Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

doi: 10.3791/59100 Published: April 21, 2019
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

Abstract

מחלה אלרגית שכיחה אצל מבוגרים וילדים. זיהוי של האלרגנים סיבתי הינו משמעותי ניהול מחלות ומניעה. עם זאת, מערכת מדידה אלקטרוני (IgE) אימונוגלובולין ספציפי עם יחס מחיר-ביצועים גבוהים חסר ביבשת סין, במיוחד בבתי-החולים טיפול ראשוני. מאמר זה מתאר את ההליכים עיקרון ותפעול של באמצעות מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic לזהות IgE הספציפי לאלרגן סרום. התוצאות הושוו עם אלה של ImmunoCAP (מערכת 1), תקן תעשייתי, ומוערכת הפארמצבטית של המערכת לזהות חולים ערים לו אלרגנים נפוצים. התוצאות הראו כי בהשוואה ImmunoCAP (מערכת 1), מערכת BioIC (מערכת 2) יש דיוק טוב ורגישות באיתור IgE ספציפי סרום נגד אלרגנים שונים שאיפה ומזון, אבל עם מחיר נמוך משמעותית. זה יכול לשמש אלטרנטיבה טובה מערכת 1 בבתי חולים טיפול ראשוני בסין יש מקלחון פיננסי נמוך.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השכיחות של אלרגיות גדל בהתמדה בעשורים האחרונים, זה משפיע על 20-30% של האוכלוסייה הכללית1. זיהוי של האלרגנים סיבתי יש משמעות חשובה בניהול המחלות. בסין, מאז בדיקות השמוק עור ויוו רשומים אינם זמינים בארץ, נחישות במבחנה של IgE ספציפי סרום הוא החשוב ביותר, כלי נפוץ עבור סוג אלרגיה המאבחן2. זה דומה לשיטות בעולם המערבי, אך למרות מערכת ImmunoCAP (מערכת 1), מערכת immunosorbent מקושרים-אנזים פלורסצנטיות הבסיס, נתפשת כתהליך של תקן הזהב עבור אבחון האלרגיה במבחנה3, השימוש בסין הוא מאוד מוגבל בשל גבוהה וציוד ריאגנט במחיר. לפיכך מערכת חדשה של אבחון האלרגיה אלטרנטיבית עם יחס מחיר-ביצועים גבוהים נדרש קשות.

מערכת BioIC (מערכת 2) היא microfluidic המבוסס על מחסנית מערכת בהתבסס על העיקרון chemiluminescence של מבחני מרובבת של IgE ספציפי סרום. בגודל של 7 ס מ x 4 ס מ, הדיו microfluidic מורכב משלוש שכבות פלסטיק הזריקה יצוק. החלק העליון הוא 3 מ מעבה פוליקרבונט שקוף אשר נושאת את יציבות טובה במהלך תהליכי הרכבה תרמי. יחד עם השכבה התחתונה מ מ בעובי 3 בנוי קופולימר של בוטאדיאן, טבעי styrene (ABS), זה כריך של 0.5 מ מעבה שכבת הביניים עשוי גומי סיליקון. להיות שחור בצבע השכבה האמצעית מציע רקע נמוך יותר במהלך זיהוי chemiluminescence. על גבי סיליקה ג'ל, שכבה דקה של ניטרוצלולוזה קרום (ממברנה NC) מרוסס במיקום המתאים לאזור התגובה, המאפשר את איתור של חלבונים אלרגניים שונים. מטרתו של מחקר זה היא להעריך את הביצועים קליני של מערכת microfluidic מצפני מרובבת IgE הספציפי לאלרגן בנסיוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקר זה, השימוש בנסיוב אדם דגימות אושרו על ידי ועדת האתיקה של הראשון המזוהה עם בית החולים של גואנגג'ואו האוניברסיטה הרפואית (GYYY-2016-73). כל המשתתפים נתנו את הסכמתם בכתב באופן עצמאי או דרך הוריהם (במקרה של ילדים).

1. מידע בסיסי של קבוצת המחקר

הערה: מאגר מידע אלרגיה של מדינת מפתח מעבדה של הנשימה המחלה (אוויר-SKLRD) הוא בנק סרום גדול שהוקם בתוך בית החולים גואנגג'ואו המכון נשימתית (GIRH). יזם בעשור האחרון, האוויר-SKLRD כבר התחיל לאסוף ולאחסן סרום דגימות מחולים במחלות אלרגיות, יחד עם4,שלהם מידע קליני (טבלה 1)5. המחקר הנוכחי בוצע עם סרה מן האוויר-SKLRD.

