Summary
该协议概述了实验程序, 以描述全基因组的变化, 在与 ALS 和帕金森病相关的蛋白质过度表达的情况下, 组蛋白翻译后修饰 (PTM) 的水平发生。酿酒酵母模型。SDS-PAGE 分离后, 通过西方印迹, 通过修正特异性抗体检测单个组蛋白 PTM 水平。
Abstract
神经退行性疾病, 如肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病 (PD), 每年造成数十万人丧生。缺乏能够阻止疾病进展的有效治疗方案。尽管在大量患者中进行了广泛的测序工作, 但大多数 ALS 和 PD 病例仅由于基因突变就无法解释。表观遗传学机制, 如组蛋白的翻译后修饰, 可能参与神经退行性疾病的病因和进展, 并导致药物干预的新目标。哺乳动物在体内和体外模型 als 和 PD 是昂贵的, 往往需要长期和费力的实验方案。在这里, 我们概述了一种实用、快速和具有成本效益的方法, 利用酿酒酵母作为模型系统, 确定组蛋白修饰水平的全基因组变化。该协议允许对与神经退行性蛋白病有关的表观遗传变化进行全面调查, 证实了以前在不同模型系统中的发现, 同时显著扩大了我们对神经退行性疾病表观基因组。
Introduction
神经退行性疾病是毁灭性的疾病, 几乎没有或根本没有治疗选择。其中, 肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病 (PD) 尤其可怕。大约90% 的 als 和 pd 病例被认为是零星的, 没有家族病史, 而其余病例在家庭中运行, 一般与特定的基因突变1,2有关。有趣的是, 这两种疾病都与蛋白质错位和聚集3,4,5,6有关。例如, 融合肉瘤 (fus) 和 tar dna 结合蛋白 43 (tdp-43) 是 rna 结合蛋白, 在 als7、8、9、10、 11,12, 而α-合核蛋白是蛋白质聚集物的主要组成部分, 称为 le七烯体在pd5,13,14,15。
尽管在大量患者中进行了广泛的全基因组关联工作, 但绝大多数 ALS 和 PD 病例在基因上仍无法解释。表观遗传学能在神经退行性疾病中发挥作用吗？表观遗传学包括基因表达的变化, 在不改变基础 DNA 序列16的情况下发生。一个主要的表观遗传机制涉及组蛋白16的翻译后修饰 (Ptm).在真核细胞中, 遗传物质紧紧地包裹在染色质中。染色质的基本单位是核糖体, 由146个基对 dna 组成, 包裹在一个组蛋白八分体上, 由四对组蛋白组成 (分别为两个组蛋白 H2A、H2A、H3 和 H4)17。每个组蛋白都有一个 n 端的尾巴, 从核糖体中伸出来, 可以通过添加各种化学分子来修饰, 通常是在赖氨酸和精氨酸残留物18上。这些 Ptm 是动态的, 这意味着它们可以很容易地添加和删除, 并包括乙酰化、甲基化和磷酸化等群体。Ptm 控制 DNA 对转录机制的可访问性, 从而有助于控制基因表达18。例如, 组蛋白乙酰化降低了高度基本的组蛋白蛋白和负电荷 DNA 主干之间的静电相互作用的强度, 使乙酰化组蛋白包装的基因更容易获得, 从而更高表示19。最近, 特定组蛋白 ptm 及其组合的显著生物学特异性导致组蛋白编码假说20, 21, 其中写、擦除和读取组蛋白 ptm 的蛋白质都协同作用调节基因表达。
酵母是研究神经退行性变的一个非常有用的模型。重要的是, 许多神经元细胞通路从酵母保存到人类22,23,24。酵母重述 fus、tdp-43 或α-共核蛋白 22、23、24、25、26的过度表达后的细胞毒性表型和蛋白质夹杂物.事实上,酿酒酵母的 als 模型已被用来识别遗传危险因素在人类27。此外, 酵母过度表达人α-共核蛋白允许将 rsp5 网络定性为可吸毒的靶点, 以改善 28,29神经元中α-共核蛋白的毒性。
在这里, 我们描述了一个利用酿酒酵母检测全基因组组蛋白 PTM 变化与神经退行性蛋白病变相关的协议 (图 1)。与其他体外和动物神经退行性模型相比, 酿酒酵母的使用具有很强的吸引力, 因为它使用方便、成本低、速度快。利用以前开发的 als 和 pd 模型22,23,25, 26, 我们在酵母中过度表达了人类 fus、tdp-43 和α-合核蛋白, 并发现了明显的组蛋白 ptm 变化发生在与每个蛋白病30的连接。我们在这里描述的协议可以在从转换到数据分析的不到两周的时间内完成。
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Protocol
1. 用神经退行性蛋白质与病理相关的蛋白质结构转化酿酒酵母
- 在30°c 晃动 (200 转/分) 的酵母提取物肽葡萄糖 (YPD) 肉汤中生长野生型 (WT) 303 酵母。
- 经过12-16小时的生长, 用 YPD 将酵母稀释到600纳米 (OD600) 的光学密度。由于每次转化都需要10毫升的酵母液体培养, 因此为5个转化制备50毫升的酵母液体培养, 这些转化与 FUS、TDP-43、a-synuclein 和向量仅 (ccdB) 结构相对应, 以及负控制转化没有 DNA
- 在30°c 下搅拌酵母, 直到达到0.60 至0.60 之间的 OD600 。这通常需要4-6 小时。
- 酵母生长完成前 30分钟, 对质粒结构进行线性化。
注: 此处使用的质粒结构必须直接集成到基因组中, 因此在转换之前需要进行线性化。- 计算为1微克的质粒存量, 从44微克减去该体积, 以计算所需的无核核酸酶无核武器区 h2o的数量。
- 在微离心管中加入无核酸酶的 h2o、5μl 的10倍限制酶缓冲液 (材料表)、1Μl 的 NheI 限制性酶 (材料表) 和适当数量的质粒 (按步骤计算 1.4.1).通过上下移液彻底混合, 在37°c 孵育15分钟。质粒现在已经线性化, 可以转换了。
- 酵母培养达到 0.6-0.8 的 OD600后, 在50毫升锥形管中收获细胞, 在4°c 下在 850 x 克的温度下旋转3分钟。
- 在4°C 的情况下, 在 850 x 克的10毫升中清洗细胞颗粒, 在4°c 下清洗细胞颗粒3分钟。重复 3倍, 共进行四次清洗。
- 在第三次清洗开始时, 在加热块上, 每次转化反应解冻10μl 三文鱼精子 DNA 5分钟。
- 在每次转化100μl 的 Dh2o中重新杀剂细胞颗粒, 并分裂成适当数量的微离心管。对于五个转变, 将颗粒重新悬浮到500Μl 的 Dh2o中, 并均匀地分裂成五个独立的微离心管。
- 在室温 (RT) 下, 以 850 x g 离心 5分钟, 并去除所有剩余的水。
- 按以下顺序添加50Μl 无菌 h2 o、240Μl 的50% 聚乙二醇 (peg)、36μl 的 1 m liac、10μl 的鲑鱼精子 dna、20Μl 的线性化质粒 dna (或无核酸酶的无核酸水, 无 dna 控制转化)。每次添加后, 在添加所有转化成分后, 应进行短暂的混合和旋涡。
- 在42°c 下培养转化反应20分钟。
注: 在水浴中进行此孵育, 以实现更一致的温度控制。 - 在 RT 以 470 x克离心 5分钟, 丢弃上清液, 并在200μl 无菌 H2o 中重新悬浮每个细胞颗粒.
