Summary
פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.
Abstract
מחלות ניווניות, כגון נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת פרקינסון (PD), לגרום לאובדן של מאות אלפי אנשים בכל שנה. אפשרויות טיפול יעיל מסוגל לעצור את התקדמות המחלה חסרים. למרות המאמצים רצף נרחב באוכלוסיות גדולות החולה, ברוב המקרים ALS ו PD להישאר בלתי מוסברת על ידי מוטציות גנטיות לבד. מנגנוני אפיגנטיקה, כגון שינוי post-translational של חלבוני היסטון, עשויים להיות מעורבים אטיולוגיה מחלות ניווניות והתקדמות ולהוביל מטרות חדשות להתערבות התרופות. אין ויוו בתרבית של דגמים במבחנה של ALS ו PD יקרות ולעיתים קרובות דורשים זמן ממושך ולא מייגעת פרוטוקולים ניסיוני. כאן, אנחנו חלוקה לרמות בגישה מעשית, מהירה וחסכונית לקביעת הגנום כולו שינויים ברמות שינוי היסטון באמצעות האפייה כמו מערכת מודל. פרוטוקול זה מאפשר מקיף חקירות שינויים epigenetic מחובר proteinopathies ניווניות המאששים ממצאים קודמים במערכות מודל שונה תוך הרחבת הידע שלנו באופן משמעותי epigenome מחלות ניווניות.
Introduction
מחלות ניווניות הן מחלות הרסנית עם מעט אין אפשרויות טיפול הזמינות. בין אלה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת פרקינסון (PD) הם נורא במיוחד. כ- 90% מהמקרים ALS ו PD נחשבים לא סדיר, המתרחשים ללא היסטוריה משפחתית של המחלה, ואילו שאר המקרים בתורשה בדרך כלל מקושרות גנים ספציפיים מוטציה1,2. מעניין, שתי המחלות האלה קשורים עם חלבון mislocalization, צבירת3,4,5,6. למשל, התמזגו בסרקומה (FUS) ו DNA זפת מחייב חלבון 43 (TDP-43) הם חלבונים איגוד ה-RNA mislocalize אל הציטופלסמה, צבירה ב- ALS7,8,9,10, 11,12, בעוד α-synuclein הוא המרכיב עיקרון של אגרגטים proteinaceous כינה גופיפי PD5,13,14,15.
למרות המאמצים האגודה הגנום כולו מקיף אוכלוסיות מטופלים גדולים, רובם המכריע של המקרים ALS ו PD להישאר בלתי מוסברת גנטית. אפיגנטיקה יכול לשחק תפקיד במחלות ניווניות? אפיגנטיקה כוללת שינויים בביטוי הגנים המתרחשים ללא שינוי רצף ה-DNA כבסיס16. מנגנון epigenetic העיקרי כרוך השינויים translational פוסט (PTMs) של חלבוני היסטון16. התאים האיקריוטים, חומר גנטי הוא עטוף בחוזקה לתוך כרומטין. יחידת הבסיס של כרומטין הוא נוקלאוזום, המורכב 146 בסיסי זוגות של DNA סביב octamer היסטון, המורכב ארבעה זוגות של שינויים היסטוניים (שני עותקים לכל של שינויים היסטוניים H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4)17. כל היסטון יש מעקב של N-מסוף בולט החוצה נוקלאוזום ולא ניתן לשנות על ידי התוספת של moieties כימיים שונים, בדרך כלל על שאריות של ליזין וארגינין-18. PTMs אלה הם דינאמיים, כלומר ניתן בקלות להוסיף, להסיר והם כוללים קבוצות כגון acetylation, מתילציה זירחון. PTMs לשלוט הנגישות של ה-DNA מכונות תעתיק, ובכך לסייע בקרת גנים ביטוי18. לדוגמה, acetylation היסטון מפחיתה את עוצמת האינטראקציה אלקטרוסטטית בין החלבון היסטון מאוד בסיסי עמוד השדרה ה-DNA טעונים שלילית, המאפשר את הגנים ארוז על ידי שינויים היסטוניים acetylated להיות נגיש יותר ובכך מאוד הביע19. לאחרונה, יחודיות ביולוגית יוצאת דופן של היסטון מסוים PTMs ושילובים שלהם הוביל היסטון קוד ההנחה20,21 ב אילו חלבונים זה לכתוב, למחוק, ולקרוא PTMs היסטון נפעל כדי לווסת את ביטוי גנים.
שמרים הוא מודל שימושי מאוד ללמוד הקשורים ניוון מוחיים. חשוב, משעולים הסלולר עצביים רבים נשמרים מן שמרים-בני22,23,24. שמרים מסכם את הדברים cytotoxicity פנוטיפים ואת החלבון הכללות על ביטוי של FUS, TDP-43 או α-synuclein22,23,24,25,26. למעשה, האפייה מודלים של ALS שימשו לזיהוי גורמי סיכון גנטיים בני27. יתר על כן, שמרים overexpressing האנושי α-synuclein מותרת עבור אפיון הרשת Rsp5 כמטרה druggable דהוא α-synuclein רעילות נוירונים28,29.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ניצול האפייה כדי לזהות שינויים PTM הגנום כולו היסטון המשויך ניווניות proteinopathies (איור 1). השימוש של cerevisiae ס הוא אטרקטיבי ביותר בשל קלות השימוש, עלות נמוכה, ומהירות לעומת דגמים אחרים במבחנה ובבעלי של הקשורים ניוון מוחיים. רתימת קודם לכן פיתחה ALS ו PD מודלים22,23,25,26, לנו יש overexpressed האנושי FUS, TDP-43 וα-synuclein שמרים, חשפו היסטון ברורים PTM שינויים המתרחשים חיבור עם כל proteinopathy30. פרוטוקול זה נתאר כאן יכולה להסתיים בתוך פחות משבועיים של טרנספורמציה כדי ניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שינוי צורה של cerevisiae ס עם בונה חלבונים הקשורים proteinopathy ניווניות
- לצמוח פראי סוג (WT) 303 שמרים, שמרים תמצית peptone מרק דקסטרוז (YPD) בין לילה עם טלטול (200 סל ד) ב- 30 ° C.
- לאחר 12−16 h של צמיחה, לדלל שמרים צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.25 עם YPD. כמו 10 מ"ל של תרבות נוזלי שמרים יהיה צורך לשינוי כל, להכין 50 מ של תרבית נוזלית שמרים להמרות חמש המתאים FUS, TDP-43,-synuclein, וקטור היחידה (ccdB) בונה, וכן שינוי שליטה שלילי ללא ה-DNA.
- מגדלים שמרים עם עצבנות ב 30 ° C עד יתר600 בין 0.60 0.80. בדרך כלל לוקח 4−6 h.
- כחצי שעה לפני צמיחת שמרים השלמת, linearize בונה פלסמיד.
הערה: המבנה פלסמיד המשמש כאן חייב להיות משולב ישירות לתוך הגנום, ומכאן לינאריזציה נדרשת לפני השינוי.- לחשב עוצמת הקול של מניות פלסמיד שמסתכם ל- 1 µg. הפחת אמצעי אחסון זה מ µL 44 כדי לחשב את הכמות של נוקלאז חינם H2O צריך.
- להוסיף נוקלאז חינם H2O, µL 5 x 10 אנזים הגבלה מאגר (טבלה של חומרים), 1 µL של אנזים הגבלה NheI (טבלה של חומרים) ו את הכמות המתאימה של פלסמיד (שלב כמחושב 1.4.1) צינור microcentrifuge. לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. פלסמיד הוא כעת טרנספורמציה ליניארית ומוכן.
- לאחר שמרים תרבות מגיע עם יתר600 של 0.6-0.8, קציר תאים צינור חרוטי 50 מ ל ו ספין למטה ב x 850 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות להשליך תגובת שיקוע.
- רחץ תא גלולה ב 10 מ"ל של H2O סטרילי צנטריפוגה ב 850 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות להשליך תגובת שיקוע. חזור על 3 x בסך הכל ארבעה שוטף.
- בתחילת לשטוף את השלישי, להפשיר, להרתיח 10 µL של זרע סלמון DNA לכל שינוי התגובה למשך 5 דקות על בלוק חימום.
- Resuspend תא גלולה ב 100 µL של dH2O לכל שינוי, לפצל מספר מתאים של צינורות microcentrifuge. עבור המרות חמש, resuspend צנפה לתוך µL 500 של dH2O, לפצל באופן שווה חמישה צינורות microcentrifuge נפרדים.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 850 גרם בטמפרטורת החדר (RT) והסר כל המים הנותרים.
- להוסיף, לפי הסדר הבא, µL 50 של סטרילי H2O, 240 µL מתוך 50% פוליאתילן גליקול (PEG), 36 µL של 1 מ' LiAc, µL 10 של זרע סלמון DNA, µL 20 של פלסמיד ליניארית דנ א (או מים חינם נוקלאז לשינוי שליטה אין דנ א). מערבבים היטב לאחר כל תוספת של מערבולת בקצרה לאחר כל שינוי הרכיבים נוספו.
- דגירה טרנספורמציה תגובות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: לבצע את זה הדגירה באמבט מים לבקרת טמפרטורה עקבית יותר. - צנטריפוגה-470 x g ב- RT עבור 5 דק להשליך תגובת שיקוע, resuspend צנפה כל תא ב- µL 200 סטרילי H2O.
- צלחת שמרים השעיה על לוחות מדיה סלקטיבי ולהפיץ עם חרוזים מתגלגל או מפזר. דגירה צלחות 2−3 ימים ב- 30 ° C.
הערה: מוגדרת על-ידי סינתטיים (SD)-צלחות שלו משמשים את פלסמידים המתוארים כאן.
2. סקירת דיכוי צמיחה המושבה ואחסון במניות גליצרול
- לחסן מושבות יחיד של טרנספורמציה צלחות ב 5 מ של מדיה סלקטיבי בתוספת 2% raffinose. גדלים על מטרף ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בחר לפחות 12 המושבות לכל שינוי.
הערה: אין מושבות צפויים בצלחת הבקרה טרנספורמציה "אין דנ א". - לעקר את ה-pin-frogger עם אתנול, ואחריו בוער.
- עבור כל תרבות, aliquot 100 µL של השעיה רווי תא בשורה הראשונה של צלחת 96-ובכן. להוסיף 200 µL סטרילי H2O בבארות כל העמודות טוב סמוכים. עבור 1:5 טורי דילולים, להוסיף 50 µL מהעמודה הראשונה העמודה הסמוכה מאחורי עם pipet רב-ערוצי. לערבב ביסודיות על ידי pipetting. לאחר מכן להוסיף 50 µL של העמודה השניה והעמודה השלישית, לערבב על-ידי pipetting. חזור על הפעולה עבור כל צלחת.
- צלחת שמרים על-ידי הצבת frogger צלחת 96-ובכן, ואז הטבעה על ידי בעדינות ובצורה שווה לוחץ על לוחות מדיה סלקטיבית עם ובלי גלקטוז. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך ימים 2−3.
הערה: צלחות SD-שלו, SGal שלו משמשים את פלסמידים המתוארים כאן. - FUS, TDP-43 של המרות-synuclein, לזהות את המושבה הצגת דיכוי צמיחה רוב בנוכחות גלקטוז. בחרו המושבה מהצלחת SD-לו, לחסן לתוך 10 מ"ל של מדיה סלקטיבי בתוספת 2% raffinose לצמיחה לילה. עבור הפקד וקטור, לבחור מושבה הצגת אין דיכוי צמיחה בנוכחות גלקטוז.
- כדי להכין גליצרול מניות, משלבים 0.5 מ של תרבית נוזלית רוויים עם 0.5 מ של 50% גליצרול. לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: מניות גליצרול ניתן לאחסן עד שנה ב-80 מעלות צלזיוס.
3. ביטוי של proteinopathy ניווניות הקשורות חלבונים ב cerevisiae ס
- גליצרול קפוא מניות, שמרים מחדש בעירום על היסטידין, 2% גלוקוז אגר מדיה סלקטיבי צלחות, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך ימים 2−3.
- לחסן מושבות יחיד עבור כל דגמי ביטוי ושליטה ב 5 מ של מדיה נוזלי סלקטיבי היסטידין, בתוספת 2% raffinose. לגדול עם טלטול (200 סל ד) ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לגדול 100 מ של תרבית נוזלית עבור כל דגמי ביטוי והפקדים (FUS TDP-43, וקטור לשלוט;-synuclein ובקרת וקטור).
- הכן 100 מ של תרבות בתקשורת סלקטיבי בתוספת 2% גלקטוז.
- למדוד את יתר600 של תרבויות בין לילה, לחשב את הסכום של תרבות לילה הדרושים כדי ליצור ביטוי התרבויות על ההתחלה OD600 של 0.3. בדרך כלל, תרבויות לילה תגיע עם יתר600 של 0.9−10, הדורשים בערך 5 מ"ל של תרבות לילה להתחיל 100 מ של תרבות טריים.
- זירוז ביטוי חלבונים על ידי הגדלה שמרים על מדיה גלקטוז (ראה שלב 3.3.1) במשך 5 שעות (FUS, TDP-43) או 8 שעות (-synuclein) ברעידות-30 ° C.
- למדוד OD600 של כל תרבות בסוף התקופה אינדוקציה. לתקנן כל תא ספירת לערך הנמוך ביותר600 OD. הקציר תרבות 50 מ ל צינורות מאת צריך שתוציאו ב x 850 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
הערה: אם הערכים600 OD נמדד בסוף אינדוקציה 0.654 0.984, בהתאמה, עבור 100 מ של תרבות-synuclein ו- 100 מ של שליטה תרבות, לקצור 95 מ"ל של התרבות-synuclein ו- mL 67.1 של התרבות שליטה. - Resuspend צנפה ב 1 מ"ל של סטרילי dH2O עבור כל 10 מ"ל של תרבות גדל. פיצול גלולה באופן שווה על ידי aliquoting 1 מ"ל של תא resuspension לתוך צינורות microcentrifuge. לדוגמה, אם החל מ- 100 מ של התרבות, resuspend צנפה ב 10 מ"ל של dH סטרילי2O, לחלק אותו לתוך צינורות microcentrifuge 10.
- צנטריפוגה ב x 850 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע. הצמד להקפיא תא כדורי חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: תא כדורי ניתן לאחסן ב- 80 ° C עד שנה אחת.
4. תא פירוק החיוורים ומכתים המערבי כדי לזהות שינויים post-translational היסטון
- פירוק התא
- הפשרת כדורי שמרים תא בקרח, resuspend תא כדורי ב- 100 µL של dH2O.
- כדי resuspension התא, להוסיף µL 300 של 0.2 M NaOH ו- µL 20 של מרקפטואתנול. Resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- דגירה תאים על קרח למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב x 3,200 g בצנטריפוגה שולחן ל 30 s ב RT. להשליך תגובת שיקוע.
- Resuspend תא גלולה ב µL 100 1 x בטעינת צבע ומרתיחים במשך 10 דקות על בלוק חימום.
הערה: ניתן למצוא את המתכון 6 x טוען לצבוע את הטבלה של חומרים.
- נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל ממברנה העברת
- הכנת ג'ל קאמרית על ידי הצבת שני ג'לים בחדר ג'ל מחזיק, מילוי פנימי הדף עם הפעלת מאגר ומילוי התא מבחוץ לסימון קו שני-ג'ל.
- לטעון µL 15 מדגם מהשלב 4.1.4 לכל טוב לתוך ג'ל לזיהוי 12% 10-. טוב. על השביל הסולם חלבון, טען 5 µL.
- להפעיל ג'ל למשך כ- 45 דקות ב 150 V, או עד בטעינת צבע החזית מגיע לתחתית של הג'ל.
- בזמן הג'ל פועל, הכן להעברת הממברנה על ידי לספוג את רפידות סיבים (שניים לכל ג'ל) מאגר העברה (טבלה של חומרים), לספוג את polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ממברנה מתנול. לשטוף ממברנה במאגר העברה לפני ההעברה.
הערה: קרום PVDF צריך להיות חתוך לגודל של הג'ל ולהשתמש ממברנה PVDF אחד עבור כל ג'ל מועבר. - להרכיב, בנייד מכשיר חצי יבש העברה, העברה 'סנדוויץ': מן התחתון אלקטרודה, מקום סיבים (1) presoaked pad, ממברנה PVDF presoaked (2), שטופים, (3) ג'ל מהשלב 4.2.3 ו (4) מזמין סיבים presoaked.
הערה: הקפד להימנע בועות אוויר בהעברה "סנדוויץ'". לגלגל בעדינות "סנדוויץ' עם pipet סרולוגית לכפות את בועות. ברגע הג'ל הושם על גבי קרום PDVF, ודא כי לא להעביר אותו. - לבצע העברה חלבונים על-ידי הגדרת ערכת צריכת החשמל 150 אמא עבור h 1 (עבור אחד ' סנדוויץ').
- זיהוי של היסטון PTMs עם נוגדנים ספציפיים השינוי
- הסר הקרום מנגנון העברה. לשטוף בקצרה עם dH2O.
- לחלופין, סמן העברה של חלבונים עם כתם צבע מאכל פונסו-S על ידי מזיגת כתם צבע מאכל פונסו-S מספיק כדי לכסות את הממברנה בתוך קופסת פלסטיק קטנה המקננת ב RT ברעידות עדינות עבור s 30−60 להסיר צבע מאכל פונסו-S הכתם ולשטוף עם dH2O עד הרקע כתם נעלם והם חלבון להקות גלויים לעין בלתי מזוינת. ממשיכים לשטוף עם dH2O עד כל כתם יוסר ממברנה.
- לחסום הממברנה על ידי המקננת חשופה עבור h 1 RT עם נדנדה עדין עם טריס buffered מלוחים (TBS) חסימה אינץ מאגר (טבלה של חומרים) ההגדלה בקופסא קטנה. השתמש מאגר חסימה מספיק כדי לכסות את כתם.
הערה: יש להיזהר המקום ממברנה זקוף בתיבת מכתימים כך הצד ממברנה שבו משקרים חלבונים לא כלפי מטה. - דגירה חשופה בתיבה מכתימים בין לילה עם נוגדן ספציפי שינוי היסטון תגובתי לכיוון שמרים ב 4 º C. לדלל הנוגדן במאגר חסימה TBS, בהתאם למפרט היצרן. גם לכלול פקד הטעינה גרעיני תקין, כגון אנטי-סך H3 העולות זן מארח שונים של נוגדן ספציפי השינוי. למשל, אם בודק H3S10ph עם נוגדן anti-H3S10ph העולות ארנב, השתמש נוגדן H3 סך נגד העולות עכבר בתור פקד הטעינה. חזור על הפעולה עבור כל כתם לפי הצורך.
הערה: נוגדן דילולים הניתנים לשימוש חוזר עבור סכום כולל של שלוש פעמים תוך חודש. לאחסן אותם ב 4 º C. - לשטוף את הקרום 4 ב- x תוצרת בית TBS + 0.1% polysorbate 20 (TBST) עבור 5 דקות עם נדנדה-RT.
- דגירה כתם עם פלורסנט נוגדנים משניים-מוגדרים על-ידי יצרן דילולים (החמור נגד הארנב 680 ועכבר החמור נגד) עבור h 1-RT.
הערה: נוגדנים משניים פלורסנט חייבת להיות מוגנת מאור במהלך אחסון ושימוש. מבצעים הדגירה קופסאות פלסטיק כהה או לכסות ברדיד אלומיניום. - לשטוף את הממברנה 4 x עם TBST עבור 5 דקות ושטוף עם TBS במשך 5 דקות תוך כדי נדנדה-RT.
- Visualize רבב פלורסנט תספיג מערכת עבור 2 דק הדמיה לדמיין את אנטי-הארנב 680 ואת אנטי-העכבר 800 נוגדנים משניים ה-800 ננומטר וערוצי 700 nm, בהתאמה.
הערה: משכפל באופן עצמאי מתנהלים החל מסעיף 1. זה הכרחי לאמת התגובה האות נוגדנים בטווח שבו התגובה האות היא לינארית לפרשנויות הנתונים המתאימים בניסויים אלה.
- הסר הקרום מנגנון העברה. לשטוף בקצרה עם dH2O.
5. נתונים וסטטיסטיקות
- תמונה פתוחה של כתם בתוכנת הדמיה (טבלה של חומרים). רוכשים את צפיפות raw של דגימות שינוי ספציפי להקות וקטור שליטה, TDP-43, ואת FUS (או וקטור שליטה,-synuclein), על ידי ציור מלבן זה מסגרות הלהקה במצב ניתוח.
- חזור על שלב 5.1 עבור טעינת פקד להקות.
הערה: תהיה טעינה לשלוט הלהקה ואת להקת שינוי ספציפי בכל מדגם. - לחשב את הצפיפות היחסית של הלהקות שינוי ספציפי על-ידי חלוקת כל הלהקה על ידי הצפיפות של הלהקה המתאימה וקטור שליטה לדוגמה. זה מווסת את הנתונים בפקד וקטור.
- לחשב את הצפיפות היחסית של הטעינה הלהקה שליטה על ידי חלוקת כל הלהקה על ידי הצפיפות של טעינת המתאימים שליטה הלהקה במדגם שליטה וקטור.
- לחשב צפיפותה היחסית מנוכי עונתיות של כל הלהקה על-ידי חלוקת צפיפותה היחסית של הלהקה שינוי ספציפי על הצפיפות היחסית של טעינת פקד הלהקה עבור כל דגימה. עכשיו, ניתן לאבחן את הנתונים בטופס היסטוגרמה.
הערה: כדי להקל על עיבוד, צעדים 5.3 – 5.5 יכול להיעשות בתוך גיליון אלקטרוני (קובץ משלים). - לאחר משכפל עצמאית מרובים, T-בדיקות ולש ריצה של בין הדגימות שני פקד את proteinopathy המתאים דגם (שליטה לעומת FUS, שליטה לעומת TDP-43 ובקרה מול-synuclein) עם p = 0.05 כמו החיתוך מובהקות .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להסביר שיטה זו, אנו ינצלו את היתרון של התוצאות שפורסמו לאחרונה30. FUS האנושי WT, TDP-43 overexpressed היו עבור 5 שעות, בעוד WT α-synuclein היה overexpressed במשך 8 שעות. בונה ccdB שימש פקד שלילי וקטור. איור 2 מציג את דיכוי צמיחה בתרבויות הנוזלית. שמרים היה נקצרו כמתואר, סופג המערבי עם נוגדנים ספציפיים השינוי בוצע. סה אנטי-כ H3 שימש פקד הטעינה. ירידה משמעותית ברמות של H3S10ph ו- H3K14ac בולטת במודל ביטוי FUS (איור 3 אב'). ישנן עליות משמעותיות ברמות של acetylation על H4K12 ועל H4K16 מודל ביטוי TDP-43, כי הם לא נצפו גם את FUS או מודל ביטוי α-synuclein (איור 3 cd). יש גם ירידה משמעותית ברמות של H3K36me2 ו- H2BT129ph במודל ביטוי α-synuclein (איור 3ef).
כדי להראות כי שינוי היסטון PTMs בקורלציה עם הכמות של ביטוי של החלבון proteinopathy ניווניות, ניתן לכוונן את הביטוי של FUS על ידי גרימת ביטוי חלבון רמות משתנות של גלקטוז (איור 4a). גלקטוז מעורבב עם סוכרוז בשינוי יחס כזה ריכוז מוחלט של סוכר קבוע ב- 2%, אך כמות גלקטוז משתנה וכתוצאה מכך מגוון של רמות ביטוי החלבון. ב cerevisiae ס, סוכרוז עובר מטבוליזם לאט לגלוקוזה, המדכא גלקטוז אינדוקציה31. לפיכך, סוכרוז לא מפעיל וגם לא מעלימה אינדוקציה גלקטוז. פחות רעילות נמוכה יותר מכמות גלקטוז המשמש לזירוז FUS ביטוי, נצפתה בתרבות מוצק וגם נוזלי (איור 4bג). חשוב לציין, שאין התחתון רמת ביטוי FUS, קטן היקף הירידה ברמות H3S10ph (איור 4-d-f).
איור 1: Methodoverview על אפיון שינויים שינויים post-translational היסטון מחובר proteinopathies מחלות ניווניות במודלים שמרים- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: רעילות הקשורים עם ביטוי של חלבונים הקשורים proteinopathy ניווניות במודלים שמרים- מבחני spotting להראות תא הכדאיות על שמרים overexpressing וקטור שליטה, TDP-43, FUS או α-synuclein בנוכחות גלוקוז () או גלקטוז (b). (ג) צמיחה עקומת הממחישות תא הכדאיות בתרבות נוזלי תחת אינדוקציה גלקטוז. קווי שגיאה מציינים ± סטיית התקן. n = 3 עבור כל זן. משכפל כתוצאה ניסויים באופן עצמאי לחלוטין. נתונים הותאם באישור חן, ק' ואח ניווניות מחלות Proteinopathies מחוברים ברורים היסטון Post-translational השינוי נופים. כימית ACS Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שינוי היסטון post-translational שינויים הקשורים עם ביטוי של חלבונים הקשורים proteinopathy ניווניות במודלים שמרים- מודל proteinopathy FUS מראה ירידה רמות () H3S10ph, n = 6 ו- (b) H3K14ac, n = 3. לעומת זאת, מודל proteinopathy TDP-43 מראה רמות גבוהות של (c) H4K12ac, n = 3, ו- (ד) H4K16ac, n = 6, בעוד דגם α-synuclein מראה ירידה רמות (e) H3K36me2, n = 3, ו- (f) H2BT129ph, n = 7. הצג סרגלי שגיאה + סטיית תקן. *, p < 0.05, * * *, p < 0.001. משכפל כתוצאה ניסויים באופן עצמאי לחלוטין. נתונים הותאם באישור חן, ק' ואח ניווניות מחלות Proteinopathies מחוברים ברורים היסטון Post-translational השינוי נופים. כימית ACS Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: היקף ירידה ברמות H3S10ph קשורה לרמה של ביטוי FUS. איור () קריקטורה של השימוש של יחסי סוכרוז, גלקטוז לכוון את כמות FUS ביטוי. מבחני Spotting (b) מציג תא הכדאיות בנוכחות רמות משתנות של גלקטוז. (ג) צמיחה עקומת בתרבות נוזלי מציג תא הכדאיות בנוכחות רמות משתנות של גלקטוז. קווי שגיאה מציינים ± סטיית התקן. (ד) נציג immunoblots מראה כי החלבון FUS רמות עלייה כמו תאים נחשפים הגדלת יחס של גלקטוז. Phosphoglycerate קינאז (PGK) שימש פקד הטעינה. (e) נציג immunoblots בסה כ מציג ירידות המתאימים ברמות H3S10ph עם הגדלת יחס של גלקטוז. היסטוגרמה (f) כימות של (e). n = 3 עבור כל תנאי. קווי שגיאה לציין + סטיית התקן עבור תרשים כמת. משכפל כתוצאה ניסויים באופן עצמאי לחלוטין. נתונים הותאם באישור חן, ק' ואח ניווניות מחלות Proteinopathies מחוברים ברורים היסטון Post-translational השינוי נופים. כימית ACS Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק דרך פשוטה, מועיל וחסכונית לסיווג שינויים PTM הגנום כולו היסטון בקורלציה עם proteinopathies ניווניות. אמנם ישנם דגמים אחרים של ALS ו PD, כגון במבחנה שורות תאים אנושיים, מאתר מודלים32, cerevisiae ס נותר אטרקטיבי בשל קלות השימוש. למשל, שמרים דגמים שאינם מצריכים שימוש ברדס סטרילי, וגם הם דורשים אינטנסיביים אימון זה הולך יחד עם תא תרבות עבודה. יתר על כן, ריאגנטים עבור culturing שמרים הם גם זולים בהרבה מאשר ספקי תרבות בתרבית של תאים. מודלים שמרים נוצלה כדי לחשוף את תחום גורמים של חלבון צבירת22,23,24,25,26אלא גם הובילה חשיפת סיכון גנטי גורמים ב- ALS27, וכן מודיפיקטורי חלבון צבירת רעילות22. יתר על כן, המחיקה של Set3, חבר deacetylase היסטון מורכבים, נמצאה כדי להפחית רעילות TDP-43 ב שמרים33. מעניין, הממצאים שלנו בשמרים הם מסכים עם דיווחים אחרונים על שינויים שינוי היסטון במודל בשני FUS העכבר ו של האדם FUS SH-SY5Y ביטוי דגם34,35. יתר על כן, לאחרונה גילו שינויים בדפוסי מתילציה של הדנ א, סביב הגנים PD מפתח, כגון SNCA ו- PARK2, תמיכה תפקיד אפיגנטיקה ב- PD36,37.
כאן, אנו מראים כי מודלים אלה שמרים יכול לשמש גם כדי לגלות איך ניווניות proteinopathies לקיים אינטראקציה עם epigenome30. אנו מוצאים כי שינויים ברורים היסטון שינויים קשורים עם כל דגם proteinopathy. פרוטוקול שמפורטות כאן מאפשר לנו לאמת ממצאים קודמים במערכות אחרות מודל. שכנראה הכי משמעותי, בשיטה זו יש גבר ההבנה שלנו של פנורמה epigenomic של מחלות ניווניות. קבוצה מורחבת של השינויים המוצגים כאן יכול לחשוף מטרות המחק ו סופר היסטון הרומן להתערבות תרופתית. תוצאות אלה להדגיש את התרומה אפשריות של שינויים היסטוניים PTMs ואת אפיגנטיקה בפתולוגיה של ALS, PD, מחלות ניווניות אחרות, עשוי לספק השדרות הרומן טיפול במחלות אלה.
הטיפול בפרט צריך לקחתו בשלבים 1.9 ו- 1.10 בשעת שינוי צורה של שמרים overexpress proteinopathies ניווניות. באופן ספציפי, הוספת את ריאגנטים בסדר הנכון במהלך שלב 1.10 יש צורך להבטיח יעילות המרה גבוהה. יתר על כן, חשוב מאוד לבחור את המושבה להצגת דיכוי צמיחה רוב גלקטוז. גם להקפיד בעת הרכבת את הכריך המערבי. תוספת מקרית של בועות בין ג'ל ממברנה לחסום העברה של החלבון ומספקים בלוק כתמים על כתם זה יכול לעכב את ניתוח הנתונים.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי נוגדנים מוגבלת רק מחייב וכן זיהוי שינויים היסטון אחד או שניים בכל פעם. חשוב גם לתקנן כראוי את דגימות לאחר ביטוי חלבון (צעדים 3.4−3.6). לחלוטין הסרת גידול כל המדיה תבטיח כי כל גלולה תא מתפתל resuspended באותו אמצעי אחסון. באופן דומה, זה חשוב aliquot בקפידה אותה כמות של הבולם תא לתוך הצינורות microcentrifuge (שלב 3.4). אם הדגימות לא מתוקננים כראוי, שקשה להסיק מסקנות מן השינויים ברמות PTM היסטון. כזו בעיה יהפוך ניכרת סתירות על רמות שליטה הטעינה של תספיג חלבון (סעיף 4.2). כדי לתקן זאת, ג'ל מרחביות-דף נטען עם דוגמאות רלוונטיות ניתן Coomassie צבעונית, המאפשר כימות הלהקה חלבון של הדגימות (סעיף 5) ותקינה מחדש עוקבות של דגימות מבוסס על כמות חלבון מתנה על כל דגימה.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של היסטון PTM שינויים הקשורים את ביטוי של חלבונים הקשורים ניווניות proteinopathies רק פחות משבועיים, מן השינוי כדי ניתוח סטטיסטי. מלבד הפעלת המחקר של proteinopathies הקשורים עם מחלות ניווניות, פרוטוקול כללי זה יכול לשמש כדי ללמוד היסטון שינויים PTM בכל דגם ביטוי שמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Royena Tanaz הודא יוסוף, סדיקא Taasen על עזרה טכנית. . אנחנו מאוד אסירי פרופסור ג'יימס שורטר למתן נדיב ריאגנטים, סיוע רוחני בעיצוב של ניסויים כוונון סוכרוז. שמרים פלסמידים היו מתנה נדיבה של פרופסור אהרון גיטלר (כולל גל 303-FUS; Addgene פלסמיד # 29614). ברוקלין קולג, מרכז מחקר מדעי מתקדם (יופי), כמו גם NIH NINDS מתקדם פוסט-דוקטורט המעבר פרס (K22NS09131401) תמיכה M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
