Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لبناء مختبر-مقياس الفقاعة العمود photobioreactors واستخدامها للثقافة الطحالب المجهرية. كما يوفر طريقة لتحديد معدل نمو الثقافة والمحتوى الدهني محايدة.
Abstract
وهناك اهتمام كبير في دراسة الطحالب المجهرية للتطبيقات الهندسية مثل إنتاج الوقود الأحيائي، والمنتجات عالية القيمة، ومعالجة النفايات. كما يبدأ معظم الجهود البحثية الجديدة في المختبرات، هناك حاجة لطرق فعالة من حيث التكلفة لاستزراع الطحالب بطريقة استنساخه. وهنا نتواصل نهجاً فعالاً للثقافة من الطحالب المجهرية في photobioreactors في المختبرات، وقياس النمو والمحتوى الدهني محايدة أن الطحالب. كما يتم تضمين إرشادات حول كيفية إعداد النظام فوتوبيوريكتور. على الرغم من أن الكائنات الحية المثال الأنواع Chlorella و أوكسينوتشلوريلا، يمكن تكييفها مع هذا النظام لزراعة مجموعة واسعة من الطحالب المجهرية، بما في ذلك الثقافات المشارك من الطحالب مع الأنواع غير الطحالب. وتزرع الثقافات الأسهم أولاً في زجاجات لإنتاج العدوى للنظام فوتوبيوريكتور. تتركز العدوى الطحالب وتحويلها إلى photobioreactors لزراعة في الوضع الدفعي. يتم جمع عينات يوميا لقراءات الكثافة البصرية. في نهاية ثقافة دفعة، خلايا يتم حصادها بالطرد المركزي، غسلها، وتجميد المجفف للحصول على تركيز وزن جاف نهائي. تركيز الوزن الجاف النهائي يستخدم لإنشاء ارتباط بين الكثافة البصرية وتركيز الوزن الجاف. استخدمت طريقة فلك معدلة في وقت لاحق لاستخراج الدهون الإجمالية من الكتلة الأحيائية المعصوفه وهو جزيئي الاستخراج لمحتواه الدهن محايدة مقايسة ميكروسكوبية باستخدام. هذا التحليل قد صدر سابقا ولكن الخطوات البروتوكول أدرجت هنا لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في الإجراء حيث تحدث الأخطاء بشكل متكرر. مفاعل حيوي النظام المذكور هنا يملأ مكانة بين زراعة قارورة بسيطة والمفاعلات الحيوية التجارية تسيطر عليها تماما. يتطابق حتى مع فقط 3-4 البيولوجية كل معاملة، ونهجنا لاستزراع الطحالب ويؤدي إلى ضيق الانحرافات المعيارية في فحوصات النمو والدهن.
Introduction
تطبيق الطحالب المجهرية في الهندسة والتكنولوجيا الأحيائية قد اجتذب اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة. وتجري الآن دراسة الطحالب المجهرية للاستخدام في المياه المستعملة المعالجة1،2،،من34، الوقود الحيوي الإنتاج5،6،،من78، إنتاج المغذيات وغيرها9،منتجات عالية القيمة10. الطحالب هي أيضا يجري المعدلة وراثيا بمعدلات أكبر في محاولة لتحسين لياقتهم البدنية ل11،التطبيقات الهندسية الخاصة12. ونتيجة لذلك، هناك اهتمام كبير في التجريب مع الكائنات ذات الصلة صناعيا في الإعدادات التي تسيطر عليها. والغرض من هذا الأسلوب هو للتواصل نهجاً فعالاً لثقافة الطحالب المجهرية في بيئة مختبرية تحت التحكم، وقياس النمو والمحتوى الدهني محايدة أن الطحالب. تحسين نمو معدلات ومحتوى الدهون محايدة من الطحالب المجهرية قد حددت كاثنين من الاختناقات الرئيسية نحو تسويق الوقود الحيوي الطحالب13.
استخدمت مجموعة واسعة من النهج للطحالب الثقافة لأغراض تجريبية. وبصفة عامة، يمكن تقسيم هذه النهج بين زراعة في الهواء الطلق على نطاق واسع، وزراعة حوض صغير. زراعة في الهواء الطلق في photobioreactors والبرك المفتوحة المناسبة للتجريب تهدف إلى الارتقاء بمستوى العمليات التي ثبت فعلا في المختبرات (مثلاً، لاختبار الارتقاء بسلالة الدهنية عالية جديدة من الطحالب)14. ومع ذلك، زراعة صغار داخلي مناسب عند تطوير سلالات جديدة أو محسنة الطحالب أو إجراء تجارب تهدف إلى فهم الآليات البيولوجية. وفي هذه الحالات الأخيرة، مطلوب درجة عالية من التحكم التجريبي لندف عليها بعض التغييرات الطفيفة في السلوك البيولوجي. تحقيقا لهذه الغاية، غالباً ما يطلب أكسينيك الثقافات بغية التقليل من العوامل الحيوية المعقدة المرتبطة بالكائنات الأخرى (مثل البكتريا والطحالب الأخرى) التي تنمو لا محالة في نظم في الهواء الطلق واسعة النطاق. حتى عند دراسة التفاعلات بين الطحالب وغيرها من الكائنات الحية، وقد وجدنا أن استخدام الشروط التجريبية الخاضعة للغاية مفيد عند دراسة تبادل الجزيئية بين الكائنات الحية15،،من1617.
ضمن فئة زراعة الطحالب داخلي صغير، استخدمت مجموعة من النهج. ولعل النهج الأكثر شيوعاً تنمو الطحالب في قوارير Erlenmeyer على طاولة شاكر تحت18،بنك خفيفة19. ويجري تبادل الأوكسجين وأول أكسيد الكربون2 بنشر السلبي من خلال المكونات رغوة في أعلى قارورة. وقد تحسنت بعض الباحثين هذا التشكيل عن طريق تهوية نشطة في قوارير20. نهج آخر زراعة الطحالب في زجاجات، المختلطة بواسطة شريط ضجة وتهوية نشطة. وعلى الرغم من بساطتها، وجدنا أن استخدام قوارير وزجاجات غالباً ما يؤدي إلى نتائج غير متناسقة بين replicates البيولوجية. يفترض أن هذا سبب موقف آثار-مواقف مختلفة تلقي كميات مختلفة من الضوء، والتي تؤثر أيضا على درجات الحرارة الداخلية المفاعل. التناوب اليومي من المفاعلات إلى مواقع جديدة يمكن أن تساعد ولكن ليس التخفيف من المشكلة لأن مراحل معينة من نمو الطحالب (مثلاً، أوائل أسي) هي أكثر حساسية للتأثيرات الموضعية من غيرها (مثلاً، سجل المرحلة).