- 板酵母悬浮在选择性介质板上, 并与滚动珠子或摊铺机一起传播。在30°c 下将板材孵化2-3天。
注: 合成定义 (SD)-他的盘子用于此处描述的质粒。
2. 调查菌落生长抑制和储存在甘油库存中
- 在5毫升的选择性培养基中从转化板中接种单菌落, 辅以2% 的松糖。在30°c 的振动台上过夜。每次转换至少选择12个菌落。
注: 在 "无 DNA" 转化控制板中不存在菌落。 - 用乙醇消毒引脚霜, 然后是燃烧。
- 对于每种培养物, 96 孔板的第一排都有100μl 的饱和细胞悬浮液。在相邻井柱的所有井中加入200μl 无菌 h2o。对于 1: 5 串行稀释, 用多通道管道将第一列的50Μl 添加到后面的相邻柱中。通过移液彻底混合。然后将第二列的50Μl 添加到第三列, 然后通过移液进行混合。对盘子的其他部分重复这一点。
- 板材酵母, 方法是将青蛙放入96孔板中, 然后轻轻地均匀地压在有半乳糖和不含有半乳糖的选择性介质板上冲压。在30°c 下孵化2-3天。
注: Sd-her 和 Sgal-hed。 - 对于 FUS、TDP-43 和 a-sy核能转化, 识别在半乳糖存在的情况下表现出最大生长抑制的菌落。从 Sd-hed 的平板中选择这个群体, 并接种10毫升的选择性培养基, 辅以2% 的松糖, 以实现隔夜生长。对于矢量控制, 选择一个在半乳糖存在的情况下没有抑制生长的菌落。
- 制备甘油库存时, 将饱和液体培养的0.5 毫升与50% 甘油的0.5 毫升结合。通过上下移液和在-80°c 下冻结进行混合。
注: 甘油库存可在-80°c 下储存长达一年。
3. 神经退行性蛋白病相关蛋白在酿酒酵母中的过度表达
- 从冷冻甘油库存, 在组氨酸上的再条纹酵母, 2% 葡萄糖琼脂选择性培养基板和孵育在 30°c 2-3天。
- 在5毫升的组氨酸选择性液体介质中, 再加上2% 的松糖, 对每种过度表达模型进行接种单菌落和对照。在30°c 下连夜晃动 (200 转/分)。
- 为每个过度表达模型和控制 (FUS、TDP-43 和矢量控制; a-sy核苷和矢量控制) 增加100毫升液体培养。
- 在选择性培养基中制备100毫升培养物, 辅以2% 的半乳糖。
- 测量隔夜培养物的 od 600 , 并计算出在0.3 的开始 od600上呈现过度表达文化所需的隔夜培养量。通常情况下, 隔夜文化将达到 0.9-10 的 OD600 , 需要约5毫升的隔夜文化来启动100毫升的新鲜文化。
- 在半乳糖介质上生长酵母 (见步骤 3.3.1), 在30°c 下晃动 5小时 (FUS 和 TDP-43) 或 8 h (a-sy核能), 从而产生蛋白质过度表达。
- 在诱导期结束时测量每种文化的 OD600 。将所有单元计数标准化为最低 OD600值。在50°c 的温度下, 在 850 x g的离心下进行5分钟的离心, 在50毫升管中收获培养物。放弃上清液。
注: 如果在诱导结束时测量的 OD 600 值分别为 100 mL 的 a-sy知 ronin 培养和 100 mL 的控制培养, 则收获 95 ml 的 a-syronin 培养和 67.1 ml 的控制培养。 - 每培养10毫升, 在1毫升无菌 Dh2o中再利用颗粒。通过引用细胞重新悬浮到微离心管中的1毫升, 均匀地拆分颗粒。例如, 如果从100毫升培养开始, 将颗粒重新悬浮在无菌Dh2o 的10 毫升中, 并将其划分为10微离心管。
- 在4°C 下, 以 850 x g 离心 5分钟, 然后去除上清液。在液氮中捕捉冷冻细胞颗粒, 并在-80°c 下储存。
注: 电池颗粒可在-80°c 下存储长达一年。
4. 细胞裂解和西部印迹检测组蛋白翻译后修饰
- 细胞裂解
- 在冰上解冻酵母细胞颗粒, 并在100μl 的 Dh2o中重新悬浮细胞颗粒。
- 在细胞再悬浮液中, 加入 300Μl 0.2 M NaOH 和 20μl 2-硫代乙醇。通过上下移液进行重新扫描。
- 在冰上加生细胞 10分钟, 然后在桌面离心机上离心 30分钟, 丢弃上清液。
- 在100μl 的1X 加载染料中重新使用细胞颗粒, 并在加热块上煮沸10分钟。
注: 6个加载染料的配方可在材料表中找到。
- 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和膜转移
- 准备凝胶室, 将两个凝胶放在凝胶支架中, 用运行的缓冲液将内腔填充到顶部, 并将外腔填充到两个凝胶线标记中。
- 将每口井4.1.4 步骤中的15μl 样品加载到10井12% 的聚丙烯酰胺凝胶中。对于蛋白质阶梯通道, 加载5μl。
- 在 150 V 处运行凝胶约 45分钟, 或直到加载染料前到达凝胶底部。
- 在凝胶运行过程中, 通过将纤维垫 (每凝胶 2个) 浸泡在转移缓冲液中 (材料表) 和将聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜浸泡在甲醇中进行膜转移做好准备。在转移前在转移缓冲液中冲洗膜。
注: PVDF 膜应切割成凝胶的大小, 并使用一个 PVDF 膜的每一个被转移的凝胶。 - 组装, 在半干转移设备电池上, 转移 "三明治": 从底部电极, 地方 (1) 预涂纤维垫, (2) 预置和冲洗 PVDF 膜, (3) 凝胶从步骤 4.2.3, 和 (4) 第二压覆纤维垫。
注: 请务必避免转移 "三明治" 中的气泡。用血清学上的移液轻轻滚动 "三明治", 以迫使气泡。一旦凝胶被放置在 PDVF 膜的顶部, 一定不要移动它。 - 通过将功率包设置为 150 mA 1小时 (对于一个 "三明治") 进行蛋白质转移。
- 组蛋白 Ptm 的修饰特异性抗体检测
- 从转移装置中取出膜。用Dh2o 短暂冲洗。
- (可选) 用 Ponceau-S 染色检查蛋白质的转移, 将足够的 Ponceau-S 染色覆盖一个小塑料盒中的膜, 并在 RT 中轻轻晃动 30-60 s. 去除 Ponceau-S 染色,用 dh2o 冲洗直到背景染色消失, 蛋白质带是可见的肉眼。继续用 Dh2o冲洗,直到从膜上去除所有污渍。
- 用三分体缓冲盐 (TBS) 阻滞缓冲液 (材料表) 在一个小的染色盒中用温和的摇摇作用, 用孵育片在 Rt 孵育膜1小时的块膜。使用足够的阻塞缓冲区来覆盖印迹。
注意: 请注意将膜直立放置在染色盒中, 以便蛋白质所在的膜侧不会朝下。 - 在4°C 时, 用组蛋白修饰特异性抗体对酵母进行反应, 在染色盒中隔夜培养印迹。根据制造商的规格稀释 TBS 阻滞缓冲液中的抗体。还包括适当的核负荷控制, 例如在不同宿主物种中提出的反总量 H3 与改性特异性抗体不同。例如, 如果使用在兔体内培养的抗 H3S10ph 抗体探测 H3S10ph, 请使用在小鼠体内培养的抗总 H3 抗体作为负载控制。根据需要对每个污点重复此操作。
注: 抗体稀释可在一个月内总共重复使用三次。将它们存放在4°c。 - 将膜4x 在自制 TBS + 0.1% 聚山梨酸盐 20 (TBST) 中清洗 5分钟, 并在 RT 摇晃。
- 在制造商指定的稀释剂 (驴抗兔680和驴抗鼠) 下, 用荧光二级抗体在 RT 中培养1小时的荧光二次抗体。
注: 在储存和使用过程中, 必须保护荧光二级抗体不受光线照射。在深色塑料盒或铝箔盖中孵育。 - 用 TBST 清洗膜 4x 5分钟, 在 RT 摇晃时用 TBS 清洗5分钟。
- 可视化荧光西方印迹成像系统上的印迹 2分钟, 分别在800纳米和700纳米通道中可视化抗兔680和抗鼠800次抗体。
注: 从第1节开始独立执行复制。为了在这些实验中进行适当的数据解释, 有必要验证抗体信号响应是否在信号响应是线性的范围内。
- 从转移装置中取出膜。用Dh2o 短暂冲洗。
5. 数据分析和统计
- 在成像软件 (材料表) 中打开印迹的图像。通过绘制一个矩形, 在分析模式下对波段进行框架, 获取矢量控制、TDP-43 和 FUS (或矢量控制和 a-sy核能) 样本中修改特定波段的原始密度。
- 对加载控制频段重复步骤5.1。
注: 每个示例中将有一个加载控制带和一个特定于修改的波段。 - 通过将每个波段除以矢量控制样本中相应波段的密度来计算修改特定波段的相对密度。这将数据规范化到矢量控制。
- 通过将每个波段除以矢量控制样本中相应加载控制带的密度来计算加载控制带的相对密度。
- 通过将修改特定波段的相对密度除以每个样本的加载控制带的相对密度来计算每个波段的调整相对密度。现在, 数据可以以直方图的形式可视化。
注: 为了便于处理, 步骤5.3–5.5 可以在电子表格中完成 (补充文件)。 - 在多次独立复制后, 在两个对照样本和适当的蛋白质病模型 (对照与 FUS、对照与 TDP-43、对照与 A-SY核素) 之间进行 Welch 的 t-测试, p = 0.05 作为意义上的截止点.
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Representative Results
为了说明这个方法, 我们将利用最近发布的结果30。WT 人 FUS 和 TDP-43 被过度表达 5小时, 而 WT α-合核蛋白被过度表达8小时。将 ccdB 构造用作矢量负控制。图 2显示了固体和液体培养物中的生长抑制。酵母被收获了, 并且西部印迹与修改特异性抗体被执行。采用抗总 H3 作为加载控制。在 FUS 过度表达模型中, H3S10ph 和 H3S10ph 的水平明显下降 (图 3a, b)。TDP-43 过度表达模型中 H4K12 和 H4K12 的乙酰化水平显著增加, 在 FUS 或α-合核蛋白过度表达模型中都没有观察到 (图 3c, d)。α-核蛋白过度表达模型中 H3K36me2 和 H2BT129ph 的水平也显著下降 (图 3e, f)。
为了表明组蛋白 Ptm 的变化与神经退行性蛋白病蛋白的表达量相关, FUS 的表达可以通过诱导不同半乳糖水平的蛋白表达来调节 (图 4a)。半乳糖与蔗糖混合在不断变化的比率, 使总浓度的糖在2% 不变, 但半乳糖的量被修改, 导致一系列的蛋白质表达水平。在酿酒酵母中,蔗糖被缓慢代谢为葡萄糖, 从而抑制半乳糖诱导31。因此, 蔗糖既不会激活也不会抑制半乳糖的诱导。用于诱导 FUS 过度表达的半乳糖含量越低, 在固体和液体培养中观察到的毒性就越小 (图 4b, c)。重要的是, FUS 过度表达的水平越低, H3S10ph 水平的减少幅度就越小 (图 4d-f)。
图 1: 酵母模型中与神经退行性疾病蛋白病有关的组蛋白翻译后修饰变化的描述方法概述.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 酵母模型中神经退行性蛋白病相关蛋白过度表达的毒性.发现检测显示酵母在葡萄糖 (a) 或半乳糖 (b) 存在的情况下, 对酵母过度表达的载体控制、TDP-43、fus 或α-合核蛋白的细胞活力。(c) 生长曲线, 说明半乳糖诱导下液体培养中细胞的活力。误差线表示±标准偏差。n = 3 为每个应变。复制完全独立实验的结果。经陈、K 等人许可改编的数据与不同的组蛋白修饰图有关。Acs 化学神经科学.9(4), 838-848 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 与酵母模型中神经退行性蛋白病相关蛋白过度表达相关的组蛋白翻译后修饰的变化.FUS 蛋白病模型显示 (a) h3s10 ph、n = 6 和 (b) H3S10ph, n = 3 的水平下降。相反, TDP-43 蛋白病模型显示 (c) h4k12ac 水平增加, n = 3 和 (d) H4K12ac, n = 6, 而α-syracrin 模型显示 (e) h3k36me2、n = 3 和 (f) h2bt129ph, n = 7 的水平下降。误差条显示 + 标准偏差。*, p < 0.05, * * *, p < 0.001。复制完全独立实验的结果。经陈、K 等人许可改编的数据与不同的组蛋白修饰图有关。Acs 化学神经科学.9(4), 838-848 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: H3S10ph 水平的下降程度与 FUS 过度表达的水平有关.(a) 使用蔗糖和半乳糖比调整 fus 过度表达量的漫画说明。(b) 发现检测显示细胞在存在不同水平半乳糖的情况下的活力。(c) 液体培养中的生长曲线, 显示细胞在存在不同半乳糖水平的情况下的活力。误差线表示±标准偏差。(d) 代表性免疫印迹显示, 随着细胞接触到半乳糖比率的增加, fus 蛋白水平会上升。以磷酸甘油激酶 (PGK) 为负载控制。(e) 免疫细胞的含量相应下降, 半乳糖比率不断增加。(f) (e) 的定量直方图。n = 3 为每个条件。误差线表示量化图表的 + 标准偏差。复制完全独立实验的结果。