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Cancer Research

कैसरजन के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग मूल्यांकन-प्रेरित म्यूरिन मूत्राशय ट्यूमर

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59101
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Surgery, Division of Urology, NorthShore University HealthSystem, 2Department of Radiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

म्यूरीन ब्लैडर ट्यूमर एन-ब्यूटिल-एन-(4-हाइड्रोक्सीब्यूटिल) नाइट्रीसामीन कैसरजन (BBN) के साथ प्रेरित हैं । मूत्राशय ट्यूमर पीढ़ी विषमजातीय है; इसलिए, ट्यूमर के बोझ का सही मूल्यांकन प्रयोगात्मक उपचार के लिए randomization से पहले की जरूरत है । यहां हम ट्यूमर आकार और चरण का आकलन करने के लिए एक तेजी से, विश्वसनीय एमआरआई प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

म्यूरिन ब्लैडर ट्यूमर मॉडल नए चिकित्सीय विकल्पों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं । मूत्राशय ट्यूमर एन butyl-n के साथ प्रेरित (4-hydroxybutyl) नाइट्रोसामीन (bbn) कैसरजन सेल लाइन आधारित मॉडल पर लाभप्रद है क्योंकि वे बारीकी से मानव ट्यूमर के जीनोमिक प्रोफाइल को दोहराने, और, सेल मॉडल और xenografts के विपरीत, वे प्रदान एक इम्युनिथेरापिओं के अध्ययन के लिए अच्छा अवसर. हालांकि, मूत्राशय ट्यूमर पीढ़ी विषमजातीय है; इसलिए, ट्यूमर के बोझ का सही मूल्यांकन प्रयोगात्मक उपचार के लिए randomization से पहले की जरूरत है । यहां वर्णित एक BBN माउस मॉडल और प्रोटोकॉल को vivo में मूत्राशय कैंसर ट्यूमर बोझ का मूल्यांकन एक तेज और विश्वसनीय चुंबकीय अनुनाद (MR) अनुक्रम (सच fisp) का उपयोग कर रहा है । इस विधि सरल और विश्वसनीय है, क्योंकि, अल्ट्रासाउंड के विपरीत, श्री ऑपरेटर स्वतंत्र है और सीधी के बाद अधिग्रहण छवि प्रसंस्करण और समीक्षा के लिए अनुमति देता है । मूत्राशय, मूत्राशय की दीवार और ट्यूमर के साथ ब्याज के क्षेत्रों के विश्लेषण के अक्षीय छवियों का उपयोग मूत्राशय की दीवार और ट्यूमर क्षेत्र की गणना के लिए अनुमति देते हैं । यह माप पूर्व vivo मूत्राशय वजन (आरएस= ०.३७, पी = ०.००९) और ट्यूमर चरण (पी = ०.०००३) के साथ संबद्ध है । अंत में, BBN विषम ट्यूमर है कि immunotherapies के मूल्यांकन के लिए आदर्श होते है उत्पंन करता है, और एमआरआई जल्दी और मज़बूती से ट्यूमर के बोझ का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक उपचार शस्त्र randomization से पहले कर सकते हैं ।

Introduction

मूत्राशय कैंसर के पांचवें सबसे आम कैंसर समग्र, लगभग ८०,००० नए मामलों और संयुक्त राज्य अमेरिका में २०१७1में १६,००० मौतों के लिए जिंमेदार है । के बारे में 30 मूत्राशय कैंसर2के प्रणालीगत उपचार में महत्वपूर्ण प्रगति के बिना साल के बाद, हाल ही में विरोधी पीडी-1 और विरोधी पीडी-L1 चेकपॉइंट अवरोध करनेवाला परीक्षण उंनत के साथ रोगियों में रोमांचक और कभी टिकाऊ प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया है urothelial कार्सिनोमा3,4,5. हालांकि, रोगियों के केवल लगभग 20% इन उपचार के लिए एक उद्देश्य प्रतिक्रिया दिखाने के लिए, और आगे के अध्ययन मूत्राशय कैंसर के साथ रोगियों में immunotherapy के प्रभावी उपयोग का विस्तार करने की जरूरत है ।

