Summary
Bu iletişim kuralı genom genelindeki değişiklikleri Histon translasyonel modifikasyonlar ALS ve Parkinson hastalığı ile ilişkili proteinlerin overexpression ile bağlantılı olarak meydana gelen (PTM) düzeyde karakterize etmek için deneysel prosedürler özetliyor Saccharomyces cerevisiae modelleri. SDS-sayfa ayrılıktan sonra bireysel Histon PTM düzeyleri batı kurutma yoluyla değişiklik özel antikorlar ile tespit edilir.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yüz binlerce her yıl hayatını kaybına neden olur. Etkili tedavi seçenekleri hastalığın ilerlemesini durdurmak için eksik vardır. Büyük hasta nüfus kapsamlı sıralama çabalarına rağmen ALS ve PD vakaların çoğunluğu tarafından Genetik mutasyonlar yalnız açıklanamayan kalır. Histon proteinleri translasyonel modifikasyon gibi epigenetik mekanizmalar nörodejeneratif hastalık etyoloji ve ilerleme içinde tutulabilir ve ilaç müdahale için yeni hedefler için yol. ALS ve PD memeli içinde vivo ve tüp bebek modelleri pahalı ve genellikle uzun ve zahmetli deneysel protokol gerektirir. Burada, genom genelindeki değişiklikler Histon değişiklik düzeylerinde Saccharomyces cerevisiae bir model sistem kullanarak belirlemek için pratik, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım anahat. Bu iletişim kuralı epigenetik değişiklikleri ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde genişletilirken farklı model sistemlerinde önceki bulguları teyit nörodejeneratif proteinopathies bağlı kapsamlı soruşturma için izin verir nörodejeneratif hastalık epigenome.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar yıkıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri yoktur çok az vardır. Bunlar arasında amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) özellikle korkunç. ALS ve PD olguların yaklaşık % 90 iken kalan servis taleplerini ailelerde çalıştırmak ve genellikle için belirli bir gen mutasyon1,2bağlı olan hastalığı aile öyküsü meydana gelen sporadik olarak kabul edilir. İlginçtir, bu hastalıkların her ikisi de protein mislocalization ve toplama3,4,5,6ile ilişkilidir. Örneğin, sarkomu (FUS) erimiş ve TAR DNA'ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43) sonra sitoplazmaya mislocalize ve ALS7,8,9,10'toplamak RNA proteinler vardır, α-synuclein proteinaceous toplamları Lewy organları PD5,13,14,15' olarak adlandırdığı ilke bileşeni ise 11,12,.
Büyük hasta nüfus geniş genom çapında Derneği çabalarına rağmen ALS ve PD durumlarda ezici çoğunluğu genetik olarak açıklanamayan kalır. Epigenetik nörodejeneratif hastalık bir rol oynayabilir? Epigenetik gen ekspresyonu için temel alınan DNA dizisi16değişiklikler meydana gelen değişiklikler oluşur. Bir ana epigenetik mekanizması Histon proteinleri16sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTMs) içerir. Ökaryotik hücrelerde genetik materyal Kromatin sıkıca sarılır. Kromatin temel birimi 146 baz çifti DNA buna sarılarak Histon octamer oluşan nucleosome, histonlarla (iki kopyasını her Histon H2A, H2B, H3 ve H4)17dört çift modülüdür. Her Histon nucleosome dışarı çıkıntı ve lizin ve arginin artıkları18üzerinde genellikle çeşitli kimyasal moieties eklenmesi tarafından okunabilen bir N-terminal kuyruğu var. Bu PTMs dinamiktir, yani onlar kolayca eklenebilir ve kaldırıldı ve asetilasyon, metilasyonu ve fosforilasyon gibi gruplar içerir. PTMs DNA transkripsiyon makine için denetlemek ve böylece denetim gen ifade18yardımcı. Örneğin, Histon asetilasyon son derece temel Histon protein ve daha erişilebilir olmasını acetylated Histon tarafından Paketli genler izin olumsuz ücret DNA omurga arasında Elektrostatik etkileşimin gücünü azaltır ve böylece son derece 19dile getirdi. Daha yakın zamanlarda, belirli Histon PTMs ve onların birleştirme dikkat çekici biyolojik özgüllük hangi proteinler bu, silmek, okuyup yazmak tüm konser için hareket Histon PTMs Histon kodu hipotezi20,21 yol açmıştır gen ifadesinin modüle.
