Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller

Published: March 24, 2019 doi: 10.3791/59104
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1, 1,4
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

Summary

Denne protokol beskriver eksperimentelle procedurer for at karakterisere genome-wide ændringer i niveauet af Histon posttranslationelle modifikationer (PTM) forekommer i forbindelse med overekspression af proteiner er forbundet med ALS og Parkinsons sygdom i Saccharomyces cerevisiae modeller. Efter SDS-PAGE adskillelse registreres individuelle Histon PTM niveauer med modifikation-specifikke antistoffer via Western blotting.

Abstract

Neurodegenerative sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sygdom (PD), forårsage tab af hundreder af tusinder af liv hvert år. Der mangler effektive behandlingsmuligheder at standse sygdomsprogression. Trods den omfattende sekventering indsats i store patientgrupper forblive størstedelen af ALS og PD tilfælde uforklarlige af genetiske mutationer alene. Epigenetik mekanismer, såsom den posttranslationel modifikation af Histon proteiner, kan være involveret i neurodegenerativ sygdom ætiologi og progression og føre til nye mål for farmaceutisk intervention. Pattedyr in vivo og in vitro-modeller af ALS og PD er dyre og kræver ofte langvarig og besværlig eksperimentelle protokoller. Her, skitsere vi en praktiske, hurtig og omkostningseffektiv fremgangsmåde til bestemmelse af genome-wide ændringer i Histon ændring niveauer ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae som et modelsystem. Denne protokol giver mulighed for omfattende undersøgelser af epigenetiske ændringer tilsluttet neurodegenerative proteinopathies, der underbygger tidligere resultater i forskellige modelsystemer mens betydeligt udvide vores kendskab til den neurodegenerativ sygdom epigenome.

Introduction

Neurodegenerative sygdomme er ødelæggende sygdomme med lidt at ingen behandlingsmuligheder til rådighed. Blandt disse er Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sygdom (PD) særligt forfærdelige. Ca. 90% af ALS og PD tilfælde betragtes som sporadiske, forekommende uden familie historie af sygdommen, mens de resterende sager køre i familier og er normalt knyttet til et specifikt gen mutation1,2. Interessant, er begge af disse sygdomme forbundet med protein mislocalization og sammenlægning3,4,5,6. Eksempelvis, sammenvokset i sarkom (FUS) og TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) er RNA-bindende proteiner, der mislocalize til cytoplasma og samlet i ALS7,8,9,10, 11,12, mens α-synuclein er princippet komponent af proteinholdige aggregater betegnes Lewy organer i PD5,13,14,15.

Trods den omfattende genome-wide association indsats i store patientgrupper forblive det overvældende flertal af ALS og PD tilfælde uforklarlige genetisk. Epigenetik kan spille en rolle i neurodegenerativ sygdom? Epigenetik omfatter ændringer i genekspression forekommende uden ændringer til underliggende DNA sekvens16. En vigtigste epigenetiske mekanisme indebærer de indlæg translationel ændringer (PTMs) af Histon proteiner16. I eukaryote celler og er genetisk materiale tæt pakket ind i kromatin. Basisenhed af kromatin er nucleosome, bestående af 146 basepar af DNA snoet omkring en Histon octamer, sammensat af fire par histoner (to eksemplarer hver histoner H2A, H2B, H3 og H4)17. Hver Histon har en N-terminale hale, der stikker ud af nucleosome og kan blive ændret ved tilsætning af forskellige kemiske grupper, som regel på Lysin og arginin rester18. Disse PTMs er dynamisk, hvilket betyder, at de kan nemt tilføjes og fjernes, og omfatter grupper såsom acetylation, methylering og fosforylering. PTMs kontrollere tilgængelighed af DNA på transkriptionel maskinen, og dermed hjælpe kontrol gen expression18. For eksempel Histon acetylation reducerer styrken af den elektrostatiske interaktion mellem de meget grundlæggende histoneprotein og negativt ladede DNA rygraden, så generne pakket af acetyleret histonerne være mere tilgængelige og dermed meget udtrykt19. For nylig, den bemærkelsesværdige biologiske specificiteten af særlig Histon PTMs og kombinationer heraf har ført til den Histon kode hypotese20,21 i hvilke proteiner, skrive, slette, og læse Histon PTMs alle handle i fællesskab for at modulere genekspression.