经陈、K 等人许可改编的数据与不同的组蛋白修饰图有关。Acs 化学神经科学.9(4), 838-848 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的协议提供了一种简单、方便和具有成本效益的方法, 可对与神经退行性蛋白病变相关的全基因组蛋白组蛋白 PTM 变化进行分类。虽然 als 和 PD 还有其他模型, 如体外人类细胞系和小鼠模型32, 但由于其易用性,酿酒酵母仍然很有吸引力。例如, 酵母模型不需要使用无菌罩, 也不需要在细胞培养工作的同时进行强化培训。此外, 酵母的培养试剂也比哺乳动物细胞培养用品更实惠。酵母模型不仅揭示了蛋白质聚集22、23、24、25、26的领域决定因素, 而且还揭示了遗传风险在 ALS27中的因素, 以及蛋白质聚集毒性的改性剂 22。此外, 还发现删除组蛋白去乙酰化酶复合物中的 set3 可以降低 30万-43 在酵母中的毒性。有趣的是, 我们在酵母中的发现与最近关于 fus 小鼠模型和人类 sh-sy5y fus 过度表达模型34,35中组蛋白修饰改变的报告一致。此外, 最近发现的关键 pd 基因 (如snca和park2) 周围 dna 甲基化模式的改变, 支持了 pd36,37中表观遗传学的作用。
在这里, 我们表明, 这些酵母模型也可以用来发现神经退行性蛋白病如何与表观基因组30相互作用。我们发现组蛋白修饰的明显变化与每个蛋白病模型有关。这里概述的协议使我们能够证实以前在其他模型系统中的发现。最值得注意的是, 这种方法提高了我们对神经退行性疾病表观全谱的理解。这里提出的扩展的修改集可以发现新的组蛋白作家和橡皮擦靶点的药物干预。这些结果突出了组蛋白 Ptm 和表观遗传学在 ALS、PD 和其他神经退行性疾病的病理中可能做出的贡献, 并可能为这些疾病的治疗提供新的途径。
在将酵母转化为过度神经退行性蛋白病时, 需要特别注意步骤1.9 和1.10。具体而言, 在步骤1.10 中按适当顺序添加试剂是确保高转换效率所必需的。此外, 选择半乳糖中表现出最抑制生长的菌落也是非常重要的。组装西式三明治时也应小心。在凝胶和膜之间意外添加气泡会阻止蛋白质的转移, 并在印迹上提供块点, 从而阻碍数据分析。
该协议的一个局限性是, 抗体被限制为一次只结合和检测一个或两个组蛋白修饰。在蛋白质过度表达 (步骤 3.4-3.6) 后, 正确地标准化样本也是至关重要的。完全去除所有生长介质将确保每个细胞颗粒最终重新悬浮在相同的体积。同样, 必须小心地将相同数量的细胞悬浮液插入微离心管 (步骤 3.4)。如果样本没有适当标准化, 就很难从组蛋白 PTM 水平的任何变化中得出任何结论。这种问题将在西方印迹的装载控制水平上的差异中显现出来 (第4.2 节)。为了补救这种情况, 装有相关样品的 SDS-PAGE 凝胶可以被涂污, 从而能够对样品进行蛋白质带定量 (第5节), 并随后根据每个样品上存在的蛋白质量对样品进行重新标准化。
总之, 该协议允许在不到两周的时间内分析与神经退行性蛋白病变相关的蛋白质过度表达相关的组蛋白 PTM 变化, 从转化到统计分析。除了能够研究与神经退行性疾病相关的蛋白病, 这个一般的协议可以用来研究组蛋白 PTM 在任何酵母过度表达模型的变化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢罗耶娜·塔纳兹、胡达·优素夫和萨迪卡·塔森的技术帮助。我们非常感谢詹姆斯·肖特教授在蔗糖调谐实验的设计方面慷慨提供试剂和智力援助。酵母浆浆体是 Aaron Gitler 教授的慷慨礼物 (包括 303Gal-FUS;添加基因质粒 # 29614)。布鲁克林学院和高级科学研究中心 (纽约市立大学) 以及国家卫生研究院 NINSS 高级博士后过渡奖 (K22NS09131401) 支持 m. p. t。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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