Maya ateş eğitim için çok kullanışlı bir modeldir. Önemlisi, birçok nöronal hücresel yolları Maya insanlar22,23,-24korunmuş. Maya özetlemek sitotoksisite fenotipleri ve overexpression üzerine protein kapanımlar FUS, TDP-43 veya α-synuclein22,23,24,25,26. Aslında, ALS Saccharomyces cerevisiae modelleri insanlar27genetik risk faktörleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Ayrıca, insan α-synuclein Rsp5 ağ karakterizasyonu druggable hedef olarak α-synuclein toksisite nöronlar28,29iyileştirmek için izin verilen overexpressing Maya.
Burada, nörodejeneratif proteinopathies (şekil 1) ile ilişkili genom çapında Histon PTM değişiklikleri algılamak için Saccharomyces cerevisiae istismar bir protokol açıklayın. S. cerevisiae kullanımı onun rahatlık-in kullanma, düşük maliyetli ve ateş diğer tüp bebek ve hayvan modellerle karşılaştırıldığında hız nedeniyle son derece çekici olduğunu. Daha önce harnessing geliştirilen ALS ve PD modelleri22,23,25,26, insan FUS, TDP-43 ve α-synuclein Maya ve ele geçen farklı Histon PTM değişiklikler meydana overexpressed Her proteinopathy30ile bağlantı. Biz burada tarif protokolü veri analizi dönüşümü az iki hafta içinde tamamlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dönüştürme S. cerevisiae nörodejeneratif proteinopathy ilişkili protein yapıları ile
- Vahşi türü (WT) 303 Maya Maya özü pepton dekstroz (YPD) suyu (200 devir/dakika) 30 ° C'de sallayarak ile bir gecede büyümek
- Maya 600 optik bir yoğunluk için büyüme s 12−16 sonra seyreltik nm (OD600) 0,25 YPD ile. Maya sıvı kültürünün 10 mL her dönüşüm için gerekli olacak gibi beş dönüşümleri FUS, TDP-43, a-synuclein ve vektör tek (ccdB) yapıları, hem hem için negatif kontrol dönüşümü karşılık gelen 50 mL sıvı Maya kültür hazırlamak DNA.
- 0,60 ve 0.80 arasında bir OD600 ulaşılana kadar Maya ajitasyon 30 ° c ile büyümek. Bu genellikle 4−6 h alır.
- Maya büyüme tamamlanmadan önce yarım plazmid yapıları linearize.
Not: Burada kullanılan plazmid yapılarını doğrudan genom entegre edilebilir ve bu nedenle Doğrusallaştırma dönüşüm önce gereklidir.- Plazmid stok hacmi bu tutarlar 1 µg için çıkarma bu birimin nükleaz ücretsiz H2O gerekli miktarını hesaplamak için 44 µL hesaplamak.
- Nükleaz ücretsiz H2O, 10 x restriksiyon enzimi arabelleği (Tablo reçetesi) 5 µL, NheI restriksiyon enzimi (Tablo reçetesi) 1 µL ve plazmid (içinde hesaplanan adım 1.4.1) uygun miktarda microcentrifuge tüp ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Plazmid şimdi doğrusallaştırılmış ve hazır dönüşümdür.
- Sonra Maya kültür 0,6-0,8, hasat hücrelerde bir 50 mL konik tüp ve 850 x g 3 dk. atma süpernatant için 4 ° C'de aşağı spin bir OD600 ulaşır.
- Hücre Pelet 10 mL steril H2O ve 3 dk. atma süpernatant için 850 x g 4 ° c de santrifüj yıkayın. 3 x dört yıkar toplam için yineleyin.