Gær er en meget nyttig model til at studere neurodegeneration. Vigtigere, bevares mange neuronal cellulære veje fra gær til mennesker22,23,24. Gær sammenfatte cytotoksicitet fænotyper og protein inklusioner ved overekspression af FUS, TDP-43 eller α-synuclein22,23,24,25,26. I virkeligheden, har Saccharomyces cerevisiae modeller af ALS været brugt til at identificere genetiske risikofaktorer i mennesker27. Derudover gær overekspression menneskelige α-synuclein tilladt til karakterisering af Rsp5 netværk som druggable mål at forbedre α-synuclein toksicitet i neuroner28,29.

Her, beskriver vi en protokol at udnytte Saccharomyces cerevisiae ægprodukters genome-wide Histon PTM ændringer forbundet med neurodegenerative proteinopathies (figur 1). Brugen af S. cerevisiae er særdeles attraktivt på grund af sin brugervenlighed, lav pris, og hastighed i forhold til andre in vitro og animalske modeller af neurodegeneration. Udnyttelse af tidligere udviklet ALS og PD modeller22,23,25,26, vi har overexpressed menneskelige FUS, TDP-43 og α-synuclein i gær og udækkede særskilte Histon PTM forandringer i forbindelse med hver proteinopathy30. Den protokol, som vi beskriver her kan være afsluttet i mindre end to uger fra transformation til dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. omdanne S. cerevisiae med neurodegenerative proteinopathy-forbundet protein konstruktioner

  1. Vokse vildtype (WT) 303 gær i gær extract pepton dextrose (YPD) bouillon natten under omrystning (200 rpm) ved 30 ° C.
  2. Efter 12−16 h af vækst, fortyndes gær til en optisk tæthed på 600 nm (OD600) på 0,25 med YPD. 10 mL af gær flydende kultur vil være nødvendigt for hver transformation, forberede fem transformationer svarende til FUS, TDP-43, en synuclein, og vektor kun (ccdB) konstruktioner, såvel som en negativ kontrol transformation 50 mL af gær flydende kultur uden DNA.
  3. Vokse gær med agitation ved 30 ° C, indtil en OD600 mellem 0,60 og 0,80 er nået. Det tager generelt 4−6 h.
  4. Tredive minutter før gær vækst er komplet, linearize plasmid konstruktioner.
    Bemærk: Plasmid konstruktioner bruges her skal integreres direkte i genomet, og dermed linearisering kræves forud for omdannelsen.
    1. Beregne omfanget af plasmid stock at beløbene til 1 µg. Subtraher denne diskenhed fra 44 µL til at beregne mængden af nukleasen gratis H2O behov.
    2. Tilføje nukleasen gratis H2O, 5 µL af 10 x begrænsning enzym buffer (Table of Materials), 1 µL af NheI begrænsning enzym (Table of Materials) og den passende mængde plasmid (beregnet i trin 1.4.1) til et microcentrifuge rør. Blandes grundigt ved pipettering op og ned og der inkuberes ved 37 ° C i 15 min. Plasmidet er nu lineært og klar til transformation.
  5. Efter gær når kultur en OD600 af 0,6-0,8, høst celler i en 50 mL konisk rør og spin-ned på 850 x g ved 4 ° C i 3 min. Fjern supernatanten.
  6. Vask celle pellet i 10 mL sterilt H2O og centrifugeres ved 850 x g ved 4 ° C i 3 min. Fjern supernatanten. Gentag 3 x for ialt fire vasker.
  7. I starten af den tredje vask, tø op og koge 10 µL af laks sæd DNA pr. transformation reaktion i 5 min på en varme blok.
  8. Resuspend celle pellet i 100 µL af dH2O pr. transformation og opdeles i passende antal microcentrifuge rør. For fem transformationer, resuspend pellet til 500 µL af dH2O og opdele jævnt i fem separate microcentrifuge rør.
  9. Der centrifugeres i 5 min på 850 x g ved stuetemperatur (RT) og fjerne alle resterende vand.
  10. Tilføje, i følgende rækkefølge, 50 µL sterilt H2O, 240 µL af 50% polyethylenglycol (PEG), 36 µL 1 M LiAc, 10 µL af laks sæd DNA, 20 µL af lineariseret plasmid DNA (eller nukleasen gratis vand til ingen DNA kontrol transformation). Blandes grundigt efter hver tilsætning og vortex kort efter alle transformation komponenter er blevet tilføjet.
  11. Inkuber transformation reaktioner på 42 ° C i 20 min.
    Bemærk: Udfør denne inkubation i et vandbad til mere ensartet temperaturstyring.
  12. Der centrifugeres ved 470 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend hver celle pellet i 200 µL sterilt H2O.
  13. Plade gær suspension på selektiv media plader og spredes med rullende perler eller spreder. Inkuber plader i 2−3 dage ved 30 ° C.
    Bemærk: Syntetisk brugerdefineret (SD)-hans plader anvendes til plasmider beskrevet her.

2. opmåling koloni vækst undertrykkelse og opbevaring i glycerol bestande

  1. Podes enkelt kolonier fra transformation plader i 5 mL af selektivt medie suppleret med 2% raffinose. Vokse på en shaker ved 30 ° C natten over. Vælg mindst 12 kolonier pr. transformation.
    Bemærk: Ingen kolonier forventes i "ingen DNA" transformation kontrol plade.
  2. Sterilisere pin-frogger med ethanol, efterfulgt af flammer.
  3. For hver kultur, alikvot 100 µL af mættede cellesuspension i den første række i en 96-brønd plade. Tilføje 200 µL sterilt H2O i alle brønde i de tilstødende godt kolonner. For 1:5 serielle fortyndinger, tilføje 50 µL fra den første kolonne til den tilstødende kolonne bag med multikanal pipette. Blandes grundigt ved pipettering. Derefter tilsættes 50 µL fra den anden kolonne til den tredje kolonne og mix af pipettering. Gentag dette for resten af pladen.
  4. Plade gær ved at placere frogger i en 96-brønd plade og derefter stempling af forsigtigt og jævnt at trykke ned på selektiv media plader med og uden galactose. Der inkuberes ved 30 ° C i 2−3 dage.
    Bemærk: SD-hans og SGal-hans plader anvendes til plasmider beskrevet her.
  5. For FUS identificere TDP-43, og a-synuclein transformationer, kolonien viser det mest vækst undertrykkelse i overværelse af galaktose. Vælg denne koloni fra SD-hans pladen og podes i 10 mL af selektivt medie suppleret med 2% raffinose for natten vækst. For vektor kontrol, vælge en koloni viser ingen vækst undertrykkelse i overværelse af galaktose.
  6. For at forberede glycerol bestande, Kombiner 0,5 mL mættet flydende kultur med 0,5 mL 50% glycerol. Mix af pipettering op og ned og fryse ved-80 ° C.
    Bemærk: Glycerol bestande kan opbevares i op til et år ved-80 ° C.

3. overekspression af neurodegenerative proteinopathy forbundet proteiner i S. cerevisiae

  1. Fra frosne glycerol bestande, re streak gær på histidin, 2% glukose agar selektivt medie plader og inkuberes ved 30 ° C i 2−3 dage.
  2. Podes enkelt kolonier af hver overekspression modeller og kontrol i 5 mL af histidin selektiv flydende medier suppleret med 2% raffinose. Vokse med rysten (200 rpm) ved 30 ° C natten over.
  3. Dyrker 100 mL flydende kultur for hver af de overekspression modeller og kontrol (FUS, TDP-43 og vektor kontrol; en-synuclein og vektor kontrol).
    1. Forberede 100 mL af kultur i selektiv media suppleret med 2% galactose.
    2. Måle OD600 af overnight kulturer og beregne mængden af overnight kultur skulle gengive overekspression kulturer på en begyndende OD600 0,3. Typisk, overnight kulturer vil nå en OD600 af 0.9−10, der kræver ca. 5 mL overnight kultur at starte 100 mL frisk kultur.
    3. Fremkalde protein overekspression af voksende gær på galactose media (Se trin 3.3.1) for 5 h (FUS og TDP-43) eller 8 h (a-synuclein) med rysten på 30 ° C.
  4. Foranstaltning OD600 hver kultur i slutningen af perioden induktion. Standardisere alle celletal til den laveste værdi, OD600 . Høste kultur i 50 mL rør ved centrifugering ved 850 x g i 5 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten.
    Bemærk: Hvis OD600 værdier målt for enden af induktion er 0.654 og 0.984, henholdsvis på 100 mL af en synuclein kultur og 100 mL kontrol kultur, høste 95 mL af en synuclein kultur og 67,1 mL kontrol kultur.
  5. Resuspend pellet i 1 mL sterilt dH2O for hver 10 mL af kultur dyrket. Delt pellet ved aliquoting 1 mL af celle resuspension i microcentrifuge rør. For eksempel, hvis starter med 100 mL af kultur, resuspend pellet i 10 mL sterilt dH2O og opdele den i 10 microcentrifuge rør.
  6. Der centrifugeres ved 850 x g i 5 min. ved 4 ° C, så Fjern supernatanten. Snap fryse celle pellets i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
    Bemærk: Celle pellets kan opbevares ved-80 ° C i op til et år.

4. celle lysis og western blotting ægprodukters Histon posttranslationelle modifikationer

  1. Celle lysis
    1. Tø gær celle pellets på is og resuspend celle pellets i 100 µL af dH2O.
    2. Til celle ophvirvling, tilsæt 300 µL af 0,2 M NaOH og 20 µL af 2-mercaptoethanol. Resuspend af pipettering op og ned.
    3. Inkuber celler i isbad i 10 min og derefter centrifugeres ved 3.200 x g på en bordplade centrifuge for 30 s på RT. udsmid supernatanten.
    4. Resuspend celle pellet i 100 µL 1 x lastning farvestof og koges i 10 min på en varme blok.
      Bemærk: Opskriften på 6 x lastning farvestof kan findes i Tabel af materialer.
  2. Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese og membran overførsel
    1. Forberede gel kammer ved at placere to geler i gel indehaveren og påfyldning indre kammer til toppen med kører buffer og fylde uden for salen til to-gel linje mark.
    2. Indlæse 15 µL af prøven fra trin 4.1.4 pr. brønd til en 10-well 12% polyacrylamid gel. Protein stigen lane, indlæse 5 µL.
    3. Køre gel i ca 45 min ved 150 V, eller indtil lastning farvestof front når bunden af gelen.
    4. Mens gelen kører, forberede membran overførsel af iblødsætning fiber puder (to pr. gel) i overførsel buffer (Table of Materials) og iblødsætning polyvinylidene fluorid (PVDF) membran i methanol. Skyl membran i overførsel bufferen før overførslen.
      Bemærk: PVDF membranen skal skæres til størrelsen af gelen og bruge en PVDF membran for hver gel, der overføres.
    5. På halvtør overførsel apparater celle, samle en overførsel 'sandwich': fra bunden elektrode, placere (1) presoaked fiber pad, (2) presoaked og skylles PVDF membran, (3) gel fra trin 4.2.3 og (4) en anden presoaked fiber pad.
      Bemærk: Sørg for at undgå luftbobler i overførsel «sandwich.» Forsigtigt rulle 'sandwich' med serologisk pipette til at tvinge ud bobler. Når gelen er blevet placeret oven på PDVF membranen, så sørg for ikke at flytte den.
    6. Foretage protein overførsel ved at indstille power pack til 150 mA for 1 h (for en ' sandwich').
  3. Påvisning af Histon PTMs med specifikke antistoffer, ændring
    1. Fjerne membran fra overførsel apparater. Skyl kort med dH2O.
      1. Valgfrit, kontrollere overførslen af proteiner med Ponceau-S pletten ved at hælde nok Ponceau-S pletten for at dække membran i en lille plastik kasse og inkubere på RT med blid ryster for 30−60 s. fjerne Ponceau-S pletten og skyl med dH2O indtil baggrunden pletten forsvinder og protein bands er synlige for det blotte øje. Fortsætte med at skylle med dH2O indtil alle pletten er fjernet fra membran.
    2. Blokere membran af inkubere skamplet for 1 h i RT med blid rokkende med tris bufferet saltvand (TBS) blokerende buffer (Table of Materials) i en lille farvning boks. Brug nok blokerende buffer til at dække skamplet.
      Bemærk: Vær forsigtig til at placere membran oprejst i boksen farvning, så den membran side som proteiner ligge ikke vender nedad.
    3. Inkuber skamplet i boksen farvning natten over med en Histon modifikation-specifikke antistof reaktive mod gær ved 4 ° C. Fortynd antistof i TBS blokerende buffer ifølge producentens specifikationer. Omfatte også en ordentlig nukleare lastning kontrol, såsom anti-total H3 rejst i en anden vært arter fra modifikation-specifikke antistof. For eksempel, hvis sondering for H3S10ph med en anti-H3S10ph antistof rejst i kanin, hjælp en anti-total H3 antistof rejst i mus som lastning kontrol. Gentag dette for hver skamplet som nødvendigt.
      Bemærk: Antistof fortyndinger kan genbruges til i alt tre gange inden for en måned. Opbevar dem ved 4 ° C.
    4. Vaske membran 4 x i hus-made TBS + 0,1% Polysorbat 20 (TBST) for 5 min med vuggende på RT.
    5. Inkuber skamplet med fluorescerende sekundære antistoffer på fabrikanten angivet fortyndinger (æsel anti-kanin 680 og æsel anti-mus) i 1 time på RT.
      Bemærk: Fluorescerende sekundære antistoffer skal beskyttes mod lys under opbevaring og brug. Udføre inkubation i mørke plastkasser eller dække med aluminiumsfolie.
    6. Vaske membran 4 x med TBST til 5 min og vask med TBS for 5 min mens vuggende på RT.
    7. Visualiser skamplet på en fluorescerende vestlige skamplet imaging system for 2 min. visualisere anti-kanin 680 og anti-mus 800 sekundære antistoffer i 800 nm og 700 nm kanaler, henholdsvis.
      Bemærk: Replikater udføres uafhængigt starter fra punkt 1. Det er nødvendigt at kontrollere, at signalet antistofrespons er inden for rækkevidde som signal reaktion er lineær for relevante data fortolkning i disse eksperimenter.

5. dataanalyse og statistik

  1. Åbn billede af skamplet i en billedbehandling software (Tabel af materialer). Erhverve rå tætheden af ændring-specifikke bands i vektor kontrol, TDP-43, og FUS (eller vektor kontrol og en synuclein) prøver, ved at trække et rektangel, der rammer bandet i analyse tilstand.
  2. Gentag trin 5.1 for lastning kontrol bands.
    Bemærk: Der vil være en loading styre band og en modifikation-specifikke band i hver prøve.
  3. Beregne den relative massefylde af ændring-specifikke bands ved at dividere hvert bånd af tætheden af tilsvarende band i vektor kontrolprøve. Det normaliserer dataene til vektor kontrol.
  4. Beregne den relative massefylde af lastning kontrol band ved at dividere hvert bånd af tætheden af tilsvarende lastning kontrol band i vektor kontrolprøve.
  5. Beregne den korrigerede relativ massefylde af hvert bånd ved at dividere den relative massefylde af ændring-specifikke bandet over den relative massefylde af lastning kontrol band for hver prøve. Nu, kan dataene visualiseres i histogram form.
    Bemærk: For at lette behandlingen af trin 5.3-5.5 kan gøres i et regneark (Supplerende fil).
  6. Efter flere uafhængige replikater, køre Welch T-tests mellem to kontrolprøverne og den passende proteinopathy model (kontrol versus FUS, kontrol versus TDP-43 og kontrol versus en synuclein) med p = 0,05 som cutoff betydning .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere denne metode, vil vi drage fordel af Seneste offentliggjorte resultater30. WT menneskelige FUS og TDP-43 var overexpressed for 5 h, mens WT α-synuclein var overexpressed for 8 h. En ccdB konstruktion blev brugt som en vektor negativ kontrol. Figur 2 viser vækst undertrykkelse i faste og flydende kulturer. Gær blev høstet som beskrevet og Western blotting med modifikation-specifikke antistoffer blev udført. Anti-total H3 blev brugt som en loading kontrol. Et betydeligt fald i niveauet af H3S10ph og H3K14ac er tilsyneladende i FUS overekspression model (figur 3ab). Der er betydelige stigninger i niveauet af acetylation på H4K12 og H4K16 i TDP-43 overekspression model, der ikke er observeret i enten FUS eller α-synuclein overekspression model (figur 3 cd). Der er også betydelige fald i niveauet af H3K36me2 og H2BT129ph i α-synuclein overekspression model (figur 3ef).

For at vise, at ændringen i Histon PTMs korrelerer med mængden af udtryk for neurodegenerative proteinopathy protein, kan et udtryk for FUS indstilles ved at inducere protein udtryk i varierende niveauer af galaktose (figur 4a). Galaktose er blandet med saccharose i skiftende nøgletal, således at den samlede koncentration af sukker er konstant på 2%, men mængden af galaktose ændres hvilket resulterede i en række Proteinniveau udtryk. I S. cerevisiae, metaboliseres saccharose langsomt til glukose, som undertrykker galactose induktion31. Derfor, saccharose hverken aktiveres eller undertrykker galactose induktion. Jo lavere mængde af galaktose anvendes til at fremkalde FUS overekspression, blev mindre toksicitet observeret i både faste og flydende kultur (figur 4bc). Vigtigere er, jo lavere niveau af FUS overekspression, jo mindre omfanget af reduktionen i H3S10ph niveauer (figur 4 d-f).

Figure 1
Figur 1: Methodoverview til karakterisering af ændringer i Histon posttranslationelle modifikationer tilsluttet neurodegenerativ sygdom proteinopathies i gær modeller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: toksicitet forbundet med overekspression af neurodegenerative proteinopathy-relaterede proteiner i gær modeller. Spotting assays Vis cellernes levedygtighed for gær overekspression vektor kontrol, TDP-43, FUS eller α-synuclein glukose (et) eller galactose (b). (c) vækst kurve illustrerer cellernes levedygtighed i flydende kultur under galactose induktion. Fejllinjer angive ± standardafvigelse. n = 3 for hver stamme. Replikater skyldes helt uafhængige forsøg. Data tilpasset med tilladelse fra Chen, K. et al. neurodegenerativ sygdom Proteinopathies er forbundet til forskellige Histon Post-translational ændring landskaber. ACS kemiske Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ændringer i Histon posttranslationelle ændringer forbundet med overekspression af neurodegenerative proteinopathy-relaterede proteiner i gær modeller. En FUS proteinopathy model viser nedsat niveau af (en) H3S10ph, n = 6), og (b) H3K14ac, n = 3. Omvendt, en TDP-43 proteinopathy model viser øgede niveauer af (c) H4K12ac, n = 3, og (d) H4K16ac, n = 6, mens en α-synuclein model viser nedsat niveau af (e) H3K36me2, n = 3, og (f) H2BT129ph, n = 7. Fejllinjer show + standardafvigelse. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Replikater skyldes helt uafhængige forsøg. Data tilpasset med tilladelse fra Chen, K. et al. neurodegenerativ sygdom Proteinopathies er forbundet til forskellige Histon Post-translational ændring landskaber. ACS kemiske Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: omfanget af fald i H3S10ph niveauer er bundet til niveauet af FUS overekspression. (en) tegneserie illustration af brugen af saccharose og galactose nøgletal til at tune mængden af FUS overekspression. (b) Spotting assays viser cellernes levedygtighed i overværelse af varierende niveauer af galaktose. (c) vækst kurve i flydende kultur viser cellernes levedygtighed i overværelse af varierende niveauer af galaktose. Fejllinjer angive ± standardafvigelse. (d) repræsentant immunoblots viser at FUS protein niveauer anledning som celler er udsat for stigende nøgletal af galaktose. Fosfoglycerat kinase (PGK) blev brugt som en loading kontrol. (e) repræsentant immunoblots viser tilsvarende fald i H3S10ph niveauer med stigende nøgletal af galaktose. (f) kvantitering histogram af (e). n = 3 for hver betingelse. Fejllinjer angive + standardafvigelse for kvantificering diagram. Replikater skyldes helt uafhængige forsøg. Data tilpasset med tilladelse fra Chen, K. et al. neurodegenerativ sygdom Proteinopathies er forbundet til forskellige Histon Post-translational ændring landskaber. ACS kemiske Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her giver en enkel, hensigtsmæssig og omkostningseffektiv måde at kategorisere genome-wide Histon PTM ændringer korreleret med neurodegenerative proteinopathies. Mens der er andre modeller af ALS og PD, såsom in vitro- modeller humane cellelinjer og murine32, S. cerevisiae forbliver attraktivt på grund af sin brugervenlighed. For eksempel gær modeller kræver ikke brug af en steril hætte, eller har de brug for den intensive træning, går sammen med celle kultur arbejde. Derudover er reagenser til dyrkning af gær også langt mere overkommelig end pattedyr celle kultur forsyninger. Gær modeller er blevet udnyttet til at ikke kun afsløre domæne determinanter for protein sammenlægning22,23,24,25,26, men også har ført til afsløring genetisk risiko faktorer i ALS27, samt modifikatorer protein sammenlægning toksicitet22. Derudover har sletning af Set3, medlem af Histon deacetylase komplekse, vist sig for at reducere TDP-43 toksicitet i gær33. Interessant, er vores resultater i gær enige med de seneste rapporter om Histon ændring ændringer i både en FUS musen model og i en menneskelig SH-SY5Y FUS overekspression model34,35. Derudover har for nylig opdaget ændringer i DNA methylering mønstre omkring centrale PD gener, såsom SNCA og PARK2, støtter en rolle for Epigenetik PD36,37.

Vi viser her, at disse gær modeller kan også bruges til at opdage, hvordan neurodegenerative proteinopathies interagerer med epigenome30. Vi finder, at forskellige ændringer i Histon ændringer er forbundet med hver proteinopathy model. Den protokol, der er skitseret her tillader os at bestyrke tidligere resultater i andre modelsystemer. Mest bemærkelsesværdigt, denne metode har øget vor forståelse af epigenomiske panorama af neurodegenerative sygdomme. Den udvidede række ændringer præsenteret her kunne afdække roman Histon forfatter og viskelæder mål for farmakologisk intervention. Disse resultater fremhæve de mulige bidrag af histonerne PTMs og Epigenetik i patologi af ALS, PD og andre neurodegenerative sygdomme og kan give nye muligheder for behandling af disse sygdomme.

Særlig forsigtighed skal tages i trin 1.9 og 1.10 når omdanne gær til overexpress neurodegenerative proteinopathies. Specifikt, tilføje reagenserne i den rigtige rækkefølge under trin 1.10 er nødvendige for at sikre høj transformation effektivitet. Derudover er det meget vigtigt at vælge kolonien viser det mest vækst undertrykkelse i galactose. Også bør udvises forsigtighed ved montering Western sandwich. Utilsigtet tilsætning af bobler mellem gel og membran vil blokere overførsel af protein og give blok steder på den skamplet, der kan hindre dataanalyse.

En begrænsning af denne protokol er at antistoffer er begrænset til kun bindende og afsløre en eller to Histon ændringer på et tidspunkt. Det er også afgørende at standardisere ordentligt prøver efter protein overekspression (trin 3.4−3.6). Fuldstændig fjernelse af alle vækst medier vil sikre, at hver celle pellet ender genopslemmes i den samme volumen. Det er ligeledes vigtigt at omhyggeligt alikvot den samme mængde cellesuspension til microcentrifuge rør (trin 3,4). Hvis prøverne ikke er standardiseret korrekt, er det vanskeligt at drage nogen konklusioner af eventuelle ændringer på Histon PTM planer. Sådan et problem ville blive synlige i uoverensstemmelser for lastning kontrol af den vestlige skamplet (afsnit 4.2). For at afhjælpe dette, kan en SDS-PAGE gel fyldt med relevante prøver være Coomassie farvede, giver mulighed for protein band kvantificering af prøverne (afsnit 5) og efterfølgende re standardisering af prøver baseret på mængden af protein til stede på hver prøve.

Til sidst, denne protokol giver mulighed for analyse af Histon PTM ændringer forbundet med overekspression af proteiner relateret til neurodegenerative proteinopathies i bare mindre end to uger, fra transformation til statistisk analyse. Bortset fra aktivering af studiet af proteinopathies forbundet med neurodegenerative sygdomme, kan denne generelle protokollen bruges til at studere Histon PTM ændringer i enhver gær overekspression model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Royena Tanaz, Huda Yousuf og Sadiqa Taasen for teknisk hjælp. Vi er meget taknemmelige for Prof. James Shorter den generøse bestemmelse af reagenser og intellektuelle bistand i udformningen af saccharose tuning eksperimenter. Gær plasmider var en generøs gave fra Prof. Aaron Gitler (herunder 303Gal-FUS; Addgene plasmid # 29614). Brooklyn College samt den avancerede videnskab forskning Center (CUNY) og en NIH NINDS avanceret postdoc overgang Award (K22NS09131401) understøttes M.P.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-His DO Supplement Clontech 630415
10x Running Buffer Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide Gels BIO-RAD 456-1041
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody MilliporeSigma 07-353 (Lot No. 2762291) Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody Abcam ab109463 (Lot No. GR187780) Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody Abcam ab46983 (Lot No. GR71882) Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody Abcam ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody Abcam ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody Abcam ab188292 (Lot No. GR211874) Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody Abcam ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30 Eppendorf 6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) Eppendorf 30702118
Cell Culture Plate, 96 well Eppendorf 30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R Eppendorf 22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW LI-COR 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD LI-COR 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) Dilution: 1/2500
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Extra thick blot paper (filter paper) BIO-RAD 1703968
Galactose Sigma-Aldrich G0750 Prepare 20% w/v stock solution.
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Prepare 20% w/v stock solution.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer Membranes MilliporeSigma IPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc) Sigma-Aldrich L4158 Prepare a 1 M solution.
Loading Dye Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
Methanol ThermoFisher A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell BIO-RAD 1658004
Multichannel pipet Eppendorf 2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x New England Bio Labs 102855-152
Nhe I Restriction Enzyme New England Bio Labs 101228-710
Nuclease Free Water Qiagen 129114
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences 2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) ThermoFisher 165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFP Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB Addgene 14133
pAG303Gal-FUS Addgene 29614
pAG303GAL-TDP-43 Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma-Aldrich P4338 Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S Stain Sigma-Aldrich P3504 Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power Supply BIO-RAD 164-5050
Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich R7630 Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNA Agilent Tech 201190
SD-His plates Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His plates Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 Prepare 0.2 M solution.
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking Buffer LI-COR 927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD 170-3940
Transfer Buffer Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeast Gift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Sigma-Aldrich Y1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013 (2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).

Tags

Genetik sag 145 neurodegeneration amyotrofisk lateral sklerose Parkinsons sygdom α-synuclein smeltet i sarkom TAR DNA-bindende protein 43 Histon posttranslationelle modifikationer Epigenetik
Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, S. A., Cobos, S. N.,… More

Bennett, S. A., Cobos, S. N., Meykler, M., Fallah, M., Rana, N., Chen, K., Torrente, M. P. Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models. J. Vis. Exp. (145), e59104, doi:10.3791/59104 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter