Summary
このプロトコル ヒストン翻訳後修飾 (PTM) ALS およびパーキンソン病に関連するタンパク質の過剰発現に関連して発生するレベルのゲノム変化を特徴づける実験手順の概要を説明します。出芽酵母のモデル。SDS ページの分離後個々 のヒストン翻訳後修飾レベルは西部にしみが付くことによって修飾特異抗体で検出されます。
Abstract
神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) などは、毎年の生活の何千もの何百もの損失を引き起こします。病気の進行を停止することができる効果的な治療オプションが不足しています。患者集団における広範なシーケンスの努力にもかかわらずほとんどの ALS と PD の場合単独で遺伝的変異が原因不明のまま。ヒストン蛋白質の翻訳後修飾などのエピジェネティクス機構は、神経変性疾患病因と進展に関与する可能性があり、薬学的介入のための新しいターゲットに 。ALS と PD の哺乳類の生体内および生体外モデルは高価であり、しばしば長引くと面倒な実験的プロトコルを必要とします。ここでは、我々 は出芽酵母をモデル システムとして使用してヒストン修正レベルのゲノム変化を決定する実用的な高速、かつコスト効率の高いアプローチを概説します。このプロトコルは、エピジェネティックな変化の知識を大幅に拡大している間別のモデル システムの前の調査結果を裏付ける神経変性 proteinopathies に接続されている包括的な調査、神経変性疾患エピゲノム。
Introduction
神経変性疾患は、治療オプションがなしにはほとんどの壊滅的な病気です。これらのうち、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) は特に恐ろしいです。ALS と PD 症例の約 90% は散発的な残りのケースが家族で実行、一般に特定の遺伝子変異の1,2にリンクされている疾患の家族歴なしで発生すると見なされます。興味深いことに、これらの疾患の両方はタンパク質サッカード定位誤りと集計3,4,5,6に関連付けられます。例えば、肉腫 (FUS) の融合し、43 (TDP-43) のタール DNA 結合タンパク質が RNA 結合蛋白質細胞質に mislocalize、ALS7,8,9,10、集計 11,12, α-シヌクレインは PD5,13,14,15にレビー小体と呼ばれるタンパク質の集合体の主成分。
患者集団における大規模なゲノム広い連合の努力にもかかわらず ALS と PD 症例の大多数は遺伝子説明されていなく残る。エピジェネティクスは、神経変性疾患における役割を再生できますか。エピジェネティクスは、基になる DNA シーケンス16に変更もなしで起こる遺伝子発現の変化を構成されています。主要なエピジェネティックなメカニズムには16ヒストン蛋白質の翻訳後修飾 (Ptm) が含まれます。真核生物の細胞の遺伝物質はしっかりとクロマチンにラップされます。クロマチンの基本単位は、DNA がヒストン 8 量体の周りをラップの 146 の塩基対から成る、ヌクレオソーム ヒストン (2 部各ヒストン H2A、H2B、H3、および H4)17の 4 つのペアから成るです。各ヒストンは N ターミナル尾ヌクレオソームの突き出した、リジンとアルギニン残基18上通常の様々 な化学基の付加によって変更することができます。これらの Ptm は動的なつまり、彼らは、簡単に追加することができます削除とアセチル化、メチル化、リン酸化などのグループが含まれます。Ptm は DNA の転写の機械へのアクセシビリティを制御し、制御遺伝子式18のため。たとえば、ヒストンのアセチル化は、非常に基本的なヒストン蛋白質と負荷電 DNA のバックボーン、充填よりアクセスできるアセチル化されたヒストン遺伝子を許可するとの間の静電相互作用の強さを軽減でき、高19を表明しました。最近では、特定のヒストン Ptm との組み合わせの顕著な生物学的特異性が、ヒストン コード仮説20,21どの蛋白質を書き込み、消去、およびヒストン Ptm のすべての行為にコンサートを読むにつながっています。遺伝子発現を調節します。
酵母は、神経変性疾患の研究に非常に有用なモデルです。重要なは、多くの神経細胞は、酵母から人間22,23,24に保存されます。酵母は、細胞毒性や α-シヌクレイン22,23,24,25,26や TDP-43、FUS の過剰発現タンパク質含有を要約します。実際には、ALS の酵母モデルは人間27遺伝的リスク要因を識別するために使用されています。さらに、酵母の過剰発現ヒト α シヌクレイン ニューロン28,29α シヌクレインの毒性を改善するための Rsp5 ネットワークの特性を druggable ターゲットとしての許可。
ここでは、神経変性 proteinopathies (図 1) に関連付けられているゲノム ヒストン PTM の変更を検出する酵母を利用するプロトコルについて述べる。出芽酵母の使用は、その使いやすさ、低コストと神経変性の他の in vitro および動物モデルと比較して速度のため非常に魅力的です。ALS は、PD モデル22,23,25,26を開発活用以前、我々 人間の FUS、TDP-43、および α-シヌクレイン酵母と覆いを取られた異なるヒストン PTM 変化で過剰に発現認知症予備30との接続。ここで説明されているプロトコルは、データ解析への変換から 2 週間足らずで完了ことができます。
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Protocol
1. 神経変性認知症予備関連タンパク質の構造と出芽酵母の変換
- 酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) スープ 30 ° C に (200 rpm) を振動で一晩で野生型 (WT) 303 酵母を育てる
- 12−16 成長の h 後、希釈 600 光学密度酵母 YPD で 0.25 nm (外径600)。酵母液の培養の 10 mL は、各変換に必要となる、50 mL の液体培養の酵母のネガティブ コントロールの変換と同様、FUS、TDP 43、シヌクレインとベクトルのみ (ccdB) 構成要素に対応する 5 つの変換の準備します。なしの DNA。
- 0.60 と 0.80 の間 OD600に到達するまでは、30 ° C で撹拌で酵母を育てます。これは一般に 4−6 h を取る。
- 酵母の増殖が完了する前に 30 分では、プラスミドの構造をリニア化します。
注: ここで使用されるプラスミドの構成要素は、ゲノムに直接統合する必要があります、それゆえ線形変換前に必要。- 金額を計算プラスミド ストック量を引くこのボリュームは、1 μ g にヌクレアーゼ フリー H2O の必要量を計算する 44 μ L から。
- 微量遠心チューブにヌクレアーゼ フリー H2O、10 x 制限酵素バッファー (材料表) の 5 μ L、NheI 制限酵素 (材料表) の 1 μ L、プラスミド (1.4.1 で計算されるステップ) の適切な量を追加します。上下ピペッティングにより徹底的に混合し、37 ° C、15 分インキュベートします。プラスミッドは、現在線形補間との準備ができての変換です。
- イースト菌文化 0.6 から 0.8、50 mL の円錐管でスピンダウン 850 x g 3 分破棄上清の 4 ° c で収穫細胞の OD600に達すると。
- 細胞ペレットを 10 mL の滅菌 H2O の 3 分破棄上清の 4 ° C で 850 × gで遠心分離機に洗ってください。4 つの洗浄の合計の 3 倍を繰り返します。
- 第 3 洗浄の開始時解凍し、サケ精子 DNA 変換反応暖房のブロック上で 5 分間ごとの 10 μ L を沸騰します。
- DH2O 変換あたりの 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、マイクロ遠心チューブ用の適切な数に分割します。5 変換 500 μ L の dH2O にペレットを再懸濁し、5 つの独立した遠心管に均等に分割します。
- 常温 (RT) 850 x gで 5 分間遠心し、残りすべての水を削除します。
- 滅菌 H2O、240 μ L 50% ポリエチレング リコール (PEG) の 1 M LiAc、サケ精子 DNA の 10 μ L、線形プラスミッド DNA の 20 μ L (変換制御なしの DNA のヌクレアーゼ フリー水) 36 μ L の 50 μ L を次の順序で追加します。混和後、それぞれ渦簡潔に変換のすべてのコンポーネントを追加した後。
- 20 分の 42 ° C で変換反応を孵化させなさい。
注: より一貫性のある温度制御の水風呂でこのインキュベーションを行います。 - 470 x g常温 5 分破棄上澄みで遠心し、滅菌 H2O を 200 μ L で各細胞ペレットを再懸濁します
- 酵母懸濁液の選択培地プレート上にプレートし、ローリング ビーズまたは拡散機で 。30 ° C で 2−3 日間インキュベート プレート
注: 合成定義 (SD)-ここで説明されているプラスミッドのため彼のプレートを使用します。
2. 測量グリセロールのコロニー成長抑制・
- 2% ラフィノースを添加した培地の 5 ml 変形プレートからシングル コロニーを接種します。一晩 30 ° C でシェーカーで育ちます。変換ごとに少なくとも 12 の植民地を選択します。
注:"ないの DNA"変換制御板の植民地は必要ありません。 - エタノール、炎が続くとピン フロッガーを滅菌します。
- カルチャごとに、96 ウェル プレートの最初の行で飽和細胞懸濁液 100 μ L 分注。隣接するよく列のすべてのウェルに 200 μ L 滅菌 H2O を追加します。1:5 のシリアル希薄、マルチ チャンネル ピペットが背後にある隣接する列が最初の列から 50 μ L を追加します。ピペッティングで徹底的にミックスします。50 μ L、2 列目から 3 列目とのミックスにして追加ピペッティングします。板の残りの部分についてこの手順を繰り返します。
- 96 ウェル プレートにフロッガーを配置し、やさしく均等に培地プレート ガラクトースと押しによって、プレス プレート酵母。30 ° C で 2−3 日間インキュベートします。
注: SD 彼と SGal 彼のプレートは、ここで説明したプラスミドに使用されます。 - FUS、TDP-43、およびシヌクレイン、変換、ガラクトースの存在下でほとんど成長抑制を表示するコロニーを識別します。SD 彼のプレートからこの植民地を選択し、一晩成長の 2% ラフィノースを添加した培地 10 mL に接種します。ベクトル制御のコロニーのガラクトースの存在下で増殖抑制を表示されないようにするを選択します。
- グリセロールを準備するには、50% のグリセロールの 0.5 mL と飽和させた液体文化の 0.5 mL を組み合わせます。上下にピペッティングして混合し、-80 ° C で凍結
注意: グリセロールの格納することができます-80 ° C で 1 年まで
3. 神経変性認知症予備の過剰発現は、出芽酵母におけるタンパク質を関連付けられています。
- 冷凍グリセロール、ヒスチジン、酵母を再デルスト リークから 2% ブドウ糖寒天培地選択培地プレートし、2−3 日, 30 ° C で。
- 過剰発現モデルおよびヒスチジン選択液体培地添加 2% ラフィノースの 5 mL のコントロールごとに単一のコロニーを接種します。一晩で 30 ° C (200 rpm) の揺れとともに成長します。
- 過剰発現モデルとコントロールのそれぞれの液体培養の 100 mL を成長 (FUS、TDP-43、およびベクトル制御; a シヌクレインとベクトル制御)。
- 2% ガラクトースを添加した培地における文化の 100 mL を準備します。
- 一晩文化の OD600を測定し、一晩かけて培養開始外径600 0.3 の過剰発現文化をレンダリングに必要な量を計算します。通常、一晩文化は一晩 100 mL の新鮮な文化の文化の約 5 mL を必要と 0.9−10 の外径600に達する。
- 5 h (FUS と TDP 43) または 30 ° c. で揺すると 8 h (a シヌクレイン) ガラクトース メディア (手順 3.3.1 参照) に酵母を成長することにより蛋白過剰発現を誘導します。
- 誘導期の終わりに各文化の OD600を測定します。外径 φ600の最小値にすべての細胞数を標準化します。4 ° C で 5 分間 850 × gで遠心分離 50 mL チューブに文化を収穫します。上清を捨てます。
注: OD600値誘導の終了時に測定が場合 0.654 と 0.984、それぞれシヌクレインは文化の 100 mL と 100 mL 管理文化の 95 mL シヌクレインは文化と制御文化の 67.1 mL の収穫します。 - 1 mL 滅菌 dH2O のための栽培文化のすべての 10 mL にペレットを再懸濁します。早かったセル巻き上がり 1 mL 遠心チューブに、ペレットを均等に分割します。たとえば、100 ml の培養の場合、滅菌 dH2O 10 mL にペレットを再懸濁します、10 マイクロ遠心チューブ用に分割します。
- 850 x g 4 ° C で 5 分間遠心し、上清を除去します。細胞ペレットに凍結する液体窒素、-80 ° C の店で
注: 細胞ペレットは-80 ° C で 1 年間保存できます。
4. セル換散およびヒストン翻訳後修飾を検出する西部のしみ
- セル換散
- 氷の上の酵母細胞ペレットを解凍し、dH2o. の 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します
- セル巻き上がりに 0.2 M NaOH の 300 μ L と 2-メルカプトエタノールの 20 μ L を追加します。上下にピペッティングによって再懸濁します。
- 10 分間氷の上のセルをインキュベートし、30 卓上遠心分離機に 3,200 x gで遠心分離した破棄上澄みで s。
- 染料と暖房のブロック上で 10 分間沸騰ロード x 1 の 100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
注:テーブルの材料でローディングの染料 × 6 のレシピを見つけることができます。
- ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動と膜を転送します。
- バッファーを実行している 2 つのゲル ライン マーク外チャンバーを充填とトップへのゲル ホルダーと充填内側室に 2 つのゲルを置くことによってゲル室を準備します。
- まあ 10 も 12% ポリアクリルアミドゲルに、4.1.4 ステップから 15 μ L のサンプルをロードします。蛋白質の梯子レーンの 5 μ L をロードします。
- 150 V、またはゲルの底に達する色素フロントの読み込みまでは、約 45 分のためのゲルを実行します。
- ゲルの実行中を転送バッファー (材料表) の繊維のパッド (ゲルごとに 2 つ) を浸漬し、メタノールのポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を浸漬膜転送の準備します。転送する前に転送バッファーの膜をすすいでください。
注: PVDF 膜のゲルのサイズにカットする必要があります、転送されるすべてのゲルの 1 つの PVDF 膜を使用します。 - アセンブル、セミドライの転送装置のセルに転送 'サンドイッチ': 下部電極から (1) さら繊維パッド、洗われ、(2) さら PVDF 膜、4.2.3 のステップからゲル (3) および (4) 2 番目のさら繊維パッドを配置。
メモ:、必ず転送 'サンドイッチ' の空気泡を避けるために'サンドイッチ' 泡を強制的に血清ピペットをゆっくりと転がしてください。ゲルは、PDVF 膜上に配置されている、それを移動しないように確認します。 - 電源パックを 150 に設定すると、タンパク質の転送を行う mA 1 h (1 つ ' サンドイッチ')。
- ヒストン Ptm 変更特定の抗体の検出
- 転送装置から膜を削除します。すすぎ簡単に dH2o.
- 必要に応じて、小さなプラスチックの箱に膜をカバーし、30−60 s. 削除 Ponceau S の穏やかな揺れで RT のインキュベーションを汚し、背景の汚れまで dH2O で洗浄十分な Ponceau S 汚れを注ぐことによって Ponceau S 染色でタンパク質の転送をチェックします。消える、蛋白質バンドが肉眼に目に見える。DH2O 膜からすべての汚れがなくなるまですすぎを続けます。
- 染色の小箱でトリス緩衝生理食塩水 (TBS) ブロック バッファー (材料表) の穏やかな揺動と RT で 1 h のしみの孵化によって膜をブロックします。しみをカバーするのに十分なブロック バッファーを使用します。
注意: 蛋白質がうそをつく膜側がに直面していないので、染色のボックスに直立に膜を配置するように気をつけてください。 - 一晩 4 ° C で酵母に対する反応性ヒストン修飾特異抗体で染色のボックスでしみを孵化させなさいメーカーの仕様によると TBS のブロック バッファーで抗体を希釈します。修飾特異抗体から別のホスト種で発生した反合計 H3 などの適切な核積載コントロールがあります。例えば、ウサギで育った抗 H3S10ph 抗体を用いた H3S10ph の調査している場合、は、ローディング コントロールとしてのマウスで発生した反合計 H3 抗体を使用します。必要に応じて、すべてのしみのため、この手順を繰り返します。
注: 抗体希釈液は一ヶ月の内で 3 回の合計は再利用できます。4 ° C で保存します。 - 4 膜を洗浄の x 家製 TBS + 0.1% ポリソルベート 20 (TBST) 室温ロッキング 5 分
- メーカー指定の希釈 (ロバ抗家兎 680 とロバ抗マウス) 室温 1 時間で二次抗体を蛍光でしみを孵化させなさい
注: 二次抗体を蛍光は、記憶域と使用率の両方の中に光から保護する必要があります。黒いプラスチックの箱でインキュベーションを行うまたは、アルミ箔でカバーします。 - 洗浄を 4 x tbst 5 分、室温を揺動しながら 5 分間 TBS で洗う
- 2 分のシステムをイメージング蛍光西部のしみしみを視覚化視覚化抗家兎 680 と抗マウス 800 二次抗体、800 nm と 700 nm チャンネル、それぞれ。
注: 複製で独立して行うセクション 1 から始まっています。抗体信号が信号応答のこれらの実験の適切なデータ解釈のために線形範囲内にあることを確認する必要があります。
- 転送装置から膜を削除します。すすぎ簡単に dH2o.
5. データ分析と統計
- イメージング ソフトウェア (材料表) のしみの画像を開く。分析モードでバンドを囲む四角形を描画することによって、ベクトル制御、TDP-43、FUS (またはベクトル制御とシヌクレインは) 変更特定バンド サンプルの生の密度を取得します。
- コントロール バンドの読み込み手順 5.1 を繰り返します。
注: ローディングがあるでしょうバンドと各サンプルの変更特定のバンドを制御します。 - 密度ベクトル コントロールのサンプルに対応するバンドの各バンドで割って修正特定バンドの相対的な密度を計算します。これは、ベクトル制御をデータを正規化します。
- 読み込みの相対密度を計算対応する読み込みの密度で各バンドを割ってコントロール バンド ベクトル コントロールのサンプル コントロール バンド。
- 読み込みの相対密度を介して変更特定バンドの相対的な密度で割って各バンドの調整の相対的な密度を計算する各サンプルのコントロール バンド。今、ヒストグラムの形式でデータを視覚化できます。
注: 処理しやすいように、手順 5.3-5.5 はスプレッドシート (補足ファイル) で実行できます。 - 複数の独立した複製、2 つの制御サンプルと適切な認知症予備の実行のウェルチの T 検定pの (FUS 対コントロール、TDP-43 対コントロールおよびシヌクレインは対コントロール) のモデルの後は意義のためのカットオフとして 0.05 を =.
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Representative Results
このメソッドを示すためには、我々 を最近公開された結果30の利用します。WT 人間 FUS と TDP 43 はいた WT α-シヌクレインが過剰に発現して 8 時間中 5 時間過剰発現。CcdB コンストラクトは、ベクトルのネガティブ コントロールとして使用されました。図 2は、固体および液体文化で成長抑制を示しています。前述の酵母が収穫され、の修飾特異抗体を用いたウエスタンブロットを行った。反計 H3 は、ローディング コントロールとして使用されました。H3S10ph と H3K14ac のレベルの重要な減少は、FUS 過剰発現モデル (図 3 a, b) で明らかです。H4K12 と H4K16 のいずれかで、FUS は観察されなかったが TDP 43 過剰発現モデルまたは α-シヌクレイン発現モデル (図 3 c、d) のアセチル化のレベルの大幅な向上があります。また、α-シヌクレイン発現モデル (図 3 e, f) の H3K36me2 と H2BT129ph のレベルで有意な減少があります。
神経変性認知症予備タンパク質の発現量とヒストン Ptm の変更に関連付けられている表示は、FUS の式はガラクトース (図 4 a) のさまざまなレベルでのタンパク質の発現を誘導することによって調整できます。ガラクトースは、砂糖の濃度が 2% で一定、ガラクトース量はタンパク質の発現レベルの範囲で変更がような比を変更中のスクロースを混ぜています。酵母ショ糖はグルコース、ガラクトース誘導31を抑制するゆっくりと代謝されます。したがって、スクロースはどちらもアクティブにもガラクトース誘導を抑制します。ガラクトース量が低いは、FUS の過剰発現を誘導するために使用、以下の毒性 (図 4 b、c) は、固体と液体の両方の文化で観察されました。重要なより低い FUS 過剰発現のレベル、H3S10ph レベル (図 4 dの-f) の減少の大きさは小さい。
図 1: 神経変性疾患 proteinopathies 酵母のモデルに接続されているヒストン翻訳後修飾の変化の特性評価のための Methodoverview 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 酵母モデルにおける神経変性認知症予備関連タンパク質の過剰発現に関連する毒性。スポッティングのアッセイは、ベクトル制御、TDP 43、FUS、または α-シヌクレイン (、) グルコースやガラクトース (b) 存在下で過剰発現酵母の細胞生存率を示しています。(c) 成長曲線は、ガラクトースの誘導の下で液体培養細胞の生存率を示します。誤差範囲は ± 標準偏差を示します。n = 各緊張に 3。レプリケートが完全に独立した実験から発生します。陳健ら神経変性疾患 Proteinopathies 異なるヒストン Post-translational 変更風景に接続されてからの許可と適応データ。化学神経。9(4)、838-848 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 酵母モデルにおける神経変性認知症予備関連タンパク質の過剰発現に関連付けられているヒストン翻訳後修飾の変化します。FUS 認知症予備モデル n (、)、H3S10ph の減らされたレベルを示しています = 6、および (b) H3K14ac、n = 3。逆に、TDP 43 認知症予備モデルは、n H4K12ac、(c) の増加されたレベルを示しています = 3、および (d) H4K16ac、n = 6、α シヌクレイン モデルは、n H3K36me2、(e) の減らされたレベルを示して = 3、および (f) H2BT129ph、n = 7。エラー バーが表示 + 標準偏差。*、 p < 0.05 * * *、 p < 0.001。レプリケートが完全に独立した実験から発生します。陳健ら神経変性疾患 Proteinopathies 異なるヒストン Post-translational 変更風景に接続されてからの許可と適応データ。化学神経。9(4)、838-848 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: H3S10ph 濃度の低下の程度は FUS の過剰発現のレベルに関連付けられます。FUS 過剰発現の量を調整するショ糖とガラクトースの比率の使用 (、) 漫画のイラスト。(b) のスポッティング スコープの試金は、ガラクトースのさまざまなレベルの存在下で細胞生存率を示します。ガラクトースのさまざまなレベルの存在下で細胞生存率を示す液体文化で (c) 成長曲線。誤差範囲は ± 標準偏差を示します。(d) 代表 immunoblots 表示のレベルが上昇するは、FUS タンパク質の場合、細胞はガラクトースの比率の増加にさらされる。ホスホ グリセリン酸キナーゼ (PGK) は、ローディング コントロールとして使用されました。代表 immunoblots (e) 表示対応する減少ガラクトースの比率の増加とともに H3S10ph レベル。(e) (f) 量子化ヒストグラム。n = 各条件に対して 3。誤差範囲を示す + 数量グラフの標準偏差。レプリケートが完全に独立した実験から発生します。陳健ら神経変性疾患 Proteinopathies 異なるヒストン Post-translational 変更風景に接続されてからの許可と適応データ。化学神経。9(4)、838-848 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したプロトコルでは、神経変性の proteinopathies に関連するゲノム ヒストン PTM 変化を分類する、方便、簡単でコスト効果の高い方法を提供します。ALS は、PD の他のモデルがありますが、体外などひと細胞およびマウス モデル32、出芽酵母のままその使いやすさのために魅力的です。例えば、無菌フードの使用を必要としない酵母モデルも集中的な訓練に同調細胞培養作業が必要か。さらに、酵母を培養用試薬は哺乳類の細胞の文化用品よりもより手頃な価格も。酵母のモデルは、タンパク質凝集22,23,24,25,26, ドメインの決定要因を明らかにするだけでなく、また遺伝的リスクの発見につながっているに悪用されています。ALS27, だけでなく、タンパク質凝集毒性22の修飾子の要因。さらに、酵母33TDP 43 毒性を軽減する Set3、ヒストンの脱アセチル化酵素複雑なメンバーの削除が見つかりました。興味深いことに、酵母における我々 の調査結果は、ヒストン修飾変化人間 SH SY5Y FUS 過剰発現モデル34,35両方 FUS マウス モデルにおける最近の報告と一致しています。さらに、最近、 SNCAおよびPARK2、PD36,37エピジェネティクスの役割のサポートなどに、周辺キーの PD 遺伝子の DNA メチル化パターンの変化を発見しました。
ここでは、これらの酵母のモデルは神経変性 proteinopathies がエピゲノム30と対話する方法を発見するも使用できますを示します。我々 は、ヒストン修飾の明確な変化が各認知症予備モデルに関連付けられているを見つけます。ここで説明したプロトコルは他のモデル システムの前の調査結果を確証することができます。最も驚くべきことは、このメソッドは、神経変性疾患のエピゲノム パノラマの私達の理解を高めています。ここで紹介の変更の拡張セットが明らかに薬理学的介入のための新たなヒストン作家と消しゴム ターゲット。これらの結果は、ヒストン Ptm の可能な貢献および他の神経変性疾患、PD、ALS の病理にエピジェネティクス研究を強調表示し、これらの疾患の治療のための新規手段を提供可能性があります。
特に注意は神経変性 proteinopathies ノザンに酵母を変換するときに手順 1.9 と 1.10 で取られる必要があります。具体的には、ステップは 1.10 の間に適切な順序で試薬を追加高変換効率を確保するため必要です。さらに、ガラクトースのほとんどの成長抑制を表示するコロニーを選択する非常に重要です。注意は、ウエスタンのサンドイッチをアセンブルするときにもすべき。泡ゲルと膜間の偶発的な添加はタンパク質の転送をブロックし、データ解析を妨げることができるしみにブロック スポットを提供します。
このプロトコルの制限の 1 つは、抗体はバインドと、一度に 1 つまたは 2 つのヒストン修飾の検出のみに制限されていることです。また、正しく蛋白過剰発現 (手順 3.4−3.6) 後サンプルを標準化することが重要です。各細胞ペレット風をメディアは、すべての成長を完全に削除する、同じボリュームで再停止されます。同様に、慎重に分注することが重要だ (ステップ 3.4) 遠心チューブに細胞懸濁液の同量。サンプルがきちんと標準化されていない場合ヒストン翻訳後修飾レベルの変更から何らかの結論を描画することは困難です。このような問題は、(セクション 4.2) の西部のしみの負荷制御のレベル上のずれで明白になるでしょう。この問題を解決関連試料搭載 SDS ページのゲルの Coomassie ステンド グラス、サンプル (セクション 5) の蛋白質バンドの定量化と各サンプルで現在の蛋白質の量に基づいてサンプルの後続の再標準化を可能にすることができます。
結論としては、このプロトコルは、統計分析への変換から 2 週間弱で proteinopathies 神経変性に関わるタンパク質の過剰発現に伴うヒストン PTM の変化の分析のためことができます。別に神経変性疾患に関連付けられている proteinopathies の研究を有効にする、任意の酵母発現モデルのヒストン PTM の変化を研究するこの一般的なプロトコルを使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
技術的なヘルプ、Royena Tanaz、Huda ユーサフと Sadiqa Taasen に感謝します。試薬およびスクロース チューニング実験の設計における知的支援の寛大な提供のため教授ジェームズ ・ ショーターに非常に感謝しております。酵母プラスミドだった (; 303 Gal FUS を含む教授アーロン ワシントンからの寛大な贈り物Addgene プラスミド # 29614)。ブルックリン大学、高度の科学研究センター (CUNY)、NIH NINDS 高度なポスドク遷移賞 (K22NS09131401) は郵政省をサポート
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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