Summary
이 프로토콜은 다양 한 생물 학적 활동 분리 분자를 흡착 하는 "라이브" nanobiotechnological 도구로 세균성 포자의 사용에 초점을 맞추고. 흡착의 효율성을 측정 하는 방법도 표시 됩니다.
Abstract
세균성 포자 탈수 세포질을 둘러싼 보호 계층의 시리즈에 의해 형성 된 metabolically 무부하 셀입니다. 이 독특한 구조는 매우 안정적이 고 저항 하는 포자를 만드는 하 고 분리 분자를 표시 하는 플랫폼으로는 포자를 사용 하 여 제안 했다. 처음에 의해 재조합 접근 그리고, 간단 하 고 효율적인 nonrecombinant 방법에 의해 지금까지, 다양 한 항 원 및 효소 새 균의 subtilis 와 다른 몇 가지 종류의 포자에 표시가 되었습니다. Nonrecombinant 디스플레이 시스템 재조합 종자의 구조와 유전자 변형된 박테리아는 환경에의 릴리스를 피하고 포자 표면에 분자를 분리의 직접 흡착을 기반으로 합니다. 흡착된 분자는 안정 하 고 항 원의 급속 한 저하와 불리 한 조건에서 효소 활동의 손실을 제한 하 포자와 상호 작용에 의해 보호. 활용 하 고, 일단 포자 흡착 효소 활동의 최소한의 감소와 함께 쉽게 수집 고 추가 반응 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 이 종이에 B. subtilis의 순화 된 포자를 모델 분자를 흡착 하는 방법, 흡착의 효율성을 평가 하는 방법 및 새로운 반응에 대 한 재활용 사용된 포자를 수집 하는 방법 표시 됩니다.
Introduction
디스플레이 시스템 미생물의 표면에 생물 학적 활성 분자를 제시 하 고 다양 한 분야, 의료 및 환경 바이오를 산업에서 응용 프로그램을 찾는 겨냥 된다. 페이지1의,2 와 셀의 다양 한 그람 음성 및 긍정적인 종3,,45,,67, 세균성 포자도 있다 두 가지 방법8,9에의해 디스플레이 시스템으로 제안 했다.
독특한 구조, 즉 탈수 세포질 둘러싸여 보호 레이어10의 시리즈 때문에 포자는 몇 가지 이점을 살 균 소 및 셀 기반 디스플레이 시스템8,9를 제공 한다. 첫 번째 장점은 모든 다른 셀10,11해로운 것 조건에서 포자의 안정성과 극단적인 견고성에서 비롯 됩니다. 포자 표시 된 항 원 및 효소는 안정 후 실 온12 에서 스토리지를 연장 및 낮은 pH와 높은 온도13저하에서 보호. 포자의 두 번째 장점은 많은 포자 형성 종의 안전입니다. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, 그리고 다른 여러 종의 probiotics로 사용 되 고 수십 년간14,15인간 또는 동물 사용에 대 한 시장에 왔다. 이 뛰어난 안전 기록 표면 디스플레이 시스템에 대 한 분명 일반적인 요구 사항 이며 때 시스템은 인간 또는 동물 사용16를 위한 특정 한 관련성의 이다. 세 번째, 중요 한 포자 기반 디스플레이 시스템의 장점은 노출 되는 분자의 크기에 대 한 한계는 없습니다. 페이지 기반 시스템에서 분리 단백질이 큰 영향을 미칠 수 구조는 capsid의 셀 기반 시스템에 (서) 동안 그것은 막의 구조에 영향을 미칠 수 있습니다 또는 저하 될 수 있습니다 제한/막 전 단계17. 포자를 둘러싼 보호 계층 이상의 70 다른 단백질10 으로 구성 되며 분명 구조적 결함 또는 기능 장애8없이 큰 외국 단백질을 받아들일 수 있도록 유연. 또한, 두 포자 기반 디스플레이 시스템과 분리 단백질의 막 전은 하지 필요한8,9. 실제로, 분리 단백질 중 어머니 세포 세포질에서 생산 되며 동일한 세포질에 형성 또는 성숙한 포자8,9에 흡착 하는 포자에 조립.
포자 디스플레이 처음 포자 표면18를 유전자 시스템을 개발 하 여 얻은 했다. 이 유전자 시스템에 근거 했다) (캐리어로 사용) 포자 외 투 단백질을 위한 유전자 코딩 하 고 되도록 단백질을 위한 유전자 코딩 사이의 유전자 융합 건설 표시-는 내 생의 transcriptional 변환 신호 존재 유전자 융해, 및 ii의 식을 제어) 유전적 안정성을 부여 하는 B. subtilis 염색체에 공상 유전자의 통합. 항 원 및 효소의 다양 한 항공사와 다양 한 잠재적인 응용 프로그램을 겨냥, biocatalyst, 바이오 센서, bioremediation, 점 막 백신에서까지 다양 한 포자 표면 단백질을 사용 하 여이 재조합 형 접근 방식에 의해 표시 되었습니다 또는 생물 도구8,13.
더 최근에, 포자 디스플레이의 다른 접근 방식이 개발된19되었습니다. 이 두 번째 시스템은 nonrecombinant 고9포자 표면 분자의 자연과 매우 엄격한 흡착 한다. 항 원19,20 및 효소13,21 효율적으로 표시 되었습니다 그리고이 방법은 재조합 형 보다 훨씬 더 효율적 이다 하는 것을 계시 했다. Nonrecombinant 이렇게 네이티브 양식20 에서 단백질의 디스플레이 허용 하 고 사용할 수 있습니다 또한 압력가, 죽음 포자19. 흡착의 분자 메커니즘은 하지 되었습니다 완전히 명백 하 게 아직. 네거티브 차지 하 고 있는 포자의 hydrophobicity 흡착13,,1922에 대 한 관련 속성으로 제안 되었습니다. 최근에, 그것은 모델 단백질, 빨간 autofluorescent 단백질 (mRFP)는 산호 Discosoma, 포자에 흡착 할 때의 내부 코트23에 지역화 표면 레이어를 통해 침투 수 있었습니다 표시 되었습니다. 다른 단백질에 대 한 사실 증명, 분리 단백질의 내부 지역화 포자23에 흡착 될 때 그들의 증가 한 안정성을 설명할 수 있었다.
최근 연구에서 두 효소 catalyzing xylan 저하 통로의 2 개의 연속적인 단계 B. subtilis 의 포자에 독립적으로 표시 했다 고, 함께 알을 품을 때 모두 저하 단계21를 수행 수 있었다. 포자 수집 후 반응 했다 여전히 적극적이 고 신선한 기판21의 추가 따라 xylan 저하를 계속할 수 있습니다. 경우에 최종 제품의 약 15%의 손실 두 번째 반응21에서 관찰 되었다, 다단계, 뿐만 아니라, 단일 반응에 대 한 흡착된 효소의 재사용은 포자 디스플레이 시스템의 추가 중요 한 이점이 다.
팬 외.24 보고 포자 표면에 분리 단백질을 표시 하는 추가 접근: 포자 형성 동안 어머니 셀에서 생산 분리 단백질 (endoglucanase 단백질 및 베타-galactosidase 하나) 자발적으로 했다 운반대의 필요 없이 형성 포자 외 투에 쌌 다. 이 추가 포자 디스플레이 시스템은 지금까지 설명 된 두 가지 방법의 조합. 사실, 그것은 재조합 이후 분리 단백질 코트 내 자신의 어셈블리 자발적인 동안 포자 형성, 동안 어머니 세포에 표현 될 설계 했다 및, 따라서, nonrecombinant24. 그러나,이 추가적인 접근의 표시의 효율성을 테스트 하 고 동일한 분리 단백질을 사용 하 여 다른 두 방법에 비해 남아 있다.
현재 프로토콜 포자 생산의 프로세스를 제외 하 고 정화 되었습니다 설명 되어 광범위 하 게24. 흡착 반응, 도트 blotting과 형광 현미경에 의해 흡착 효율 평가 및 라운드 추가 반응에 대 한 흡착된 효소의 재활용.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 흡착 반응
- 2, 5, 및 10 µ g mRFP의 바인딩 버퍼, 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 4.0 (16.7 m m 구 연산 나트륨이 수화물; 33.3 m m 구 연산 산) 1 h 락 통 (그림 1)에 25 ° C에서의 200 µ L에 B. subtilis 야생-타입 순화 된 포자의 2 x 109 품 어 .
- 펠 릿 (P2, P5, P10)과 (S2와 S5, S10) supernatants 충분치에 바인딩 혼합물 (13000 x g 10 분)을 원심. 3.2 단계에서 설명 하는 흡착의 효율성의 간접 평가 supernatants 저장 합니다.
