Summary
Tumores de bexiga murino são induzidas com carcinógeno nitrosamina N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Aqui nós apresentamos um protocolo de MRI, rápido e confiável para avaliar o estágio e o tamanho do tumor.
Abstract
Modelos de tumor murino de bexiga são críticos para a avaliação de novas opções terapêuticas. Tumores de bexiga induzidas com N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) carcinógeno nitrosamina (BBN) são vantajosos sobre modelos baseados em linha de celular porque eles estreitamente replicar os perfis genômicos de tumores humanos, e, ao contrário dos modelos de célula e xenografts, eles fornecem um boa oportunidade para o estudo de imunoterapias. No entanto, a geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Descrito aqui é um modelo do rato BBN e protocolo para avaliar a bexiga câncer tumor fardo na vivo usando uma sequência rápida e confiável de ressonância magnética (RM) (FISP verdadeiro). Este método é simples e confiável porque, ao contrário de ultra-som, senhor independe do operador e permite o processamento de imagem de pós aquisição direta e revisão. Análise de regiões de interesse ao longo da parede da bexiga e tumor usando imagens axiais da bexiga, permitem o cálculo da área de parede e tumor de bexiga. Esta medida se correlaciona com o ex vivo peso da bexiga (rs= 0,37, p = 0,009) e estágio do tumor (p = 0.0003). Em conclusão, BBN gera heterogêneos tumores que são ideais para avaliação de imunoterapias, e MRI podem rapidamente e confiantemente avaliar a carga do tumor antes da randomização de braços de tratamento experimental.
Introduction
Câncer de bexiga é o quinto mais comum de câncer em geral, responsável por cerca de 80.000 novos casos e 16.000 mortes nos Estados Unidos em 20171. Após cerca de 30 anos sem avanços significativos no tratamento sistêmico do câncer de bexiga2, recentes ensaios de inibidor de ponto de verificação anti-PD-1 e anti-PD-L1 demonstraram respostas emocionantes e ocasionalmente duráveis em pacientes com avançado carcinoma urotelial3,4,5. No entanto, apenas cerca de 20% dos pacientes mostram uma resposta objetiva para estes tratamentos e mais estudos são necessários para expandir o uso eficaz da imunoterapia em pacientes com câncer de bexiga.
Modelos de câncer de bexiga murino são ferramentas essenciais na avaliação pré-clínica de novos tratamentos,6,7. A fim de controlar para o tamanho do tumor quando randomizar ratos para diferentes tratamentos, fardo de tumor deve ser avaliado e controlado entre os grupos de tratamento. Estudos anteriores usaram ultra-som ou bioluminescência para avaliar ortotópico celular baseado em linha de bexiga câncer modelos8,9,10,11. No entanto, ambas as técnicas apresentam várias desvantagens. Medições de ultra-som podem ser influenciadas por habilidades do operador e faltam características tridimensionais e alta resolução espacial. Métodos de bioluminescência só podem fornecer avaliação semi-quantitativa das células do tumor e não permitem a visualização da bexiga anatomia e morfologia. Além disso, a bioluminescência só pode ser usada com os modelos de linha de base celular, que expressam genes bioluminescentes em ratos sem pelos ou mouses com jalecos brancos.
Ressonância magnética (RM), por outro lado, oferece flexibilidade original na aquisição de imagens de alta resolução anatômicas, exibindo uma ampla gama de contraste de tecido que permite a visualização precisa e avaliação quantitativa da carga do tumor sem a necessidade de expressar Propriedades bioluminescentes. Imagens do senhor são mais facilmente reproduzíveis com os pipelines de análise adequada e garantidas a visualização em 3D da bexiga. As maiores limitações do MRI são o período de tempo necessário para um exame e custos elevados associados que limitam os ensaios de alto rendimento. No entanto, vários estudos têm mostrado que o Sr. sequências podem fornecer imagens de diagnósticos de alta qualidade que podem ser usadas para efetivamente detectar e monitorar tumores de bexiga baseado em linhas de células; assim, eles podem ser usados para alto throughput análise9,12.