म्यूरिन ब्लैडर कैंसर मॉडल उपन्यास उपचार के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में महत्वपूर्ण उपकरण हैं6,7. आदेश में ट्यूमर के आकार के लिए नियंत्रित करने के लिए जब अलग उपचार के लिए चूहों randomizing, ट्यूमर बोझ और मूल्यांकन किया जाना चाहिए उपचार समूहों के बीच नियंत्रित । पिछले अध्ययनों में अल्ट्रासाउंड या bioluminescence का इस्तेमाल किया है orthotopic सेल लाइन आधारित मूत्राशय कैंसर मॉडल8,9,10,11का मूल्यांकन । हालांकि, दोनों तकनीकों के कई नुकसान मौजूद हैं । अल्ट्रासाउंड माप ऑपरेटर के कौशल से प्रभावित किया जा सकता है और तीन आयामी सुविधाओं और उच्च स्थानिक संकल्प की कमी है । Bioluminescence तरीकों केवल अर्द्ध ट्यूमर कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान कर सकते है और मूत्राशय शरीर रचना विज्ञान और morphology के दृश्य के लिए अनुमति नहीं है । इसके अलावा, bioluminescence केवल सेल लाइन आधारित मॉडल है, जो सफेद कोट के साथ गंजा चूहों या चूहों में बायोल्युमिनेसेंट जीन एक्सप्रेस के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), दूसरी ओर, उच्च संकल्प संरचनात्मक छवियों के अधिग्रहण में अद्वितीय लचीलापन प्रदान करता है, ऊतक इसके विपरीत है कि सटीक दृश्य और ट्यूमर के बोझ के मात्रात्मक मूल्यांकन में सक्षम बनाता है की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन बिना बायोलमिनिसेंट गुण व्यक्त करने की जरूरत है. श्री छवियों को और अधिक आसानी से उपयुक्त विश्लेषण पाइपलाइनों और गारंटी 3 मूत्राशय के डी दृश्य के साथ reproducible हैं । एमआरआई की सबसे बड़ी सीमाओं एक परीक्षा के लिए आवश्यक समय की लंबाई और उच्च थ्रपुट assays सीमा है कि संबंधित उच्च लागत हैं । हालांकि, कई अध्ययनों से पता चला है कि श्री दृश्यों को प्रभावी ढंग से पता लगाने और सेल लाइन आधारित मूत्राशय ट्यूमर की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उच्च गुणवत्ता वाले नैदानिक छवियों प्रदान कर सकते हैं; इस प्रकार, वे उच्च थ्रपुट विश्लेषण9,12के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहां, हम एक गैर इनवेसिव श्री आधारित विधि का वर्णन करने के लिए मज़बूती से और कुशलता से चूहों में carcinogen प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर की विशेषता । यह पूरा करने के लिए, हम स्थिर राज्य अयन श्री तकनीक (सच FISP), जो कम स्कैनिंग सत्र की गारंटी देता है, जबकि अभी भी उच्च गुणवत्ता और उच्च स्थानिक संकल्प (~ १०० microns) का पता लगाने और मूत्राशय की माप के लिए प्रदान करने के साथ एक तेजी से इमेजिंग का उपयोग ट्यूमर13। इसके अलावा, इस गैर इनवेसिव एमआरआई परख की सटीकता की पुष्टि करने के लिए, हम एमआरआई के बीच संबंध का वर्णन-व्युत्पन्न मापदंडों और पूर्व वीवो मूत्राशय वजन के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोगविज्ञान की पुष्टि की ट्यूमर चरण.

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Protocol

यहां बताई गई सभी विधियों को नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमिटी (IACUC) ने मंजूरी दे दी है ।

1. BBN के साथ ट्यूमर के प्रेरण

  1. पुरुष C57/BL6 चूहों को प्राप्त करें, प्रत्येक में कम से 6 सप्ताह पुराने ।
    नोट: पुरुष चूहों और अधिक जल्दी और लगातार महिला चूहों14,15की तुलना में मूत्राशय के कैंसर का विकास ।
  2. पीने के पानी के लिए ०.०५% की एक खुराक पर एन नाइटेसोब्यूटाइल (4-hydroxybutyl) amine (BBN) जोड़ें । यह एक अपारदर्शी कंटेनर में स्टोर और यह16चूहों को पीने के पानी के रूप में विज्ञापन libitum प्रदान करते हैं ।
    नोट: एक स्पष्ट कंटेनर में bbn समाधान भंडारण17कैसरजन नीचा दिखाना होगा ।
  3. ०.०५% BBN पानी प्रति सप्ताह दो बार बदलें ।
  4. रक्तमेह, फर्म मूत्राशय, और आम जनता सहित मूत्राशय ट्यूमर के साथ जुड़े संकट के संकेत के लिए निरीक्षण करके जानवरों की निगरानी । प्रति सप्ताह दो बार या स्थानीय IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों का निरीक्षण करें ।
  5. ट्यूमर की अपेक्षा 16 और 24 जोखिम के सप्ताह के बीच विकसित करने के लिए18।

