuss und Katze Dander, mit Korrelationskoeffizienten r = 0.942 (95 % CI, 0.907 – 0.965; p < 0,0001) und R = 0.927 (95 % CI, 0.900 – 0,947; p < 0,0001), beziehungsweise.

In Abbildung 3, entsteht ein Streudiagramm mit System 2 Ergebnisse entlang der X-Achse und System 1 entlang der y-Achse, um die Verteilung der sIgE Konzentration ergibt sich aus den beiden Systemen für D. Pteronyssinus, D. zeigen Farina, Katze Dander, Milch, Garnelen und Erdnüssen. Für eine Konkordanz und Discordance Analyse wurden die Allergene, die ± 1 Klassenunterschied zeigte D. Pteronyssinus (91,60 %, 229 vs 250), D. Farinae (81.25 %, 91 vs. 112), Katze Dander (98.00 %, 147 und 150), Milch (83.58 %, 112 vs. 134), Garnelen (59.72 %, 129 vs. 216), und Erdnuss (76.56 %, 49 vs. 64). Die kombinierte Gesamtrate Konkordanz war 81.75 % (757 vs 926).

Figure 1
Abbildung 1: die Positivität Preise über den Nachweis von 19 gemeinsame Allergene von mikrofluidischen Assay. D1 - Dermatophagoides Pteronyssinus, d2 - Dermatophagoides Farinae, d201 - Blomia Tropicalis, e1 - Katze Dander, e5 - Hund Hautschuppen, g2 - Bermudagras, g6 - Lieschgras, i6 - Kakerlaken, m3 - Aspergillus Fumigatus, m5 - Candida Albicans, w1 - Ambrosie, f1 - Eiweiß, f2 - Milch, f4 - Weizen, f13 - Erdnuss, f14 - Soja, f20 - Mandel, f23 - Krabbe, und f24 - Garnelen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Levey Jennings-Diagrammen der drei Allergene der mikrofluidischen System wiederholt festgestellt. (A) Katzenhaare, Hundehaare (B) und (C) Schabe für Wiederholbarkeit Bewertung ausgewählt wurden. Die schwarze, grüne, gelbe und rote Linien darstellen des Mittelwerts (X), Mittelwert ± Standardabweichung (SD X ±), der Mittelwert + Standardabweichung mal zwei (X ± 2SD), und der Mittelwert + Standardabweichung mal drei (X ± 3SD) mehrere Messungen, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: streuen Grundstücke sechs Allergenkonzentrationen sIgE gemessen System 1. System 1 (Y-Achse) und das System 2 (X-Achse). Jede Zeile in der Handlung steht für Klasse Cutoff (Klasse 0: 0,35, Klasse 1: 0,35 – 0,7, Klasse 2: 0,7 – 3,5, Klasse 3: 3,5 – 17,5, Klasse 4: 17,5 – 50, Klasse 05:50 – 100 und Klasse 6: > 100 IE/mL). Schattierte Felder sind übereinstimmende Bereiche in der Konzentration-Klasse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Charakteristisch No.(%)
Geschlecht, n(%)
Weiblich 123(41.98%)
Männlich 170(58.02%)
Alter, Jahr, n(%)
Median (25 %, 75 %) 23(8,36)
≤10 97(33.11%)
11-20 37(12.63%)
21-40 101(34.47%)
> 41 58(19.80%)
Diagnose, n(%)
Allergische rhinitis 92(31.40%)
Allergisches asthma 117(39.93%)
Allergische Rhinitis mit asthma 36(12.29%)
Andere 48(16.38%)

Tabelle 1: demographische Patientenmerkmalen. Insgesamt wurden 293 Themen gefunden, die die Einschlusskriterien, mit einem Durchschnittsalter von 23 (Interquartilbereich von 8 bis 36 Jahre alt) erfüllt. Unter Ihnen: 170 (58.02 %) waren männlich und 123 (41.98 %) waren weiblich. Auch, 92 (31,40 %) von ihnen hatten allergischen Rhinitis, 117 (39,93 %) allergisches Asthma, 36 (12,29 %) hatten Komorbidität von Rhinitis und Asthma und 48 (16.38 %) hatten hatten andere allergischen Erkrankungen, wie z. B. einer Nahrungsmittelallergie oder Hautallergien.

Stichprobenumfang KAPPE + CAP- Völlige Übereinstimmung SE SP PPV NPV AUC (95 % CI)
BioIC + BioIC- BioIC + BioIC-
D1 250 196 20 0 34 92.00 % 90.74 % 100,00 % 100,00 % 62.96 % 0,975 (0,947, 0.991)
D2 112 93 6 0 13 94.64 % 93.94 % 100,00 % 100,00 % 68.42 % 0.984 (0.941 bis 0,999)
E1 150 34 5 2 109 95.33 % 87,18 % 98.20 % 94.44 % 95.61 % 0,968 (0,925 zu 0.990)
F2 134 16 27 10 81 72,39 % 37,21 % 89.01 % 61.54 % 75,00 % 0.744 (0.661, 0.815)
F13 64 18 15 6 25 67.19 % 54.55 % 80.65 % 75,00 % 62,50 % 0.731 (0.606, 0.834)
F24 216 36 127 1 52 40,74 % 22.09 % 98,11 % 97.30 % 29.05 % 0.613 (0.545, 0.678)
D1-tanzen p1, d2-tanzen f1, e1-Katze Dander, f2-Milch, f13 Erdnuss, f24-Garnelen. CAP-ImmunoCAP, +-Positive, –-negative, SE-Sensibilität, SP-Spezifität PPV-positiven prädiktiven Wert, NPV-negativen prädiktiven Wert, AUC Fläche unter der ROC-Kurve. Der Intervallwert von 95 % (95 % CI) ist aus AUC-Werte in der Tabelle gezeigt.

Tabelle 2: klinische Leistung zwischen den beiden Systemen. D1 - D. Pteronyssinus, d2 - D. Farina, e1 - Katze Dander, f2 - Milch, f13 - Erdnuss, und f24 - Garnelen. CAP - ImmunoCAP + -positiv, – - negative, SE - Empfindlichkeit, SP - Spezifität PPV - positive prädiktive Wert, NPV - negativen prädiktiven Wert, AUC - Fläche unter der ROC-Kurve. Der Intervallwert von 95 % (95 % CI) ist aus der AUC-Werte in der Tabelle gezeigt.

Kappa(95%,CI) Spearman'rho(95%,CI)
D1 0.727 (0.617, 0.838) 0.896 (0.869, 0.918)
D2 0.783 (0.617, 0.948) 0.731 (0.631, 0.807)
E1 0.876 (0,786 bis 0.965) 0.927 (0,900, 0,947)
F2 0.293 (0,122 zu 0.463) 0.681 (0.579, 0.763)
F13 0.349 (0,129, 0.569) 0,969 (0.949, 0.981)
F24 0.112 (0,062, 0.162) 0.833 (0.788, 0.870)

Tabelle 3: Korrelationen und Vereinbarung zwischen den beiden Systemen. D1 - D. Pteronyssinus, d2 - D. Farina, e1 - Katze Dander, f2 - Milch, f13 - Erdnuss, und f24 - Garnelen. Aus Kappa und Spearmans Rho Werte ist der Intervallwert von 95 % (95 % CI) in der Tabelle gezeigt.

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Discussion

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Ähnlich den Ergebnissen von vielen anderen Studien15,16,17, die Ergebnisse aus dem mikrofluidischen System basierend auf Seren von 293 allergischen Patienten zeigte, dass Haus Hausstaubmilben (einschließlich D. Pteronyssinus, D. Farinae, und B. Tropicalis) sind die wichtigsten Inhalat Allergene führt zu allergischen Erkrankungen im Süden Chinas, während für Lebensmittel, Milch, Erdnuss, Garnelen und Krabben sind die häufigsten Allergene, die allergische Symptome verursachen. Im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit Studie über drei Allergene zeigten alle gute Ergebnisse mit einer insgesamt Wiederholungsrate von 88.89 %, was bedeutet, dass es die maximale zulässige Fehler traf.

Mit System 1 als Referenz, bewertet die aktuelle Studie die klinische Diagnose Wirksamkeit des Systems 2. Mit einem sIgE-Serumspiegel von 0,35 IU/mL als cutoff2bedeutet eine Probe mit sIgE > 0,35 IU / mL, dass der Patient empfindlich auf das Allergen, und je höher der Titer, die bessere Korrelation zu der Patient Symptome18ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konkordanz bei den drei Inhalat Allergene alle mehr als 90 waren %. Neben den Ergebnissen für Lebensmittel-Allergene, die eine Konkordanz von ~40.74%-72.39 % hatte, war die totale Übereinstimmung 81.75 % (757/926). Der Kappa-Wert von D. Pteronyssinus, D. Farinaund Katze Dander waren 0.778, 0.663 und 0.860 (p < 0,001), beziehungsweise. Die Kappa-Werte für Lebensmittelallergene waren alle unter 0,4. Für die drei großen Inhalat und Lebensmittel-Allergene wurde eine signifikante Korrelation der quantitativen Ergebnisse zwischen den beiden Systemen (RSpearman ≈ 0.681-0,969, p < 0,01) gesehen.

Es wurde festgestellt, dass während der Koeffizient RS für Erdnuss 0,969, war der Kappa-Wert des Indexes Konsistenz Bewertung nur 0.349 (95 % CI, 0,129-0.569). Diese Diskrepanz könnte aufgrund der niedrigen Prävalenz von Erdnuss Empfindlichkeit in der Region sein und daher die meisten der eingestellten Sera waren negativ für die spezifischen IgE. Viele Studien haben gezeigt, dass eine deutliche Diskrepanz zwischen sIgE Titer und klinische Symptome von Lebensmittelallergenen gesehen werden könnte. Die Verwendung von verschiedenen Test-Systeme für Lebensmittel-spezifische IgE-Bestimmung kann auch große Variationen19erstellen. Dies ist möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass es nicht der Rohe aufgenommenen Nahrung die allergischen Symptome auslöst, aber die geänderte Komponenten erzeugt während des Kochens oder Verdauung. Die Verwendung verschiedener Rohstoffe von verschiedenen Herstellern, die Allergene zu machen kann auch auf das Ergebnis Diskrepanz20beitragen.

Die mikrofluidischen Cartridge besteht aus fünf Hauptteilen: fünf Lagertanks, fünf Reagenz Übermittlungskanäle, fünf unidirektional Pumpen, einen einzigen Reaktionszone in welche Allergene Extrakte immobilisiert werden können und einen Fäkalientank, alle Nebenprodukte der Reaktion zu sammeln. Basierend auf der Assay-Notwendigkeit, bis zu 40 Allergen, die Extrakte auf die Reaktionszone gepunktet werden können. Gesteuert durch den PC, die fünf unidirektionalen Pumpen leiten und koordinieren den Fluss der Serumprobe, waschen-Puffer, blockierende Reagenzien, Konjugate und subtrahiert, um einen zweistufigen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay zu beenden. Nach Abschluss die Reaktion der Chemilumineszenz-Reaktion-Bilder werden durch eine niedrig aufgelöste gekühlten CCD-Kamera erfasst und die Signale werden verarbeitet, indem der PC die Eichkurve herstellen und quantitative und semiquantitative sIgE Ergebnisse berechnen.

Die aktuelle Studie zeigt, dass die beiden Systeme guten Konsistenz zeigen. Jedoch verglichen mit dem System 1 System 2 ist einfacher zu bedienen und hat einen geringeren Bedarf an Schulung des Bedienpersonals. Da jede mikrofluidischen Patrone eine eigene Qualitätskontrolle-Kurve hat, wird die Zuverlässigkeit des Systems erheblich verbessert. Weitere Vorteile des Systems sind ein Licht und geringen Platzbedarf, eine erweiterbare modulare Aufbau und die Leichtigkeit, mit der es an einen PC zur Steuerung verbunden ist. All diese Vorteile erheblich reduzieren, die Einrichtung und die laufenden Kosten, und zur gleichen Zeit, gefährden sie nicht die Anforderungen an Genauigkeit und Geschwindigkeit in der täglichen klinischen Praxis, die macht das System besonders geeignet für Allergie-Screening in Krankenhäusern der Grundversorgung in China. Ein großer Nachteil des mikrofluidischen Systems ist jedoch, dass es kein vollautomatisches System, und häufige Eingreifen während des Betriebs erforderlich ist. Es kann nicht immer noch die Systeme ersetzen, die eine große Anzahl von Proben täglich verarbeiten müssen.

Aufgrund des Mangels an genügend positive Seren für bestimmte Allergene deckten diese Studie nicht die 19 Allergene in mikrofluidischen Patrone, aber nur sechs gebräuchlichsten verfügbar in Südchina. Weitere Studien sind erforderlich, darüber, ob die Bewertung auch auf andere Allergene zu erarbeiten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Professor Mei Jiang für ihre Hilfe bei der statistischen Auswertung und Herr Hammer Tsui bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Studie wurde unterstützt durch das Guangzhou Science and Technology Foundation (201804020043) und die National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063 und NSFC 81802076). Die Finanzierung stimmten mit Studiendesign, Datenanalyse, Manuskript Vorbereitung und Entscheidung zu veröffentlichen. Keine anderen Mittel wurde für diese Studie aufgenommen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agnitio BioIC Analyzer Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) T20SET
BioIC Reagent Dispenser Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DS-1
Image two-dimensional barcode machine Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) NLS-HR200
Software Package, LabIT Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd. VORTEX-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)
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Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).More

Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).

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