- Üçüncü yıkama başlangıçta, çözülme ve somon Sperm DNA dönüşüm reaksiyonu bir Isıtma blokta 5 min için başına 10 µL kaynatın.
- DH2O dönüşüm başına 100 µL hücre Pelet resuspend ve uygun sayıda microcentrifuge tüpler bölünmüş. Beş dönüştürmeleri için Pelet dH2O 500 µL resuspend ve eşit olarak beş ayrı microcentrifuge tüpler içine bölünmüş.
- 850 x g oda sıcaklığında (RT) de 5 dk santrifüj kapasitesi ve tüm kalan su kaldırın.
- , Aşağıdaki sırada 50 µL steril H2O, 240 µL % 50 polietilen glikol (PEG), 36 µL 1 M LiAc, somon Sperm DNA 10 µL, 20 µL doğrusallaştırılmış plazmid DNA (veya nükleaz boş su hiçbir DNA denetim dönüştürme için) ekleyin. İyice her toplama ve girdap sonra kısaca tüm dönüştürme bileşenleri ekledikten sonra karıştırın.
- Dönüştürme reaksiyonlar için 20 dk 42 ° C'de kuluçkaya.
Not: Bu kuluçka daha tutarlı sıcaklık kontrolü için bir su banyosu içinde yerine getirir. - 470 x g de RT için 5 dk. atma süpernatant, santrifüj kapasitesi ve her hücre Pelet steril H2o 200 µL içinde resuspend
- Maya süspansiyon seçmeli medya plakalar üzerinde plaka ve haddeleme boncuk veya dağıtıcı ile yayıldı. Tabak 30 ° C'de 2−3 günlerce kuluçkaya
Not: Sentetik tanımlı (SD)-onun plakasını burada açıklanan plazmid için kullanılır.
2. araştırma kolonisi büyüme bastırma ve gliserol stokları depolama
- 5 mL % 2 raffinose ile desteklenen seçmeli medya dönüştürme levha üzerinden tek kolonileri aşılamak. Bir shaker 30 ° c üzerinde bir gecede büyümek. Dönüşüm başına en az 12 koloninin seçin.
Not: Hiçbir kolonileri "DNA" dönüşümü kontrol plaka bekleniyor. - PIN-frogger etanol, alev tarafından takip ile sterilize.
- Her kültür için doymuş hücre süspansiyon bir 96-şey plaka ilk satırda aliquot 100 µL. Steril H2O 200 µL bitişik iyi sütunların bütün wells ekleyin. 1:5 seri dilutions için 50 µL bitişik sütun ile çok kanallı damlalıklı ilk sütunundan ekleyin. Pipetting tarafından iyice karıştırın. O zaman 50 µL ikinci sütundan üçüncü sütun için pipetting tarafından ekleyip karıştırın. Plaka geri kalanı için bu işlemi yineleyin.
- Frogger bir 96-şey tabağına yerleştirip yavaşça ve eşit olarak aşağı seçmeli medya plakaları ve galaktoz olmadan bastırarak damgalama tabak maya. 30 ° C'de 2−3 günlerce kuluçkaya.
Not: Burada açıklanan plazmid için SD-His ve SGal O'nun levhalar kullanılır. - FUS, TDP-43 ve synuclein bir dönüştürmeleri için çoğu büyüme bastırma galaktoz huzurunda görüntüleme koloni tanımlayın. Bu koloni SD-onun plaka seçin ve 10 mL % 2 raffinose gecede büyüme ile takıma seçmeli medya içine aşılamak. Vektör kontrolü için bir koloni yok büyüme bastırma galaktoz huzurunda görüntüleme seç.
- Gliserol stokları hazırlamak için % 50 gliserol ile 0.5 mL 0.5 mL doymuş sıvı kültürünün birleştirin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix ve-80 ° C'de dondurmak
Not:-Ebilmek var olmak stok gliserol hisse senetleri için-80 ° C'de bir yıl kadar
3. overexpression nörodejeneratif proteinopathy S. cerevisiae proteinler ilişkili
- Donmuş gliserol hisse senetleri, histidin üzerinde Maya yeniden çizgi üzerinden % 2 glukoz agar seçmeli medya tabaklar ve 30 ° C'de 2−3 günlerce kuluçkaya.