  1. חפש במאגר המידע של האוויר-SKLRD עבור סרה שנאסף בינואר 2015 עד 2018 יוני ובחר לחולים עם מחלה אלרגית, אשר נמצאו להיות רגישים לאלרגנים הנפוצים באזור.
  2. להבטיח כי כל החולים שנבחרה יש מחלות אלרגיות הקשורות, כמו קדחת השחת או אסטמה, דלקת עור אלרגית, ו/או סרפדת, כי הסרום של חולים אלו מכיל סרום מרובים אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE) sensitizations של אלרגנים נפוצים באזור זה, שזיהה את מערכת 1.
  3. אל תכלול חולים עם לא שלם הרשומות הרפואיות, אלו איבדו ולצרכיו, אלה שמסרבים לתת הסכמה מדעת לגבי אופן השימוש שלהם הדוגמאות סרום למטרות מדעיות, אלה עם מזוהה כשל חיסוני, אלה כעת על חיסוני או immunomodulatory סוכנים, או אלו נמצא כי טפילי.
  4. ודא שמרשם הטיפול או התרופה ניתנה לפני האוסף סרום כדי למזער הפרעה את ממצאי מעבדה. הדוגמאות סרום שאינם עונים על דרישות הקריטריונים נדחו.

2. ללמוד זרימה ומדידות עניין

הערה: מערכת microfluidic צריך µL 100 של נסיוב לקביעת 19 אלרגנים. דם ורידי (5 מ"ל) נאסף מתוך כל מטופל באמצעות כלי דם ואקום המכיל ג'ל הפרדת. לאחר צריך שתוציאו 10 דקות ב x 1000 גרם, השכבה העליונה נאסף לבדיקה. סרום שאינם בשימוש היה מאוחסן ב- 80 ° c לפני ביצוע בדיקות, הנסיוב נשמר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, היה מנוער עם מערבל מערבולת. חוזרים ונשנים מחזורים ההקפאה-הפשרה היה נמנע.

  1. בעיקר לבדוק את הדוגמאות סרום עבור sIgEs לאלרגנים שלם של Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), לפרוות חתולים (e1), יחסית לקשקשי הכלב (e5), ברמודה גראס (g2), טימותי דשא ( g6), תיקנים (i6) fumigatus אספרגילוס (m3), קנדידה אלביקנס (m5), אמברוסיה (w1), חלבון ביצה (f1), חלב (f2), חיטה (f4), בוטנים (f13), סויה (f14), שקדים (f20), סרטן (f23), שרימפס (f24). עקוב אחר ההוראות שניתנו בסעיף 3.
    הערה: נחישות sIgE נעשה עם IgE הספציפי לאלרגן assay קיט (ראה את הטבלה של חומרים) ומדד על ידי מנתח chemiluminescence.
  2. בחר באופן אקראי 3 דגימות מקרב הדגימות עם סרום מספיק (לפחות 900 µL) למחקר הפארמצבטית. שמירה על כל התנאים ללא שינוי, למדוד את סרה שלושה עבור אלרגן sIgEs מדי יום 9 ימים רצופים (קרי, סך של 100 x 9 = 900 µL של סרום).

3. חצי אוטומציה שהליך הבדיקה של מערכת microfluidic

הערה: 2 מערכת היא השילוב של טכנולוגיית microfluidic אוטומטי microarray חלבון, אור קר ניתוח, ניתוח IgE מקבילים, טכנולוגיית עיבוד תמונה. פרוטוקול הבדיקה מחולק לארבעה חלקים: הכנה של ציוד, טעינה הדגימה, דגירה, מדידה.