Aqui, descrevemos um método não invasivo, baseado em senhor de forma confiável e eficiente caracterização de tumores de bexiga induzida por substância cancerígena em ratos. Para fazer isso, usamos uma imagem rápida com estado estacionário precessão senhor técnica (FISP verdadeiro), que garante curtas sessões de digitalização enquanto ainda fornece alta qualidade e alta resolução espacial (~ 100 mícrons) para a detecção e medição da bexiga tumores13. Além disso, para confirmar a precisão deste teste não-invasivo de MRI, descrevemos a correlação entre parâmetros derivados de MRI e ex vivo peso na bexiga, bem como palco de tumor patologicamente confirmado.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Northwestern.
1. indução de tumores com BBN
- Obter camundongos C57/BL6 machos, pelo menos 6 semanas de idade.
Nota: Camundongos machos desenvolvem câncer de bexiga, mais rápida e consistente do que ratos fêmeas14,15. - Adicione N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amina (BBN) na dose de 0,05% para a água potável. Armazená-lo em um recipiente opaco e fornecê-la ad libitum como água potável para ratos16.
Nota: Armazenar a solução BBN em um recipiente transparente irá degradar o carcinógeno17. - Mude a água do BBN 0,05% duas vezes por semana.
- Monitore os animais por meio da inspeção de sinais de perigo associado com tumores de bexiga, incluindo massas, firme na bexiga e hematúria. Inspecione os ratos duas vezes por semana ou de acordo com orientações IACUC locais.
- Espero que os tumores desenvolver entre 16 e 24 semanas de exposição18.
2. instalação MRI
- Realizar uma injeção subcutânea de solução salina estéril (0,1-0,2 mL, utilizando uma seringa de 1 mL e agulha de 25-27 G) 10 min antes da ressonância magnética para facilitar o enchimento da bexiga.
- Anestesia a cada rato com uma mistura de gás de 100% O2 e isoflurano (2-4% conforme necessário). Verifique se um plano adequado de anestesia por testar o reflexo de retirada (pitada de dedo do pé) antes de prosseguir. Aplica a pomada estéril para o animal.
- Transferi o mouse para o titular da imagem latente, equipado com um cone de nariz para entrega de inalado isoflurano (0,5 – 3%).
- Monitorar a temperatura corporal e respiração usando uma sonda de temperatura retal conectada ao computador de gravação fisiológica.
Nota: A temperatura Normal do corpo (36 – 37 ° C) é mantida usando o circuito de água quente recirculação incorporado o animal titular Sr. Temperatura é medida através de um sensor retal e gravada no computador monitoramento fisiológico usando software de monitorização fisiológico dedicado. O mesmo sistema é usado para gravar os sinais de respiração e eletrocardiograma, medidos através de um travesseiro pneumático colocado sob a caixa torácica e através de eletrodos de eletrocardiograma de 3 derivações. O sinal de respiração também é usado para acionar a aquisição de MRI e reduzir artefatos associados com o movimento de respiração.
3. aquisição de imagens de MRI
- Utilize uma bobina de corpo de quadratura para a excitação.
- Coloque uma bobina do receptor de 4 canais na parte inferior do abdome do mouse sendo digitalizado para habilitar a detecção de otimizado dos sinais da região de interesse.
- Inicie os ajustes automáticos através do software de imagem integrado para adquirir um conjunto tri-axial de imagens do corpo inteiro do mouse. Este conjunto de referência de imagens, identifica a região de interesse (no caso, a região da bexiga).
- Adquira três conjuntos de imagens ortogonal cortado ao longo das planos axiais, coronais e sagitais, usando referenciais radiológicas.
- Utilizar o verdadeiro FISP imagem sequência (incluída como uma das características do software de imagem integrado) com os seguintes parâmetros de senhor: TR = 900 ms, TE = 2 ms, FA = 70, 14 médias.
Nota: Este conjunto de parâmetros permite a rápida geração de imagens com alta qualidade de diagnóstica, incluindo a ponderação T1/T2 em < 10 min por rato. - Espessura de resolução e fatia espacial são determinados pelos parâmetros geométricos selecionados pelo usuário através da interface gráfica de plataforma de imagem. Isso resulta em uma série de fatias em toda a bexiga toda de 0,5 mm de espessura, com uma resolução no plano de 0,148 mm.
4. análise de imagem do senhor
- Identifica o conjunto de fatias de 0,5 mm de espessura e resolução no plano de 0,148 mm, cobrindo a bexiga toda.
- Exportar para o software de análise de imagens médicas, selecionando a pasta com as imagens correspondentes em formato ANALYZE.
- Selecione "vista axial representativa" no centro da bexiga para análise quantitativa percorrer as imagens geradas e identificando uma fatia no ponto médio da bexiga, que permite a visualização da parede da bexiga e lúmen.
Nota: A fatia do centro deve ser o escolhido com o maior diâmetro. - Cuidadosamente, delinear a região de interesse (ROI) traçando manualmente as fronteiras em torno da borda exterior da bexiga (BLApara fora) e em torno do lúmen interno da bexiga (BLAem) (ver figuras representativas e esquemáticas na Figura 2) na vista axial representante selecionada.
- Subtrai o lúmen interno da borda exterior para calcular a área de superfície da parede da bexiga.
BLAparede = BLAfora - BLAem
Nota: A área da superfície de uma bexiga de controle com nenhum tumor deverá ser menor do que com um tumor na bexiga.
5. eutanásia e dissecação da bexiga
- Após 20 semanas de exposição BBN, eutanásia os ratos usando procedimentos habituais de funcionamento em conformidade com diretrizes IACUC locais.
- Limpe a área da incisão com etanol a 70%, em seguida, segure e levante a pele da parede abdominal com fórceps.
- Fazer uma incisão da sínfise púbica ao processo xifoide.
- Incise agudamente a cavidade peritoneal, segurando com fórceps e incisão com uma tesoura.
- Identifica a bexiga, que está localizada na parte inferior do abdome na linha média.
- Identificar e cortar o ligamento umbilical mediano, conectando a cúpula da bexiga ao umbigo e parede abdominal.
- Agarre a cúpula da bexiga com fórceps para fornecer aonde e dissecar a bexiga longe em torno de estruturas, incluindo as vesículas seminais, reto e gordura.
- Identificar os ureteres entram na bexiga e corte com tesoura perto da bexiga.
- Levantamento da bexiga cefálica, corte da uretra com uma tesoura e remover a bexiga.
- Pese imediatamente a bexiga após enxaguá-lo com PBS.
6. histologic examinação de tecido da bexiga
- Fixar o tecido da bexiga em formol tamponado neutro de 10% para 36-48 h à temperatura ambiente (RT).
- Incorporar o tecido em blocos de parafina, cortar as lâminas para exame posterior e manchar os slides com hematoxilina e eosina para exame microscópico conforme descrito anteriormente,19,20.
- Realizar um exame microscópico da bexiga em baixo do mouse (2.5 x e x 10) e ampliações de alta (20x e 40x), examinando para lesões macroscópicas, hiperplasia, carcinoma em situ, papilomas, papilas tumores e neoplasias invasivas19 , 21.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito (Figura 1), tumores de bexiga foram induzidas em camundongos C57/B6 do sexo masculino. MRI foi feito em 16 semanas, e os ratos foram sacrificados às 20 semanas. Ex vivo bexiga pesos (BW) para cada mouse foram gravados. Lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina, e todas as lâminas de histologia foram analisadas para a fase do tumor.
Para analisar o fardo de tumor usando o senhor, o lúmen interno da parede da bexiga (BLAem) foi subtraído o bexiga parede lúmen externo (BLApara fora) para calcular a espessura da parede da bexiga (BLAparede) (Figura 2). Imagens de senhor FISP verdadeiro representante, reconstruções em 3-d de bexiga parede e imagens patológicas de um rato de controle (ou seja, nenhum tumor) são mostrados na Figura 3A-F e um rato com um grande tumor é mostrado na Figura 3-L.
O parâmetro derivado de MRI BLAparede fracamente correlaciona com ex vivo BW (rs = 0,37, p = 0,009; A Figura 4). Exame de MRI-derivado BLAparede parâmetro e dados de BW demonstra uma associação com o estágio do tumor (teste de Kruskal-Wallis MRI p = 0.0003, Figura 5A; BW p = 0,0006; Figura 5B), bem como uma associação quando estratificar a patologia por câncer de bexiga músculo-invasivos e câncer de bexiga músculo-invasivos (teste de Mann-Whitney U MRI p = 0,0002, Figura 5; BW p < 0,0001, Figura 5). O desempenho do BLAparede e BW para determinar o câncer de bexiga músculo-invasivos é mostrado na Figura 5E. A área sob a curva (AUC) para BLAparede (AUC = 0,81, 95% CI 0,68-093) é estatisticamente semelhante ao AUC para BW (AUC = 0,89, IC 95% 0,80-0,98; p = 0,30).
Figura 1: esquema para a indução de tumor de bexiga com BBN e sincronismo de MRI e eutanásia. BBN é administrado ad libitum na concentração de 0,05% em água potável. Ratos são submetidos a MRI em 16 semanas. Os ratos são sacrificados às 20 semanas e bexigas de cada um são examinadas com imuno-histoquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação gráfica esquemática do método para obter BLAparede e imagem representativa do senhor com contornos correspondentes. Usando a intensidade de imagens MRI, identificou-se a parede exterior de uma bexiga e um contorno foi desenhado em vermelho (BLApara fora). O lúmen da bexiga aspecto foi delineado em verde (BLAem), e obteve-se a área correspondente do lúmen da bexiga. Subtração dessas duas quantidades rendeu o parâmetro deparede BLA, que corresponde ao disco luz cinzento na imagem gráfica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens verdadeiro representante do senhor FISP, reconstruções em 3-d de bexiga parede e imagens patológicas de um rato de controle (ou seja, nenhum tumor) (A-F) e um rato com um grande tumor (G-L). (A) senhor representante a imagem de um rato com nenhum tumor. (B) segmentação da área de parede de bexiga (BLAparede), descrita em vermelho, definida como a área entre o lúmen da bexiga (BLAem) e a parede exterior da bexiga (BLApara fora). (C) de renderização 3D da parede da bexiga de um rato de controle, gerado por meio da definição BLAparede em cada fatia através da bexiga. Setas verdes ilustram a bexiga em uma imagem 2D traduzida para renderização 3D. (D) renderização 3D de uma corte dos BLAparede de um rato de controle. (E) de baixa potência (2.5 x) e imagens de alta potência (10x) (F) da bexiga rato mesmo. (G) senhor representante a imagem de um rato com um grande tumor. (H) segmentação da área de parede de bexiga (BLAparede), descrita em vermelho, definida como a área entre o lúmen da bexiga (BLAem) e a parede exterior da bexiga (BLApara fora). (I) renderização 3D da parede da bexiga de um rato com um grande tumor. (J) renderização 3D de um corta-circuito da bexiga de um rato com um grande tumor, gerado por meio da definição BLAparede em cada fatia através da bexiga. Setas verdes ilustram a bexiga em uma imagem 2D traduzida para renderização 3D. Baixa potência (K) (2.5 x) e imagens de alta potência (10 x) (L) da bexiga rato mesmo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: correlação de Spearman entre a MRI-derivado BLAparede e peso final bexiga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação de fase patológica e MRI-derivado parâmetro BLAparede em 47 ratos. (A) comparação de todas as fases patológicas e ressonância magnética BLAparede (teste de Kruskal-Wallis). (B) comparação de estágios tudo patológicos e peso na bexiga (teste de Kruskal-Wallis). (C) comparação de câncer de bexiga músculo-invasivos (fase ≤T1) e câncer de bexiga músculo-invasivos (fase ≥T2) com ressonância magnética BLAparede (teste de Mann-Whitney U). (D) comparação de câncer de bexiga músculo-invasivos (fase ≤T1) e câncer de bexiga músculo-invasivos (fase ≥T2), com peso de bexiga (teste de Mann-Whitney U). (E) curva ROC da área de MRI-derivado da bexiga e peso final da bexiga na determinação de câncer de bexiga músculo-invasivos (fase ≥T2). O p-valor listado é a diferença entre os dois AUCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Imagem exata dos modelos de tumor é necessária para o adequado estadiamento pré-eutanásia e randomização animal antes do início do tratamento experimental. Usando o procedimento aqui apresentado, demonstramos a metodologia para (1) gerar tumores de bexiga, usando o carcinógeno BBN e (2) estratificar o fardo de tumor de bexiga com o uso de derivados de um senhor Mr área medida (BLAparede) correlaciona-se significativamente com ex vivo peso na bexiga e está associada com a fase patológica do tumor.
Adotando uma abordagem rápida de imagem com tempos curtos de aquisição em alta resolução espacial (FISP verdadeiro) e alta qualidade de diagnóstica, pode realizamos ensaios de alta taxa de transferência de ratos nas fases intermédias do desenvolvimento do tumor, antes da randomização de tratamento. Nosso relatório é consistente com relatórios anteriores do Sr imaging de tumor de células com base em linha implantes9,12 e confirma seu potencial como uma ferramenta para otimizar os estudos de drogas números grande assunto.
Neste protocolo de MRI, é fundamental para a imagem do rato com a bexiga cheia para obter imagens de alta qualidade e delinear as diferenças entre o lúmen do tumor e da bexiga. Encontramos que injectar cada rato com salinos 10 minutos antes de imagem permite a imagem adequada da bexiga. Outras etapas críticas incluem provocando confiável de aquisição de MRI usando o sinal de respiração detectado com um travesseiro pneumático colocado sob o rato caixa torácica e a aquisição de um número adequado de fatias do senhor que permite a cobertura da bexiga toda.
Outras opções para o desenvolvimento e progressão dos tumores de bexiga murino de imagem incluem ultra-som8 e bioluminescência10,11. Microecografia de implantado MBT-2 células detectado tumores em 15 ratos, 13 dos quais foram confirmados histologicamente ter tumores8. Volume de ultra-som correlacionado significativamente com estereoscópico volume do tumor, mas peso do tumor e estágio não foram investigadas8. Bioluminescência tem sido usada para monitorar com precisão os implantes de tumor baseado em linha de celular, mas não pode ser usado para monitorar cancros induzida por substância cancerígena sem transplantar tumores cancerígeno-derivado de um rato para outro. A capacidade de monitorar com precisão o câncer induzido por substância cancerígena é crítica, como estes modelos têm diversas vantagens sobre os modelos de linha celular. Modelos baseados em linha de celular são geneticamente homogênea e derivadas de tumores que já tenham evadido o sistema immunosurveillance, e implantados tumores crescem rapidamente sem um microambiente inflamatório crônico de22. O modelo BBN tem sido utilizado com sucesso por mais de 30 anos, e continua a ser um modelo crítico para a compreensão do desenvolvimento de câncer de bexiga e tratamento23,24,25. Além disso, o modelo da BBN demonstra mutacional e expressão gênica perfis semelhantes ao ser humano câncer de bexiga, mantendo o sistema imunológico intacto para permitir o estudo de potenciais agentes de imunoterapia26,27 .
Disponibilidade do animal pequeno dedicado MRIs como recursos compartilhados em várias instituições torna esta técnicas vantajoso e prático para a pesquisa básica e triagem de novas terapias. No entanto, existem algumas limitações. Os ratos foram fotografados apenas em um Commit, não continuamente durante o desenvolvimento de tumores. No entanto, com base em nossos resultados estatísticos, sugerimos que o valor de commit único é capaz de estratificar com precisão os ratos em grupos por fase e tamanho do tumor, e representa um parâmetro ideal, não-invasivo para classificar e atribuir indivíduos de grupos diferentes. Vários estágios do tumor foram gerados usando BBN, variando de Ta a T4. No entanto, estas podem ser estratificadas (como sugerido na Figura 5-D) como músculo-invasivos (T2 ou maior) e não-músculo invasiva (T1 ou menos), pois este é o padrão de gestão em câncer de bexiga humana28.
Outra limitação potencial é que o parâmetro deparede BLA foi derivado usando um único corte através de cada bexiga e fatias não disponíveis cobrindo-o. Estes critérios foram escolhidos para reduzir os requisitos de gasoduto de análise (ou seja, exigência de desenho múltiplas ROIs em várias fatias) e foram considerados suficientes para um ensaio rápido, quantitativo. Análise volumétrica mais complexa pode ser conduzido sobre os assuntos (i.e., mostrado para fins ilustrativos, na Figura 3), mas que inevitavelmente exigem mais esforço e custos. Imagem automatizada, algoritmos de processamento pode ser usada para delimitação automática da região da bexiga; no entanto, estes métodos sofrem de variabilidade intrínseca da bexiga forma e tamanho entre ratos individuais e requerem significativo de testes e validação antes da adopção de confiança em um estudo pré-clínico29.
Avaliação qualitativa de dados volumétricos sugerem que esse método única fatia é suficiente para este tipo de ensaio. No entanto, é possível que os ensaios mais avançados podem exigir esta etapa de processamento de dados adicionais/imagem. Do ponto de vista da aquisição, há vários exames adicionais que podem ser adquiridos, que podem aumentar ainda mais a capacidade de prever a progressão dos tumores, enquanto também revelam mais mudanças de microambiente do tumor sutil. Estas técnicas adicionais incluem contraste dinâmico avançado MRI, MRI de difusão ponderada e outras sequências de30 que permitem uma caracterização abrangente, multi paramétrica da parede da bexiga. No entanto, a consideração de custo e eficiência levou-na limitar nosso ensaio àquele descrito neste protocolo.
Em conclusão, descrevemos a metodologia para T1/T2-weighted rápida imagem Sr. sequências (FISP verdadeiro) para adquirir imagens do multi-slice cobrindo a bexiga inteira do mouse. Vamos demonstrar que essas imagens podem ser usadas para determinar a extensão do tumor em um modelo baseado em agente cancerígeno de câncer de bexiga murino. Dados de MRI correlaciona-se com pesos de tecido da bexiga e é associados com o estágio do tumor. Estes resultados suportam o uso deste teste MRI rápido e confiável para estratificar os ratos antes da randomização tratamento experimental.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
J. J. M. é financiado pelo mérito de administração de saúde de veteranos conceder BX0033692-01. J. J. M. também é suportado pela P. John Hanson Foundation para pesquisa do câncer da Universidade Robert H. Lurie abrangente câncer centro de noroeste. Agradecemos o centro translacional Imaging para proporcionar a aquisição de MRI e processamento. Fontes de financiamento não tinham qualquer papel na escrita do manuscrito ou a decisão de enviar para publicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice |
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN) | TCI American | B0938 | Carcinogen |
| 0.9% normal saline | Hospira, Inc | NDC 0409-488-02 | |
| Isoflurane | Piramal HealthCare | 60307-120-25 | Anesthetic |
| 7Tesla ClinScan MRI | Bruker | NA | Dedicated Small Animal Imaging MRI |
| Syngo | Siemens | NA | MR Integrated Imaging Software |
| Model 1030 Monitoring & Gating System | Small Animal Instruments, Inc. (SAII) | NA | Small animal physiologic monitoring |
| Formalin, Neutral Buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Fixative |
| Eosin Y | Fisher Scientific | NC1093844 | Histologic staining agent |
| Hematoxylin | Fisher Scientific | 23-245651 | Histologic staining agent |
| Jim7 | Xinapse Systems | NA | Medical image analysis software |
| GraphPad Prism v7.04 | Graphpad | NA | Graphing software |
| R v3.4.2 | The R Project for Statistical Computing | NA | Statistical software |
| R package pROC v1.10.0. | The R Project for Statistical Computing | NA | ROC analysis |
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