على الجانب الآخر من طيف التطور التكنولوجي هي photobioreactors التجارية التي تسيطر عليها تماما. هذه الأنظمة باستمرار رصد وضبط الأوضاع في المفاعل لتحسين نمو الطحالب. لديهم الإضاءة قابلة للبرمجة والتحكم في درجة الحرارة في الوقت الحقيقي ومراقبة درجة الحموضة. لسوء الحظ، أنها غالية الثمن وتكلف عادة عدة آلاف من الدولارات في المفاعل. أهم المجلات العلمية والهندسية تتطلب النسخ المتماثل البيولوجية للنتائج، مما استلزم شراء المفاعلات الحيوية متعددة. نحن الحاضرين هنا نظام مفاعل عمود فقاعة تلك الجسور الفجوة بين بسيطة (قارورة) ومتطورة (تسيطر عليها تماما مفاعل حيوي) نهج لزراعة الطحالب على نطاق المختبر. استخدام الأعمدة فقاعة ارتفاع فقاعات الغاز لتسهيل تبادل الغازات ومزيج المفاعل. هذا النهج يوفر درجة من التحكم في الإضاءة ودرجة الحرارة ولكنه يفعل ذلك بطريقة فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، فقد وجدنا هذا النظام إلى نتائج متسقة عالية بين replicates البيولوجية، تخفيض العدد المطلوب من replicates البيولوجية اللازمة من أجل الحصول على نتائج مهمة إحصائيا بالمقارنة مع النهج قارورة أو زجاجة. كما أننا استخدمنا هذا النظام بنجاح زراعة مخاليط من الطحالب والبكتيريا21. بالإضافة إلى زراعة الطحالب، أننا مخطط إجراء لقياس المحتوى الدهني محايدة في الطحالب المستزرعة. الأسلوب الأخير قد تم نشرها في أماكن أخرى من22، ولكن نقوم بتضمين الإجراء هنا لتوفير الإرشادات خطوة بخطوة عن كيفية استخدامها بنجاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الإعداد لفقاعة العمود Photobioreactors
- إنشاء مجموعة من أغطية تنفيس من الأغطية البلاستيكية التي جاءت مع 1 لتر الزجاجات والأنابيب التهجين (انظر الشكل 1 التخطيطي والصور). بناء الأغطية المرطب، خلط فخ وكل فوتوبيوريكتور النقل الجوي وكل زجاجة المفاعل.
- حفر ¼ "ثقوب في الغطاء: 2 الثقوب اللازمة لاغطية مفاعل حيوي والمرطب؛ ثمة حاجة إلى 3 ثقوب فخ الخلط.
- تنزلق من ¼ "الدائري على المواضيع من المناسب اللوير جبل الفريق 1/8"، والشرائح وهذا في حفرة ¼ "حفر في الغطاء (الشكل 1A).
- زلة ثاني ¼ "الدائري على المواضيع حيث أن الغطاء هو تقع بين اثنين من حلقات س. زلة ربطه على المواضيع وتشديد لإصلاح نظام جبل لوحة في المكان.
- انجذاب خواتم قفل على إسقاط نظام الذكور المكشوفة من الغطاء. كرر الخطوات 1.1.2-1.1.4 لكل ثقب في الغطاء.
- لإرفاق الأغطية التي سيتم استخدامها في المفاعلات العمود وزجاجة فقاعة، 1/8 "اللوير الإناث لتجهيزات لاذع إلى 1.5" قطعة من 1/8 "الأنابيب" البلاستيكية معرف ". إرفاق هذه إلى كل من التركيبات اللوير الذكور المعرضة على الغطاء.
- الاتصال صمام الاختيار (الإشارة بعيداً عن الغطاء) إلى نهاية مجاناً من 1/8 "قطعة.
ملاحظة: هذا سيكون بمثابة منفذ العادم مفاعل حيوي. - الاتصال نظام ذكور بارب المناسب للقطعة الثانية من 1/8 "أنابيب إسقاط من الغطاء. انقر فوق الحلبة قفل الدورية في مكانها وربط عامل تصفية هواء 0.2 مم لهذا.
ملاحظة: هذا سيكون بمثابة مدخل الميناء للمفاعل.
رقم 1. التخطيطي وصور لبناء المفاعلات الحيوية. التخطيطي (A) لتشييد مفاعل حيوي أغطية (ب) صور من غطاء مفاعل حيوي المجمعة، وصور (ج) غطاء المجمعة المستخدمة المرطب. علما أن تجهيزات المرطب يجب أن تكون مغلفة في سيليكون مقاوم للمياه لضمان ختم محكم مع الغطاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- تجميع نظام التسليم بالهواء (انظر الشكل 2 ألف و 2 باء التخطيطي وصور).
- إرفاق معاهدة عدم الانتشار الموضوع 1/8 "لتجهيزات لاذع لمداخل ومنافذ في الجزء الخلفي من كل روتاميتير.
ملاحظة: يتم 200 2,500 سم3دور/دقيقة روتاميتيرس لتعديل ضغط الهواء المنبع من المرطب، 100 1,000 سم3دور/دقيقة روتاميتيرس من أجل زجاجة المفاعلات، 50-500 سم3/روتاميتيرس مين للهواء رفع المفاعلات الحيوية، و 5-50 سم3/ روتيميتيرس دقيقة من أجل تنظيم تدفق2 CO. من المستحسن أن جبل روتاميتيرس إلى سطح ثابت (مثل ورقة من البلاستيك) حتى لا تقع خلال العملية. - إيقاف تشغيل مصدر الهواء المضغوط، ثم قم بتوصيل ¼ "معرف الأنابيب البلاستيكية المرنة مصدر الهواء المضغوط مع المشبك خرطوم. التنحي قطر خرطوم إلى 1/8 "الأنابيب" البلاستيكية معرف "مرونة استخدام ¼" الإناث لتركيب لاذع ومن 1/8 "ذكور لتركيب لاذع.
- قم بتوصيل الطرف الحرة 1/8 "معرف الأنابيب إلى المدخل روتاميتير دور/دقيقة 200 2,500 سم3.
ملاحظة: سوف تغذية المآخذ من هذا روتاميتير زجاجة المرطب عبر معرف أنابيب 1/8 ". - توصيل الأنابيب إلى مدخل إلى غطاء التهوية (استخدام اللوير الإناث بارب المناسب لإجراء الاتصال) 1/8 ". قم بتوصيل قطعة ثانية من 1/8 "أنابيب إلى داخل جبل الفريق المناسب.
ملاحظة: سيتم إنهاء هذه القطعة لأسفل في المرطب وفقاعة الهواء عن طريق المياه. - إرفاق 1/8 "اللوير الإناث بارب التجهيزات إلى نهاية كل قطعة من 1/8" معرف الأنابيب وتستخدم هذه القطعة للاتصال بمأخذ المرطب مدخل فخ الخلط.
- بنفس الطريقة التي يعامل بها 1.2.5، الاتصال بالمأخذ المنظم2 CO منفذ ثان في فخ الخلط.
- بناء متعددة استخدام 1/8 "شوكة متعددة المنافذ الأنابيب و 1/8" (انظر الشكل 2 ج) لتغذية الهواء المصارف روتاميتير.
ملاحظة: سيتم استخدام هذه روتاميتيرس لتوريد المفاعلات الحيوية. تجنب بناء روتاميتيرس أكثر من 6 في السلسلة. بدلاً من ذلك، استخدام المصارف الموازية من روتاميتيرس لتوسيع نطاق النظام. التأكد من أن الطلب التدفق الإجمالي لجميع المفاعلات أقل من سم 2,5003دور/دقيقة (أو آخر سوف تكون هناك حاجة إلى روتاميتير أكبر المنبع من المرطب). - قم بتوصيل المخرج (3شارع الميناء) فخ الخلط البنوك روتاميتير المشيدة حديثا باستخدام 1/8 "الأنابيب وفي 1/8" الإناث إلى شوكة اللوير.
- الاتصال طويلة بما فيه الكفاية 1/8 "أنابيب لمنافذ البيع لكل روتاميتير في الضفة روتاميتير الإمداد الجوي للمفاعلات الحيوية. قم بتسمية نهايات الأنابيب، فضلا عن روتاميتيرس في البنك الدولي.
- تطبيق سيليكون الماء حول كافة المنافذ المرطب وخلط الأغطية الملائمة التأكد من أنها الهواء ضيقة.
- إرفاق معاهدة عدم الانتشار الموضوع 1/8 "لتجهيزات لاذع لمداخل ومنافذ في الجزء الخلفي من كل روتاميتير.
رقم 2. التخطيطي والصور لتجميع نظام العمود الفقاعي. التخطيطي (A) للصورة (ب) نظام التهوية من المرطب، خلط فخ، ومصرف روتاميتير، وصور (ج) من الفتحات تستخدم لربط البنوك روتاميتير معا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- إعداد أحواض الأسماك، ويحرك الصفائح، وأضواء (الشكل 3).
تحذير: يتطلب هذا النظام عدد كبير من المنافذ وقدرة الدائرة كافية لدعم كافة المكونات. تجنب التوتير معا العديد من شرائح الطاقة وتمديد الأسلاك بطريقة سلسلة الأقحوان لأن هذا مخاطر كهربائية. استخدام شرائح الطاقة ومنافذ نوع GFI تشجيعا كبيرا بسبب وجود المياه في النظام.- ترتيب النمامون الأضواء المغنطيسية على سطح مستو تكون قوية بما يكفي لإجراء وزن أحواض الأسماك مملوءة بالمياه.
- مكان خشبية أو بلاستيكية كتل صغيرة (التي أطول قليلاً من لوحات ضجة) حول المحيط اللوحات إثارة لدعم وزن الدبابات الأسماك.
تحذير: تجنب وضع الدبابات الأسماك مباشرة على لوحات ضجة حسب الوزن سيتم سحقهم. - ضع الدبابات الأسماك على لوحات إثارة ودعم كتل وملء الخزانات بالماء.
- قص قطعة من ورقة بلاستيكية قاسية لاحتوائه على رأس خزان الأسماك كغطاء. قطع ثقوب في هذا الغطاء الشريحة أنابيب التهجين والخروج. كما قطع حفرة لسخان للدبابات الأسماك.
- ترتيب البنوك الضوء الفلورسنت بجوار خزان الأسماك لتوفير الإضاءة الأفقية للمفاعلات الحيوية. قم بتوصيل البنك الخفيفة جهاز توقيت خفيفة دورة اليوم/الليل.
الشكل 3. النظام التخطيطي للمفاعلات الحيوية زجاجة (يسار) وفقاعة عمود photobioreactors (يمين). وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغنز et al. 17- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2-إعداد العدوى الطحالب المجهرية
- الحصول على الطحالب المجهرية العدوى من ثقافة الحفاظ على البرد أو مطلي، أو السائل.
ملاحظة: من المستحسن أن يكون مطلي cryopreserved الكائنات قبل استخدام كالعدوى ضمان أن خلايا قابلة للتطبيق، وأن الثقافة الناتجة أكسينيك. متوسط أجار (مثلاً.، 5 # ATCC سبورولاتينج أجار)21 هو متوسط غنى الذي يعمل جيدا لإنعاش الأنواع Chlorella و أوكسينوتشلوريلا من البرد-التخزين. - إعداد ل 2.4 متوسطة المعدنية المناسبة لأنواع معينة من الطحالب المجهرية.
ملاحظة: الأمثلة على N8 المتوسطة23 نوعا من Chlorella، N8-NH4 متوسطة21 نوعا من أوكسينوتشلوريلا. استخدام وسيلة مناسبة لسلالة الطحالب واحد من أهم الخطوات نحو ضمان نمو الطحالب قوية. - إضافة الكوة ل 2.4 متوسطة المعدنية على قدم المساواة إلى ثلاثة قوارير زجاجية 1 لتر، يقلب أشرطة لكل زجاجة وتجميع الأغطية تنفيس (الشكل 1) لكل زجاجة. الاختيار مزدوج هو أنبوب التهوية في الجانب مدخل وكل زجاجة يضم حانة ضجة في ذلك.
- اﻷوتوكﻻف الزجاجات المخزون باستخدام تعقيم سائل دورة (121 درجة مئوية) 30 دقيقة اﻷوتوكﻻف 100 مل من المياه (dH2س)، وبعض أنابيب 1.5 مل في نفس الوقت، الذي سيتم استخدامه في وقت لاحق للطلاء. تسمح على المديين المتوسط وباردة بين عشية وضحاها. وبدلاً من ذلك، تبريد المفاعل إلى درجة حرارة الغرفة وثم تهوية ح 2 قبل التطعيم.
- في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء (BSC)، تطعيم الطحالب المجهرية من لوحة أو ثقافة السائل أكسينيك في زجاجات الأسهم. استخدام أسلوب تعقيم للحفاظ على الثقافات أكسينيك في الخطوات التالية.
- إضافة 20 مل من يعقم dH2س إلى أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل. استخدم حلقة المتاح 10 ميليلتر عقيمة لاختيار عدة مستعمرات واحدة من اللوحة من الخطوة 2، 1. وتراجع في الحلقة في أنبوب 50 مل ويغسل خلايا الطحالب إلى 20 مل من يعقم dH2يهز O. أنبوب 50 مل جعل حل الطحالب المجهرية متجانسة.
- "الماصة؛" 6 مل من محلول الطحالب المجهرية في كل زجاجة الأسهم مع 10 مل ماصة مصلية عقيمة. دوامة الزجاجة مزيج من الطحالب المجهرية بالتساوي في المتوسط.
- استخدام ماصة مصلية عقيم 2 مل لاستخلاص عينات 1 مل من كل زجاجة الأسهم ونقلها في أنابيب معقمة 1.5 مل.
ملاحظة: لا ينصح ميكروبيبيتيس لهذه الخطوة نظراً لخطر التلوث. تشديد الأغطية تنفيس في زجاجات الأسهم. - ضع الزجاجات الأسهم على لوحات ضجة (~ 150 لفة في الدقيقة) وضبط معدل تدفق الهواء، وأول أكسيد الكربون2، ومستويات الإضاءة حسب الاقتضاء للأنواع. استدارة موضع زجاجة الأسهم كل يوم.
- تمييع 1 مل العينات التي تم الحصول عليها أثناء الخطوة 2.6 (تمييع 100-fold في الماء المعقم وعادة ما يعمل بشكل جيد) ونشر لوحة على متوسط أجار غنية.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه اللوحات التحقق من حالات التلوث كذلك بمثابة مصدر للعدوى الطحالب مستقبلا لمواصلة تجارب. - أخذ عينات من الزجاجات (في البحرين) كل يومين للتأكد من أن نمو الطحالب المجهرية.
وضع العينات في ميكروسكوبية 96-جيدا في ثلاث نسخ (200 ميليلتر) وقياس الكثافة البصرية (OD) عند 550 نانومتر و 680 نانومتر كل يومين حتى OD تصل إلى 0.2-0.3 (والتي عادة ما تتطلب 5-7 أيام). - وقف في الحضانة والزجاجات الأسهم على مقاعد البدلاء ح 24-48 للسماح لخلايا الطحالب تسوية بالجاذبية.
ملاحظة: ستستخدم الخلايا استقر القادم لتطعيم photobioreactors عمود الفقاعة. إذا كان المطلوب هو مجموعة خلايا أكثر سرعة، قد فصل الخلايا في أي أكثر من 1,000 ز x لجمع الخلايا.
3-زراعة الطحالب المجهرية في فقاعة العمود Photobioreactors
- مفاعل حيوي التطعيم، قبل يوم من تحضير الوسائط المناسبة ونقل 200 مل (أو المجلد المطلوب) إلى فوتوبيوريكتور عمود فقاعة الأنابيب (أنابيب التهجين). أنابيب اﻷوتوكﻻف مع وسائل الإعلام وأغطية التهوية في المكان.
ملاحظة: إذا كان استخدام المياه المستعملة كوسيلة نمو، اﻷوتوكﻻف إفراغ المفاعلات الحيوية وإضافة العقيمة تصفية المياه المستعملة (إذا كان المطلوب هو الثقافة أكسينيك). - تركز الأسهم الطحالب المجهرية تمت تسويتها عن طريق إزالة المادة طافية باستخدام مضخة فراغ. ترك أقل من 100 مل متوسط في كل زجاجة ولكن تجنب إزالة الطحالب تمت تسويتها.
ملاحظة: هذا الإجراء داخل BSC واتبع أسلوب تعقيم. يمكن تركيب جهاز فراغ بسيط باستخدام أما فراغ قارورة أو زجاجة. يصلح ماصة معقمة مصلية إلى نهاية الأنبوب. - تعليق ونقل الطين الطحالب إلى أنابيب الطرد المركزي العقيمة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق لزيادة تركيز الطحالب.
- بكالوريوس العلوم، إزالة المادة طافية ما يكفي لتحقيق إجمالي حجم ~ 80 مل من الطحالب ويركز على فوتوبيوريكتيرس 12. تجنب كنس بها بيليه. نقل تركيز الطحالب إلى حاوية معقمة (أو زجاجة الأسهم الطحالب المستخدمة).
- إضافة 6 مل ملاط الطحالب في كل فوتوبيوريكتور مع ماصة معقمة 10 مل مصلية.
- عقيمة عامل تصفية (0.2 مم المحاقن أو فراغ) وإضافة الكميات المناسبة من أي مركبات أخرى (مثل مخزون فيتامين) التي لا يمكن أن يعقم.
- دوامة المفاعلات الحيوية مزيج الطحالب في المتوسط.
- رسم نموذج 2 مل من كل مفاعل حيوي باستخدام ماصة المصلية ونقل إلى أنبوب 2 مل. جمع عينة 2 مل (في BSC) كل 24 ساعة رصد التقدم المحرز في الثقافة. فحص العينة للأس الهيدروجيني باستخدام اختبار شرائط وضبط المفاعل حسب الحاجة باستخدام أما 3 M هيدروكسيد الصوديوم أو 3 M HCl.
- تشديد الأغطية مفاعل حيوي، ووضع جميع المفاعلات الحيوية في حمام مياه خزان الأسماك. ضبط CO2، التهوية والإضاءة إلى المستوى المناسب لهذه الأنواع. استدارة موضع مفاعل حيوي كل يوم بعد أخذ العينات (الخطوة 3، 8).
- تطبيق 200 ميليلتر من كل عينة الثقافة في ثلاث نسخ إلى آبار 96 الميكروسكوبية جيدا. قياس الكثافة البصرية (OD) على 550 نانومتر و 680 نانومتر.
- في اليوم الأخير من فترة الثقافة، قياس القطر الخارجي تحت عوامل تخفيف مختلفة (مثلاً، علامة x 1، 2 x، 4 x، 8 x، 16 x و 32 x) إلى إنشاء علاقة متبادلة بين التطوير التنظيمي والوزن الجاف الفعلية بعد الحصاد (الخطوة 4).
- الطرد المركزي أنبوب عينة 2 مل في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- تصفية المادة طافية من خلال 0.2 ميكرون الحقن غير المعقمة التصفية وتخزين المادة طافية (وبيليه إذا لزم الأمر) أي أعلى من-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل وتحليلات لاحقة للتغييرات في تكوين وسائط الإعلام.
4-الحصاد وتجميد تجفيف الكتلة الحيوية ميكروالجال
- قياس كمية ثابتة من الطحالب الثقافة من كل مفاعل حيوي مع اسطوانة (مثلاً 160 مل من مفاعل حيوي أن 200 مل الواردة أصلاً في المتوسط)، ونقل في زجاجات للطرد المركزي. شطف الاسطوانة مع dH2س ما بين كل قياس.
- أجهزة الطرد المركزي في 4,696 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية بعناية كنس بها.
- نقل الكريات للأنابيب المسماة 50 مل. شطف بزجاجات الطرد المركزي مع dH2س، ونقل المحتويات إلى أنابيب 50 مل. التأكد من حجم أنبوب إجمالي لا يتجاوز 45 مل.
- تغسل الكريات الطحالب مع dH2س لإزالة الأملاح.
- الطرد المركزي أنابيب 50 مل في 4,696 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- إضافة مل 40 درهم2س إلى كل أنبوب 50 مل؛ دوامة المزيج. الطرد المركزي مرة أخرى في 4,696 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- كرر الخطوة 4.4.2 مرة أخرى.
- التسمية ووزنها فارغة 15 مل أنابيب الطرد المركزي على توازن 4-عشري (تسمية كل من غطاء وأنبوب وتزن عليهم معا). وزن أنبوب واحد كل ثقافة الطحالب. تزن كل أنبوبة 15 مل مرتين لتقليل الخطأ.
- بعد يغسل الماضي، تجاهل المادة طافية، وإضافة 7.5 مل من dH2س إلى كل أنبوب 50 مل. دوامة ونقل أنابيب عجائن الطحالب إلى 15 مل قبل موزون. شطف أنابيب 50 مل مع إضافية dH2س ونقل السائل إلى أنابيب 15 مل. تجنب تجاوز 12 مل حجم الإجمالي في أنابيب 15 مل.
- الطرد المركزي أنابيب 15 مل في 4,696 س ز لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية. تجميد هذه الأنابيب مع الكريات في-80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل استعدادا للتجميد.
- تجميد جاف بين عشية وضحاها أو حتى مجففة.
- زن وسجل أنابيب 15 مل تجميد المجفف مع الطحالب.
5-الدهن الاستخراج باستخدام أسلوب "تعديل فلك"24
- تزن من 20 ملغ المعصوفه الكتلة الحيوية الطحلبية في أنبوب 2 مل ملولبة البوليبروبيلين (الاختيار الصانع تسمية لضمان المنتج مناسب لعمليات الاستخراج حبة).
- إضافة 1.5 مل مذيب فلك (كلوروفورم/الميثانول 2:1) لكل أنبوبة 2 مل (الذي يحتوي على 20 ملغ طحالب المعصوفه). صب ~0.5 مل الزركونيا/السليكا الخرز (0.5 ملم) في كل أنبوبة حتى يصل إلى مستوى السائل في الأنبوب 2 مل.
تنبيه: التعامل مع كلوروفورم والميثانول في غطاء دخان وتجنب الأبخرة في التنفس أو الجلد الاتصال. - مجانسة عينات الطحالب في طاحونة حبة 20 s بسرعة 6.5 m/s. نقل أنابيب الجليد لمدة 30 ثانية لالبرد وعينات. كرر خمس مرات أكثر لاستخراج الدهون تماما.
- تصفية هوموجيناتي عن طريق حقنه 5 مل يحتوي على قرص شبكة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (مش #60) إلى سلالة من الخرز، جمع filtrate في أنبوب 15 مل.
- أغسل حبات مع 1.5 مل مذيب فلك، دفع السائل عن طريق المحاقن عند الاقتضاء. كرر هذا يغسل مرتين أخريين وجمع جميع فيلتراتي في الأنبوبة 15 مل، تسفر عن وحدة تخزين نهائي لحوالي 6 مل.
- إضافة 1.2 مل من 0.9% (w/v) محلول كلوريد الصوديوم لاستخراج فولتش في أنبوب 15 مل ودوامه مزيج جيد.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن استخدام المذيبات فلك أكثر لغسل حبات (استخدام 0.2 x حجم غسل الكلي من محلول كلوريد الصوديوم 0.9% للحث على انفصال). - الطرد المركزي أنابيب 15 مل في س 6,000 ز لأدنى 5 سجل حجم المرحلة (الأخضر) كلوروفورم أسفل إلى أقرب 0.1 مليلتر باستخدام خطوط على جانب الأنبوبة 15 مل. نقل المرحلة السفلي لقنينة زجاج (مع الغطاء) استخدام زجاج ماصة باستور.
- تخزين الدهون في-20 درجة مئوية أو (-80 درجة مئوية إذا كانت هناك خطط لاستخدام هذا المقتطف لتحليل الأحماض الدهنية).
6. "مقايسة الدهن" محايدة لاستخدام أسلوب الميكروسكوبية (مقتبس من هيغنز et al. عام 201422)
- إعداد حلول الأسهم. إعداد معيار زيت نباتي 1 مغ/مل 10 مل في كلوروفورم وتخزينها في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تستخدم أي زيت نباتي في هذا التحليل لأنها ليست حساسة لأنواع الأحماض الدهنية. إعداد 10 مل من 200 ميكروغرام/مل الحل "الأحمر النيل" في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وتخزينها في الظلام في درجة حرارة الغرفة. - كتلة الميكروسكوبية الجافة قبل الحرارة إلى 55 درجة مئوية في غطاء دخان. في حين أن هذا هو تدفئة، تمييع مقتطفات الدهون والزيوت النباتية القياسية 3-fold مع الميثانول.
ملاحظة: يمكن تغيير هذا التخفيف استناداً إلى محتوى الدهن من الطحالب، ولكن هذا المستوى يعمل بشكل جيد ل معظم Chlorella. - لكل عينة مخففة، إضافة ميليلتر 80 إلى ميكروسكوبية جيدا البوليبروبيلين 96 في البيلوروسية.
تحذير: لا ينصح باستخدام البوليسترين بلاستيكواري للاستخدام مع المذيبات العضوية. - المذيب فارغة، تطبيق ميليلتر 80 من 2:1 الميثانول/كلوروفورم في البيلوروسية. للمعايير، وإضافة 10 و 30، 60، 90 و 120 ميليلتر من الزيت النباتي المخفف القياسية في البيلوروسية.
- مكان الميكروسكوبية في سخان كتلة جافة في 55 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة حتى يتبخر جميع المذيبات. في حين يتبخر المذيب، يعد العامل "الأحمر النيل" الحل (الحاجة إلى 200 ميليلتر من الحل 1 ميكروغرام/مل كل لوح جيدا). على سبيل مثال، عينات اثنا عشر ومجموعة كاملة من المعايير يتطلب 16 مل من 1.0 ميكروغرام/مل الحل؛ تعد بحل ميليلتر 80 من مجموع 200 ميكروغرام/مل (في [دمس]) إلى 16 مل dH2o.
- إزالة الصفيحة من كتلة التدفئة والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. إضافة 30 ميليلتر من كحول الأيزوبروبيل لكل بئر ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ضمان جميع ماصة قنوات يتم خلط الحل وريسوسبيندينج الدهون، مما أسفر عن سائل أخضر متجانسة.
- إضافة 200 ميليلتر من حل "الأحمر النيل" (1 ميكروغرام/مل) لكل منها أيضا، "الماصة؛" أعلى/لأسفل 10 مرات لخلط. احتضان لوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بينما كان ينتظر، إعداد حل التبييض 50% بخلط التبييض (6% هيبوكلوريت) مع dH2سين 20 ميليلتر الواحدة وكذلك هناك حاجة. يتم إعداد 3 مل التبييض 50% كافية لعينات 12 ومجموعة كاملة من المعايير.
- إضافة 20 ميليلتر من حل التبييض لكل الميكروسكوبية جيدا و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 5 مرات مزيج جيد. احتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 30 دقيقة، قراءة الأسفار في العينات كل 5-10 دقيقة في الإثارة/575 نانومتر 530 نانومتر الانبعاثات مع قطع السيارات تعيين إلى 570 نانومتر حتى تستقر الإشارة من عينات الطحالب. عادة ما يكون 60 دقيقة من مجموع حضانة كافية.
- إنشاء منحنى معايرة لمعايير الزيوت النباتية (في النطاق من 0-40 نانوغرام/آبار النفط).
ملاحظة: خطي تناسب تعمل بشكل جيد منخفض (< 30 نانوغرام/بئر) يمكن استخدام تركيزات النفط ومتعدد حدود تناسب إذا تجاوز المستوى 30 نانوغرام/جيدا. استخدم هذا الارتباط لقياس الدهون محايدة في الآبار عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا الإجراء يعطي دورة وقت بيانات الكثافة البصرية الطحالب في شمال البحر الأبيض المتوسط OD 550 (الشكل 4 أ). الكثافة البصرية والوزن الجاف تركيز البيانات التي يمكن ربطها (الشكل 4 باء). هذا هو إنجاز بأول حساب تركيز الطحالب الوزن الجاف النهائي بعد خطوة التجفيف. المقبل، يمكن أن ترتبط الكثافة البصرية تمييع الثقافة المسلسل (يقوم في اليوم الأخير لأخذ العينات) وتركيزات الوزن الجاف الفعلية. لتركيزات منخفضة الخلية، يمكن استخدام ارتباط خطي حين لتركيزات أعلى الخلية، يمكن استخدام ارتباط متعدد الحدود ترتيب ثاني. من المستحسن إنشاء ارتباط منفصل لكل شرط الثقافة. أخيرا، يمكن تطبيق الارتباط إلى البيانات الكثافة البصرية بالطبع الوقت للحصول على منحنى نمو وزن جاف (الشكل 4). في هذه التجربة مثال، بروتوثيكويديس أوكسينوتشلوريلا (2341 أوتي25) كان مثقف تحت أربعة شروط: الثقافات التحكم أكسينيك نمت على جديدة N8-NH4 متوسطة21، في ثقافة المشارك بالبكتيريا والازوسبيريللوم براسيلينسيوالمتوسط وتستكمل مع 50 مغ/لتر حامض اندول-3-أنهيدريد، وقضى على المتوسط من براسيلينسي أ. ومن المعروف براسيلينسي أ لإنتاج حمض اندول-3-أنهيدريد، ونمو نبات تشجيع الهرمون، كما تعزز النمو في بعض الطحالب المجهرية. بيد عند 50 مغ/لتر، معاملة الأكاديمية تماما تحول دون نمو بروتوثيكويديس أ . ونتيجة لذلك، كانت كثافة بصرية البيانات المتاحة، ولكن كمية الطحالب لم تكن كافية للحصول على بتركيز دقيق من وزن جاف. وفي هذه الحالة، يمكن تطبيق الارتباط بثقافة التحكم أو قد يتم الإعلام عن بيانات الكثافة الضوئية مباشرة. لأنه تم جمع بيانات التطوير التنظيمي في كلا 550 نانومتر و 680 نانومتر امتصاص، يمكن استخدام مجموعة البيانات أما للعلاقة بين التطوير التنظيمي والوزن الجاف. بشكل عام، OD 550 يستخدم نظراً لأنه يستبعد تماما تقريبا امتصاص الكلوروفيل26، وبالتالي كبت التحيز من التغييرات في محتوى الكلوروفيل. وفي المقابل، OD 680 تشمل امتصاص الكلوروفيل ونسب عالية من 680/550 OD تشير إلى محتوى الكلوروفيل العالية في الطحالب. يبين الشكل 4 مجموعة من اثني عشر الثقافات الطحالب تنمو في photobioreactors عمود فقاعة. حتى مع ثلاثة فقط replicates البيولوجية كل معاملة، تحققت الانحرافات المعيارية ضيقة، مما يسمح لحساسية عالية للفروق بين العلاجات.
الشكل 4. ويؤدي نمو الطحالب فقاعة العمود photobioreactors. (أ) الكثافة البصرية (550 نانومتر) يبين منحنى النمو من بروتوثيكويديس أوكسينوتشلوريلا (أوتي 2341) الثقافات الدخول المتأخر النمو لوغاريتمي على 120 ساعة. كانت تزرع ثقافات السيطرة على المتوسط4 N8-NH الطازجة، والعلاج 1 الثقافات المشارك من بروتوثيكويديس أ و براسيلينسي والازوسبيريللوم نمت على جديدة N8-NH4 المتوسطة، معاملة 2 هي أكسينيك بروتوثيكويديس أ- نمت على N8-NH4 المتوسطة وتستكمل مع حمض اندول-3-أنهيدريد 50 مغ/لتر (IAA)، ومعاملة 3 هو أكسينيك بروتوثيكويديس أ- نمت في المتوسط المستهلك من براسيلينسي أ. وقد أعدت المتوسطة المستهلك استزراع براسيلينسي أ لمدة 96 ساعة في المتوسط4 N8-NH تستكمل مع حمض malic 2 غرام/لتر. تم إزالة الخلايا، والمتوسطة تم إعادة تستكمل مع أمونيوم لاستعادة مستواه الأولى وتم ضبط الأس الهيدروجيني والمتوسط كان العقيمة التي تمت تصفيتها (0.2 ميكرومتر). ملاحظة أن العلاج 50 مغ/لتر الأكاديمية تماما تحول دون نمو الطحالب. منحنيات (ب) العلاقة بين OD 550 نانومتر وتركيز نهائي الوزن الجاف باستخدام تناسب ترتيب متعدد الحدود ثانية. يظهر أي ارتباط للعلاج 2 لأن الطحالب لا يمكن أن تحصد في نهاية فترة الثقافة. (ج) تطبيق الارتباط متعدد الحدود للبيانات الكثافة البصرية غلة منحنى نمو مع تركيز الوزن الجاف على المحور ص. ارتباط الثقافة عنصر التحكم تم تطبيقه على البيانات OD للعلاج 2. أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية التي تستند إلى 3 البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. (د) صورة photobioreactors عمود فقاعة بعد وقت قصير من ثقافة التطعيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تظهر بيانات الدهن محايدة لتجربتين مثال في الشكل 5. لقد ثبت هذا التحليل ترتبط كذلك بمحتوى الدهون محايدة، لا سيما ترياسيجليسيرول (العلامة) المحتوى. يمكن رؤية هذا بمقارنة المقايسة المحايدة في الدهون (الشكل 5A) إلى لوحة طبقة رقيقة لوني مقابلة (الشكل 5 (ب)). يمكن أن ينظر إليه في نفس الاتجاه في التجربة الثانية (الشكل 5 و 5 د). في كل هذه التجارب، تستخدم كمعيار زيت الكانولا وأسفرت ارتباط خطي (ص2 0.98 للتجربة الأولى و 0.99 الثانية) بين الأسفار والكتلة الكانولا النفط في البئر. لاحظ أنه إذا كانت جميع العينات تحتوي على محتوى منخفض الدهون، ثم أعلى نقطة أو اثنتين على المستوى قد يتم إسقاط. يمكن استخدام هذا الارتباط لحساب كمية الدهون محايدة (ميكروغرام) في كل من الآبار عينة الطحالب. يمكن الشامل النفط ثم تحويلها إلى تركيز في استخراج المحتوى الدهني تطبيقها على الميكروسكوبية جيدا. يتم ضرب هذه القيمة بمعامل التخفيف المستخدمة (مثلاً، 3 x) للحصول على محتوى المادة الدهنية محايدة فلك الأصلي مقتطفات. وهذا التركيز ثم مضروباً في حجم الاستخراج (يجب أن تكون قريبة من 4 مل) وثم مقسوماً على مجموع كتلة من الطحالب الكتلة الحيوية المستخدمة لاستخراج المادة الدهنية (يجب أن تكون قريبة من 20 ملغ). والنتيجة هي المحتوى الدهني محايدة من الطحالب المجهرية.
الشكل 5. الحصول على بيانات الدهن محايدة من الثقافات من سوروكينيانا Chlorella (2714 أوتي)- (أ) محتوى الدهون محايدة (% من الوزن الجاف) للطحالب في تجربة 1 في الطحالب التي كانت تزرع لمدة 120 ساعة. ثقافة السيطرة أكسينيك ومثقف في N8 جديدة متوسطة23، كانت معاملة 1 ثقافة المشارك سوروكينيانا جيم- كان براسيلينسي أ على جديدة N8 المتوسطة، معاملة 2 المتوسطة N8 جديدة تستكمل مع 50 مغ/لتر الأكاديمية وأنفق العلاج 3 المتوسطة من براسيلينسي أ. وكان المتوسط المستهلك أعده تثقيف براسيلينسي أ لمدة 96 ساعة في المتوسط N8 تكملة مع حمض malic 2 غرام/لتر، إزالة الخلايا، المكمل النترات المفقودة، ضبط الأس الهيدروجيني، والعقيمة التصفية المتوسطة (0.2 ميكرومتر). خلافا بروتوثيكويديس (أ)، لا تمنع 50 مغ/لتر الأكاديمية C. سوروكينيانا النمو. (ب) TLC الصورة لوحة لتجربة عرض 1 الوفرة العلامة النسبية. (ج) محتوى الدهون محايدة (% من الوزن الجاف) للطحالب في التجربة 2 الذي كان هو العلاج نفسه كتجربة 1 ولكن الخلايا كانت تحصد بعد 72 ساعة نمو. (د) TLC الصورة لوحة لتجربة عرض 2 الوفرة العلامة النسبية. أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية التي تستند إلى 3 البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أيضا، أنها ممارسة جيدة لحساب معامل التباين (الانحراف المعياري) مقسوماً على المتوسط القراءات الفلورية الخام عبر جميع replicates التقنية في مقايسة الدهن محايدة. افتراض replicates التقنية قد نفذت في الميكروسكوبية في البيلوروسية وكما لوحظ في الإجراء، معامل الاختلاف عادة يجب أن لا تتجاوز 10%. عادة ما تكون معاملات عالية التباين نتيجة لخلط الفقيرة (خاصة أثناء إضافة كحول الأيزوبروبيل) ويحتمل أن تكون غير دقيقة استخدام ماصة متعددة القنوات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهم الاعتبارات عند استزراع الطحالب فهم للاحتياجات المحددة للكائن أو مجموعة الكائنات. الطحالب يمكن استخدام نظام زراعة الموصوفة هنا للثقافة مجموعة واسعة من الطحالب ولكن العوامل اللاأحيائية محددة (درجة الحرارة، ووسائل الإعلام، الأس الهيدروجيني، كثافة الضوء، المستوى2 CO، معدل تهوية) تحتاج إلى تعديل لاحتياجات الكائن الحي. ملاحظة البارامترات المذكورة هنا كانت تستخدم لزراعة Chlorella و أوكسينوتشلوريلا. هذه الكائنات ذات الأهمية الصناعية لأنها متسامحة للمغذيات عالية، والضوء، و مستويات درجة الحرارة27. ومع ذلك، يمكن تخفيض مستويات الضوء من خلال إزالة لمبات الفلورسنت ويمكن تعديلها دورة اليوم/الليل لتمثيل موسمية. وبالمثل، سخانات المياه يمكن أن تحول أعلى أو أسفل عنصر التحكم على درجة حرارة حمام الماء على النظام. بينما النظام المذكور هنا لا تستخدم هذه ميزة، فمن الممكن لالبرد والحمامات مياه خزان الأسماك تحت درجة حرارة الغرفة من خلال نظام تبريد منخفضة التكلفة. وضع دلو من الماء في ثلاجة صغيرة واستخدامها سرعة متغيرة مضخة لضخ مياه من دلو المياه الباردة إلى خزان الأسماك والعودة. أسرع معدل الضخ، سوف تصبح أكثر برودة الخزان خزان الأسماك.
على الرغم من أن نظام زراعة الطحالب عموما يوفر نتائج متسقة، وهناك بعض المحاذير الهامة التي يجب أن تعتبر. الأول هو شفط المياه التي تحدث في هذه المناسبة أن نظام تهوية تجارب فقدان مفاجئ للضغط (مثل مهب مناسب أو عدم ضاغط هواء). الضغط الذي في مرطبات ستدفع الماء المرطب المتخلفة عن طريق الأنابيب، بما في ذلك عن طريق روتاميتير. يمكن أن تساعد في تثبيت فخ المنبع أو الدفق المانع. علما أن ينزح لن تؤثر في المفاعلات الحيوية نفسها لأنها تعمل تحت الضغط الجوي. التفتيش الروتينية من الأنابيب والتجهيزات يمكن أن تساعد على التخفيف من حالات فشل النظام. هو اعتبار هام آخر لتفقد بشكل روتيني واستبدال مرشحات الهواء وفحص الصمامات في المفاعلات الحيوية. يجب التأكد من اتباع توصية الشركة المصنعة لعدد دورات اﻷوتوكﻻف المسموح بها. هذا مهم خاصة إذا كان صون الثقافات أكسينيك أمر حاسم للتجربة. وأخيراً، يوصي بشراء أو بناء رف أوتوكلافابل للنقل الأمن للمفاعلات الحيوية بين أحواض المياه، اﻷوتوكﻻف، والسلامة البيولوجية في مجلس الوزراء. رف أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ يمكن أن تخدم هذا الغرض.
مفاعل حيوي النظام المذكور هنا نقائص عديدة. القيد رئيسي هو الحاجة إلى التعامل مع هذه المفاعلات في خزانة السلامة الأحيائية باستخدام تقنية تعقيم. المفاعلات التي تفتقر إلى منفذ أخذ عينات ينزح المضادة، التي تتطلب المستخدم لنقل المفاعل للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء بعينه دون تلويث الثقافة. كما تتطلب المفاعلات قراءة دليل الأس الهيدروجيني والتكيف التي تطرح احتمال الخطأ البشري.
مفاعل حيوي النظام المذكور هنا يملأ مكانة بين زراعة قارورة بسيطة والمفاعلات الحيوية التي تسيطر عليها تماما. واستحدث نظام مفاعل حيوي في استجابة لحاجة إلى نتائج أكثر اتساقا مما كان يمكن تحقيقه باستخدام الزجاجات. وتوضح البيانات أن هذا النظام يولد نتائج النمو المطرد عندما تعمل بشكل مناسب. ملاحظة أن الزجاجات الغازية يعملن في الإجراءات المتعلقة بزراعة الطحالب المخزون، ولكن ذلك فقط لإنتاج العدوى للتجربة. وهذا مقبول لأنه تم تجميع زجاجات الأسهم للتطعيم ومن ثم تقلب بين المفاعلات ليست قضية.
كما أن العديد من الطحالب باحثون مهتمون برصد النمو والمحتوى الدهني محايدة، أدرجنا نهجنا لقياس كل من هذه المعلمات هنا. استخدام الكثافة الضوئية لقياس النمو هو ممارسة عادية ولا مثيل له في بساطته. بيد أن العلاقات المتبادلة بين الوزن الجاف والكثافة البصرية تتغير بمرور الوقت وتعتمد على ظروف الثقافة. من المستحسن لإنتاج معادلة ارتباط كل العلاج التجريبي داخل كل مجموعة تجريبية. وهذا أمر ممكن في الإجراء المقترح نظراً لتجميد المجفف وسيتم الحصول على الطحالب بعد كل تجربة الثقافة. افتراضا حرجة للنهج الكثافة البصرية أن العلاقة بين الكثافة البصرية والوزن الجاف يحمل المستمر على مدى نمو دفعة. طالما الانحرافات عن هذا الافتراض الصغيرة، سوف تكون النتيجة دقيقة بشكل معقول. ويمكن تقييم دقة نسبية بمقارنة تركيز الوزن الجاف الطحالب المحسوبة في الساعة صفر. افتراض الثقافات كانت مختلطة جيدا وبيبيتينج كانت دقيقة، كل الثقافات يجب أن يكون بنفس الكثافة التطعيم الأولى. كما يمكن الطعن في النهج الكثافة البصرية عند امتصاص خلفية من الوسط مرتفع (أي، عند العمل مع بعض مياه الفضلات). الطرح لامتصاص متوسطة (قبل التلقيح) من كل قراءة OD يمكن أن تساعد في هذه المسألة.
استخراج الدهون من الطحالب الجافة يتبع راسخة فولتش النهج21،24؛ ومع ذلك، هناك اعتبارات هامة. أنواع مختلفة من الطحالب قد الجدران خلية مختلفة بدرجات متفاوتة من الصلابة. الزركونيا/السليكا الخرز المستخدمة هنا حادة، وهي مصممة بيرس قوية، جدران الخلايا السكاريد. يمكن استخدام نوع حبة ليونة (مثل الزجاج) أو حبة أقل اضطراب دورات على الطحالب مع جدران الخلايا الضعيفة. ومع ذلك، قاعدة عامة أن بيليه الخلية الناتجة بعد استخراج ينبغي أن تكون خالية من الصبغة، مشيراً إلى أنه تم استخراج الكلوروفيل جميع. أحد المصادر الأكثر شيوعاً للفشل أثناء الخطوة استخراج الدهن يحدث بسبب سوء تجميد التجفيف. إذا كانت العينة يذوب في تجميد مجفف قبل أن تكون جافة تماما، سوف تكون النتيجة جد، والظلام، وشمعي بيليه. هذا هو نتيجة للخلايا التي تفكيك تحت ظروف التجميد مجفف الفراغ. بيليه قد يكون وزنه للحصول على وزن جاف، ولكن لا يمكن استخدامه لاستخراج الدهن كجزيئات شمعية لا تنهار في فولتش المذيبات. للتأكد من أن تجميد التجفيف دائماً العينات لينة، ومساحيق الغلال، من الضروري تجميد جميع العينات إلى-80 درجة مئوية وسرعة نقلها إلى تجميد مجفف. وعلاوة على ذلك، أن استخدام بارافيلم (مع وجود ثقب مطعون فيه) بدلاً من أغطية أنبوب خففت سيضمن أن الرطوبة يمكن إزالتها باستمرار من العينة قبل أن يذوب.
والرزن دهن محايد هو موضح في هذا الإجراء قد سبق نشرة، ويتضمن مناقشة ل فحوصات الدهون بديلة22. ومع ذلك، قد أحرز بعض التحسينات الهامة على هذا الإجراء منذ نشر. وأبرزها زاد تركيز الحل الأحمر النيل من 0.5 ميكروغرام/مل إلى 1 ميكروغرام/مل. وكان تأثير هذا التغيير أعلى كثافة الإشارات والتكرار محسنة وإزالة إشارة الانخفاض مع مرور الوقت خلال فترة الحضانة. وتبين النتائج أن يقارن المقايسة جيدا للنتائج من النوعية طبقة رقيقة اللوني. ووضعت هذا الفحص والتحقق من صحتها باستخدام الأنواع المختلفة من Chlorella و أوكسينوتشلوريلا حيث لم يحدد انطباقه على الأنواع من تركيبة تختلف اختلافاً كبيرا. يجب إزالة الصباغ الأخضر جميع من المقايسة تماما أثناء الاحتضان التبييض، مما يؤدي إلى العينات التي هي الصفراء واضحة أو باهتة جداً. لاحظ أيضا أن مقتطفات الدهون التي عادة ما تكون المتدهورة (على النحو المشار إليه بواسطة تغيير من اللون الأخضر إلى اللون البنى) تفشل في تحقيق نتائج دقيقة في هذا التحليل. وبالتالي من الضروري تخزين العينات الدهنية في أي أعلى من-20 درجة مئوية في الظلام.
الأساليب المقدمة هنا لاستزراع الطحالب، قياس النمو، وتحديد كمية الدهون محايدة هي مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات الهندسية للطحالب، ولكن هي مناسبة بشكل خاص للبحوث المتعلقة بإنتاج الوقود الحيوي. هذه الأساليب تستخدم أيضا لدراسة تثبيط نمو الطحالب في مياه الفضلات28 ، فضلا عن الآثار المترتبة على التفاعل الحي على النمو وتكوين الطحالب المجهرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
قدم الدعم لهذه البحوث بوزارة الزراعة المعهد الوطني للأغذية والزراعة هاتش مشروع ALA0HIGGINS ومكاتب جامعة أوبورن قائد الشرطة العسكرية، نائب الرئيس للبحوث، وصموئيل أي Ginn كلية الهندسة. وقدم الدعم أيضا من جبهة الخلاص الوطني منح كبيت-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).