  1. הכנת הציוד
    1. הפעל את המחשב ואת הכוח מנתח.
      הערה: מתג ההפעלה הוא בצד השמאל של הבסיס.
    2. הפעלת התוכנית LabIT על המחשב. אם החלון אזהרה מסגרת כהה יצוץ, לחץ על אישור בדיקה הדליפה. לאחר מכן, לחץ על הסמל מרכז להיכנס לממשק מבצע.
      הערה: המערכת יזכיר למשתמש להריץ בדיקת דליפת אם אין פעילות במשך יותר מ 24 שעות.
    3. בדוק את זמני התגובה ואת CCD (תשלום מצמידים מכשיר) Temp בפינה הימנית התחתונה של המסך. זמני התגובה צריך לעלות 37 ° C ± 1 ° C כ- 10 דקות, ולשחרר הזמנית CCD צריך לטאוואנג ± 1 ° C.
    4. הפעל את בדיקת דליפת לאחר הזמנית CCD ירד ל לטאוואנג ± 1 ° C. לפני הפעלת המבחן הדליפה, ודא כי אין פריטים אחרים יישאר בתוך המכשיר ולסגור את הדלת. לחץ על כלים | בדיקת המערכת | בדיקת הדליפה. אל תפתח את הדלת במהלך הבדיקה. עם סיום הבדיקה, חלון דוח יופיע.
  2. טעינה הדגימה
    1. הוסף µL 620 של מאגר לשטוף, µL 120 מאגר חסימה, 60 µL של conjugates A ו- B, µL 60 של המצע A ו- B, ו- µL 100 הדוגמאות סרום למיכל ריאגנט המתאימה שעל מחסנית microfluidic.
  3. אינקובציה של רגשות
    1. לחץ על מזהה מחסנית, להשתמש בסורק ברקוד כדי לסרוק את המספר הסידורי של המחסנית, הזן את המזהה לדוגמה, להכניס את המחסנית במנתח וסגור את הדלת ולאחר לחץ על מנתח , הפעל כדי להתחיל את הניתוח.
  4. מדידה
    1. לייצא את התוצאות לתוכנה סטטיסטית (למשל, Excel) לאחר המדידה.
      הערה: לאחר 30 דקות של דגירה, במנתח באופן אוטומטי מבצע את המדידה ומדווח על התוצאה.
  5. החלפת במנתח
    1. תחזוקה שוטפת, מסיים את המבחן, להסיר את המחסנית, לנגב מנתח את חימום פנימי וברזל אלקטרומגנט בקלילות עם 75% אלכוהול.
      הערה: לא ללחוץ חזק או לנער את האלקטרומגנט.
    2. סגור את חלון LabIT. החלון ניטור טמפרטורה יופיע. היא תיסגר באופן אוטומטי כאשר ה-CCD מחממת למצב הגנה 5 ° C. עד אז, זה יהיה בטוח לבטל את הכוח של מנתח ו PC.
      הערה: לא לסגור באופן ידני את הטמפרטורה ניטור חלון לפני הזמנית CCD עלתה עד 5 מעלות צלזיוס, לא לכבות את מנתח ולא המחשב במהלך החימום CCD.

4. ההגדרה של תגובתיות sIgE

הערה: עבור הדגימה סרום מדולל, הטווח זיהוי של 2 מערכת הוא 0.21 – 100 IU/mL.

  1. בהתבסס על ערך הסף של 0.35 IU/mL, שקול ברמה sIgE העולה על 0.35 IU/mL להיות חיובי6,7. לדרג את תגובתיות של הבדיקות sIgE כ8: מחלקה 1 (≥0.35 ו < 0.70 IU/mL), כיתה 2 (≥0.70 ו < 3.50 IU/mL), מחלקה 3 (≥3.50 ו < 17.50 IU/mL), כיתה 4 (≥17.50 ו < 50.00 IU/mL), מחלקה 5 (≥50.00 ו < 100.00 IU/mL) , מחלקה 6 (≥100.00 IU/mL).

5. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש היסטוגרמה הראה שיעור חיובי של האלרגנים 19 (איור 1) ולהשתמש העקומה Levey-ג'נינגס כדי להדגים את הדיר של זיהוי מערכת (איור 2)9.
  2. בחר אלרגנים נשימתית הנפוץ ביותר שלושה אלרגנים (בסך הכל, אלרגנים 6) ולהשוות את התוצאות אני מערכת 1 כדי להעריך את ביצועי אבחון קליני10,11. כוללים את קצב קונקורדנציה רגישות, ירידה לפרטים, ערכים חיוביים ושליליים חזוי, האזור שמתחת המקלט פועל אופייני (ROC) עקומת (AUC) כקריטריונים להערכה.
  3. החל ספירמן נמצא מיתאם ניתוח12 כדי לתאר מתאמים בין שתי המערכות ולהשתמש קאפה ערך עבור עקביות. לסווג את הערך קאפה כמעט מושלם (0.8-1.0), ניכר (0.6-0.8), בינוני (0.4-0.6), יריד (0.2-0.4) או עני (< 0.2)13. השתמש SPSS 23.0 וניתוח סטטיסטי MedCalc 11.0 ולהגדיר P 0.05 < כמו מובהקות סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחירים חיובי עבור 19 אלרגנים נפוצים
תוצאות סרה 293 מוצגים באיור3. בין כל האלרגנים נשימתית, farinae ד היה שיעור חיובי הגבוה ביותר (80.89%, 273/293), ואחריו ד pteronyssinus (78.84%, 231/293). בין האלרגנים מזון, סרטן יש שיעור חיובי הגבוה ביותר (20.48%, 60/293), ואחריו 13.65% (40/293) שרימפס. שיעור חיובי הכולל עבור אלרגנים נשימתית היה גבוה מזה של אלרגנים.

הדיר של מערכת microfluidic
הדיר תוצאות עבור לפרוות חתולים יחסית לקשקשי הכלב, מקק, מבוססת על תשעה סיבובים של בדיקות, היו 32.98 ± 8.94, 1.61 ± 0.48, ± 0.76 0.18, בהתאמה, רמות עקביות היו 100% (9/9), 100% (9/9), ו- 67% (6/9). הפצה של התוצאות מוצג עם עקומת Levey-ג'נינגס באיור2. כל הנתונים נמצאים בטווח של X ± 2 x SD, אשר עולה בקנה אחד עם המרבי המותר שגיאה קלינית14.

השוואה של שתי מערכות
הממצאים האיכותניים הראו לפרוות חתולים הזה היה את הקונקורדנציה הגבוהה 1 מערכת (95.33%, 243/150). הקונקורדנציה הנמוך נראתה שרימפס (40.75%, 88/216). קונקורדנציה הכולל בין אלרגנים נשימתית נע בין 92.00% ל- 95.33%. עבור מזון אלרגנים, הטווח הקונקורדנציה הייתה 40.74%-72.39%. הרגישות הגבוהה של חומרים נדיפים נראתה ב- Dermatophagoides farinae (93.94%), עם ירידה לפרטים 100%. בין מזון אלרגנים, הרגישות הגבוהה נראתה בבוטנים (54.55%), עם יחודיות של 80.65%. בטבלה 2 מראה גם כי כל התוצאות הערכה עבור אלרגנים ממסים נדיפים היו נעלה אלרגנים. כיוון שהערכים חאן אל הראה טווח של 0.613 0.984 חאן אל האלרגנים נשימתית שלוש היה גדול יותר 0.950, ניתן להסיק שמקדם 2 מערכת שיש רמת דיוק גבוהה ביחס מערכת 1.

עקביות ניתוח של שתי המערכות הראה כי הערכים קאפה שלושה חומרים נדיפים היו בין 0.727 – 0.876, עם הערך הגבוה ביותר אצל לפרוות חתולים כמו 0.876 (95% CI, 0.786 – 0.965). הם היו כל טוב יותר. מאשר הערכים kappa עבור אלרגנים אשר, באופן כללי, נפל < 0.400. הערך קאפה הנמוך ביותר היה 0.112 שרימפס (95% CI, 0.062 – 0.162) (טבלה 3). ניתוח מתאם ספירמן נמצא הראה כי המתאם הטוב נראה בהבוטנים והחתול קשקשים, עם מקדמי המתאם כמו r = 0.942 (95% CI, 0.907 – 0.965; p < 0.0001) ו- r = 0.927 (95% CI, 0.900 – 0.947; p < 0.0001), בהתאמה.

איור 3, נבנה מגרש פיזור עם התוצאות של מערכת 2 לאורך ה- x-הציר והן לאורך yשל מערכת 1-ציר להראות חלוקת sIgE ריכוז תוצאות של שתי המערכות pteronyssinus ד, ד פארינה, חתול קשקשים, חלב, שרימפס, בוטנים. קונקורדנציה וניתוח הכתבים, האלרגנים הראה הבדלי המעמדות ± 1 היו ד pteronyssinus (91.60%, 229 לעומת 250), farinae ד (81.25%, 91 לעומת 112), לפרוות חתולים (98.00%, 147 לעומת 150), חלב (83.58%, 112 לעומת 134), שרימפס (59.72%, 129 לעומת 216), ולא בוטנים (76.56%, 49 לעומת 64). הקצב קונקורדנציה משולב הכולל היה 81.75% (757 לעומת 926).

Figure 1
איור 1: שיעור חיוביות של הגילוי של אלרגנים נפוצים 19 מאת וזמינותו microfluidic. d1 - Dermatophagoides pteronyssinus, d2 - Dermatophagoides farinae, d201 - Blomia tropicalis, e1 - לפרוות חתולים, e5 - יחסית לקשקשי הכלב, g2 - ברמודה גראס, g6 - טימותי דשא, i6 - ג ' וקים, m5 m3 - אספרגילוס fumigatus, - קנדידה אלביקנס, w1 - הפריחה, f1 - חלבון ביצה, f2 - חלב, f4 - חיטה, f13 - בוטן, f14 - סויה, f20 - שקדים, f23 - סרטן, ו- f24 - שרימפס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Levey-ג'נינגס גרפים של האלרגנים שלוש שוב ושוב זוהה על ידי מערכת microfluidic. (א) שיער החתול שיער הכלב (B), (ג) מקק נבחרו להערכה הדיר. השחור, ירוק, צהוב ואדום קווים מייצגים הממוצע (X), זאת אומרת ± סטיית התקן (X ± SD), הממוצע + סטיית פעמים שני (X ± 2SD), ו הממוצע + פעמים סטיית תקן של שלושה (X ± 3SD) של מדידות מרובות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פיזור החלקות של שישה ריכוזים sIgE של אלרגן, נמדדת מערכת 1. מערכת 1 (Y-ציר) ועל מערכת 2 (X-ציר). כל קו העלילה מייצג את המכנסונים מחלקה (מחלקה 0: 0.35, כיתה 1: 0.35 – 0.7, כיתה 2: 0.7 – 3.5, מחלקה 3: 3.5 – 17.5, כיתה 4: 17.5 – 50, מחלקה 5:50 – 100, ו- class 6: > 100 IU/mL). תיבות מוצל הם אזורים concordant בכיתה ריכוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מאפיין No.(%)
מין, n(%)
נקבה 123(41.98%)
זכר 170(58.02%)
גיל, שנה, n(%)
חציון (25%, 75%) 23(8,36)
≤10 97(33.11%)
11-20 37(12.63%)
21-40 101(34.47%)
> 41 58(19.80%)
אבחון, n(%)
קדחת השחת 92(31.40%)
אסטמה אלרגית 117(39.93%)
דלקת אלרגית עם אסטמה 36(12.29%)
אחרים 48(16.38%)

טבלה 1: תכונות דמוגרפיות החולה. בסך הכל, נמצאו 293 נושאים אשר הגשים את הקריטריונים הכללה, ועם גיל חציון של 23 (בין רבעוני נע בין 8 ל בת 36). בין אותם, 170 (58.02%) הזכר אדיב 123 (41.98%) היו נשים. כמו כן, 92 (31.40%) אחד מהם היה דלקת אלרגית, 117 (39.93%) היה אסטמה אלרגית, 36 (12.29%) הייתה תחלואה נלווית של דלקת אסטמה ו 48 (16.38%) היו מחלות אלרגיות אחרות כגון אלרגיה למזון או אלרגיות בעור.

גודל המדגם כובע + כובע- דעים SE SP שלם וצפה NPV חאן אל (95%, CI)
BioIC + BioIC- BioIC + BioIC-
d1 250 196 20 0 34 92.00% 90.74% 100.00% 100.00% 62.96% 0.975 (0.947 אל-0.991)
d2 112 93 6 0 13 94.64% 93.94% 100.00% 100.00% 68.42% 0.984 (0.941 כדי 0.999)
e1 150 34 5 2 109 95.33% 87.18% 98.20% 94.44% 95.61% 0.968 (0.925 אל-0.990)
f2 134 16 27 10 81 72.39% 37.21% 89.01% 61.54% 75.00% 0.744 (0.661 אל-0.815)
f13 64 18 15 6 25 67.19% 54.55% 80.65% 75.00% 62.50% 0.731 (0.606 אל-0.834)
f24 216 36 127 1 52 40.74% 22.09% 98.11% 97.30% 29.05% 0.613 (0.545 כדי 0.678)
d1-Der. p1, d2-Der. f1, לפרוות חתולים-e1, f2-חלב, f13-בוטנים, f24-שרימפס. קאפ-ImmunoCAP, +-חיובית, –-שלילי, SE-רגישות, SP-ירידה לפרטים, ערך ניבוי חיובי PPV, ערך ניבוי שלילי NPV, חאן אל-אזור תחת עקומת ROC. חאן אל ערכים, הערך מרווח 95% (95%, CI) מוצג גם בטבלה.

