Summary
ويركز هذا البروتوكول على استخدام الجراثيم البكتيرية كأداة نانوبيوتيتشنولوجيكال "حية" الجسميات جزيئات مغايرة مع مختلف الأنشطة البيولوجية. وترد أيضا أساليب لقياس كفاءة الامتزاز.
Abstract
بوغ البكتيرية خلية أيضي هادئة، يتكون من سلسلة من الطبقات الواقية المحيطة السيتوبلازم المجففة. يجعل في بوغ مستقرة للغاية ومقاومة هذا الهيكل غريبة وقد اقترح استخدام بوغ كمنصة لعرض جزيئات مغايرة. وحتى الآن، تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات على أبواغ عصيات نجحت ، وعدد قليل من الأنواع الأخرى، في البداية بنهج المؤتلف، ومن ثم، باستخدام أسلوب نونريكومبينانت بسيطة وفعالة. ويستند نظام العرض نونريكومبينانت الامتزاز المباشر من جزيئات مغايرة على السطح بوغ، تجنب بناء سلالات المؤتلف والإفراج عن البكتيريا المعدلة وراثيا في البيئة. استقرت الجزيئات الممتزة والمحمية بالتفاعل مع الجراثيم، مما يحد من التدهور السريع لمولدات المضادات، والخسارة في نشاط إنزيم في ظروف غير مواتية. متى تستخدم، يمكن جمعها بسهولة مع تخفيض الحد أدنى من نشاط الإنزيمات تمتز بوغ واستخدامها لجولات إضافية للرد. يرد في هذه الورقة كيف أن الجسميات الجزيئات النموذجية لجراثيم المنقي من باء-نجحتوكيفية تقييم كفاءة الامتزاز وكيفية جمع الجراثيم المستخدمة إعادة تدويرها لردود فعل جديدة.
Introduction
عرض النظم تهدف إلى تقديم النشيطة بيولوجيا الجزيئات على السطح للكائنات الحية الدقيقة وإيجاد التطبيقات في مجموعة متنوعة من المجالات، من الصناعي للتكنولوجيات الأحيائية الطبية والبيئية. وبالإضافة إلى فاجيس1،2 وخلايا مختلفة الغرام-وإيجابية الأنواع3،4،5،،من67، كانت أيضا الجراثيم البكتيرية اقترحه كأنظمة العرض نهجين8،9.
بسبب هيكلها غريبة، هي المجففة السيتوبلازم محاطة بسلسلة من10من طبقات واقية، بوغ يوفر العديد من المزايا بالعاثية-ويستند إلى الخلية عرض نظم8،9. ميزة أولى يأتي من الشدة القصوى واستقرار الجراثيم في الظروف التي تكون ضارة لكل أخرى الخلايا10،11. عرض بوغ المستضدات والأنزيمات مستقرة بعد التخزين في درجة حرارة الغرفة12 لفترات طويلة، والحماية من تدهور في درجة الحموضة منخفضة وارتفاع درجات الحرارة13. وميزة ثانية للجراثيم هو سلامة العديد من الأنواع تشكيل بوغ. باء-نجحت، كلاوسي، كواجولانس باء، والعديد من الأنواع الأخرى المستخدمة في جميع أنحاء العالم البروبيوتيك وقد تم في السوق للاستخدام البشري أو الحيواني لعقود14،15. هذا سجل سلامة استثنائية شرط عامة واضحة لنظام عرض سطحي ويتسم بأهمية خاصة عند النظام معد للاستخدام البشري أو الحيواني16. ثالث، هو ميزة هامة لنظام العرض القائم على بوغ أن ليس لديه قيود الحجم جزيء التي قد يتعرض. في الأنظمة المستندة إلى بالعاثية، بروتين مغايرة كبيرة قد تؤثر على الهيكل من قفيصه، بينما في الأنظمة المستندة إلى الخلية، فإنه قد تؤثر على هيكل الغشاء أو قد حد/تنال الخطوة إزفاء غشاء17. الطبقات الواقية المحيطة بوغ تتألف من أكثر من 70 البروتينات المختلفة10 وهي مرنة بما يكفي لقبول كبير البروتينات الخارجية دون أي خلل هيكلي واضح أو إعاقة وظيفية8. وبالإضافة إلى ذلك، مع كل أنظمة العرض القائم على بوغ، إزفاء غشاء من البروتين مغايرة ليس مطلوب8،9. في الواقع، البروتينات مغايرة هي أما أنتجت في السيتوبلازم الخلية الأم وتجميعها في بوغ أن يتشكل في السيتوبلازم نفسه أو تمتز على8،بوغ ناضجة9.
في البداية حصل عرض بوغ وضع نظام وراثية مهندس السطحية سبور18. يستند هذا النظام الوراثي أنا) بناء التحام الجينات بين ترميز الجينات لبروتين معطف سبور (تستخدم ناقل) وترميز الجينات للبروتين أن يكون عرض-وجود إشارات النسخي ومتعدية الجنسيات ذاتية سيتم التحكم في الجينات تعبير الانصهار، والثاني) التكامل تشيميريك الجينات على كروموسوم ب-نجحت منح الاستقرار الوراثي. وقد تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات بهذا النهج المؤتلف، استخدام مختلف البروتينات السطحية بوغ الناقلين وتهدف مختلف التطبيقات المحتملة، تتراوح بين لقاح المخاطية بيوكاتاليست، بيوسينسور، والمعالجة البيولوجية، أو بيواناليتيكال أداة8،13.
في الآونة الأخيرة، تم اتباع نهج مختلف لعرض سبور19من البلدان المتقدمة النمو. هذا النظام الثاني هو نونريكومبينانت، ويعتمد على الامتزاز عفوية وضيق للغاية من الجزيئات على السطح سبور9. المستضدات19،20 والأنزيمات13،21 أظهروا كفاءة وقد كشفت عن أن هذا الأسلوب إلى حد كبير أكثر كفاءة من المؤتلف. هذا النهج نونريكومبينانت يتيح عرض البروتينات في النموذج الأصلي20 ويمكن أن تستخدم أيضا مع يعقم، وموت الجراثيم19. الآلية الجزيئية الامتزاز لم تماما يتضح حتى الآن. شحنة سالبة و hydrophobicity بوغ اقترحت كخصائص ذات صلة لل19،13،الامتزاز22. في الآونة الأخيرة، قد ثبت أن نموذج بروتين، البروتين أوتوفلوريسسينت الأحمر (مرفب) للشعاب المرجانية ديسكوسوما، عندما تمتز إلى بوغ، تمكنت من التسلل عبر الطبقات السطحية إضفاء الطابع المحلي في معطف الداخلية23. الترجمة الداخلية من البروتينات مغايرة إذا ثبت صحيحاً للبروتينات الأخرى، يمكن أن يفسر زيادة الاستقرار عندما تمتز إلى جراثيم23.
في دراسة أجريت مؤخرا، عامين الإنزيمات تحفيز الخطوات المتتابعة اثنين من مسار التدهور زيلان تم عرضها بشكل مستقل على جراثيم من باء-نجحت ، وعندما المحتضنة معا، كانت قادرة على القيام بكل الخطوات تدهور21. الجراثيم التي جمعت بعد رد فعل كانت لا تزال نشطة وقادرة على مواصلة تدهور زيلان عند إضافة الركازة جديدة21. حتى لو كان قد لوحظ فقدان حوالي 15% المنتج النهائي في الرد الثاني21، إعادة استخدام الإنزيمات الممتزة لردود فعل واحد، فضلا عن الخطوة متعددة، ميزة هامة إضافية من نظام العرض بوغ.
وأفادت عموم et al.24 نهج إضافية لعرض مغايرة البروتينات على سطح بوغ: البروتينات مغايرة (بروتين اندوجلوكاناسي وبيتا-جالاكتوسيداسي واحدة) تنتج في الخلية الأم خلال تبوغ كانت عفوية المغطى في تشكيل معطف بوغ، دون الحاجة إلى الناقل. هذا النظام عرض إضافية بوغ مزيج من النهجين وصف حتى الآن. وفي الواقع، أنها المؤتلف منذ كانت هندسة البروتينات مغايرة ليمكن التعبير عنها في الخلية الأم خلال تبوغ، بينما كانت هذه الجمعية داخل المعطف عفوية، ومن ثم نونريكومبينانت24. ومع ذلك، يظل كفاءة عرض هذا النهج الإضافية لفحصها ومقارنة مع هذين النهجين الآخرين باستخدام نفس البروتينات مغايرة.
هذا البروتوكول لا يشمل عمليات إنتاج بوغ وتنقية، التي وصفت على نطاق واسع في أماكن أخرى24. يتضمن رد فعل الامتزاز، تقييم كفاءة الامتزاز بالفحص المجهري النشاف دوت والأسفار، وجولات إعادة التدوير للإنزيمات الممتزة لإضافية للرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الامتزاز رد فعل
- احتضان 2 و 5 و 10 ميكروغرام من مرفب مع 2 x 109 باء-نجحت البرية من نوع الجراثيم المنقاة في 200 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت، وسترات الصوديوم 50 مم، pH 4.0 (16.7 مم سترات الصوديوم ثنائي هيدرات؛ حمض الستريك 33.3 مم) ح 1 عند 25 درجة مئوية على شاكر هزاز (الشكل 1) .
- الطرد المركزي الخلائط ملزمة (13,000 س ز لمدة 10 دقائق) يجزئ الكريات (P2, P5 و P10) وسوبيرناتانتس (S2 و S5 و S10). تخزين سوبيرناتانتس لتقييم كفاءة الامتزاز هو موضح في الخطوة 3، 2 غير المباشرة.
- تغسل الكريات 2 x مع 200 ميليلتر المخزن المؤقت وريسوسبيند لهم في 100 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت واستخدامه لتحليل التالي الملزمة.
ملاحظة: يحدث رد فعل ملزم تفضيلي في قيمة pH أقل من نقطة isoelectric من البروتين؛ نموذجياً، 1.5 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، يتم استخدام الرقم الهيدروجيني pH 4.0، أو سترات الصوديوم 50 مم، 4.0،.
2-المباشر تقييم كفاءة الامتزاز
-
استخراج البروتينات السطحية وتحليل لطخة غربية
- تأخذ 50 ميليلتر من استثارة جراثيم تمتز مرفب (P2, P5 و P10 من الخطوة 1، 3) وإضافة 50 ميليلتر من 2 × دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)-ديثيوثريتول (DTT) (0.1 M تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8؛ الحزب الديمقراطي الصربي 2%؛ 0.1 م DTT) جعل البروتينات السطحية بوغ.
- استخدام مرفب مجاناً، وتنقية ومقتطفات من نفس المبالغ من الجراثيم التي هي لا تمتز بالبروتين كعناصر إيجابية وسلبية، على التوالي.
- وبعد 45 دقيقة من الحضانة عند 65 درجة مئوية، الطرد المركزي (13,000 س ز لمدة 10 دقائق) الخلائط وتحليل 10 ميليلتر من البروتينات المستخرجة (طاف) بوصمة عار الغربية مع [مونوكلونل] جسم صاحب المضادة الاعتراف له العلامة الموجودة في ن--المحطة طرفية مرفب ( الشكل 2A).
-
الملاحظات مجهر فلوري
ملاحظة: باستخدام البروتينات الفلورية مغايرة أو القيام بتحليل الفلورة، من الممكن لتوطين وقياس الجزيئات الممتزة بالفحص المجهري الأسفار.- تأخذ 5 ميليلتر من استثارة للجراثيم الممتزة من الخطوة 1، 3 وإضافة ميليلتر 95 من برنامج تلفزيوني 1 x، pH 4.0، للحصول على ~ 1 × 106 بوغ/ميليلتر.
- 5 مكان ميليلتر من تعليق على شريحة مجهر، تغطية ذلك مع ساترة تعامل سابقا مع بولي-l-يسين لمدة 30 ثانية، والاحتفال به تحت مجهر الأسفار.
- لكل حقل، حفظ صورة مجهرية المرحلة-التباين والأسفار صورة مجهرية (الشكل 2ب).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، جراثيم الفلورسنت يمكن تحليلها سيتوفلوريميتري. ريسوسبيند ما مجموعة 106 جراثيم تمتز أو تمتز عدم مع البروتين مغايرة في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني، pH 4.0، وتحليل تعليق استخدام تدفق سيتوميتير (الشكل 2-ج).
-
تحليل البيانات باستخدام إيماجيج
- افتح الصور مجهرية الأسفار مع برنامج إيماجيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) وفحص للتأكد من أن جميع الصور في شكل 8 بت (صورة | نوع | 8-بت).
- ضبط التباين إذا لزم الأمر (صورة | ضبط | السطوع) وتحقق من حجم الصورة بكسل (صورة | ضبط مقياس).
- من تحليل القائمة، حدد تعيين قياسات. تأكد من المنطقةو كثافة المتكاملة، و يعني رمادي القيمة المحددة.
- رسم خط حول بوغ اهتمام باستخدام أي من أدوات الرسم/التحديد (أي دائرة، مضلع، أو شكل حر) (الشكل 3).
- حدد الإجراء من قائمة تحليل (أو ضرب cmd + M). يظهر مربع منبثق مع كومة من القيم لهذا بوغ الأولى (الشكل 3).
- كرر هذه الخطوات اثنين على الأقل 50 الجراثيم الأخرى في مجال الرؤية المختارة التي يمكن قياسها.
- حدد عدة مناطق دون أي جراثيم (التي لديها لا الأسفار) وكرر القياس؛ سوف تكون هذه الخلفية.
ملاحظة: الحجم غير مهم. سوف تستخدم هذه القيم fluorescence الخلفية المقابلة للطرح الخلفية يدوياً. - حدد كافة البيانات في إطار النتائج ونسخ النتائج في جدول بيانات.
- حساب متوسط كثافة المتكاملة و المجال جراثيم المحدد والقيم fluorescence الخلفية واستخدامها للحصول على الأسفار مجموع كل خلية المصوبة (كتكف) باستخدام الصيغة: كتكف = يعني المتكاملة الكثافة--(منطقة يعني x يعني خلفية الأسفار).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا كان جميع الجراثيم تظهر جيدا المنفصلين عن ذويهم، من الممكن لتحليل جميع الجراثيم الحقل الصورة باستخدام وظيفة تحليل الجزيئات، بعد التعليمات إيماجيج. لتجنب أن البرنامج يقرأ الأسفار محددة أو المجاميع بوغ، البعد للجسيمات قد يحدد في pixelˆ2 = 50-200 (الشكل 4).
3-غير المباشر تقييم كفاءة الامتزاز
- إعداد تخفيف التسلسلي للبروتين المنقي.
- إعداد أول أنبوب 1.5 مل تحتوي على 250 ميليلتر من المنقي مرفب بتركيز 0.5 نانوغرام/ميليلتر، استخدام المخزن المؤقت الربط نهائي. هذا الحجم غير كافية لتحميل اثنين من الممرات.
- إجراء ستة شقين المسلسل تخفيف من 250 ميليلتر (الحجم النهائي) كل منها باستخدام المخزن المؤقت ملزم.
- إعداد شقين تخفيف المسلسل لطاف العينات المحتوية على الكسر مرفب غير منضم من رد فعل الامتزاز (S2 و S5 و S10 من الخطوة 1، 2).
- وضع 100 ميليلتر من كل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل وإضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم. إجراء ستة شقين المسلسل تخفيف من 200 ميليلتر (الحجم النهائي) كل منها باستخدام المخزن المؤقت ملزم.
- قطع النيتروسليلوز غشاء (استقطاع 0.45 ميكرومتر)، 9 × 10 سم في الحجم، لتغطية المنطقة 5 (عدد العينات) × 6 (عدد تخفيف) النقاط. لا ينبغي أن يمتد الغشاء بعد حافة طوقا جهاز وصمة عار دوت.
- مكان الغشاء بريويت في الجهاز دوت وصمة عار. قم بإزالة أي فقاعات الهواء محاصرين بين الغشاء وطوقا. تغطية الجزء غير المستخدم من الجهاز مع الفيلم الشريط أو البرافين لمنع الهواء من التنقل عبر هذه الآبار.
- تجميع جهاز وصمة عار دوت، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
- وإذا تم استخدام فراغ أثناء تجميع ترطيب الغشاء مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 الواحدة وكذلك لضمان الربط الموحد للمستضد ومنع هالات أو إشارة الكشف عن ضعف.
- بلطف بإزالة المخزن المؤقت من الآبار بفراغ. حالما تسقط الحل المخزن المؤقت من جميع الآبار، تتوقف المضخة الفراغ وقطع الاتصال به.
- تحميل القياسية في الممرات الخارجية الأكثر اثنين والعينات في الوسط (الشكل 5). سد الآبار المناسبة مع 100 ميليلتر من كل تخفيف. ينبغي أن تكفل وحدة التخزين نفسها المستخدمة لكل بئر ترشيح متجانسة لكل عينة الآبار.
- قم بتشغيل مضخة فراغ لمدة 2 دقيقة ووقفه، ثم السماح للعينة للتصفية من خلال الغشاء حسب خطورة تدفق.
- تغسل جميع الآبار مع 100 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني وترك فراغ مضخة تشغيل لمدة 5 دقائق أخرى بعد المخزن المؤقت الغسيل استنزفت تم تماما من الجهاز.
- مع الفراغ في، قم بفك البراغي، وفتح الجهاز وصمة عار دوت بعناية.
- إيقاف الفراغ ويأخذ الغشاء ومعالجته في أعقاب بروتوكول لطخة غربية.
- القيام بتحليل دينسيتوميتريك لعامل التصفية، باستخدام البرمجيات المناسبة، مثل إيماجيج.
- قياس كثافة المتكاملة لكل نقطة تحدد لهم مع دائرة من نفس المنطقة واستخدام الأمر تحليل/التدبير .
- إجراء تصحيح خلفية للصورة، ورسم دائرة في منطقة فارغة وقياس كثافته المتكاملة أو باستخدام الأمر خلفية عملية/استقطاع .
- الربط بين كثافة النقاط القياسية المتكاملة مع كمية البروتين محملة والحصول على خط معايرة (ص2 القيم للمعايرة يجب أن تكون المنحنيات على 0.95).
- استخدام منحنى المعايرة لاستقراء تركيز مرفب لكل نقطة عينة.
- حساب تركيز مرفب المتبقية في الكسور غير منضم.
ملاحظة: لضمان إغلاق الصحيح الجهاز وصمة عار نقطة، ومن ثم إلى موضوع الغشاء إلى ضغط موحدة، تضييق الخناق باتباع نظام قطري متقاطعة و، ثم فتح مضخة فراغ تضييق الخناق بقوة أكبر.
4-سبور جمع وإعادة استخدام
- لإعادة تدوير بوغ الممتزة، أداء اثنين من ردود فعل الامتزاز 2.0 × 109 تنقية الجراثيم مع 10 ميكروغرام لتنقية GH10 شي إكسيلاناسي أو 10 ميكروغرام من β GH3-XT المنقي-إكسيلوسيداسي، كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.3 (الشكل 6A).
- جمع الكريات المحتوية على جراثيم تمتز الإنزيم، ريسوسبيند لهم في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت المثلى للانزيم رد الفعل الأنزيمي (50 مم فوسفات الصوديوم العازلة في درجة الحموضة 6.5؛ 2.48689 غرام/لتر Na2هبو4، ز 4.88991/L NaH2بو4)، ومزجها معا للحصول على خليط 100 ميليلتر من جراثيم أدسوربينج GH10-XA أو GH3-XT.
- إضافة الركازة (5 ملغ/مل 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [مجكس]) وترك ردود فعل إنزيم تجري ح 16 عند 65 درجة مئوية.
- الطرد المركزي خليط رد فعل (لمدة 15 دقيقة في 13,000 س ز) وتخزين المادة طافية الذي يحتوي على المنتج رد فعل الإنزيم.
- ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من جديد 50 مم فوسفات الصوديوم العازلة في درجة الحموضة 6.5 حضور ركيزة جديدة (مجكس) (الشكل 6ب).
ملاحظة: الجسميات إنزيم واحد أو أكثر، أنه من الممكن الجسميات كليهما معا أو واحدة تلو الأخرى بشكل مستقل. الإمكانية الأخيرة يسهل التحليل الكمي لكفاءة الامتزاز والنشاط لكل إنزيم، مما يتيح توازناً المقايسة لكل إنزيم بحاجة لردود الفعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تقييم الامتزاز ناجحة من النشاف الغربية. بناء على رد فعل، هذا الخليط هو مجزأ بالطرد المركزي وغسلها، والكسر بيليه (الشكل 1) ويستخدم لاستخراج البروتينات السطحية. الاستخراج مجزأ من الحزب الديمقراطي الصربي polyacrylamide هلام التفريد (صفحة)، اليكتروترانسفيريد لغشاء الفينيليدن فلوريد (PVDF)، وكان رد فعل ضد الأجسام المضادة للابتدائي والثانوي. وجود بروتينات الحجم المتوقع، إلا في حارة محملة بمقتطف من جراثيم الممتزة، يدل على فعل الامتزاز الناجحة (الشكل 2أ).
ويمكن تقييم فعالية رد فعل الامتزاز بطرق مباشرة وغير مباشرة. تقييم كفاءة الامتزاز المباشر يعتمد على البروتين مغايرة التي استخدمت، ويمكن تنفيذها بواسطة fluorescence مجهرية (الشكل 2ب) وسيتوفلوريميتري (الشكل 2ج) على الكسر بيليه بعد تجزئة من رد فعل الامتزاز. إجراء تقييم كمي للإشارات الفلورسنت موجودة على جراثيم يمكن أن يؤديها باستخدام البرمجيات إيماجيج (رقم 3 و رقم 4). تحليل كفاءة الامتزاز غير مباشر يمكن أن يؤديها نقطة النشاف تحليل (الشكل 5ألف) في كسر طافية يحتوي على البروتين غير منضم (الشكل 1). ثم تسمح بتحليل دينسيتوميتريك للبروتين غير منضم (الشكل 5ب) العلماء لحساب كمية البروتين تمتز على جراثيم غير مباشر.
يمكن حفز ردود فعل متتالية اثنين من خلال مزيج جراثيم عرض أحد الإنزيمات محددة اثنين (الشكل 6A). يمكن جمعها في الممتزة enzyme(s) مع خطوة بسيطة الطرد المركزي، غسلها، والمحتضنة مع الركازة جديدة لدورة جديدة لرد فعل (الشكل 6ب).
الشكل 1:المخطط العام للتجربة الامتزاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : توجيه تحليل كفاءة عرض مرفب. لطخة الغربية (A) بجسم مرفب على حدة. ج + = مرفب المنقي مجاناً؛ ج-= استخراج بروتين من جراثيم لا تمتز للبروتين؛ P2/P5/P10 = البروتينات المستخرجة من الجراثيم ب-نجحت تمتز مع 2 و 5، و 10 مغ من مرفب، على التوالي. (ب) الفحص المجهري الفلورة في الممتزة جراثيم. وأجريت إيمونوريكشنز مع جسم أساسي الاعتراف بالبروتين الممتزة وجسم ثانوي فلورسنت مترافق مع fluorescein isothiocyanate (فيتك). اللوحة اليسرى يبين fluorescence مرفب حمراء مضمنة، اللوحة اليسرى يبين الفلورية الخضراء من جسم الثانوي مترافق FITC. (ج) تحليل سيتوميتريك من جراثيم الممتزة تدفق. وتجاوب مع الأجسام المضادة مرفب محددة ومع الأجسام المضادة الثانوية مترافق FITC الجراثيم، ثم تم تحليلها بواسطة سيتوفلوريميتري. وأجرى التحليل على السكان بوغ كامل (أحداث 10,000، أونجاتيد). في اللوحة اليمنى، يبين عدم تمتز جراثيم جراثيم سوداء، تمتز مرفب باللون الأحمر. اللوحة اليسرى يظهر المؤامرة دوت مبعثر أمامية وجانبية (منتدى التعاون الأمني-التعاون بين بلدان الجنوب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الكمي اليدوي لإشارة الفلورسنت من إيماجيج- صورة مجهر الأسفار من جراثيم، تمتز مع مرفب البروتين الأحمر نيون، حلل مع برنامج إيماجيج. وضعت دائرة صفراء حول بوغ واحد للحصول على بيانات دينسيتوميتريك (الصورة الموسعة). مربع منبثق يظهر نتائج تحليل دينسيتوميتريك بوغ المحدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الكمي المتزامن لإشارة الفلورسنت من إيماجيج- (أ) الحصول على مربع المنبثقة عند اختيار تحليل الجسيمات. قيمة الفاصل زمني من 50-200 بكسل ^ 2 يجب أن يكون تعيين لجراثيم23. (ب) تجزئة الصورة من الشكل 3ألف بعد استخدام تحليل الجزيئات (يسار)، ونتائج التحليل دينسيتوميتريك النسبية (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: دوت تحليل النشاف ودينسيتوميتريك- النشاف مع تخفيف المسلسل من مرفب المنقاة في تكرار (1 من الأمراض المنقولة جنسياً والأمراض المنقولة جنسياً2) والمادة طافية (S10 و S5 و S2) لرد فعل الامتزاز يؤديها مع 10 و 5 و 2 ميكروغرام من مرفب، على التوالي23نقطة (A). النشاف (ب) النقطة للفريق A يستخدم لتحليل دينسيتوميتريك. الدوائر تشير إلى منطقة تستخدم بكثافة الإشارات كوانتيتاتي. تقارير الفريق المعني بالحق مثالاً على النتائج التي تم الحصول عليها في التحليل دينسيتوميتريك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: تحويل زيلان بجراثيم القابل لإعادة الاستخدام- (أ) المخطط العام لتدهور زيلان. جراثيم (ب) عرض إكسيلاناسي أو الإنزيمات β-إكسيلوسيداسي، عندما تمزج معا، حفز تدهور خطوتين إكسيلان. بعد أن رد الفعل، هو مجزأ العينة باستخدام الطرد المركزي. المادة طافية يحتوي على المنتج، ورد فعل بينما بيليه يحتوي على إنزيمات بوغ زمنياً يمكن إعادة استخدامها عن طريق إضافة الركازة الطازجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول الامتزاز بوغ جداً بسيط ومباشر. أن رد الفعل يعتمد كلياً على درجة الحموضة من رد فعل المخزن المؤقت وكفاءة الامتزاز الأمثل في قيم الأس الهيدروجيني الحمضية (pH 5.0 أو أقل). في ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة، وكفاءة الامتزاز منخفض، وفي قيم الأس الهيدروجيني قلوية، وقد لا يحدث الامتزاز. والامتزاز الأمثل يتم الحصول عليها باستخدام وحدة تخزين من 200 ميليلتر في أنابيب 1.5 مل (أو الحفاظ على نسبة مماثلة) على شاكر هزاز.
الامتزاز ضيق جداً، ويغسل مع المخزن مؤقت على درجة الحموضة نفس المخزن المؤقت رد فعل لا تتسبب في أي إصدار من البروتينات الممتزة. يغسل مع المخازن المؤقتة القلوية يؤدي إلى الحد الأدنى (عادة أقل من 15%26) الإفراج عن البروتين الممتزة.
تقييم كفاءة الامتزاز النشاف دوت غير المباشرة موثوق بها إذا كان يتم تحليل تخفيف العديد من البروتين المنقي المنضمة وغير المنضمة، ويتم إجراء تحليل دينسيتوميتريك بشكل صحيح. وقد أية أدلة على تدهور البروتينات مغايرة عن25. تقييم كفاءة الامتزاز المباشر يعتمد اعتماداً كبيرا على البروتين الذي هو تمتز. إذا كان البروتين أوتوفلوريسسينت أو المسمى فلوريسسينتلي، يوفر تحليلاً ImageJ ساعد تحديد كمية الأسفار وكميات من جزيئات الفلورسنت الحالي على بوغ. إذا كان نشاط الأنزيمي للبروتين، تحليل الأنزيمي محددة يمكن أن توفر مؤشرا لكميات البروتين هذا على الجراثيم. ومع ذلك، فمن المعروف أنه يمكن زيادة النشاط الأنزيمي المرتبطة بجراثيم بتأثير استقرار نتيجة للتفاعل مع سبور13. إذا لم يكن البروتين الممتزة الفلورسنت وليس لديه نشاط الأنزيمي، يمكن تقييم كفاءة الامتزاز بنقطة النشاف على جراثيم انتزعت تحت شروط صارمة.
مجموعة من الجراثيم المستخدمة يمكن أن يتم بإجراء بسيط جداً. خطوة غسيل مع رد فعل المخزن المؤقت قد تكون هامة لإزالة المنتجات الثانوية رد الفعل، بينما إضافة الركازة جديدة أمر ضروري الشروع في رد فعل جديد21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "فينانزيامينتو di اتينيو دي ريشيركا" للأم باكسيجالوبي، عنوان المشروع "وضع SP: الجراثيم البكتيرية كمنصة لايف لعرض البروتينات".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