- Her overexpression modelleri ve 5 mL de %2 raffinose ile desteklenmiş histidin selektif sıvı medya denetiminde tek kolonileri aşılamak. Bir gecede 30 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile büyümek.
- 100 mL sıvı kültürünün overexpression modelleri ve denetimlerin her biri için büyümek (FUS, TDP-43 ve vektör kontrol; a-synuclein ve vektör kontrolü).
- 100 mL % 2 galaktoz ile desteklenen seçmeli medya kültürünün hazırlayın.
- Bir gecede kültür OD600 ölçmek ve gecede kültür overexpression kültürler 0.3, başlangıç OD600 işlemek için gereken miktarını hesaplar. Genellikle, gecede kültür 0.9−10, yaklaşık 5 mL 100 mL taze kültür başlatmak için gecede kültür gerektiren bir OD600 ulaşacak.
- Protein overexpression Maya 5 h (FUS ve TDP-43) ya da 8 ile 30 ° C'de sallayarak h (a-synuclein) için galaktoz medya (bkz. Adım 3.3.1) büyüyen tarafından teşvik
- OD600 her kültür indüksiyon dönemin sonunda ölçmek. Tüm hücre sayımları en düşük doz600 değeri standartlaştırmak. 850 x g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından 50 mL tüpler kültüründe hasat Süpernatant atmak.
Not: indüksiyon sonunda ölçülen OD600 değerler 0.654 ve 0,984, sırasıyla, 100 mL synuclein bir kültür ve denetim kültür, 100 mL için ise 95 mL synuclein bir kültür ve kontrol kültürünün 67.1 mL hasat. - Pelet 1 ml steril dH2O her 10 mL yetiştirilen kültür için resuspend. Aliquoting hücre resuspension 1 mL microcentrifuge tüpler içine tarafından eşit olarak bölünmüş Pelet. Örneğin, kültür 100 mL ile başlayan, pelet 10 mL steril dH2O resuspend ve 10 microcentrifuge tüpler içine bölmek.
- Vasıl 850 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, sonra süpernatant kaldırın. Ek hücre topakları sıvı azot ve store-80 ° C'de dondurmak
Not: Hücre granül-80 ° C'de bir yıl süreyle saklanır.
4. hücre lizis ve western Blot Histon translasyonel modifikasyonlar algılamak için
- Hücre lizis
- Maya hücre topakları buz çözme ve hücre topakları dH2O. 100 µL içinde resuspend
- Hücre resuspension için 300 µL 0.2 M NaOH ve 2-mercaptoethanol 20 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend.
- Hücreleri 10 min için buz üzerinde kuluçkaya ve 3200 x g 30 için masa üstü bir santrifüj, santrifüj kapasitesi RT. atma süpernatant s.
- Hücre Pelet 100 µL boya ve kaynatın bir Isıtma blokta 10 min için yükleme x 1 resuspend.
Not: Boya yükleme x 6 için tarifi Malzemeler tablobulunabilir.
- Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez ve membran aktarma
- Jel odası tampon çalıştıran ve iki-jel çizgi işareti dış odasına girmede en tepeye jel tutucu ve dolum iç odası iki jelleri koyarak hazırlamak.
- Örnek 15 µL adım 4.1.4 iyi başına 10-şey % 12 polyacrylamide jel içine yükleyin. Protein merdiven lane için 5 µL yükleyin.
- Yaklaşık 45 dakika için jel 150 V veya boya ön yükleme alt jel ulaşıncaya kadar çalıştırın.
- Jel çalışırken, membran aktarımı için fiber yastıkları (jel ikişerli) Aktarım arabellek (Tablo reçetesi) nemlendirici ve metanol içinde polivinilidin florid (PVDF) membran iliklerine hazırlayın. Aktarma arabelleği transferi önce membran durulayın.