בטבלה 2: ביצועים קליניים בין שתי המערכות. d1 - pteronyssinus ד, d2 - פארינה ד, e1 - לפרוות חתולים, f2 - חלב, f13 - בוטן, ו- f24 - שרימפס. קאפ - ImmunoCAP, + - חיובי – - שלילי, SE - רגישות, SP - ירידה לפרטים, PPV - ערך ניבוי חיובי, NPV - שלילי ערך ניבוי, חאן אל - תחת עקומת ROC. חאן אל הערכים, ערך המרווח 95% (95%, CI) מוצג גם בטבלה.

Kappa(95%,CI) Spearman'rho(95%,CI)
d1 0.727 (0.617 אל-0.838) 0.896 (0.869 אל-0.918)
d2 0.783 (0.617 כדי 0.948) 0.731 (0.631 אל-0.807)
e1 0.876 (0.786 כדי 0.965) 0.927 (0.900 אל-0.947)
f2 0.293 (0.122 אל-0.463) 0.681 (0.579 כדי 0.763)
f13 0.349 (0.129 כדי 0.569) 0.969 (0.949 כדי 0.981)
f24 0.112 (0.062 כדי 0.162) 0.833 (0.788 אל-0.870)

טבלה 3: המתאם והסכמה בין שתי המערכות. d1 - pteronyssinus ד, d2 - פארינה ד, e1 - לפרוות חתולים, f2 - חלב, f13 - בוטן, ו- f24 - שרימפס. קאפה וערכים Rho של ספירמן, ערך המרווח 95% (95%, CI) גם מוצג בטבלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דומה התוצאות ממחקרים רבים אחרים15,16,17, התוצאות של המערכת microfluidic מבוסס על שרה מ-293 מטופלים אלרגית, הראה את הבית אבק קרדית (כולל pteronyssinus ד, ד farinae, ו tropicalis דרב) הם האלרגנים נשימתית הראשי המוביל למחלות אלרגיות בדרום סין, ואילו עבור מזון, חלב, בוטן, חסילונים, סרטנים הם האלרגנים הכי שכיח לגרום תסמיני האלרגיה. לגבי המחקר הפארמצבטית על שלושה אלרגנים, כולן הראו תוצאות טובות, עם שיעור החזרה הכללית של 88.89%, מה שאומר שזה פגש את השגיאה המרבי המותר.

המחקר הנוכחי באמצעות מערכת 1 התייחסות, הערכת יעילות אבחון קליני של 2 מערכת. עם רמה sIgE סרום של 0.35 IU/mL הקיצוץ2, דגימה עם sIgE > 0.35 IU / mL מרמז כי המטופל הוא רגיש לאלרגן, גבוה יותר את כייל נוגדנים, מתאם טוב יותר הסימפטומים של החולה18. התוצאות הראה כי שיעור קונקורדנציה של האלרגנים נשימתית שלושה היו הכל למעלה מ-90%. בנוסף התוצאות עבור מזון אלרגנים, שהיו קונקורדנציה של ~40.74%-72.39%, הקונקורדנציה הכולל היה 81.75% (757/926). הערך קאפה pteronyssinus ד, ד farinaואת לפרוות חתולים היו 0.778, 0.663 ו- 0.860 (p < 0.001), בהתאמה. הערכים kappa עבור מזון אלרגנים היו הכל מתחת 0.4. כדי להפוך את שלוש שאיפה גדולה אלרגנים, מובהק של תוצאות כמותיות נראתה בין שתי המערכות (rספירמן ≈ 0.681-0.969, p < 0.01).

זה היה שם לב כי בעוד המקדם rS בוטנים היה 0.969, הערך קאפה של מדד הערכה עקביות היה רק 0.349 (95% CI, 0.129-0.569). פער כזה יכול להיות בשל השכיחות הנמוכה של בוטנים רגישות באזור, לפיכך, רוב sera מגויסים יצאו שליליות IgE הספציפי הזה. מחקרים רבים הראו כי ניתן לראות פער משמעותי בין sIgE כייל סימפטומים קליניים אלרגנים. השימוש במערכות assay שונים לקביעת IgE ספציפי מזון יכול גם ליצור וריאציות גדול19. ייתכן שהדבר נובע מהעובדה שזה לא האוכל בלע הגולמיים אשר מפעיל את תסמיני האלרגיה, אבל הרכיבים ששונה שנוצרו במהלך הבישול או עיכול. השימוש של חומרי גלם שונים על ידי יצרנים שונים כדי להפוך את האלרגנים יכול לתרום גם הפער תוצאה20.

הדיו microfluidic מורכב חמישה חלקים עיקריים: מיכלי אחסון 5 חמישה ערוצים משלוח ריאגנט, משאבות חד כיווני חמש, אזור תגובה אחת בלאיזה אלרגן תמציות יכול להיות מרותק למיטה, מיכל פסולת כדי לאסוף את כל חלקי פנים התגובה. מבוסס על הצורך assay, עד 40 אלרגן תמציות יכול להיות מנוקד על אזור תגובה. נשלט על ידי ה-PC, משאבות חד כיווני חמש מדריך לתיאום זרימת דגימת נסיוב, מאגר כביסה, ריאגנט חסימה, conjugates ו מפחית, לסיים assay מקושרים-אנזים immunosorbent של שני שלבים. לאחר השלמת התגובה, הדימויים התגובה chemiluminescence נלכדים ע י מצלמת CCD ברזולוציה נמוכה מקורר, האותות מעובדים על ידי ה-PC להקים את עקומת כיול וכדי לחשב תוצאות sIgE כמותית, semiquantitative.

המחקר הנוכחי מראה כי שתי המערכות להוכיח עקביות טוב. עם זאת, בהשוואה של מערכת 1, 2 מערכת קל לשימוש ויש לו ביקוש נמוך יותר עבור אופרטור הדרכה. מאז בכל מחסנית microfluidic יש עקומת בקרת איכות משלו, האמינות של המערכת הוא שיפור משמעותי. יתרונות נוספים של המערכת כוללים אור, שטח רצפה קטן, התקנה מודולרית להרחבה הקלות שבה הוא מחובר מחשב עבור פעולת הבקרה. כל היתרונות הללו לצמצם במידה ניכרת את ההתקנה והעלות פועל, באותו הזמן, הם לא תסכן את דרישות הדיוק ומהירות הקלינית מדי יום, מה שהופך את המערכת מתאימה במיוחד אלרגיה הקרנה בבתי חולים טיפול ראשוני בסין. בכל זאת, אחד החיסרון העיקרי של המערכת microfluidic היא כי זו לא מערכת אוטומטית לחלוטין, יש צורך בהתערבות בתדירות גבוהה במהלך המבצע. זה עדיין לא ניתן להחליף את מערכות צריך לעבד מספר גדול של דוגמאות מדי יום.

בגלל העדר מספיק סרה חיובי עבור אלרגנים מסוימים, מחקר זה כיסו כל האלרגנים 19 זמין הדיו microfluidic, אבל רק שישה הנפוצות ביותר הזמינים בדרום סין. מחקר נוסף יש צורך לפרט אם ההערכה הוא גם ישים אלרגנים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה פרופסור ג'יאנג מיי על העזרה ניתוח סטטיסטי, מר פטיש צוי באופן ההכנה של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המדע גואנגג'ואו, טכנולוגיית קרן (201804020043) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC 81572063, NSFC 81802076). מימון קבוצות הסכימו עם תכנון המחקר, ניתוח נתונים, הכנת כתב היד, ההחלטה לפרסם. אין מימון אחרים התקבלה במחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agnitio BioIC Analyzer Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) T20SET
BioIC Reagent Dispenser Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) DS-1
Image two-dimensional barcode machine Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) NLS-HR200
Software Package, LabIT Agnitio Science & Technology(Taiwan, China) Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd. VORTEX-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46, (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53, (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121, (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9, (5), e94776 (2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25, (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78, (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74, (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14, (1), 145 (2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327, (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22, (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37, (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38, (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66, (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72, (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64, (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32, (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100, (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108, (1), 82-88 (1995).
יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).More

Huang, Z., Luo, W., Zou, X., Liu, X., Cai, C., Wu, Z., Hu, H., Sun, B. Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE). J. Vis. Exp. (146), e59100, doi:10.3791/59100 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter