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Genetics

विशेषता हिस्one पोस्ट-translational में संशोधन परिवर्तन खमीर न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी मॉडल

Published: March 24, 2019 doi: 10.3791/59104
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1, 1,4
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

Summary

इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की रूपरेखा को हिस्टोन के स्तर में जीनोम व्यापक परिवर्तन विशेषता के बाद translational संशोधनों (ptm) में ALS और पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े प्रोटीन के overexpression के संबंध में होने वाली सैचरोमाइसीज़ सेरेविस्सी मॉडल | एसडीएस-पृष्ठ जुदाई के बाद, व्यक्तिगत हिस्टोन ptm स्तर पश्चिमी blotting के माध्यम से संशोधन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पता चला रहे हैं ।

Abstract

तंत्रिका अपक्षयी रोग, जैसे कि आमयोपोषी पार्श्व स्क्लेरोसिस (ए. ए. पी.) और पार्किंसंस रोग (पीडी), हर साल हजारों की सैकड़ों लोगों की हानि का कारण है । रोग प्रगति को रोकने में सक्षम प्रभावी उपचार विकल्प की कमी है । बड़े रोगी आबादी में व्यापक अनुक्रमण प्रयासों के बावजूद, एलों और पीडी मामलों के बहुमत आनुवंशिक उत्परिवर्तनों से अकेले अस्पष्टीकृत रह । उपआनुवंशिकी तंत्र, इस तरह के बाद के रूप में-हिस्टोन प्रोटीन के translational संशोधन, न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग एटियलजि और प्रगति में शामिल किया जा सकता है और दवा हस्तक्षेप के लिए नए लक्ष्य के लिए नेतृत्व. वीवो में स्तनधारी और ALS और पीडी के विट्रो मॉडल में महंगा है और अक्सर लंबे समय तक और श्रमसाध्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है । यहाँ, हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में saccharomyces cerevisiae का उपयोग कर हिस्टोन संशोधन के स्तर में जीनोम व्यापक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक व्यावहारिक, तेजी से, और लागत प्रभावी दृष्टिकोण की रूपरेखा । इस प्रोटोकॉल पश् चजात न्यूरोडेजेनेरेटिव proteinopathies से जुड़े परिवर्तन में व्यापक जांच के लिए अनुमति देता है कि विभिंन मॉडल प्रणालियों में पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करते हुए काफी के हमारे ज्ञान का विस्तार तंत्रिका अपक्षयी रोग एपिजीनोम ।

Introduction

न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों कोई इलाज उपलब्ध विकल्प के लिए थोड़ा के साथ विनाशकारी बीमारियों हैं । इन के अलावा, पेशीशोषी पार्श्व स्क्लेरोसिस (ALS) और पार्किंसंस रोग (पीडी) विशेष रूप से भयानक हैं । लगभग ९०% ALS और पीडी मामलों छिटपुट, रोग के परिवार के इतिहास के बिना होने वाली माना जाता है, जबकि शेष मामलों परिवारों में चलाने के लिए और आम तौर पर एक विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन1,2से जुड़े हुए हैं । दिलचस्प है, इन दोनों बीमारियों के प्रोटीन mislocalization और एकत्रीकरण3,4,5,6के साथ जुड़े रहे हैं । उदाहरण के लिए, सार्कोमा (संगलित) और राल डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन ४३ (टीडीपी-४३) में संगलित है rna बाध्यकारी प्रोटीन है कि कोशिका द्रव्य को mislocalize और ALS में कुल7,8,9,10, 11,12, जबकि α-उपकेन्द्रक, प्रोटेनिशियस समुच्चय का मुख्य घटक है, जिसे पीडी5,13,14,15में लेवी शरीरों के रूप में माना जाता है ।

बड़े रोगी आबादी में व्यापक जीनोम व्यापक संघ के प्रयासों के बावजूद, ALS और पीडी मामलों के भारी बहुमत अनसमझाया आनुवंशिक रूप से रहते हैं । क्या एपिजेनेटिक्स न्यूरोडेजेनेरेटिव डिजीज में भूमिका निभा सकता है? एपिजेनेटिक्स अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम16में परिवर्तन के बिना होने वाली जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन शामिल हैं । एक मुख्य एपिजेनेटिक तंत्र में हिस्टोन प्रोटीन16के बाद शोधों संशोधनों (ptms) शामिल है । यूकार्योटिक कोशिकाओं में आनुवंशिक पदार्थ को क्रोमेटिन में कसकर लपेटा जाता है । क्रोमेटिन की आधार इकाई नाभिक है, जिसमें १४६ आधार जोड़े डीएनए के एक हिस्टोन ऑक्टामर के चारों ओर लिपटे होते हैं, जो चार जोड़ों के हिस्टोनों से बना होता है (दो प्रतियां H2A, H2B, H3 और H4)17। प्रत्येक हिस्टोन में एक एन-टर्मिनल पूंछ होती है जो नाभिकोणों से बाहर निकलती है और इसे विभिन्न रासायनिक मॉइटीज के परिवर्धन द्वारा संशोधित किया जा सकता है, आमतौर पर लिसाइन और आर्जिनिन अवशेषों पर18। इन PTMs गतिशील हैं, जिसका अर्थ है कि वे आसानी से जोड़ा और हटाया जा सकता है, और इस तरह के acetylation के रूप में समूहों, methylation, और फॉस्फोरिलेशन शामिल हैं । PTMs नियंत्रण transअपंग मशीनरी के लिए डीएनए की पहुंच, और इस तरह नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति18मदद करते हैं । उदाहरण के लिए, हिस्टोन ऐसीटिलन उच्च बुनियादी हिस्टोन प्रोटीन और नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए रीढ़ के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत की ताकत कम कर देता है, ऐसीटिलन हिस्टोन द्वारा पैक जीन की अनुमति अधिक सुलभ हो सकता है और इस प्रकार अत्यधिक व्यक्त१९. हाल ही में, विशिष्ट हिस्टोन ptms के उल्लेखनीय जैविक विशिष्टता और उनके संयोजनों हिस्टोन कोड परिकल्पना20,21 में जो प्रोटीन है कि लिखने, मिटा, और पढ़ें हिस्टोन ptms सभी संगीत कार्यक्रम में अधिनियम के लिए नेतृत्व किया है जीन अभिव्यक्ति मिलाना ।

खमीर एक बहुत ही उपयोगी के लिए neurodegeneration: पतन का अध्ययन मॉडल है । महत्वपूर्ण बात, कई न्यूरोनल सेलुलर रास्ते खमीर से मनुष्यों के लिए22,23,24संरक्षित कर रहे हैं । खमीर fus, टीडीपी-४३, या α-synuclein22,23,24,25,26के overexpression पर कोशिका आविषता phenotypes और प्रोटीन inclusions पुनर्पूंजीकरण । वास्तव में, सैचरोमाइसीज़ सेरेवीसी मॉडलों को मनुष्यों में आनुवंशिक जोखिम कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है27. इसके अलावा, खमीर मानव α-syनाभिक overexpressing के लिए एक druggable लक्ष्य के रूप में Rsp5 नेटवर्क के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी ंयूरॉंस में α-synuclein विषाक्तता सुधार करने के लिए28,29।

यहां, हम न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोथिनोपैथी (चित्रा 1) के साथ जुड़े जीनोम चौड़ा हिस्टोन ptm परिवर्तन का पता लगाने के लिए saccharomyces cerevisiae शोषण प्रोटोकॉल का वर्णन । एस cerevisiae का उपयोग अत्यधिक आकर्षक है क्योंकि उपयोग की अपनी आसानी, कम लागत, और गति की तुलना में अंय विट्रो और तंत्रिका अध: पतन के पशु मॉडल में । पहले विकसित किए गए ALS और पीडी मॉडलों का दोहन22,23,25,26, हम मानव fus, टीडीपी-४३ और α-synuclein खमीर में और उजागर विशिष्ट हिस्टोन ptm परिवर्तन में होने वाले overexpressed किया है प्रत्येक प्रोटिनोपैथी के साथ संबंध30. प्रोटोकॉल है कि हम यहां का वर्णन रूपांतरण से डेटा विश्लेषण के लिए दो सप्ताह से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है ।

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Protocol

1. न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटीनोपैथी के साथ एस cerevisiae बदलने से जुड़े प्रोटीन constructs

  1. बढ़ती जंगली प्रकार (wt) खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोज (ypd) में ३०३ खमीर 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (२०० rpm) के साथ रातोंरात शोरबा ।
  2. विकास के 12 − 16 ज के बाद, YPD के साथ ०.२५ के ६०० एनएम (ओडी६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को पतला खमीर । खमीर तरल संस्कृति के 10 मिलीलीटर के रूप में प्रत्येक परिवर्तन के लिए आवश्यक हो जाएगा, FUS के लिए इसी पांच रूपांतरणों के लिए खमीर तरल संस्कृति के ५० मिलीलीटर तैयार, टीडीपी-४३, एक-synuclein, और वेक्टर केवल (ccdB) constructs, साथ ही साथ एक नकारात्मक नियंत्रण परिवर्तन डीएनए के बिना ।
  3. 30 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ खमीर बढ़ने जब तक ०.६० और ०.८० के बीच एक आयुध डिपो६०० तक पहुंच गया है । यह साधारणतया 4 − 6 ज लेता है ।
  4. तीस मिनट खमीर विकास से पहले पूरा हो गया है, प्लाज्मिड संरचनाओं linearize ।
    नोट: यहां प्रयुक्त प्लाज्मिड constructs सीधे जीनोम में एकीकृत किया जाना चाहिए, और इसलिए linearization परिवर्तन से पहले की आवश्यकता है ।
    1. प्लाज्मिड स्टॉक की मात्रा की गणना करें जो 1 μg तक होता है, इस आयतन को ४४ μL से घटा कर नाभिक मुक्त ज2ओ की मात्रा की गणना करने के लिए आवश्यक होता है ।
    2. nuclease मुक्त एच2ओ, 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर (सामग्री की तालिका) के 5 μl, nhei प्रतिबंध एंजाइम के 1 μl (सामग्री की मेज), और प्लाज्मिड की उचित मात्रा (1.4.1 कदम में गणना) एक microcentrifuge ट्यूब के लिए जोड़ें । 15 मिनट के लिए ऊपर और नीचे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेने के द्वारा अच्छी तरह से मिक्स । प्लाज्मिड अब अर्थवान और परिवर्तन के लिए तैयार है ।
  5. के बाद खमीर संस्कृति 0.6-0.8 के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में फसल कोशिकाओं और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ८५० एक्स जी पर नीचे स्पिन । अधित्याग करना ।
  6. 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ८५० x जी पर बाँझ एच2ओ और सेंट्रीफ्यूज के 10 मिलीलीटर में धोने के सेल गोली. supernatant छोड़ें । चार washes की कुल के लिए 3x दोहराएं ।
  7. तीसरे धोने के शुरू में, गल और एक हीटिंग ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए रूपांतरण प्रतिक्रिया प्रति सामन शुक्राणु डीएनए के 10 μL फोड़ा ।
  8. रेस्पेंड सेल गोली में १०० μL में परिवर्तन प्रतिओ और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के उपयुक्त संख्या में विभाजन । पांच रूपांतरणों के लिए, डीएच2ओ के ५०० μl में resuspend गोली और पांच अलग microcentrifuge ट्यूबों में समान रूप से विभाजित ।
  9. ८५० एक्स जी पर कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और सभी शेष पानी को हटा दें ।
  10. निम्नलिखित क्रम में जोड़ें, बाँझ एच2ओ, २४० μl के ५०% पॉलीथीन ग्लाइकोल के ५० μl (खूंटी), 1 एम liac के ३६ μl, सामन शुक्राणु डीएनए के 10 μl, अर्थवान प्लाज्मिड डीएनए के 20 μl (या कोई डीएनए नियंत्रण परिवर्तन के लिए न्यूनलेस मुक्त पानी). मिश्रण अच्छी तरह से प्रत्येक इसके अलावा और भंवर के बाद संक्षेप में सभी परिवर्तन घटकों के बाद जोड़ा गया है ।
  11. 20 मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर इन्सेबेट रूपांतरण प्रतिक्रियाओं ।
    नोट: अधिक सुसंगत तापमान नियंत्रण के लिए एक पानी स्नान में इस ऊष्मायन बाहर ले ।
  12. 5 मिनट के लिए आर टी पर ४७० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज. छोड़ supernatant और बाँझ एच2ओ के २०० μl में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend ।
  13. प्लेट खमीर चयनात्मक मीडिया प्लेटों पर निलंबन और रोलिंग मोती या स्प्रेडर के साथ फैल गया । 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 − 3 दिनों के लिए इन्सेबेट प्लेट ।
    नोट: सिंथेटिक-निर्धारित (एसडी)-उसकी प्लेटों यहां वर्णित plasmids के लिए उपयोग किया जाता है ।

2. सर्वेक्षण कॉलोनी वृद्धि दमन और ग्लिसर्ल शेयरों में भंडारण

  1. चुनिंदा मीडिया के 5 मिलीलीटर में परिवर्तन प्लेटों से एक कालोनियों को 2% रैफिनोज से संपूरित किया गया । 30 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर रातोंरात बढ़ने । परिवर्तन के प्रति कम से 12 कालोनियों का चयन करें ।
    नोट: कोई कालोनियों "नहीं डीएनए" परिवर्तन नियंत्रण प्लेट में उंमीद कर रहे हैं ।
  2. कील के साथ पिन-frogger, ज्वलंत द्वारा पीछा किया ।
  3. प्रत्येक संस्कृति के लिए, एक ९६-well थाली की पहली पंक्ति में संतृप्त कोशिका निलंबन के १०० μL aliquot । संनिकट कूप स्तंभों के सभी कुओं में बाँझ एच2ओ के २०० Μl जोड़ें । 1:5 सीरियल dilutions के लिए, जोड़ें ५० μl पहले स्तंभ से संनिकट स्तंभ के पीछे मल्टीचैनल पिपेट के साथ । पिख्ता करके अच्छी तरह मिक्स कर लीजिये. फिर दूसरे कॉलम से तीसरे कॉलम में ५० μL जोड़ें और पिख्ता द्वारा मिश्रण । इस थाली के बाकी के लिए दोहराएं ।
  4. थाली एक ९६-अच्छी तरह से थाली में frogger रखकर और फिर धीरे से मुद्रांकन और समान रूप से चयनात्मक मीडिया के साथ और galactose बिना प्लेटों पर नीचे दबाने से । 2 − 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    नोट: SD-His और SGal-उसकी प्लेट्स यहां वर्णित प्लामिड्स के लिए उपयोग की जाती हैं ।
  5. FUS के लिए, टीडीपी-४३, और एक-synuclein रूपांतरणों, galactose की उपस्थिति में सबसे अधिक वृद्धि दमन प्रदर्शित कॉलोनी की पहचान. एसडी अपनी थाली से इस कॉलोनी का चयन करें और रातोंरात विकास के लिए 2% raffinose के साथ पूरक चयनात्मक मीडिया के 10 मिलीलीटर में संरोपण । वेक्टर नियंत्रण के लिए, galactose की उपस्थिति में कोई वृद्धि दमन प्रदर्शित कॉलोनी उठाओ ।
  6. ग्लिसेरोल स्टॉक तैयार करने के लिए, ५०% ग्लिसेरोल के ०.५ मिलीलीटर के साथ संतृप्त द्रव संस्कृति की ०.५ मिलीलीटर संयोजित करें । ऊपर और नीचे और फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस पर रोक द्वारा मिक्स ।
    नोट: ग्लिसॉल स्टॉक-८० डिग्री सेल्सियस पर एक वर्ष तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

3. मस्तिष्क में न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी से जुड़े प्रोटीन की अधिअभिव्यक्ति

  1. फ्रोज़न ग्लिसरॉल स्टॉक से, हिस्टीडीन पर री-स्ट्रीक यीस्ट, 2% ग्लूकोज ऐगार चुनिंदा मीडिया प्लेट्स और 2 − 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं ।
  2. एक ओवरएक्सप्रेशन मॉडल और नियंत्रण के 5 मिलीलीटर में हिस्टीडिन चयनात्मक तरल मीडिया के प्रत्येक के लिए एकल कालोनियों Inoculate 2% raffinose के साथ पूरक । मिलाते हुए 30 ° c पर (२०० rpm) रात भर के साथ बढ़ें ।
  3. ओवरएक्सप्रेशन मॉडल और नियंत्रण (FUS, टीडीपी-४३, और वेक्टर नियंत्रण, एक-synuclein और वेक्टर नियंत्रण) के प्रत्येक के लिए तरल संस्कृति के १०० मिलीलीटर बढ़ाएँ ।
    1. 2% galactose के साथ चुनिंदा मीडिया में संस्कृति के १०० मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
    2. उपाय रातोंरात संस्कृतियों के आयुध डिपो६०० और रातोंरात संस्कृति की मात्रा की गणना करने के लिए ०.३ के एक प्रारंभिक ओडी६०० पर overexpression संस्कृतियों प्रदान की जरूरत है । आम तौर पर, रातोंरात संस्कृतियों 0.9 − 10 के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंच जाएगा, रातोंरात संस्कृति के बारे में 5 मिलीलीटर की आवश्यकता के लिए ताजा संस्कृति के १०० मिलीलीटर शुरू करते हैं ।
    3. गैलेक्टोज मीडिया पर बढ़ खमीर द्वारा प्रोटीन overexpression प्रेरित (3.3.1 कदम देखें) के लिए 5 एच (fus और टीडीपी-४३) या 8 एच (एक-synuclein) 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ ।
  4. प्रेरण अवधि के अंत में प्रत्येक संस्कृति का माप आयुध डिपो६०० । मानक सभी सेल गिनती सबसे कम आयुध डिपो६०० मूल्य के लिए । ५० मिलीलीटर ट्यूबों में फसल की संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८५० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा । परवर्तनांत.
    नोट: यदि इंडक्शन के अंत में मापा गया ओडी६०० मान क्रमशः ०.६५४ और ०.९८४, a-syनाभिक संस्कृति के १०० मिलीलीटर और नियंत्रण संस्कृति के १०० मिलीलीटर के लिए, a-syनाभिक संस्कृति की फसल ९५ मिलीलीटर और नियंत्रण संस्कृति की ६७.१ मिलीलीटर हैं ।
  5. संस्कृति के हर 10 मिलीलीटर के लिए बाँझ dH2ओ के 1 मिलीलीटर में Resuspend गोली उगाया । समान रूप से विभाजित गोली aliquoting द्वारा सेल resuspension के 1 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में । उदाहरण के लिए, अगर संस्कृति के १०० मिलीलीटर के साथ शुरू, बाँझ dH2ओ के 10 मिलीलीटर में resuspend गोली और यह 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित ।
  6. 4 ° c पर 5 मिनट के लिए ८५० x g पर सेंट्रीफ्यूज, फिर supernatant निकालें । स्नैप-८० डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और स्टोर में सेल छर्रों फ्रीज ।
    नोट: सेल छर्रों एक वर्ष तक के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

4. सेल lysis और पश्चिमी सोख्ता हिस्टोन के बाद translational संशोधनों का पता लगाने के लिए

  1. कोशिका लाइसिस
    1. बर्फ पर गल खमीर सेल छर्रों और resuspend सेल छर्रों में १०० μL के dH2हे ।
    2. सेल पुनर्पेंशन के लिए, ०.२ एम NaOH के ३०० μL और 2-mercaptoethanol के 20 μL जोड़ें । ऊपर और नीचे से पिख्ता करके Resuspend ।
    3. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते कोशिकाओं और फिर ३,२०० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज 30 एस के लिए एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज पर RT. छोड़ें supernatant पर ।
    4. 1x लोड डाई के १०० μL में Resuspend सेल गोली और एक हीटिंग ब्लॉक पर 10 मिनट के लिए उबाल लें ।
      नोट: 6x लोडिंग डाई के लिए नुस्खा सामग्री की मेजमें पाया जा सकता है ।
  2. सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीऐक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और झिल्ली स्थानांतरण
    1. एक जेल धारक में दो जैल रखकर जेल चैंबर तैयार और बफर चल रहा है और दो जेल लाइन निशान के बाहर चैंबर भरने के साथ शीर्ष पर भीतरी चैंबर भरने ।
    2. एक 10-अच्छी तरह से 12% polyacrylamide जेल में कदम 4.1.4 प्रति से नमूना के 15 μL लोड । प्रोटीन सीढ़ी लेन के लिए, लोड 5 μL ।
    3. चलाने के लिए जेल लगभग ४५ मिनट में १५० वी, या जब तक डाई सामने लोड जेल के नीचे तक पहुंचता है ।
    4. जबकि जेल चल रहा है, फाइबर पैड (दो प्रति जेल) स्थानांतरण बफर (सामग्री की मेज) में भिगोने और मेथनॉल में पॉलीविलिडीन फ्लोराइड (pvdf) झिल्ली भिगोने के लिए झिल्ली स्थानांतरण के लिए तैयार करते हैं । स्थानांतरण से पहले स्थानांतरण बफर में झिल्ली कुल्ला ।
      नोट: PVDF झिल्ली जेल के आकार के लिए काटा जाना चाहिए और हर जेल स्थानांतरित किया जा रहा है के लिए एक PVDF झिल्ली का उपयोग करें ।
    5. इकट्ठा, अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण उपकरण सेल, एक हस्तांतरण ' सैंडविच ' पर: नीचे इलेक्ट्रोड, प्लेस (1) presoaked फाइबर पैड से, (2) presoaked और rinsed PVDF झिल्ली, (3) 4.2.3 कदम से जेल, और (4) एक दूसरा presoaked फाइबर पैड.
      नोट: स्थानांतरण ' सैंडविच में हवाई बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें । धीरे से बाहर बुलबुले मजबूर करने के लिए सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ ' सैंडविच ' रोल । एक बार जेल PDVF झिल्ली के शीर्ष पर रखा गया है, इसे स्थानांतरित करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें ।
    6. 1 ज (एक ' सैंडविच ') के लिए १५० mA के लिए पावर पैक स्थापित करके प्रोटीन स्थानांतरण ले ।
  3. संशोधन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ हिस्टोन ptms का पता लगाना
    1. स्थानांतरण उपकरण से झिल्ली निकालें । dH2ओ के साथ संक्षेप कुल्ला ।
      1. वैकल्पिक रूप से, एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स में झिल्ली को कवर करने के लिए पर्याप्त पोंसियू-एस दाग और 30 − 60 एस के लिए कोमल मिलाते के साथ आरटी पर इनसेबटिंग, Ponceau-s दाग के साथ प्रोटीन के हस्तांतरण की जांच गायब हो जाता है और प्रोटीन बैंड नग्न आंखों को दिखाई दे रहे हैं । जब तक सभी दाग झिल्ली से हटा दिया जाता है dH2ओ के साथ कुल्ला करने के लिए जारी रखें ।
    2. एक छोटे धुंधला बॉक्स में tris buffered खारा (टीबीएस) अवरुद्ध बफर (सामग्री की मेज) के साथ कोमल कमाल के साथ आरटी में 1 एच के लिए दाग इनकूबटिंग द्वारा ब्लॉक झिल्ली । ब्लॉट को कवर करने के लिए पर्याप्त ब्लॉकिंग बफर का प्रयोग करें ।
      नोट: झिल्लीदार दाग वाले बॉक्स में झिल्ली को सीधा रखने के लिए सावधान रहें ताकि झिल्ली की तरफ प्रोटीन लेट न हो ।
    3. एक हिस्टोन संशोधन-4 डिग्री सेल्सियस पर खमीर के प्रति विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशील के साथ रात भर धुंधला बॉक्स में सेते ब्लॉट । निर्माता विनिर्देशों के अनुसार बफर अवरुद्ध टीबीएस में एंटीबॉडी को पतला । इसके अलावा एक उचित परमाणु लोडिंग नियंत्रण, जैसे विरोधी कुल H3 संशोधन विशिष्ट एंटीबॉडी से एक अलग मेजबान प्रजातियों में उठाया शामिल हैं । उदाहरण के लिए, यदि एक विरोधी के साथ H3S10ph के लिए जांच H3S10ph एंटीबॉडी खरगोश में उठाया, एक विरोधी कुल H3 एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में माउस में उठाया एंटीबॉडी का उपयोग करें । हर ब्लाटर के लिए इसे आवश्यकतानुसार दोहराएं ।
      नोट: एंटीबॉडी dilutions एक महीने के भीतर तीन बार की कुल के लिए पुनः उपयोग किया जा सकता है । उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    4. धो झिल्ली 4x घर में बनाया TBS + ०.१% polysorbate 20 (TBST) 5 मिनट के लिए आरटी पर कमाल के साथ ।
    5. आर टी पर 1 एच के लिए निर्माता-निर्दिष्ट dilutions पर फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा विरोधी खरगोश ६८० और गधे विरोधी माउस) के साथ इनसेबेट ब्लॉट ।
      नोट: फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों भंडारण और उपयोग के दौरान प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए । डार्क प्लास्टिक बक्से या एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर में ऊष्मायन बाहर ले ।
    6. धो झिल्ली 4x 5 मिनट के लिए TBST के साथ और 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ धोने जबकि आरटी में कमाल ।
    7. 2 मिनट के लिए एक फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट इमेजिंग सिस्टम पर कल्पना दाग । क्रमश ८०० एनएम और ७०० एनएम चैनल में एंटी-खरगोश ६८० और एंटी-माउस ८०० सेकेंडरी एंटीबॉडी की कल्पना करें ।
      नोट: Replicates स्वतंत्र रूप से अनुभाग 1 से प्रारंभ किए गए हैं । यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि एंटीबॉडी सिग्नल प्रतिसाद उस श्रेणी के भीतर है जिस पर इन प्रयोगों में उपयुक्त डेटा व्याख्या के लिए सिग्नल प्रतिसाद रेखीय है ।

5. डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

  1. एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ब्लाटर की खुली छवि (सामग्री की तालिका) । वेक्टर नियंत्रण, TDP-४३, और FUS (या वेक्टर नियंत्रण और एक-synuclein) नमूनों में संशोधन-विशिष्ट बैंड के कच्चे घनत्व प्राप्त, विश्लेषण मोड में बैंड फ्रेम एक आयत ड्राइंग द्वारा ।
  2. नियंत्रण बैंड लोड करने के लिए ५.१ चरण को दोहराएं ।
    नोट: एक लोड हो रहा है नियंत्रण बैंड और प्रत्येक नमूने में एक संशोधन-विशिष्ट बैंड होगा ।
  3. सदिश नियंत्रण नमूने में इसी बैंड के घनत्व के द्वारा प्रत्येक बैंड विभाजित करके संशोधन-विशिष्ट बैंड के सापेक्ष घनत्व की गणना । यह वेक्टर नियंत्रण करने के लिए डेटा normalizes ।
  4. वेक्टर नियंत्रण नमूना में इसी लोड हो रहा है नियंत्रण बैंड के घनत्व से प्रत्येक बैंड को विभाजित करके लोड हो रहा है नियंत्रण बैंड के सापेक्ष घनत्व की गणना ।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए लोड हो रहा है नियंत्रण बैंड के सापेक्ष घनत्व पर संशोधन-विशिष्ट बैंड के सापेक्ष घनत्व विभाजित करके प्रत्येक बैंड के समायोजित सापेक्ष घनत्व की गणना । अब, डेटा हिस्टोग्राम रूप में कल्पना जा सकता है ।
    नोट: प्रसंस्करण की सुगमता के लिए, चरण 5.3 – 5.5 स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल) में किया जा सकता है ।
  6. के बाद एकाधिक स्वतंत्र replicates, दो नियंत्रण के नमूने और उपयुक्त proteinopathy मॉडल के बीच वेल्च टी परीक्षण भागो (नियंत्रण बनाम FUS, नियंत्रण बनाम TDP-४३, और नियंत्रण बनाम ए-synuclein) के साथ p = ०.०५ महत्व के लिए कटऑफ के रूप में .

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Representative Results

इस विधि को समझाने के लिए, हम हाल ही में प्रकाशित परिणाम30का लाभ ले जाएगा । WT मानव FUS और टीडीपी-४३ 5 एच के लिए overexpressed थे, जबकि WT α-synuclein 8 ज के लिए overexpressed किया गया था । एक ccdB निर्माण एक सदिश नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 2 ठोस और तरल संस्कृतियों में वृद्धि दमन से पता चलता है । खमीर के रूप में वर्णित है और संशोधन के साथ पश्चिमी सोख्ता-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रदर्शन किया गया था काटा गया था । विरोधी कुल H3 एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । H3S10ph और H3K14ac के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी FUS अधिअभिव्यक्ति मॉडल में स्पष्ट है (चित्रा 3a, बी) । वहां H4K12 पर ऐसीटिलन के स्तर में महत्वपूर्ण बढ़ जाती है और H4K16 तेदेपा-४३ overexpression मॉडल है कि या तो fus या α-syनाभिक overexpression मॉडल में नहीं मनाया जाता है (चित्रा 3 सी, डी) । α-साइक्लोइन ओवरएक्सप्रेशन मॉडल (चित्र 3e, f) में H3K36me2 और H2BT129ph के स्तरों में भी महत्वपूर्ण कमी होती है ।

यह दिखाने के लिए कि हिस्टोन ptms में परिवर्तन neurodegenerative प्रोटिनोपैथी प्रोटीन की अभिव्यक्ति की मात्रा के साथ संबद्ध है, fus की अभिव्यक्ति गैलेक्टोज के अलग स्तर में प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्प्रेरण द्वारा tuned किया जा सकता है (चित्र 4a). गैलेक्टोज को बदलने के अनुपात में सुक्रोज के साथ मिलाया जाता है इस तरह कि चीनी की कुल एकाग्रता 2% पर स्थिर है, लेकिन गैलेक्टोज की मात्रा प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की एक सीमा में जिसके परिणामस्वरूप संशोधित किया गया है. एस सेरेविस्सी में, सुक्रोज धीरे ग्लूकोज, जो गैलेक्टोज प्रेरण31को दबाने के लिए metabolized है. इसलिए, सुक्रोज न तो सक्रिय करता है और न ही गैलेक्टोज प्रेरण को रोकता है । कम विषाक्तता ठोस और तरल संस्कृति दोनों में मनाया गया (चित्रा 4b, सी) गैलेक्टोज की मात्रा कम fus overexpression प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया. महत्वपूर्ण बात, FUS अधिव्यंजक के स्तर को कम, H3S10ph के स्तर में कमी की भयावहता छोटे (चित्रा 4d-f) ।

Figure 1
चित्रा 1: में परिवर्तन के लक्षण वर्णन के लिए Methodoverview हिस्टोन के बाद शोधों खमीर मॉडल में न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग proteinopathies से जुड़े संशोधनों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विषाक्तता न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटीनोपैथी के overexpression के साथ जुड़े खमीर मॉडल में प्रोटीन से संबंधित. assays से पता चलता है कि ग्लूकोज (ए) या गैलेक्टोज (b) की उपस्थिति में वेक्टर नियंत्रण, टीडीपी-४३, fus, या α-synuclein खमीर के लिए सेल व्यवहार्यता दिखाना । (ग) गैलक्टोज प्रेरण के अंतर्गत तरल संस्कृति में कोशिका व्यवहार्यता को दर्शाने वाला विकास वक्र । त्रुटि पट्टियां ± मानक विचलन इंगित करती हैं । n = 3 प्रत्येक तनाव के लिए । पूरी तरह से स्वतंत्र प्रयोगों से परिणाम Replicates. चेन, के. एट अल. न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग प्रोतियोपैथी से अनुमति के साथ अनुकूलित डेटा विशिष्ट Histone के बाद translational संशोधन परिदृश्य से जुड़े हुए हैं । ACS रासायनिक तंत्रिका विज्ञान । 9 (४), 838-848 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसाइटी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ऊतक के बाद में परिवर्तन-translational न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटीनोपैथी के overexpression के साथ जुड़े संशोधनों खमीर मॉडल में प्रोटीन से संबंधित । एक FUS प्रोटिनिपैथी मॉडल (a) H3S10ph, n = 6, और (b) H3K14ac, n = 3 के स्तर में कमी दिखाता है । इसके विपरीत, एक TDP-४३ प्रोटिनोपैथी मॉडल (c) H4K12ac, n = 3, और (d) H4K16ac, n = 6 के स्तर में वृद्धि दिखाता है, जबकि एक α-synuclein मॉडल (e) H3K36me2, n = 3, और (f) H2BT129ph, n = 7 के स्तर में कमी दिखाता है । त्रुटि पट्टियां + मानक विचलन दिखाती हैं । *, पी < ०.०५, * * *, पी < ०.००१ । पूरी तरह से स्वतंत्र प्रयोगों से परिणाम Replicates. चेन, के. एट अल. न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग प्रोतियोपैथी से अनुमति के साथ अनुकूलित डेटा विशिष्ट Histone के बाद translational संशोधन परिदृश्य से जुड़े हुए हैं । ACS रासायनिक तंत्रिका विज्ञान । 9 (४), 838-848 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसाइटी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: H3S10ph स्तरों में कमी की सीमा FUS अधिव्यंजक के स्तर से बंधा हुआ है । (क) सूक्रोज और गैलक्टोज अनुपात के उपयोग का कार्टून चित्रण fus अधिअभिव्यक्ति की मात्रा को ट्यून करने के लिए । (ख) गैलेक्टोज के विभिन्न स्तरों की उपस्थिति में कोशिका व्यवहार्यता दर्शाने वाले assays को खोलना । (ग) तरल संस्कृति में वृद्धि वक्र गैलेक्टोज के विभिन्न स्तरों की उपस्थिति में कोशिका व्यवहार्यता को दर्शाता है । त्रुटि पट्टियां ± मानक विचलन इंगित करती हैं । (घ) प्रतिनिधि immunoblots दर्शाते हैं कि कोशिकाओं के रूप में fus प्रोटीन के स्तर में वृद्धि galactose के अनुपात में वृद्धि करने के लिए उजागर कर रहे हैं. फॉस् फोग्लिसेरेट किन्से (PGK) का प्रयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था । (ङ) रिप्रेजेंटेटिव इमयूनोबाइट गैलेक्टोज के अनुपात को बढ़ाने के साथ H3S10ph स्तरों में तदनुरूपी कमी दर्शाता है । (च) (ङ) का मात्रात्मक हिस्टोग्राम n = 3 प्रत्येक शर्त के लिए । त्रुटि पट्टियां परिमाणन चार्ट के लिए मानक विचलन का संकेत देती हैं । पूरी तरह से स्वतंत्र प्रयोगों से परिणाम Replicates. चेन, के. एट अल. न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग प्रोतियोपैथी से अनुमति के साथ अनुकूलित डेटा विशिष्ट Histone के बाद translational संशोधन परिदृश्य से जुड़े हुए हैं । ACS रासायनिक तंत्रिका विज्ञान । 9 (४), 838-848 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसाइटी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक सरल, समीचीन, और लागत प्रभावी तरीके से categorizing जीनोम चौड़ा हिस्टोन ptm परिवर्तन neurodegenerative प्रोतीनोपैथी के साथ सहसंबद्ध प्रदान करता है । जबकि वहां ALS और पीडी के अंय मॉडल, इस तरह के रूप में इन विट्रो मानव सेल लाइनों और murine मॉडल३२, एस cerevisiae के रूप में उपयोग की अपनी आसानी की आकर्षक रहता है । उदाहरण के लिए, खमीर मॉडल एक हुड के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, न ही वे गहन प्रशिक्षण कि सेल संस्कृति के काम के साथ चला जाता है की आवश्यकता है । इसके अलावा, संवर्धन खमीर के लिए अभिकर्मकों भी अधिक स्तनधारी सेल संस्कृति की आपूर्ति की तुलना में सस्ती कर रहे हैं । खमीर मॉडल केवल प्रोटीन एकत्रीकरण22,23,24,25,26के डोमेन निर्धारकों प्रकट नहीं करने के लिए शोषण किया गया है, लेकिन यह भी आनुवंशिक जोखिम का पर्दाफाश करने के लिए नेतृत्व किया है कारकों में27, साथ ही प्रोटीन एकत्रीकरण विषाक्तता के संशोधक22। इसके अलावा, Set3 के विलोपन, हिसोन deacetylase परिसर के एक सदस्य, को कम करने के लिए पाया गया है TDP-४३ विषाक्तता में खमीर३३। दिलचस्प है, खमीर में हमारे निष्कर्षों दोनों एक fus माउस मॉडल में हिस्टोन संशोधन परिवर्तन पर हाल ही में रिपोर्ट के साथ समझौते में है और एक मानव SH-SY5Y fus अधिअभिव्यक्ति मॉडल३४,३५में । इसके अलावा, हाल ही में इस तरह के snca और PARK2के रूप में प्रमुख पीडी जीन, के आसपास डीएनए मेथिलन पैटर्न में परिवर्तन की खोज, पीडी३६,३७में epigenetics के लिए एक भूमिका का समर्थन.

यहां, हम बताते है कि इन खमीर मॉडल भी पता चलता है कि कैसे neurodegenerative proteinopathies30epigenome के साथ बातचीत किया जा सकता है । हम पाते है कि हिस्टोन संशोधनों में अलग परिवर्तन प्रत्येक प्रोटिनोपैथी मॉडल के साथ जुड़े रहे हैं । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल हमें अंय मॉडल प्रणालियों में पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करने की अनुमति देता है । सबसे उल्लेखनीय, इस विधि न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग की epigenomic पैनोरमा की हमारी समझ बढ़ गया है । यहां प्रस्तुत संशोधनों के विस्तारित सेट उपंयास हिस्टोन लेखक और औषधीय हस्तक्षेप के लिए रबड़ लक्ष्यों को उजागर कर सकता है । इन परिणामों के संभावित योगदान पर प्रकाश डाला histones PTMs और एपीजेनेटिक्स की विकृति में ALS, पीडी, और अंय neurodegenerative रोगों और इन रोगों के उपचार के लिए उपंयास रास्ते प्रदान कर सकते हैं ।

विशेष रूप से देखभाल करने के लिए कदम १.९ और १.१० जब खमीर बदलने के लिए न्यूरोडेजेनेरेटिव proteinopathies overexpress में लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, अभिकर्मकों चरण १.१० के दौरान उचित क्रम में जोड़ने उच्च परिवर्तक दक्षता को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, यह बहुत galactose में सबसे अधिक वृद्धि दमन प्रदर्शित कॉलोनी लेने के लिए महत्वपूर्ण है । पश्चिमी सैंडविच कोडांतरण करते समय देखभाल भी की जानी चाहिए । जेल और झिल्ली के बीच बुलबुले के आकस्मिक अलावा प्रोटीन के हस्तांतरण ब्लॉक और ब्लाटर पर ब्लॉक स्पॉट प्रदान करेगा कि डेटा विश्लेषण बाधा कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि एंटीबॉडी केवल बाध्यकारी और एक समय में एक या दो हिस्टोन संशोधनों का पता लगाने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं । यह भी उचित रूप में प्रोटीन overexpression (कदम 3.4 − 3.6) के बाद नमूनों के मानकीकरण के लिए महत्वपूर्ण है । पूरी तरह से सभी विकास मीडिया को हटाने से यह सुनिश्चित होगा कि प्रत्येक कोशिका गोली हवाओं को एक ही मात्रा में सस्पेंड । इसी तरह, यह ध्यान से सूक्ष्म अपकेंद्री ट्यूबों (चरण ३.४) में सेल निलंबन की एक ही राशि aliquot महत्वपूर्ण है । यदि नमूनों को ठीक से मानकीकृत नहीं कर रहे हैं, यह हिस्टोन ptm स्तर पर किसी भी परिवर्तन से किसी भी निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए मुश्किल है । इस तरह की समस्या पश्चिमी ब्लाटर (धारा ४.२) के लदान नियंत्रण के स्तर पर विसंगतियों में स्पष्ट हो जाएगा । इस उपाय करने के लिए, एक एसडीएस-पृष्ठ जेल प्रासंगिक नमूनों के साथ भरी हुई coomassie दाग हो सकता है, नमूनों की प्रोटीन बैंड परिमाणन के लिए अनुमति (धारा 5) और बाद में नमूने के बाद पुनः मानकीकरण प्रत्येक नमूने पर मौजूद प्रोटीन की मात्रा के आधार पर.

अंत में, इस प्रोटोकॉल के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है हिस्टोन ptm परिवर्तन से संबंधित प्रोटीन के overexpression के साथ जुड़े न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटियोपैथी बस से कम दो सप्ताह में, परिवर्तन से सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए. न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों के साथ जुड़े proteinopathies के अध्ययन को सक्षम करने के अलावा, इस सामान्य प्रोटोकॉल किसी भी खमीर overexpression मॉडल में हिस्टोन ptm परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

तकनीकी मदद के लिए हम रोयेन तनाज, हुदा यूसूफ, और सादिक्यु तासें का शुक्रिया अदा करते हैं । हम सुक्रोज ट्यूनिंग प्रयोगों के डिजाइन में अभिकर्मकों और बौद्धिक सहायता के उदार प्रावधान के लिए प्रो जेम्स कम के लिए बहुत आभारी हैं । खमीर plasmids प्रो हारून Gitler से एक उदार उपहार थे (303Gal-FUS सहित; ऐडजीन प्लाज्मिड # २९६१४). ब्रुकलिन कॉलेज और उंनत विज्ञान अनुसंधान केंद्र (CUNY) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक NIH NINDS उंनत Postdoctoral संक्रमण पुरस्कार (K22NS09131401) का समर्थन किया M.P.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-His DO Supplement Clontech 630415
10x Running Buffer Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide Gels BIO-RAD 456-1041
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody MilliporeSigma 07-353 (Lot No. 2762291) Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody Abcam ab109463 (Lot No. GR187780) Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody Abcam ab46983 (Lot No. GR71882) Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody Abcam ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody Abcam ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody Abcam ab188292 (Lot No. GR211874) Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody Abcam ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30 Eppendorf 6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) Eppendorf 30702118
Cell Culture Plate, 96 well Eppendorf 30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R Eppendorf 22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW LI-COR 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD LI-COR 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) Dilution: 1/2500
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Extra thick blot paper (filter paper) BIO-RAD 1703968
Galactose Sigma-Aldrich G0750 Prepare 20% w/v stock solution.
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Prepare 20% w/v stock solution.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer Membranes MilliporeSigma IPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc) Sigma-Aldrich L4158 Prepare a 1 M solution.
Loading Dye Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
Methanol ThermoFisher A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell BIO-RAD 1658004
Multichannel pipet Eppendorf 2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x New England Bio Labs 102855-152
Nhe I Restriction Enzyme New England Bio Labs 101228-710
Nuclease Free Water Qiagen 129114
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences 2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) ThermoFisher 165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFP Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB Addgene 14133
pAG303Gal-FUS Addgene 29614
pAG303GAL-TDP-43 Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma-Aldrich P4338 Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S Stain Sigma-Aldrich P3504 Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power Supply BIO-RAD 164-5050
Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich R7630 Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNA Agilent Tech 201190
SD-His plates Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His plates Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 Prepare 0.2 M solution.
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking Buffer LI-COR 927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD 170-3940
Transfer Buffer Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeast Gift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Sigma-Aldrich Y1375

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आनुवंशिकी अंक १४५ न्यूरोअध: पतन पेशीशोषी पार्श्व स्क्लेरोसिस पार्किंसंस रोग α-synuclein सार्कोमा में संगलित राल डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन ४३ हिस्टोन पोस्ट-translational संशोधनों एपिजेनेटिक्स
विशेषता हिस्one पोस्ट-translational में संशोधन परिवर्तन खमीर न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी मॉडल
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Bennett, S. A., Cobos, S. N.,… More

Bennett, S. A., Cobos, S. N., Meykler, M., Fallah, M., Rana, N., Chen, K., Torrente, M. P. Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models. J. Vis. Exp. (145), e59104, doi:10.3791/59104 (2019).

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