- 2 펠 릿을 세척 바인딩 버퍼 및 바인딩 100 µ L에서 버퍼링 및 다음 분석을 위해 그것을 사용 하 여 resuspend의 200 µ L x.
참고: 바인딩 반응이 우선적으로 단백질;의 전자 보다 낮은 pH 값에 발생 일반적으로 1.5 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 4.0, 또는 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 4.0, 사용 됩니다.
2. 직접 흡착 효율 평가
-
표면 단백질 및 서쪽 오 점 분석의 추출
- MRFP 흡착 포자 물의 resuspension (P2, P5, 및 단계 1.3 P10)의 50 µ L 고 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) x 2의 50 µ L 추가-dithiothreitol (DTT) (0.1 M Tris HCl, pH 6.8; 2 %SDS, 0.1 M DTT) solubilize 포자 표면 단백질을.
- 사용 하 여 무료, 순화 mRFP와 동일한 양의 포자는 하지 흡착 단백질에 긍정적이 고 부정적인 컨트롤로 각각의 추출 물.
- 65 ° C에 외피의 45 분, 후 원심 (13000 x g 10 분)는 혼합물 및 분석 10 µ L의 추출 된 단백질 (표면에 뜨는) 서쪽 오 점 여는 단일 클로 널과 반대로 그의 항 체는 그의 인식 태그 mRFP ( 의 N 맨끝에 존재 그림 2A).
-
형광 현미경 관찰
참고: 형광 분리 단백질을 사용 하 여 면역 형광 분석을 수행, 그것은 지역화 하 여 형광 현미경 검사 법에 의해 흡착된 분자를 계량.- 1.3 단계에서 흡착된 포자 물의 resuspension의 5 µ L 고 95 µ L 1 x PBS, pH 4.0 ~ 106 포자 / µ L x 1를의 추가.
- 현미경 슬라이드에 현 탁 액의 장소 5 µ L 이전 폴 리-l-리 신 30으로 치료 하는 coverslip로 커버 s, 형광 현미경으로 관찰 하 고.
- 각 필드에 대 한 단계 대조 현미경 이미지 및 형광 현미경 이미지 (그림 2B)를 저장 합니다.
참고: 또는, 형광 포자 분석할 수 있습니다 cytofluorimetry에 의해. Resuspend 106 포자의 총 흡착 또는 아닙니다-1 x PBS, pH 4.0의 1 mL에 분리 단백질 흡착 및 분석 흐름 cytometer (그림 2C)를 사용 하 여 정지.
-
ImageJ를 사용 하 여 데이터 분석
- ImageJ 소프트웨어 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 및 모든 이미지는 8 비트 형식으로 다는 것을 확인 하는 검사와 형광 현미경 이미지를 열고 (이미지 | 유형 | 8 비트).
- 필요한 경우 대비를 조정 (이미지 | 조정 | 밝기 대비) 고 규모는 이미지의 픽셀 인지 확인 합니다 (이미지 | 설정 규모).
- 분석 메뉴에서 측정 설정선택 합니다. 영역, 통합 밀도및 의미 회색 값 이 선택 되었는지 확인 합니다.
- 드로잉/선택 도구를 사용 하 여 관심의 포자 주위 선 그리기 (즉, 원형, 다각형, 자유형 또는) (그림 3).
- 분석 메뉴에서 측정값 을 선택 (또는 cmd + M을누르십시오). 이 첫 번째 포자에 대 한 값의 스택 팝업 상자가 나타납니다 (그림 3).
- 보기의 필드 측정을 선택에서 적어도 50 다른 포자에 대 한 이러한 두 단계를 반복 합니다.
- (있는 아무 형광) 포자 없이 여러 영역을 선택 하 고 반복 측정; 이 배경에 있을 것입니다.
참고: 크기는 중요 하지 않습니다. 이러한 배경 형광 값 수동으로 백그라운드를 빼기에 사용 됩니다. - 결과 창에서 모든 데이터를 선택 하 고 스프레드시트에 결과 복사 합니다.
- 통합 된 밀도 와 지역 선택 된 포자의 배경 형광 값의 평균을 계산 하 고 수식을 사용 하 여 수정 된 총 당 세포 형광 (CTCF)를 그들을 사용 하 여: CTCF 의미 통합 = 밀도-(평균 면적 평균 배경 형광 x).
참고: 또한 모든 포자 잘 분리 된 경우, 그것은 입자 분석, ImageJ의 명령 다음 함수를 사용 하 여 이미지 필드의 모든 포자를 분석할 수 있습니다. 하지 않도록 소프트웨어 읽고 특정 형광 또는 포자 집계, 입자의 크기는 pixelˆ2에서 설정 = 50-200 (그림 4).
3. 간접 흡착 효율 평가
- 순화 된 단백질에 대 한 직렬 희석을 준비 합니다.
- 0.5 ng / µ L, 바인딩 버퍼를 사용 하 여의 최종 농도에 순화 mRFP의 250 µ L을 포함 하는 첫 번째 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 이 볼륨은 2 차선 로드 충분 합니다.
- 6 이중 직렬 희석 250 µ L (최종 볼륨) 각각의 바인딩 버퍼를 사용 하 여 수행 합니다.
- 두 가지 직렬 희석 (S2와 S5, S10 단계 1.2에서에서) 흡착 반응의 언바운드 mRFP 분수를 포함 하는 표면에 뜨는 샘플에 대 한 준비.
- 1.5 mL 튜브에 각 상쾌한의 100 µ L를 넣고 바인딩 버퍼의 100 µ L를 추가. 6 이중 직렬 희석 200 µ L (최종 볼륨) 각각의 바인딩 버퍼를 사용 하 여 수행 합니다.
- 크기 6 (희석 수) 점 x 5 (샘플 수)의 영역을 커버 하는 니트로 막 (0.45 μ m 컷오프), 9 cm x 10 cm를 잘라. 막 점 오 점 장치의 가스 켓의 가장자리를 넘어 확장 되지 한다.
- Prewet 막 점 오 점 장치에 놓습니다. 막과 근육 사이 갇혀 있는 공기 방울을 제거 합니다. 그 우물을 통해 이동에서 공기를 방지 하기 위해 테이프 또는 파라핀 영화과 기구의 미사용된 부분을 커버.
- 점 오 점 장치 제조 업체에 의해 설명 된 대로 조립 한다.
- 조립 하는 동안 진공을 사용 하는 경우 항 원의 유니폼 바인딩 및 후광 또는 약한 검출 신호를 방지를 잘 당 1 x PBS의 100 µ L로 막 rehydrate.
- 부드럽게 진공에 의해 우물에서 버퍼를 제거 합니다. 최대한 빨리 버퍼 솔루션 모든 우물에서 빼낸, 진공 펌프를 중지 하 고 그것을 분리.
- 두 개의 가장 외부 차선에서 표준 중간 (그림 5)에서 샘플을 로드 합니다. 각 희석의 100 µ L로 적절 한 우물을 채우십시오. 동일한 볼륨 각 잘 사용 하는 모든 샘플 우물의 균질 여과 해야 합니다.
- 2 분 동안 진공 펌프를 켭니다, 그리고 그것을 중지 하 고, 샘플 중력 흐름에 의해 멤브레인을 통해 필터링 할 수 있도록.
- 100 µ L의 PBS와 세척 버퍼 후 또 다른 5 분 동안 실행 하는 진공 펌프는 완전히 배수 장치에서 x 1으로 모든 웰 스 워시.
- 에 진공, 나사, 하 고 조심 스럽게 점 오 점 장치를 엽니다.
- 진공, 멤브레인, 걸릴 끄고 서쪽 오 점 프로토콜에 따라 처리.
- ImageJ 같은 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 필터의 densitometric 분석을 수행 합니다.
- 같은 영역의 원이 그들을 요약 하 고 분석/측정 명령을 사용 하 여 각 도트의 통합된 밀도 측정 합니다.
- 빈 영역에 동그라미를 그리기 및 통합된의 밀도 측정 또는 과정/빼기 배경 명령을 사용 하 여 이미지의 배경 보정을 확인 합니다.
- 로드 된 단백질의 양을 표준 점의 통합된 밀도 연관 하 고 교정 라인 (R2 값 보정 곡선 0.95 이상 이어야 한다).
- 보정 곡선을 사용 하 여 각 샘플 점의 mRFP의 농도 추정.
- MRFP는 언바운드 분수에 남아의 농도 계산 합니다.
참고: 정확한 종료 점 오 점 기구 및, 따라서, 주제를 위해 균일 한 압력을 막 대각선 교차 체계에 따라 나사를 조여 고, 다음, 엽니다 나사를 조입니다 더 강하게 진공 펌프.
4. 포자 수집 및 재사용
- 흡착된 포자의 재활용에 대 한 정화 GH10 XA xylanase의 10 µ g 또는 정제 GH3 XT β-xylosidase, (그림 6A) 1.1-1.3 단계에서 설명한 대로 10 µ g 109 정화 포자 x 2.0의 두 흡착 반응을 수행 합니다.
- 효소 흡착 포자를 포함 하는 알 약을 수집, (50 m m 나트륨 인산 버퍼 pH 6.5에서; 2.48689 g/L Na2HPO4, 4.88991 g/L NaH2포4), 효소 반응 분석 결과 대 한 최적의 버퍼의 50 µ L에서 resuspend 와 adsorbing GH10 XA 또는 GH3 XT 포자의 100 µ L 혼합물을 얻기 위해 함께 그들을 섞는다.
- 기판 (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX])을 추가 하 고 16 h 65 ° c.에 대해 수행 하는 효소 반응 하자
- (13000 x g에서 15 분)에 대 한 반응 혼합물을 원심 고 상쾌한 효소 반응 제품에 포함 된 저장 합니다.
- 신선한 50 mM 나트륨 인산 버퍼 pH 6.5 새로운 기판 (MGX) (그림 6B) 존재의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.
참고: 개 이상의 효소를 Adsorb 아니에요 둘 다 함께 흡착 수 또는 하나에 의해 독립적으로. 후자의 가능성의 흡착 효율성과 반응에 필요한 각 효소의 화학 량 론 균형을 수 있도록 각 효소의 활동의 정량 분석을 촉진 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
성공적인 흡착 부 blotting에 의해 평가 될 수 있다. 반응, 시 혼합물은 원심 분리에 의해 분류 한, 그리고 펠 릿 분수 (그림 1)은 표면 단백질을 추출 하는 데 사용 됩니다. 추출은 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 electrotransferred에 의해 분류 한 고 1 차 및 이차 항 체에 대 한 반응. 흡착된 포자를 추출 하 여 로드 레인에만 예상 되는 크기의 단백질의 존재 성공적인 흡착 반응 (그림 2A)의 지표 이다.
직접 및 간접 방법에 의해 흡착 반응의 효율성을 평가할 수 있습니다. 흡착 효율의 직접 평가 분리 단백질을 사용 하 고 형광 현미경 검사 법 (그림 2B) 및 cytofluorimetry (그림 2C) 펠 릿 분수에 의해 수행 될 수에 따라 달라 집니다. 후에 흡착 반응의 분류. 포자에 형광 성 신호의 정량화 ImageJ 소프트웨어 (그림 3 및 그림 4)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 언바운드 단백질 (그림 1)를 포함 하는 표면에 뜨는 분수의 분석 (그림 5A) blotting 점이 흡착 효율의 간접 분석을 수행할 수 있습니다. (그림 5B) 언바운드 단백질의 densitometric 분석 다음 직접 포자에 흡착 하는 단백질의 양을 계산 하는 과학자를 허용할 것 이다.
두 연속 반응 두 특정 효소 (그림 6A) 중 하나를 표시 하는 포자의 혼합물에 의해 촉매 될 수 있습니다. 흡착된 enzyme(s) 간단한 원심 분리 단계, 세척, 그리고 새로운 반응 주기 (그림 6B)에 대 한 신선한 기판으로 알을 품을 수집할 수 있습니다.
그림 1:흡착 실험의 일반적인 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 직접 mRFP 디스플레이의 효율성 분석. MRFP 특정 항 체로 (A) 서쪽 오 점. C + = 무료 순화 mRFP; C-포자; 단백질을 흡착 하지에서 단백질 추출 = P2/P5/P10 2, 5, 및 10 mg mRFP의 각각 흡착 B. subtilis 포자에서 추출한 단백질을 =. (B) 흡착된 포자의 면역 형광 검사 현미경 검사 법. Immunoreactions 흡착된 단백질을 인식 하는 기본 항 체와 형광 이차 항 체 fluorescein isothiocyanate (FITC)로 활용 된 수행 했다. 왼쪽된 패널 오른쪽 패널 표시 FITC 활용 된 이차 항 체의 녹색 형광 빨간색 내장 mRFP 형광 표시 됩니다. (C) 흡착된 포자의 cytometric 분석 흐름. 포자는 mRFP 특정 항 체와 FITC 활용 2 차 항 체 반응 하 고, 다음, cytofluorimetry에 의해 분석 되었다. 분석은 전체 포자 인구 (10, 000 건의 ungated)에서 수행 되었다. 왼쪽된 패널에서 아니 흡착 포자 블랙, mRFP 흡착 포자 빨간색으로 표시 됩니다. 오른쪽 패널에는 전방 및 측면 (FSC-SSC) 점 점도를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ImageJ로 형광 신호의 수동 정량화. ImageJ 소프트웨어로 분석 빨간 형광 단백질 mRFP를 흡착 하는 포자의 형광 현미경 이미지. 노란색 원 densitometric 데이터 (확대 이미지)를 얻기 위해 한 포자 주위 그려 왔다. 팝업 상자 선택한 포자의 densitometric 분석의 결과 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: ImageJ로 형광 신호 동시 정량화. (A) 팝업 상자 얻은 입자 분석을 선택할 때. 50-200 픽셀의 간격 값 ^2 포자23설정할 수 있다. (B) 후 분석 입자 (왼쪽), 그리고 상대 densitometric 분석 결과 (오른쪽)를 사용 하 여 그림 3A 의 이미지의 분할. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 더 럽 히 고 densitometric 분석 점. (A) 점 중복 (Std1 과 성병2)와 10, 5와 2 µ g mRFP, 각각23의 흡착 반응의 상쾌한 (S10, S5, 그리고 S2) 정화 mRFP의 직렬 희석으로 더럽혀. (B) 점을 blotting 패널 A 의 densitometric 분석을 위해 사용 됩니다. 동그라미 quantitate 밀도의 신호를 사용 하는 영역을 나타냅니다. 오른쪽에 있는 패널 densitometric 분석 결과의 예를 보고 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 재사용 포자에 의해 xylan의 변환. (A) 일반 체계 xylan 저하입니다. (B) 포자는 xylanase 또는 β-xylosidase 효소를 표시 하는 때 함께 혼합 촉매 xylan의 2 단계 저하. 반응 후 샘플은 분류 한 원심 분리에 의해. 상쾌한 펠 릿 포함 신선한 기판에 추가 하 여 다시 사용할 수 있는 포자 바인딩된 효소 반응 제품을 포함 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 포자 흡착 프로토콜은 매우 단순 하 고 간단. 반응이 반응 버퍼의 pH에 엄격 하 게 의존 하 고 흡착 효율은 산 성 pH 값 (pH 5.0 또는 더 낮은)에서 최적의. 중립 pH 조건에서 흡착 효율은 낮은, 그리고 알칼리 성 pH 값에서 흡착 하지 발생할 수 있습니다. 최적의 흡착 락 통에 1.5 mL 튜브 (또는 비슷한 비율을 유지)에 200 µ L의 볼륨을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
흡착이 매우 빡 빡 이며, 반응 버퍼의 동일한 pH buffer로 세척 흡착된 단백질의 어떤 버전을 발생 하지 않습니다. 알칼리 성 버퍼와 세척 최소화 될 수 있습니다 (일반적으로 미만의 1526) 흡착된 단백질의 릴리스.
단백질을 순화 하 고 해방의 여러 희석 분석 하 고 densitometric 분석 제대로 수행 점 blotting에 의해 흡착 효율의 간접 평가 안정적입니다. 분리 단백질의 저하의 증거가 보고25되었습니다. 흡착의 효율성의 직접적인 평가 크게 흡착은 단백질에 따라 달라 집니다. 단백질은 autofluorescent 또는 붙일 레이블이 ImageJ 기반 분석 제공 하는 형광의 형광 분자의 금액의 양적 결정 하는 경우는 포자에 현재. 경우에 단백질 효소 활동, 특정 효소 분석 결과 포자에 단백질 현재 양의 표시를 제공할 수 있습니다. 그러나, 그것은 포자와 관련 된 효소 활동 포자13와 상호 작용으로 인해 안정화 효과 의해 증가 될 수 있습니다 알려져. 흡착된 단백질 형광은 효소 활동을 하지 않은 경우 점 blotting 과감 한 조건 하에서 추출 하는 포자에 의해 흡착의 효율성을 평가할 수 있습니다.
사용 된 포자의 컬렉션은 매우 간단한 절차에 의해 수행할 수 있습니다. 반응 버퍼와 세척 단계 동안 신선한 기판의 추가 새로운 반응21를 시작 필수적 이다 반응 부산물을 제거 하는 것이 중요 있을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 "Finanziamento 디 검색 디 Ateneo" L. Baccigalupi, 프로젝트 제목에 의해 지원 되었다 "SP-레이: 세균성 포자 단백질 디스플레이 대 한 라이브 플랫폼으로".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