Not: PVDF membran jel boyuta kesilebilir olmalıdır ve bir PVDF membran aktarılan her jel için kullanın. - Araya, yarı kuru aktarım cihazları cep telefonundan bir transfer 'sandviç': alt elektrot (1) presoaked elyaf yastık, (2) presoaked ve durulanır PVDF membran, adım 4.2.3 jel (3) ve (4) bir ikinci presoaked elyaf yastık yerleştirin.
Not: Hava kabarcıkları transfer 'sandviç.' önlemek emin olun Yavaşça kabarcıklar zorlamak için serolojik damlalıklı sandviçle' roll. Jel PDVF membran üstüne yerleştirilen bir kez hareket emin olun. - 150 güç paketi ayarlayarak protein aktarımı taşımak mA (bir ' sandviç' için) 1 h için.
- Histon PTMs değişiklik belirli antikorlar ile tespiti
- Membran aktarım cihazları kaldırın. Durulama kısaca dH2O.
- İsteğe bağlı olarak, küçük bir plastik kutuda membran kapak ve RT nazik 30−60 s. kaldırmak Ponceau-S sallayarak ile kuluçka leke ve arka plan leke kadar dH2ile O durulama için yeterli Ponceau-S leke dökerek proteinler Ponceau-S leke ile transferini kontrol kaybolur ve protein bantları çıplak gözle görünür. Tüm leke membran kaldırılana kadar dH2ile O durulama devam edin.
- Membran leke RT nazik tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) engelleme ile tampon (Tablo reçetesi) sallanan ile 1 h için kuluçka tarafından küçük bir boyama kutusunda engelleyin. Engelleme yeterli arabellek leke kapsayacak şekilde kullanın.
Not: hangi proteinler yalan membran yüzün dönük olduğundan değil böylece membran dik boyama kutusunda yer için dikkatli olun. - Histon değişiklik özgü Antikor Reaktif Maya 4 ° C'de doğru boyama kutusuyla gecede Blot kuluçkaya TBS engelleme arabelleği göre üretici özellikler antikor sulandırmak. Ayrıca Anti-toplam H3 değişiklik özgü antikor farklı ana türlerden büyüdü gibi bir uygun nükleer yükleme denetim içerir. Örneğin, H3S10ph için tavşan yükseltilmiş bir anti-H3S10ph antikor ile sondalama fare yükleme denetimi olarak büyüdü bir anti-toplam H3 antikor kullanın. Her leke gerektiği gibi için yineleyin.
Not: Antikor dilutions üç kez bir ay içinde toplam için yeniden kullanılabilir. Onları 4 ° C'de depolayın - Membran 4 yıkama x ev yapımı TBS + %0,1 polysorbate 20 (TBST) RT. sallanan ile 5 min için
- Üretici tarafından belirtilen dilutions (eşek Anti-tavşan 680 ve eşek Anti-fare) RT. 1 h için ikincil floresan antikor ile leke kuluçkaya
Not: Floresan antikor ikincil depolama ve kullanım sırasında ışıktan korunmalıdır. Kuluçka karanlık plastik kutular içinde yürütmek veya alüminyum folyo ile kapatın. - Membran 4 yıkama TBST ile x 5 min ve RT. sallanan süre 5 min için TBS ile yıkama için
- Görüntüleme sistemi 2 dakika süreyle bir floresan Western blot leke Visualize görselleştirmek Anti-tavşan 680 ve anti-fare 800 ikincil antikorlar içinde 800 nm ve 700 nm kanallar, anılan sıraya göre.
Not: 1 bölümünden başlayarak çoğaltır bağımsız olarak yapılmaktadır. Antikor sinyal yanıt sinyali yanıt bu deneylerde uygun veri yorumlanması için doğrusal aralığında olduğunu doğrulamak gereklidir.
- Membran aktarım cihazları kaldırın. Durulama kısaca dH2O.
5. veri analizi ve istatistik
- Bir görüntüleme yazılımı (Tablo reçetesi) blot açık görüntü. Vektör kontrolü, TDP-43 ve FUS (veya vektör kontrolü ve synuclein a) değişiklik özgü bantlarında örnekleri, ham yoğunluk analiz modu grupta kare bir dikdörtgen çizerek elde etmek.
- 5.1 kontrol bantları yüklemek için adımları yineleyin.
Not: Bir yükleme olacak kontrol grubu ve her örnek bir değişiklik özgü grupta. - Değişiklik özel gruplarından göreli yoğunluk yoğunluğu ile vektör kontrolü örnek olarak, ilgili grubun her grup bölünerek hesaplayın. Bu vektör kontrolü için veri normalleştirir.
- Yükleme göreli yoğunluğunu hesaplamak her grup karşılık gelen yükleme yoğunluğu tarafından bölünerek kontrol grubu vektör kontrolü örnek grupta denetim.
- Yükleme göreli yoğunluğunu üzerinde değişiklik özel grup göreli yoğunluğunu bölerek her grup ayarlanan göreli yoğunluğunu hesaplamak denetim grup her örnek için. Şimdi, verileri çubuk grafik formunda görüntülenir.
Not: işleme kolaylaştırmak için bir elektronik tablo (Ek dosya) adımlar 5.3-5,5 yapılabilir. - Sonra birden çok bağımsız çoğaltır, iki kontrol örnekleri ve uygun proteinopathy arasında çalışma Welch T-testleri (FUS karşı denetim, TDP-43 karşı kontrol ve denetim synuclein a karşı) model p ile önemi için kesim olarak 0,05 = .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem göstermek için biz kısa bir süre önce sonuçları30yararlanabilecek. WT α-synuclein için 8 h overexpressed iken WT insan FUS ve TDP-43 5 h için overexpressed. Bir ccdB yapı bir vektör negatif kontrol kullanıldı. Şekil 2 katı ve sıvı kültürlerde büyüme bastırma gösterir. Maya açıklandığı gibi hasat ve Western Blot değişiklik özel antikorlar ile gerçekleştirildi. Anti-toplam H3 yükleme denetimi olarak kullanıldı. H3S10ph ve H3K14ac seviyeleri önemli bir azalma FUS overexpression modelinde (şekil 3ab) görülür. Birinde FUS gözlenir değil TDP-43 overexpression modeli veya α-synuclein overexpression modeli (şekil 3 cd) H4K12 ve H4K16 asetilasyon düzeyde önemli artışlar vardır. Ayrıca H3K36me2 ve H2BT129ph seviyeleri (3e rakamf) α-synuclein overexpression modelindeki önemli düşüşler vardır.
Histon PTMs değişikliği ifade nörodejeneratif proteinopathy protein miktarı ile karşılıklı olarak ilişkilendirir göstermek için FUS ifade protein ifade galaktoz (şekil 4a) farklı düzeyde inducing tarafından ayarlanabilir. Galaktoz sukroz şeker toplam konsantrasyonu % 2 olarak sabittir ama galaktoz miktarda protein ifade düzeyleri bir dizi sonucu değiştirilir bu oranları değişen ile karıştırılır. S. cerevisiae ' Sükroz yavaş yavaş galaktoz indüksiyon31bastırır glikoz için metabolize edilir. Bu nedenle, sukroz etkinleştirir ne galaktoz indüksiyon bastırır. Galaktoz düşük miktarda FUS overexpression ikna etmek için kullanılan, katı ve sıvı kültüründe (şekil 4bc) daha az toksisite gözlenmiştir. Önemlisi, alt FUS overexpression düzeyi, H3S10ph düzeyleri (şekil 4 d-f) azalma küçük büyüklüğü.
Şekil 1: Methodoverview Histon translasyonel modifikasyonlar değişimler karakterizasyonu için bağlı nörodejeneratif hastalık proteinopathies Maya modelleri için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: overexpression Maya modellerinde nörodejeneratif proteinopathy kaynaklı proteinlerin ile ilişkili toksisite. Edindiği deneyleri için vektör kontrolü, TDP-43, FUS veya α-synuclein glikoz (bir) veya galaktoz (b) huzurunda overexpressing Maya hücre canlılığı göster. (c) büyüme eğrisi hücre canlılığı galaktoz indüksiyon altında sıvı kültüründe gösteren. Hata çubukları ± standart sapma gösterir. n = 3 için her zorlanma. Çoğaltır tamamen bağımsız deneyler sonucu. Veri Chen, K. ve ark. nörodejeneratif hastalık Proteinopathies bağlı farklı Histon Post-translational değişiklik manzara izniyle uyarlanmıştır. ACS kimyasal Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Histon translasyonel modifikasyonlar Maya modellerinde nörodejeneratif proteinopathy kaynaklı proteinlerin overexpression ile ilişkili değişimler. Bir FUS proteinopathy modeli gösterir düşük düzeyde (bir) H3S10ph, n = 6 ve (b) H3K14ac, n = 3. Tersine, gösterir bir TDP-43 proteinopathy modeli yüksek düzeyde (c) H4K12ac, n = 3 ve (d) H4K16ac, n bir α-synuclein modeli (e) H3K36me2, düşük düzeyde n gösterirken = 6 = 3 ve (f) H2BT129ph, n = 7. Hata çubuklarını göster + standart sapma. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Çoğaltır tamamen bağımsız deneyler sonucu. Veri Chen, K. ve ark. nörodejeneratif hastalık Proteinopathies bağlı farklı Histon Post-translational değişiklik manzara izniyle uyarlanmıştır. ACS kimyasal Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: H3S10ph düzeyleri azalma ölçüde FUS overexpression seviyesine bağlı. (bir) Çizgi Film gösterimi sukroz ve galaktoz oranları FUS overexpression miktarını ayarlamak için kullanın. (b) Spotting deneyleri hücre canlılığı galaktoz çeşitli düzeylerde huzurunda gösterilen. (c) büyüme eğrisi hücre canlılığı galaktoz çeşitli düzeylerde huzurunda gösterilen sıvı kültüründe. Hata çubukları ± standart sapma gösterir. (d) temsilcisi immunoblots gösteren hücreleri galaktoz oranları artırmak için sunulan gibi FUS protein artış düzeyleri. Phosphoglycerate kinaz (PGK) yükleme denetimi olarak kullanıldı. (e) temsilcisi immunoblots gösteren H3S10ph düzeyleri artan galaktoz oranları ile karşılık gelen düşüşler. (e), (f) Nefelometri histogram. n = 3 her koşul için. Hata çubuklarını göstermek + miktar grafik için standart sapma. Çoğaltır tamamen bağımsız deneyler sonucu. Veri Chen, K. ve ark. nörodejeneratif hastalık Proteinopathies bağlı farklı Histon Post-translational değişiklik manzara izniyle uyarlanmıştır. ACS kimyasal Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol genom çapında Histon PTM değişiklikleri nörodejeneratif proteinopathies ile ilişkili kategorilere, basit, uygun ve uygun maliyetli bir yolu sağlar. ALS ve PD diğer modelleri olmakla birlikte, vitro gibi insan hücre satırları ve fare modelleri32, S. cerevisiae kalır kullanım kolaylığı nedeniyle çekici. Örneğin, Maya modelleri steril bir başlık kullanılması gerekli değil, ne de onlar eğitim yoğun hücre kültür çalışmalar ile birlikte gider gerekli. Ayrıca, Maya kültürü için reaktifleri da memeli hücre kültür kaynakları çok daha uygun. Maya modelleri sadece protein toplama22,23,24,25,26etki alanı belirleyicileri ortaya, ama aynı zamanda ortaya çıkarılması genetik risk açmıştır için istismar ALS27yanı sıra protein toplama toksisite22değiştiriciler faktörler. Ayrıca, silme işlemini Set3, karmaşık, Histon deacetylase üyesi Maya33TDP-43 toksisite azaltmak için bulundu. İlginçtir, Maya bizim bulgular Histon değişiklik değişiklikler her iki bir FUS fare modeli ve bir insan SH-SY5Y FUS overexpression model34,35üzerinde son raporlar ile anlaşma vardır. Ayrıca, yakın zamanda keşfedilen değişiklikler DNA metilasyonu desen etrafında anahtar PD genler, SNCA ve PARK2, destek gibi bir rol epigenetik PD36,37' için.
İşte, bu Maya modeller de nörodejeneratif proteinopathies ile epigenome30arasındaki etkileşimle keşfetmek için kullanılabilir göstermektedir. Histon değişiklikleri farklı değişiklikler her proteinopathy modeli ile ilişkili olduğunu öğrenin. Burada özetlenen Protokolü diğer modeli sistemlerinde önceki bulguları teyit için bize izin verir. En dikkat çekici, bu yöntem nörodejeneratif hastalık epigenomic Panoraması anlayışımız artan. Burada sunulan değişiklikler genişletilmiş dizi farmakolojik müdahale için roman Histon yazar ve silgi hedefler ortaya çıkarmak. Bu sonuçlar Histon PTMs mümkün katkısını ve ALS, PD ve diğer nörodejeneratif hastalıkların patolojisi epigenetik vurgulamak ve bu hastalıkların tedavisi için yeni yollar sağlayabilir.
Belirli bakım adım 1.9 ve 1,10 Maya dönüşümünde nörodejeneratif proteinopathies overexpress için alınması gerekir. Özellikle, reaktifler düzgün sırayla adım 1,10 sırasında ekleme yüksek dönüşüm verimliliği sağlamak gereklidir. Ayrıca, çoğu büyüme bastırma galaktoz içinde görüntüleme koloni almak çok önemlidir. Ayrıca ne zaman Western sandviç montaj özen gösterilmelidir. Baloncuklar jel ve membran arasında yanlışlıkla yanı sıra transfer protein engellemek ve veri analizi engel olabilir leke blok noktalar sağlar.
Bu iletişim kuralı bir sınırlama antikor sadece bağlama ve bir defada bir veya iki Histon değişiklikler tespit olmasıdır. Düzgün örnekleri protein overexpression (adımları 3.4−3.6) sonra standartlaştırmak önemlidir. Tamamen kaldırma tüm büyüme medya her hücre Pelet rüzgarlar sağlayacaktır aynı birim resuspended. Benzer şekilde, dikkatli bir şekilde aliquot için önemli olan hücre süspansiyon microcentrifuge tüpler (Adım 3.4) içine aynı miktarda. Örnekleri düzgün standart değil, Histon PTM düzeyde herhangi bir değişikliklerden herhangi bir sonuç çıkarmak zordur. Böyle bir sorun belirgin farklılıklar Western blot (Bölüm 4.2) yükleme kontrolünü düzeyleri üzerine olacak. Bu sorunu gidermek için ilgili örnekleri ile dolu bir SDS-sayfa jel lekeli, Coomassie protein grubu miktar örnekleri (Bölüm 5) ve her örnek protein mevcut miktarına göre örnekleri sonraki yeniden standartlastirma izin olabilir.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı Histon PTM değişiklikleri nörodejeneratif proteinopathies için sadece iki hafta içinde istatistiksel analiz için dönüşümü ile ilgili proteinlerin overexpression ile ilişkili analizi için izin verir. Nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili proteinopathies çalışmanın etkinleştirmenin yanı sıra, bu genel protokol Histon PTM değişiklikler herhangi bir maya overexpression modeli eğitim için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Teknik yardım için Royena Tanaz, Huda Yousuf ve Sadiqa Taasen teşekkür ederim. Prof. James Shorter reaktifler ve sukroz ayarlama deneyler tasarım fikri yardım cömert sağlanması için minnettarız. Maya plazmid Prof. Dr. Aaron (303 Gal-FUS; dahil Gitler cömert bir hediye edildi Addgene plazmid # 29614). Brooklyn College ve gelişmiş Bilim Araştırma Merkezi (CUNY) yanı sıra bir NIH NINDS gelişmiş doktora sonrası geçiş Ödülü (K22NS09131401) M.P.T. desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