2. एमआरआई सेटअप

  1. मूत्राशय भरने की सुविधा के लिए एमआरआई करने से पहले बाँझ खारा (0.1 – 0.2 मिलीलीटर एक 25-27 ग्राम सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज) 10 मिनट का उपयोग कर के एक उपचर्म इंजेक्शन प्रदर्शन ।
  2. Anesthetize प्रत्येक माउस एक गैस मिश्रण के साथ १००% O2 और isoflurane (2% – 4% के रूप में आवश्यक). आगे बढ़ने से पहले वापसी पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) परीक्षण द्वारा बेहोशी की एक पर्याप्त विमान की जाँच करें । पशु के लिए बाँझ आँख मरहम लागू करें ।
  3. (0.5%-3%) साँस की आइसोफ्लूराने के वितरण के लिए एक nosecone के साथ outfitted इमेजिंग धारक के लिए माउस स्थानांतरण ।
  4. शरीर के तापमान और श्वसन शारीरिक रिकॉर्डिंग कंप्यूटर से जुड़े एक मलाशय तापमान जांच का उपयोग कर मॉनिटर.
    नोट: सामान्य शरीर का तापमान (36-37 डिग्री सेल्सियस) पशु श्री धारक में निर्मित recirculating गर्म पानी सर्किट का उपयोग कर बनाए रखा है । तापमान एक मलाशय संवेदक के माध्यम से मापा जाता है और समर्पित शारीरिक निगरानी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर शारीरिक निगरानी कंप्यूटर पर दर्ज की गई है । इसी प्रणाली के लिए श्वसन और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम संकेत एक वायवीय रिब पिंजरे के नीचे रखा तकिया के माध्यम से मापा और 3-सीसा इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम इलेक्ट्रोड के माध्यम से रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । श्वसन संकेत भी एमआरआई अधिग्रहण को ट्रिगर और श्वसन गति के साथ जुड़े कलाकृतियों को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

3. एमआरआई छवि अधिग्रहण

  1. उत्तेजन के लिए एक चौकोर शरीर का तार का उपयोग ।
  2. माउस के निचले पेट पर एक 4 चैनल रिसीवर कुंडल प्लेस ब्याज के क्षेत्र से संकेतों का पता लगाने अनुकूलित सक्षम करने के लिए स्कैन किया जा रहा है ।
  3. एकीकृत इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से स्वत: समायोजन आरंभ करने के लिए पूरे माउस शरीर की छवियों का एक त्रि-अक्षीय सेट प्राप्त । छवियों के इस संदर्भ सेट से, ब्याज के क्षेत्र की पहचान (इस मामले में, मूत्राशय क्षेत्र) ।
  4. संदर्भ के रेडियोलॉजिकल फ्रेम का उपयोग कर अक्षीय, कोरोनल, और समस्तल विमानों के साथ लांबिक-कटा हुआ छवियों के तीन सेट प्राप्त करें ।
  5. सच FISP इमेजिंग अनुक्रम का उपयोग (एकीकृत इमेजिंग सॉफ्टवेयर में सुविधाओं में से एक के रूप में शामिल) निंनलिखित श्री मापदंडों के साथ: TR = ९०० msec, ते = 2 एमएस, एफए = ७०, 14 औसत ।
    नोट: पैरामीटर का यह सेट उच्च नैदानिक गुणवत्ता के साथ तेजी से इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, सहित T1/T2 भार < में 10 मिनट प्रति माउस.
  6. स्थानिक संकल्प और स्लाइस मोटाई एकीकृत इमेजिंग मंच के ग्राफिकल इंटरफेस के माध्यम से उपयोगकर्ता द्वारा चयनित ज्यामितीय मापदंडों द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । यह ०.१४८ मिमी के एक में विमान संकल्प के साथ ०.५ मिमी मोटाई के पूरे मूत्राशय भर में स्लाइस की एक श्रृंखला में परिणाम है ।

4. श्री छवि विश्लेषण

  1. ०.५ मिमी मोटाई के स्लाइस के सेट की पहचान और ०.१४८ मिमी के विमान संकल्प पूरे मूत्राशय को कवर ।
  2. प्रारूप का विश्लेषण में इसी छवियों के साथ फ़ोल्डर का चयन करके चिकित्सा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर करने के लिए निर्यात.
  3. का चयन करें "प्रतिनिधि अक्षीय दृश्य" मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मूत्राशय के केंद्र में उत्पंन छवियों के माध्यम से स्क्रॉल और मूत्राशय, जो मूत्राशय की दीवार और lumen के दृश्य के लिए अनुमति देता है के मध्यबिंदु पर एक टुकड़ा की पहचान के द्वारा ।
    नोट: केंद्र टुकड़ा सबसे बड़ा व्यास के साथ चुना एक होना चाहिए ।
  4. ध्यान से ब्याज (रॉय) के क्षेत्र को मैंयुअल रूप से मूत्राशय के बाहरी किनारे के आसपास की सीमाओं का पता लगाने से (BLAबाहर) और भीतरी लुमेन (blaमें) मूत्राशय के आसपास ( चित्र 2में योजनाबद्ध और प्रतिनिधि आंकड़े देखें) चयनित प्रतिनिधि अक्षीय दृश्य में ।
  5. मूत्राशय की दीवार के सतह क्षेत्र की गणना करने के लिए बाहरी छोर से भीतरी लुमेन को घटाना ।
    blaवॉल = blaबाहर -blaमें
    नोट: कोई ट्यूमर के साथ एक नियंत्रण मूत्राशय की सतह क्षेत्र एक मूत्राशय ट्यूमर के साथ कि तुलना में कम होने की उंमीद है ।

5. इच्छामृत्यु और मूत्राशय का विच्छेदन

  1. BBN जोखिम के 20 सप्ताह के बाद, स्थानीय IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं का उपयोग चूहों euthanize ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ चीरा के क्षेत्र को साफ, तो समझ और forceps के साथ पेट की दीवार त्वचा उठा ।
  3. जघन सिंफाइसिस से एक मिडलाइन चीरा करने के लिए असिरूप प्रक्रिया ।
  4. तेजी से, संदंश के साथ लोभी और कैंची के साथ उत्कीर्ण करना द्वारा पेरिटोनियल गुहा को उत्तेजित ।
  5. मूत्राशय की पहचान, जो मिडलाइन निचले पेट में स्थित है ।
  6. पहचान और नाल और उदर दीवार के लिए मूत्राशय के गुंबद को जोड़ने के मध्य नाल स्नायु में कटौती ।
  7. अवकर्षण प्रदान करने के लिए संदंश के साथ मूत्राशय के गुंबद को समझना और मूत्राशय को आस-पास की संरचनाओं से दूर काटना, जिसमें लाभदायक पीप, मलाशय और वसा शामिल हैं ।
  8. मूत्राशय में प्रवेश मूत्रल की पहचान और कैंची के साथ कट मूत्राशय के करीब ।
  9. मूत्राशय सेपहलाद को उठाना, मूत्रमार्ग को कैंची से काटना और मूत्राशय को हटाना.
  10. तुरंत यह पीबीएस के साथ rinsing के बाद मूत्राशय वजन ।

6. मूत्राशय ऊतक की हिस्टलॉजिक परीक्षा

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 36-48 एच के लिए 10% तटस्थ buffered फार्मेलिन में मूत्राशय के ऊतकों को ठीक करें ।
  2. पैराफिन ब्लॉकों में ऊतक एंबेड, बाद की परीक्षा के लिए स्लाइड में कटौती, और hematoxylin के साथ स्लाइड दाग और सूक्ष्म परीक्षा के लिए eosin पहले19,20के रूप में वर्णित है ।
  3. कम (2.5 x और 10x) और उच्च (20x और 40x) भव्यता में माउस मूत्राशय की एक सूक्ष्म परीक्षा प्रदर्शन, स्थूल घावों के लिए जांच, hyperplasia, स्वस्थानी मेंकार्सिनोमा, papillomas, पैलरी ट्यूमर, और इनवेसिव अर्बुद19 , 21.

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Representative Results

प्रोटोकॉल का उपयोग कर वर्णित (चित्रा 1), मूत्राशय ट्यूमर C57 में प्रेरित किया गया/ एमआरआई 16 सप्ताह में प्रदर्शन किया गया था, और चूहों 20 सप्ताह में euthanized थे । Ex vivo मूत्राशय वजन (BW) प्रत्येक माउस के लिए दर्ज किए गए । स्लाइड hematoxylin और eosin के साथ दाग थे, और सभी ऊतक विज्ञान स्लाइड ट्यूमर चरण के लिए समीक्षा की गई ।

श्री का उपयोग कर ट्यूमर बोझ का विश्लेषण करने के लिए, मूत्राशय दीवार इनर लुमेन (BLAमें) मूत्राशय की दीवार बाहरी लुमेन (blaबाहर) से घटाया गया था मूत्राशय की दीवार की मोटाई की गणना (Blaदीवार) (चित्रा 2) । प्रतिनिधि सच FISP श्री छवियां, मूत्राशय की दीवार 3 डी reconstructions, और एक नियंत्रण माउस के रोगविज्ञान छवियों (यानी, कोई ट्यूमर) चित्रा 3A-F में दिखाए जाते हैं, और एक बड़े ट्यूमर के साथ एक माउस चित्रा 3 जीमें दिखाया गया हैएल।

एमआरआई-व्युत्पन्न पैरामीटर BLAदीवार पूर्व vivo BW के साथ कमजोर रूप से संबद्ध (आरएस = ०.३७, पी = ०.००९; चित्रा 4). एमआरआई की परीक्षा-बीएलएदीवार पैरामीटर और BW डेटा ट्यूमर चरण के साथ एक संबद्धता दर्शाता है (Kruskal-वालिस परीक्षण एमआरआई पी = ०.०००३, चित्रा 5a; BW p = ०.०००६; चित्रा 5B), साथ ही साथ एक संघ जब गैर द्वारा विकृति-मांसपेशी आक्रामक मूत्राशय कैंसर और मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (मान-Whitney U परीक्षण एमआरआई पी = ०.०००२, चित्रा 5b; BW p < ०.०००१, चित्र 5d) । बीएलएदीवार और BW के प्रदर्शन के लिए मांसपेशियों का निर्धारण-इनवेसिव ब्लैडर कैंसर चित्रा 5eमें दिखाया गया है । बीएलएवॉल (एओसी = ०.८१, ९५% सीआई 0.68-093) के लिए वक्र (एओसी) के अंतर्गत क्षेत्र सांख्यिकीय रूप से बेंजमिन के लिए एओसी के समान है (एओसी = ०.८९, ९५% सीआई 0.80-0.98; पी = ०.३०) ।

Figure 1
चित्रा 1: BBN और एमआरआई और इच्छामृत्यु के समय के साथ मूत्राशय ट्यूमर प्रेरण के लिए स्कीमा । BBN पीने के पानी में ०.०५% की एकाग्रता पर विज्ञापन libitum प्रशासित किया जाता है । चूहों 16 सप्ताह में एमआरआई से गुजरना । चूहों 20 सप्ताह में euthanized रहे है और प्रत्येक के मूत्राशय immunohistochemistry के साथ की जांच कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विधि की योजनाबद्ध चित्रमय चित्रण BLAदीवार और इसी रूपरेखा के साथ प्रतिनिधि श्री छवि प्राप्त करने के लिए । एमआरआई छवियों की तीव्रता का उपयोग कर, एक मूत्राशय की बाहरी दीवार की पहचान की गई थी और एक रूपरेखा लाल (BLAआउट) में खींचा गया था । hyperइंटेंस मूत्राशय लुमेन हरे रंग में उल्लिखित (BLAमें) था, और इसी मूत्राशय लुमेन क्षेत्र प्राप्त किया गया था । इन दो मात्राओं का घटाव बीएलएदीवार पैरामीटर, जो ग्राफिकल छवि में प्रकाश ग्रे डिस्क से मेल खाती है उपज । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि सच FISP श्री छवियां, मूत्राशय की दीवार 3 डी reconstructions, और एक नियंत्रण माउस (यानी, कोई ट्यूमर) (ए-एफ) और एक बड़े ट्यूमर (जी एल) के साथ एक माउस के पैथोलॉजिक छवियों । (क) कोई ट्यूमर के साथ एक माउस के प्रतिनिधि श्री छवि । (ख) मूत्राशय दीवार क्षेत्र (बीएलएदीवार) के विभाजन, लाल रंग में उल्लिखित, मूत्राशय लुमेन (blaमें) और बाहरी मूत्राशय की दीवार (बीएलए) केबीच क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया । (ग) एक नियंत्रण माउस से मूत्राशय की दीवार के 3-डी प्रतिपादन, मूत्राशय के माध्यम से हर स्लाइस में BLAदीवार परिभाषित द्वारा उत्पंन । हरे तीर 3-डी प्रतिपादन करने के लिए अनुवादित 2-डी छवि पर मूत्राशय वर्णन । (घ) एक नियंत्रण माउस से बीएलएदीवार के एक कट-आउट का 3-डी प्रतिपादन । (ङ) कम शक्ति (2.5 x) और (च) उच्च शक्ति (10x) एक ही माउस मूत्राशय की छवियां । (छ) एक बड़े ट्यूमर के साथ एक चूहे की प्रतिनिधि श्री छवि । (ज) मूत्राशय दीवार क्षेत्र (बीएलएदीवार) के विभाजन, लाल रंग में उल्लिखित, मूत्राशय लुमेन के बीच क्षेत्र के रूप में परिभाषित (blaमें) और बाहरी मूत्राशय की दीवार (बीएलएआउट) । (I) एक बड़े ट्यूमर के साथ एक चूहे की मूत्राशय की दीवार के 3-डी प्रतिपादन । (ञ) एक बड़े ट्यूमर के साथ एक चूहे के मूत्राशय के एक कट-आउट का प्रतिपादन, ब्लैडर के माध्यम से हर स्लाइस पर BLAदीवार परिभाषित द्वारा उत्पंन । हरे तीर 3-डी प्रतिपादन करने के लिए अनुवादित 2-डी छवि पर मूत्राशय वर्णन । (K) कम शक्ति (2.5 x) और (एल) उच्च शक्ति (10x) एक ही माउस मूत्राशय की छवियां । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एमआरआई के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध-BLAदीवार और अंतिम मूत्राशय वजन व्युत्पंन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:४७ चूहों में रोगविज्ञान चरण और एमआरआई से व्युत्पन्न पैरामीटर BLAदीवार की तुलना. (क) सभी वैकृत अवस्थाओं और एमआरआई बीएलएवाल (क्सकल-वालिस परीक्षण) की तुलना । (ख) सभी वैकृत अवस्थाओं और मूत्राशय भार (क्सकल-वालिस परीक्षण) की तुलना । (ग) गैर-मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (स्टेज ≤ T1) और मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (स्टेज ≥ T2) की तुलना एमआरआई बीएलएवॉल (मान-whitney U test) के साथ करें । (घ) गैर-मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (स्टेज ≤ T1) और मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (स्टेज ≥ T2) की तुलना ब्लैडर वेट (मान-व्हिटनी यू टेस्ट) के साथ करें । (ङ) एमआरआई-व्युत्पन्न मूत्राशय क्षेत्र और मांसपेशी इनवेसिव ब्लैडर कैंसर (स्टेज ≥ टी2) के निर्धारण में अंतिम मूत्राशय भार का रॉक वक्र । सूचीबद्ध p-मान दो AUCs के बीच अंतर है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ट्यूमर मॉडल की सटीक इमेजिंग उचित पूर्व इच्छामृत्यु मचान और पशु randomization के लिए आवश्यक है प्रयोगात्मक उपचार की दीक्षा से पहले । यहां प्रस्तुत की प्रक्रिया का उपयोग करना, हम (1) के लिए पद्धति का प्रदर्शन मूत्राशय का उपयोग कर ट्यूमर bbn कैसरजन और (2) श्री एक श्री के उपयोग के माध्यम से स्तरित होना मूत्राशय ट्यूमर बोझ-व्युत्पन्न क्षेत्र माप (BLAदीवार) के साथ महत्वपूर्ण रूप से संबद्ध पूर्व vivo मूत्राशय वजन और रोगविज्ञान ट्यूमर चरण के साथ जुड़ा हुआ है ।

उच्च स्थानिक संकल्प (सच FISP) और उच्च नैदानिक गुणवत्ता पर लघु अधिग्रहण बार के साथ एक तेजी से इमेजिंग दृष्टिकोण को अपनाने के द्वारा, हम ट्यूमर के विकास के मध्यवर्ती चरणों में चूहों के उच्च थ्र्यूपुट assays का संचालन कर सकते हैं, उपचार randomization से पहले । हमारी रिपोर्ट के श्री इमेजिंग की पूर्व रिपोर्टों के साथ संगत है सेल लाइन के ट्यूमर आधारित9,12 प्रत्यारोपण और एक उपकरण के रूप में अपनी क्षमता की पुष्टि के लिए बड़े विषय संख्या दवा अध्ययन का अनुकूलन ।

इस एमआरआई प्रोटोकॉल में, यह एक पूर्ण मूत्राशय के साथ माउस छवि के लिए महत्वपूर्ण है उच्च गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने और ट्यूमर और मूत्राशय लुमेन के बीच मतभेदों को चित्रित करना । हम पाते है कि नमक के साथ प्रत्येक माउस इंजेक्शन से पहले 10 मिनट इमेजिंग के लिए पर्याप्त इमेजिंग मूत्राशय की अनुमति देता है । इसके अलावा महत्वपूर्ण कदम एमआरआई अधिग्रहण के विश्वसनीय ट्रिगर एक वायवीय माउस रिब पिंजरे और श्री स्लाइस कि पूरे मूत्राशय के कवरेज को सक्षम बनाता है की एक पर्याप्त संख्या के अधिग्रहण के नीचे रखा तकिया के साथ पाया संकेत का उपयोग कर शामिल हैं ।

इमेजिंग विकास और म्यूरिन मूत्राशय ट्यूमर की प्रगति के लिए अंय विकल्प अल्ट्रासाउंड8 और bioluminescence10,11शामिल हैं । प्रत्यारोपित MBT-2 कोशिकाओं के माइक्रो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग 15 चूहों में ट्यूमर का पता चला, 13 जिनमें से histologically8ट्यूमर है की पुष्टि की । अल्ट्रासाउंड मात्रा ट्यूमर के त्रिविम मात्रा के साथ काफी सहसंबद्ध है, लेकिन ट्यूमर वजन और चरण8जांच नहीं की गई । bioluminescence सही सेल लाइन आधारित ट्यूमर प्रत्यारोपण की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह एक माउस से दूसरे करने के लिए carcinogen-व्युत्पंन ट्यूमर रोपाई बिना carcinogen प्रेरित कैंसर पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । सही carcinogen प्रेरित कैंसर की निगरानी करने की क्षमता महत्वपूर्ण है, के रूप में इन मॉडलों सेल लाइन मॉडल पर कई फायदे हैं । सेल लाइन आधारित मॉडल आनुवंशिक रूप से समरूप है और ट्यूमर है कि पहले से ही immunosurveillance चोरी है से व्युत्पंन, और प्रत्यारोपित ट्यूमर एक पुरानी भड़काऊ microenvironment22के बिना तेजी से विकसित । bbn मॉडल सफलतापूर्वक 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह मूत्राशय कैंसर के विकास और उपचार23,24,25की समझ के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहता है । इसके अलावा, bbn मॉडल को दर्शाता है कि उत्परिवर्तीय और जीन अभिव्यक्ति मानव मूत्राशय कैंसर के समान प्रोफाइल, जबकि अभी भी बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली को बनाए रखने के लिए संभावित immunotherचिकित्सीय एजेंटों के अध्ययन के लिए अनुमति26,27 .

कई संस्थानों में साझा संसाधनों के रूप में समर्पित छोटे जानवर MRIs की उपलब्धता इस तकनीक लाभप्रद और बुनियादी अनुसंधान और उपंयास चिकित्सा की स्क्रीनिंग के लिए व्यावहारिक बनाता है । हालांकि, कुछ सीमाएं हैं । चूहों केवल एक timepoint पर imaged थे, ट्यूमर के विकास के दौरान लगातार नहीं । हालांकि, हमारे सांख्यिकीय परिणामों के आधार पर, हम सुझाव है कि एक timepoint मूल्य सही ट्यूमर आकार और मंच से समूहों में चूहों स्तरित होना करने में सक्षम है, और यह एक आदर्श, गैर इनवेसिव पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करने के लिए वर्गीकृत करने और विभिंन समूहों के लिए विषयों आवंटित । कई ट्यूमर चरणों BBN का उपयोग कर उत्पन्न किया गया, टीए से T4 को लेकर. हालांकि, इन स्तरीकृत किया जा सकता है (के रूप में चित्रा 5Cमें सुझाव दिया-डी) के रूप में मांसपेशी इनवेसिव (टी 2 या अधिक) और गैर मांसपेशी आक्रामक (T1 या कम), के रूप में इस मानव मूत्राशय कैंसर में मानक प्रबंधन है28।

एक अंय संभावित सीमा यह है कि बीएलएदीवार पैरामीटर प्रत्येक मूत्राशय और नहीं सभी उपलब्ध स्लाइस इसे कवर के माध्यम से एक टुकड़ा का उपयोग कर व्युत्पंन किया गया । इन मानदंडों के विश्लेषण पाइपलाइन आवश्यकताओं को कम करने के लिए चुना गया (यानी, कई स्लाइस भर में कई ROIs ड्राइंग की आवश्यकता) और एक तेजी से, मात्रात्मक परख के लिए पर्याप्त समझा गया । अधिक जटिल volumetric विश्लेषण विषयों पर आयोजित किया जा सकता है (यानी, चित्रा 3में उदाहरण के प्रयोजनों के लिए दिखाया गया है), लेकिन अनिवार्य रूप से अधिक प्रयास और लागत की आवश्यकता होगी । स्वचालित छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम मूत्राशय क्षेत्र के स्वत: अष्टक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इन तरीकों मूत्राशय आकार और व्यक्तिगत चूहों के बीच आकार के आंतरिक परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है और महत्वपूर्ण परीक्षण और मांयता एक पूर्व नैदानिक अध्ययन29में विश्वसनीय अपनाने से पहले की आवश्यकता है ।

volumetric डेटा के गुणात्मक मूल्यांकन का सुझाव है कि इस एकल टुकड़ा विधि परख के इस प्रकार के लिए पर्याप्त है । हालांकि, यह संभव है कि अधिक उंनत assays इस अतिरिक्त डेटा/छवि संसाधन चरण की आवश्यकता हो सकती है । देखने के अधिग्रहण बिंदु से, वहां कई अतिरिक्त स्कैन कि प्राप्त किया जा सकता है, जो आगे ट्यूमर की प्रगति की भविष्यवाणी करने की क्षमता में वृद्धि कर सकते है जबकि भी अधिक सूक्ष्म ट्यूमर microenvironment परिवर्तन खुलासा । इन अतिरिक्त तकनीकों गतिशील इसके विपरीत बढ़ाया एमआरआई, प्रसार भारित एमआरआई, और अंय30 दृश्यों है कि एक व्यापक, बहु मूत्राशय दीवार के पैरामीट्रिक लक्षण वर्णन सक्षम शामिल हैं । हालांकि, लागत और क्षमता के विचार के लिए हमारे नेतृत्व में एक इस प्रोटोकॉल में वर्णित करने के लिए हमारी परख सीमित ।

अंत में, हम T1/T2-भारित रैपिड इमेजिंग श्री दृश्यों (सच FISP) के लिए पद्धति का वर्णन करने के लिए बहु-टुकड़ा पूरे माउस मूत्राशय को कवर छवियों का अधिग्रहण । हम प्रदर्शित करते है कि इन छवियों को एक carcinogen में ट्यूमर की सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-म्यूरिन ब्लैडर कैंसर के मॉडल पर आधारित है । एमआरआई डेटा मूत्राशय ऊतक वजन के साथ संबंधित है और ट्यूमर चरण के साथ जुड़ा हुआ है । इन परिणामों के इस तेजी से और विश्वसनीय एमआरआई परख के उपयोग के लिए चूहों स्तरित होना प्रयोगात्मक उपचार randomization से पहले समर्थन करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जे. जे. एम. दिग्गजों स्वास्थ्य प्रशासन मेरिट अनुदान BX0033692-01 द्वारा वित्त पोषित है । जे. जे. एम. नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र में जॉन पी Hanson फाउंडेशन कैंसर अनुसंधान के लिए भी समर्थन किया है । हम एमआरआई अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रदान करने के लिए Translational इमेजिंग के लिए केंद्र धंयवाद । धन स्रोत पांडुलिपि या प्रकाशन के लिए प्रस्तुत करने के लिए निर्णय के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 664 Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN) TCI American B0938 Carcinogen
0.9% normal saline Hospira, Inc NDC 0409-488-02
Isoflurane Piramal HealthCare 60307-120-25 Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI Bruker NA Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo Siemens NA MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System Small Animal Instruments, Inc. (SAII) NA Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10% Sigma HT501128 Fixative
Eosin Y Fisher Scientific NC1093844 Histologic staining agent
Hematoxylin Fisher Scientific 23-245651 Histologic staining agent
Jim7 Xinapse Systems NA Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04 Graphpad NA Graphing software
R v3.4.2 The R Project for Statistical Computing NA Statistical software
R package pROC v1.10.0. The R Project for Statistical Computing NA ROC analysis

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
  3. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  4. Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
  5. Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
  6. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
  7. Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
  8. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
  9. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
  10. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
  11. Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
  12. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
  13. Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
  14. Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
  15. Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
  16. Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
  17. Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
  18. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
  19. Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , Fifth Edition, 624-661 (2019).
  20. Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
  21. Wood, D. P. Jr Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
  22. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
  23. Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598 (2018).
  24. Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
  25. Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214 (2017).
  26. Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
  27. Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
  28. Network, N. C. C. NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018).
  29. Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
  30. Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).

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कैंसर अनुसंधान अंक १४५ मूत्राशय अर्बुद चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग carcinogens चूहों BBN मूत्राशय कैंसर
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Glaser, A. P., Procissi, D., Yu, Y., Meeks, J. J. Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors. J. Vis. Exp. (145), e59101, doi:10.3791/59101 (2019).

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