Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att konstruera lab-skala bubbla kolumn photobioreactors och använda dem till kultur mikroalger. Det ger också en metod för bestämning av kultur tillväxttakt och neutrala fettinnehållet.
Abstract
Det finns betydande intresse i studien av mikroalger för tekniska applikationer såsom produktion av biobränslen, produkter med högt värde, och för behandling av avfall. Som de flesta nya forskningsinsatser börjar på laboratorieskala, finns det ett behov av kostnadseffektiva metoder för att odla mikroalger i ett reproducerbart sätt. Här, kommunicerar vi en effektiv strategi för kultur mikroalger i laboratorieskala photobioreactors och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Instruktioner finns också på hur du ställer in photobioreactor systemet. Även om exempel organismerna är arter av Chlorella och Auxenochlorella, kan detta system anpassas för att odla ett brett utbud av mikroalger, inklusive samtidig kulturer av alger med icke-alger arter. Beståndet kulturer odlas först i flaskor att producera inokulum för photobioreactor system. Alger inokulum är koncentrerad och överförs till photobioreactors för odling i batch-läge. Prover tas dagligen för Absorbansavläsningar. I slutet av batch kultur, celler skördas av centrifug, tvättas, och frysa torkade att erhålla en slutlig torrvikt koncentration. Den slutliga torrvikt koncentrationen används för att skapa ett samband mellan den optiska densiteten och torrvikt koncentrationen. En modifierad Folch metod används därefter att extrahera sammanlagda mängden lipider från den frystorkade biomassan och extraktet har analyserats för dess neutrala fetthalten med en mikroplattan-analys. Denna analys har publicerats tidigare men protokollstegen ingick här Markera kritiska steg i förfarandet där fel inträffar ofta. Bioreaktor systemet beskrivs här fyller en nisch mellan enkel kolv odling och fullt kontrollerade kommersiella bioreaktorer. Även med bara 3-4 biologiska replikerar per behandling, vår metod för att odla alger leder till snäva standardavvikelser i tillväxt och lipid analyserna.
Introduction
Tillämpningen av mikroalger i teknik och bioteknik har rönt stort intresse under de senaste åren. Mikroalger studeras för användning i avloppsvatten behandling1,2,3,4, biobränsle produktion5,6,7,8, och produktion av nutraceuticals och andra värdefulla produkter9,10. Alger är också att vara genetiskt modifierade på större priser i ett försök att förbättra deras lämplighet för särskilda engineering program11,12. Följaktligen finns det stort intresse för experiment med industriellt relevanta organismer i kontrollerade miljöer. Syftet med denna metod är att kommunicera en effektiv strategi för kultur mikroalger i kontrollerad laboratoriemiljö och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Att förbättra tillväxten priser och neutrala fettinnehållet i mikroalger har identifierats som två viktiga flaskhalsar mot kommersialisering av alger biobränslen13.
En rad olika metoder har använts för att kultur alger i experimentsyfte. Dessa strategier kan i allmänhet delas mellan storskalig utomhus odling och småskalig inomhus odling. Utomhus odling i photobioreactors och öppna dammar är lämplig för experiment som syftar till att skala upp processer som har redan visat på laboratorieskala (t.ex. att testa skala upp av en ny hög-lipid stam av alger)14. Men inomhus småskalig odling är lämpligt när du utvecklar nya eller förbättrade alger stammar eller utföra experiment som syftar till att förstå biologiska mekanismer. I dessa senare fall krävs en hög grad av experimentell kontroll att locka fram subtila förändringar i biologiska beteende. Därför krävs ofta axenic kulturer för att minimera de komplexa biotiska faktorer som förknippas med andra organismer (t.ex. bakterier, andra alger) som oundvikligen växer i stora utomhus-system. Även när man studerar interaktionen mellan alger och andra organismer, har vi funnit att användningen av mycket-kontrollerade försöksbetingelser är till hjälp när man undersöker molekylära utbyte mellan organismer15,16,17.
Inom kategorin småskaliga inomhus Algodling, en uppsättning strategier har använts. Kanske är den vanligaste metoden att odla alger i Erlenmeyer-kolvar på ett skakbord under en ljus bank18,19. Utbytet av syre och CO2 sker genom passiv diffusion genom en skum plugg i toppen av kolven. Vissa forskare har förbättrat detta upplägg genom aktiv luftning av kolvar20. En annan metod är att odla alger i flaskor, mixad av uppståndelse bar och aktiv luftning. Trots sin enkelhet, har vi funnit att användningen av kolvar och flaskor ofta leder till inkonsekventa resultat bland biologiska replikat. Förmodligen detta är på grund av position effekter - olika positioner får olika mängder av ljus, vilket även påverkar interna reaktorn temperaturer. Dagliga rotation av reaktorer till nya positioner kan hjälpa men inte lindra problemet eftersom vissa stadier av alger tillväxt (t.ex. tidigt exponentiell) är mer känsliga för positionella effekter än andra (t.ex. log fas).
På motsatta sidan av spektrumet av teknisk finess är fullt kontrollerade kommersiella photobioreactors. Dessa system kontinuerligt övervaka och justera villkoren i reaktorn att optimera algtillväxt. De har programmerbar belysning, realtid temperaturkontroll och pH-kontroll. Tyvärr, de är dyra och vanligtvis kosta flera tusen dollar per reaktor. Den vetenskapliga och tekniska tidskrifter kräver biologiska replikering av resultat, vilket kräver inköp av flera bioreaktorer. Vi presenterar här en bubbla reaktorn pelarsystem som överbryggar klyftan mellan det enkla (kolv) och sofistikerade (fullt kontrollerade bioreaktor) närmar sig för lab-skala alger odling. Bubbla kolumner Använd stigande gasbubblor att underlätta gasutbyte och blanda reaktorn. Detta tillvägagångssätt ger en viss kontroll över belysning och temperatur men gör det på ett sätt som är kostnadseffektivt. Dessutom har vi funnit detta system att ge konsekvent resultat bland biologiska replikat, minska antalet krävs för biologiska replikat som krävs för att få statistiskt signifikanta resultat jämfört med metoden kolv eller flaska. Vi har också använt detta system att framgångsrikt odla blandningar av alger och bakterier21. Utöver Algodling beskriva vi ett förfarande för att mäta den neutrala fetthalten i de odlade algerna. Den senare metoden har varit publicerad någon annanstans22, men vi inkludera den här proceduren för att ge anvisningar för hur man använder det framgångsrikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inställning av bubbla kolumn Photobioreactors
- Konstruera en uppsättning ventilerade lock från de plast lock som kom med 1 L glasflaskor och hybridisering rör (se figur 1 för Schematisk och foton). Konstruera lock för luftfuktare, blanda fällan, varje air lift photobioreactor och varje flaska reaktor.
- ¼ ”hål i locket: 2 hål behövs för bioreaktor och luftfuktare lock; 3 hål behövs för blandande fällan.
- Glida en ¼ ”o-ringen över trådar av en 1/8” panel mount Luer passande, och skjut in detta i ¼ ”hålet borras i locket (figur 1A).
- Glida en andra ¼ ”o-ringen över gängorna så att locket är inklämt mellan två O-ringarna. Glida en låsmutter på trådar och dra åt för att fixa den panel mount Luer på plats.
- Knäppa låsringar på den exponerade manlig Luer projicering från locket. Upprepa steg 1.1.2-1.1.4 för varje hål i locket.
- Till lock som kommer att användas på bubbla kolumn och flaska reaktorer, bifoga 1/8 ”kvinnliga Luer för barb tillbehör till 1,5” bitar av 1/8 ”ID PVC slangar. Koppla dessa till var och en av de exponerade manlig Luer rördelarna på locket.
- Ansluta en backventil (pekar bort från locket) till den fria änden av en av de 1/8 ”bitar.
Obs: Detta kommer att fungera som avgasporten för bioreaktor. - Anslut en hanluer till barb passande att den andra halvan av 1/8 ”slang projicering från locket. Klicka på roterande låsringen på plats och fäst ett 0,2 mm luftfilter till detta.
Obs: Detta kommer att fungera som inlopp porten för reaktorn.
Figur 1. Schematiska och foton för att konstruera bioreaktorer. (A) Schematisk för byggandet av bioreaktor lock (B) foto av monterade bioreaktor locket, och (C) foto av monterade locket används för luftfuktare. Observera att luftfuktare beslag bör vara belagd i vattentät silikon att säkerställa en lufttät tätning med locket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Montera av systemet för leverans (se figur 2A och 2B för en schematisk och foto).
- Tillmäter barb beslag till vikar och uttag på baksidan av varje rotameter 1/8 ”NPT gänga.
Obs: 200-2500 cm3/min rotametrar är för luft trycket modulering uppströms luftfuktare, 100-1000 cm3/min rotametrar är för flaska reaktorer, 50-500 cm3/min rotametrar är för air lift bioreaktorer och 5-50 cm3/ min rotemeters är för CO2 flödesreglering. Det rekommenderas att montera rotametrar till en fast yta (t.ex. plastfolie) så de inte faller under drift. - Stänga av tryckluft källan och sedan ansluta ¼ ”ID PVC slangar till tryckluft källan med en slangklämma. Steg ner slang diameter till 1/8 ”ID PVC slangar med en ¼” kvinnliga barb montering och en 1/8 ”hane till barb montering.
- Anslut den fria änden av 1/8 ”ID slangen till en 200-2500 cm3/min rotameter inlopp.
Obs: Denna rotameter utlopp matas luftfuktare flaskan via 1/8 ”ID slangar. - Anslut den 1/8 ”slang till ett inlopp till ventilerade lock (Använd en kvinnlig Luer till barb passande att göra anslutningen). Anslut sedan en andra bit 1/8 ”slang på insidan av panelen fäste passande.
Obs: Detta stycke kommer att hänga ner in i luftfuktare och bubbla luft genom vattnet. - Koppla 1/8 ”kvinnliga Luer barb beslag till varje ände en bit 1/8” ID slangar och använda denna pjäs för att ansluta uttaget av luftfuktare till öppningen av blandande fällan.
- På samma sätt som 1.2.5, Anslut uttaget av CO2 regulatorn till en andra port på blandande fällan.
- Konstruera ett samlingsrör med 1/8 ”slang och 1/8” multiport barb (se figur 2 C) för att mata luft in rotameter bankerna.
Obs: Dessa rotametrar kommer att användas för att leverera bioreaktorerna. Undvik att bygga fler än 6 rotametrar i serien. Använd istället parallella bankerna av rotametrar för att utöka systemet. Se till att den totala flöde efterfrågan för alla reaktorer är mindre än 2500 cm3/min (eller annars det kommer att behövas en större rotameter uppströms luftfuktare). - Anslut utloppet (3rd port) av blandande fällan till nybyggda rotameter bankerna använder 1/8 ”slangen och en 1/8” kvinnliga till barb Luer.
- Anslut tillräckligt lång 1/8 ”slang till uttag av varje rotameter på rotameter banken att tilluft till bioreaktorerna. Etikett i ändarna av slangen samt rotametrar i banken.
- Applicera vattentät silikon runt alla portar på luftfuktare och blanda fälla lock för att säkerställa att de är lufttäta.
- Tillmäter barb beslag till vikar och uttag på baksidan av varje rotameter 1/8 ”NPT gänga.
Figur 2. Schematiska och foton för montering bubbla pelarsystem. (A) Schematisk bild av luftning system (B) foto av luftfuktare, som blanda fällan, och rotameter bank, och (C) foto av de grenrör används för att ansluta rotameter bankerna tillsammans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ställa in fisk tank, rör tallrikar och lampor (figur 3).
Varning: Detta system kräver ett stort antal försäljningsställen och tillräcklig krets kapacitet att stödja alla komponenter. Undvika kopplas ihop flera grenuttag och förlängningssladdar i en daisy-kedja mode eftersom detta är en elektrisk fara. Användning av GFI typ försäljningsställen och grenuttag är mycket uppmuntras på grund av förekomsten av vatten i systemet.- Ordna de låg profil magnetisk omrörare på en plan yta som är tillräckligt stark för att hålla vikten av vattenfyllda fisk tank.
- Placera små trä eller plast block (som är något högre än uppståndelse plattorna) runt omkretsen av uppståndelse plattorna att stödja vikten av fisketankar.
FÖRSIKTIGHET: Undvik att placera fisketankar direkt på uppståndelse plattorna som vikten kommer att krossa dem. - Placera fisketankar över rör plattorna och stödja block och fyller tankarna med vatten.
- Skär en bit av en styv plast ark att passa ovanpå akvariet som ett lock. Skär hål i denna täcka glida hybridisering rören in och ut. Skär även ett hål för fisk tank värmaren.
- Ordna de fluorescerande ljusa bankerna bredvid akvariet för att ge horisontell belysning av bioreaktorerna. Koppla in ljus banken i en ljus timer för att ställa in en dag/natt cykel.
Figur 3. Systemet Schematisk för de flaska bioreaktorer (vänster) och den bubbla kolumn photobioreactors (höger). Denna siffra har ändrats från Higgins et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
2. beredning av mikroalger inokulum
- Erhålla mikroalger inokulum från en cryo-bevarade, Förkromad eller flytande kultur.
Obs: Det rekommenderas att nedfrysta organismer beläggas före användning som inokulum att se till att cellerna är livskraftig och att de resulterande kulturen är axenic. Agarsubstrat (t.ex., ATCC #5 sporulating agar)21 är ett rikt medium som fungerar väl för att återuppliva arter av Chlorella och Auxenochlorella från cryo-lagring. - Förbereda 2,4 L mineral medium som är lämplig för särskilt mikroalger arter.
Obs: Exempel N8 medium23 arter av Chlorella, N8-NH4 medelstora21 för arter av Auxenochlorella. Användning av ett medium som är lämpliga för alger stammen är en av de viktigaste stegen mot att säkerställa robust algtillväxt. - Alikvotens 2,4 L mineral medium lika i tre 1 L glasflaskor, lägga rör barer till varje flaska och montera den ventilerade locken (figur 1) för varje flaska. Dubbelkolla att luftning röret är på på inloppssidan och varje flaska har en uppståndelse bar.
- Autoklav lager flaskorna med hjälp av en flytande sterilisering cykel (121 ° C) för 30 min. autoklav 100 mL avjoniserat vatten (dH2O) och några 1,5 mL rör samtidigt, vilket senare kommer att användas för plätering. Att på medellång till svalt över natten. Alternativt kyla reaktorn till rumstemperatur och sedan lufta för 2 h före ympningen.
- I en biosäkerhet skåp (BSC), Inokulera mikroalger från en tallrik eller axenic flytande kultur i lager flaskorna. Använd steril teknik för att underhålla axenic kulturer i följande steg.
- Tillsätt 20 mL av Ånghärdad dH2O till en steril 50 mL centrifugrör. Använd en steril 10 µL disponibla slinga för att plocka flera enstaka kolonier från plattan från steg 2.1. Doppa slingan i 50 mL röret och tvätta alger cellerna i de 20 mL av Ånghärdad dH2O. Shake 50 mL röret att göra en homogen mikroalger lösning.
- Pipettera 6 mL mikroalger lösning i varje lager flaska med 10 mL sterilt serologiska pipett. Snurra flaskan för att blanda mikroalgen jämnt till medium.
- Använd 2 mL steril serologiska pipett Rita 1 mL prov från varje lager flaska och överföring till sterila 1,5 mL rör.
Obs: Mikropipetter rekommenderas inte för detta steg på grund av risken för kontaminering. Dra åt den ventilerade locken på lager flaskor. - Placera lager flaskorna på uppståndelse tallrikar (~ 150 rpm) och justera luftflödet, CO2och belysningsnivåer som lämpar sig för arten. Rotera lager flaska ställning varje dag.
- Späd 1 mL proverna erhållits under steg 2,6 (100-faldig utspädning i sterilt vatten brukar fungera bra) och sprida plattan på ett agarsubstrat som rik.
Obs: Dessa plattor kan användas för att kontrollera för instanser av kontaminering samt som fungera som en källa till framtida alger inokulum för ytterligare experiment. - Ta prover från flaskorna (i BSC) varannan dag för att kontrollera mikroalger tillväxten.
Placera prover i en 96 brunnar mikroplattan i tre exemplar (200 µL) och mäta optiska densitet (OD) vid 550 nm och 680 nm varannan dag tills OD når 0,2-0,3 (som vanligtvis kräver 5-7 dagar). - Stoppa ruvning och placera lager flaskorna på en bänk för 24-48 h så att alger cellerna sedimentera självtryck.
Obs: Fast cellerna kommer att användas nästa att ympa den bubbla kolumn photobioreactors. Om en snabbare cell samling önskas, kan celler vara centrifugeras vid mer än 1 000 x g att samla in celler.
3. odling av mikroalger i bubbla kolumn Photobioreactors
- Dagen innan bioreaktor Inympning, förbereda lämpliga medier och överföring 200 mL (eller önskad volym) till den bubbla kolumn photobioreactor rör (hybridisering rör). Autoklav slangar med media och ventilerade lock på plats.
Obs: Om du använder avloppsvatten som ett odlingsmedium, autoklav tomt bioreaktorer och lägga till sterila-filtreras avloppsvatten (om axenic kultur önskas). - Koncentrera sig fast mikroalger beståndet genom att ta bort supernatanten med hjälp av en vakuumpump. Lämna mindre än 100 mL medium i varje flaska men undvika att ta bort fast alger.
Obs: Genomföra proceduren inuti en BSC och följ steril teknik. En enkel vakuum apparatur kan konstrueras med hjälp av antingen en termos eller flaska. Passa en steril serologiska pipett på änden av slangen. - Avbryta och överföra alger suspensionen till sterila 50 mL centrifugrör. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min till ytterligare koncentrera alger.
- I BSC, ta bort tillräckligt supernatanten för att uppnå en total volym på ~ 80 mL alger koncentrat för 12 photobioreacters. Undvik att dammsuga ut pelleten. Överföra alger koncentratet till en steril behållare (eller begagnade alger lager flaskan).
- Tillsätt 6 mL alger flytgödsel i varje photobioreactor med en steril 10 mL serologiska pipett.
- Sterila filter (0,2 mm spruta eller vakuum filter) och lägga till lämpliga mängder av några andra föreningar (t.ex. vitamin lager) som inte kan autoklaveras.
- Snurra bioreaktorer för att blanda alger till medium.
- Rita ett 2 mL prov från varje bioreaktor som med hjälp av serologiska pipett och överföring till en 2 mL tub. Samla en 2 mL prov (i en BSC) varje 24 h för att övervaka kultur framsteg. Kontrollera provet för pH använda testa remsor och justera reaktorn som behövs med antingen 3 M NaOH eller 3 M HCl.
- Dra åt bioreaktor locken och placera alla bioreaktorer i vattenbad fisk tank. Justera luftning, CO2och belysning till lämplig nivå för arten. Rotera bioreaktor ställning varje dag efter provtagning (steg 3.8).
- Applicera 200 µL av varje kultur prov i tre exemplar till brunnar i en 96 väl mikroplattan. Mäta optiska densitet (OD) vid 550 nm och 680 nm.
- Den sista dagen av perioden kultur, mäta OD under olika utspädningsfaktorer (t.ex. en 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x och 32 x) att upprätta en korrelation mellan OD och den faktiska torrvikten efter skörd (steg 4).
- Centrifugera 2 mL prov röret på 12 000 x g i 5 min.
- Filtrera supernatanten genom 0,2 µm icke-steril spruta filter och lagra supernatanten (och pellets om det behövs) utan högre än-20 ° C för långtidsförvaring och senare analyser av förändringar i media sammansättning.
4. skörda och frystorkning av Microalgal biomassa
- Mäta en fast volym av alger kultur från varje bioreaktor med en graderad cylinder (t.ex. 160 mL från en bioreaktor som ursprungligen innehöll 200 mL medium) och överför till centrifug flaskor. Skölj den graderad cylindern med dH2O mellan varje mätning.
- Centrifugera vid 4.696 x g i 5 min. Tag bort supernatanten genom att dammsuga noggrant ut.
- Överför pellets till märkt 50 mL rör. Skölj den centrifug flaskor med dH2O, och överföra innehållet till 50 mL tuberna. Säkerställa den totala tube volymen inte överstiger 45 mL.
- Tvätta alger pellets med dH2O ta bort salter.
- Centrifugera 50 mL tuberna på 4.696 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 40 mL dH2O i varje 50 mL rör; Vortex att blanda. Centrifugera igen 4.696 x g i 5 min och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 4.4.2 igen.
- Etikett och väger tom 15 mL centrifugrör på en 4-decimal balans (etikett både locket och tube och väger dem samman). Väg en tub per alger kultur. Väga varje 15 mL rör två gånger för att minimera fel.
- Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten och tillsätt 7,5 mL dH2O till varje 50 mL tub. Vortex och överföring av alger slam i den pre vägde 15 mL rör. Skölj 50 mL tuberna med ytterligare dH2O och överför vätska till 15 mL tuberna. Undvika att överskrida 12 mL totalvolym 15 mL tuberna.
- Centrifugera 15 mL tuberna på 4.696 x g i 5 min och Dekantera supernatanten. Frysa rören med pellets vid-80 ° C i minst 30 min förberedelse för frystorkning.
- Frysa torka över natten eller tills torkat.
- Väga och registrera frystorkad 15 mL tuberna med alger.
5. lipid utvinning en modifierad Folch metod24
- Väg upp 20 mg frystorkade alger biomassa i en 2 mL skruvlock av polypropylen rör (Kontrollera tillverkarens etikett att säkerställa att produkten är lämplig för bead extraktioner).
- Tillsätt 1,5 mL Folch spädningsvätska (2:1 kloroform/metanol) i varje 2 mL rör (som innehåller 20 mg frystorkade alger). Häll ~0.5 mL zirconia/kvarts pärlor (0.5 mm) i varje rör tills vätskenivån i röret når 2 mL.
FÖRSIKTIGHET: Hantera kloroform och metanol i ett dragskåp och Undvik att inandas ångor eller hudkontakt. - Homogenisera alger proverna i en pärla kvarn för 20 s vid en hastighet av 6,5 m/s. överföring rör till is för 30 s till chill prover. Upprepa fem gånger fullt extrahera lipider.
- Filtrera blandningen genom en 5 mL spruta innehåller en rostfritt stål wire mesh disk (mesh #60) till stam ut pärlorna, samla filtratet i en 15 mL tub.
- Tvätta pärlorna med 1,5 mL Folch, driver vätskan genom med sprutan som behövs. Upprepa detta tvätta två gånger och samla alla filtratet i 15 mL röret, vilket ger en slutlig volym av ca 6 mL.
- Tillsätt 1,2 mL 0,9% (w/v) NaCl-lösning till Folch utdrag i 15 mL röret och vortex att blanda väl.
Obs: Om det behövs mer Folch lösningsmedel kan användas att tvätta pärlor (Använd 0,2 x den totala tvätta volymen 0,9% NaCl-lösning att inducera fasseparation). - Centrifugera 15 mL tuberna vid 6000 x g för 5 min. post botten kloroform (grön) fas volymen till närmaste 0,1 mL med hjälp av linjer på sida 15 mL röret. Överföra fasen botten till en injektionsflaska av glas (med locket) med ett glas Pasteur-pipett.
- Lagra lipid vid-20 ° C eller -80 ° C om det finns planer på att använda detta extrakt för fettsyra analys.
6. Neutral Lipid Assay metoden en mikroplattan (anpassad från Higgins et al. 201422)
- Förbereda stamlösningar. Förbereda 10 mL 1 mg/mL vegetabilisk olja standard i kloroform och förvaras vid-20 ° C.
Obs: Någon vegetabilisk olja kan användas i denna analys eftersom det inte är känsliga för typerna av fettsyror. Förbereda 10 mL 200 µg/mL Nile röd lösning i dimetyl sulfoxid (DMSO) och förvaras mörkt i rumstemperatur. - Förvärm torr mikroplattan block till 55 ° C i ett dragskåp. Medan detta värme, späd den lipid extrakt och vegetabilisk olja standard 3 gånger med metanol.
Obs: Denna utspädning kan ändras baserat på fettinnehållet av alger, men denna nivå fungerar bra för de flesta Chlorella. - För varje utspätt prov, tillsätt 80 µL till en 96 väl polypropylen mikroplattan i fyra exemplar.
Varning: Användning av polystyren plasticware rekommenderas inte för användning med organiska lösningsmedel. - För blankprovlösningen, applicera 80 µL av 2:1 metanol/kloroform i fyra exemplar. För standarder, lägga till 10, 30, 60, 90 och 120 µL utspädda vegetabilisk olja standard i fyra exemplar.
- Placera mikroplattan i en torr motorvärmare vid 55 ° C i 20-30 min tills all vätska har avdunstat. Medan lösningsmedlet avdunstar, förbereda arbetande Nile röd lösning (behöver 200 µL 1 µg/ml lösning per platta väl). Som ett exempel kräver tolv prover och en full uppsättning standarder 16 mL 1,0 µg/mL lösning; Förbered genom upplösning 80 µL av 200 µg/mL beståndet (i DMSO) i 16 mL dH2O.
- Ta bort mikroplattan från värmeblocket och låt svalna till rumstemperatur. Tillsätt 30 µL isopropylalkohol i varje brunn och blanda genom pipettering upp och ner. Säkerställa alla pipett kanaler är blanda lösningen och omblandning av lipider, vilket ger en homogen grön vätska.
- Tillsätt 200 µL av Nile röd lösning (1 µg/mL) till varje brunn, Pipettera upp/ned 10 gånger för att blanda. Inkubera plattan för 5 min i rumstemperatur. Medan du väntar, Bered en 50% blekmedel genom att blanda blekmedel (6% hypoklorit) med dH2O. 20 µL per brunn behövs. Beredning av 3 mL 50% blekmedel räcker för 12 prover och en full uppsättning av standarder.
- Tillsätt 20 µL av blekmedel lösning till varje mikroplattan väl och Pipettera upp och ner 5 gånger att blanda väl. Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
- Efter 30 min, Läs fluorescens i proven var 5-10 min på 530 nm excitation/575 nm utsläpp med auto cutoff inställd på 570 nm tills signalen från alger prover stabiliserar. 60 min totala inkubationstiden är vanligtvis tillräcklig.
- Skapa en kalibreringskurva för vegetabilisk olja standarder (i intervallet 0-40 ng olja per brunn).
Obs: En linjär passar fungerar bra för låg (< 30 ng per brunn) olja koncentrationer och ett polynom som passar kan användas om standarden överstiger 30 ng per brunn. Använd denna korrelation för att kvantifiera den neutrala lipider i provet brunnarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta förfarande ger en tidsförloppet för alger optisk densitet data vid OD 550 nm (figur 4A). Den optiska densiteten och torr vikt koncentration data kan vara korrelerade (figur 4B). Detta åstadkoms genom att första beräkna den slutliga torrvikt alger koncentrationen efter frystorkning steget. Nästa, den optiska densiteten av kultur seriell utspädning (utförs den sista dagen för provtagning) och faktiska torrvikt halterna kan korreleras. För lågt koncentrationer, kan en linjär korrelation användas för högre cell koncentrationer, en andra beställning polynom korrelation kan användas. Det rekommenderas att skapa en separat korrelation för varje kultur villkor. Slutligen kan korrelationen tillämpas på tid kursen optisk densitet data att få en torr vikt tillväxtkurva (figur 4 c). I detta exempel experiment, Auxenochlorella protothecoides (UTEX 234125) var odlade fyra villkor: axenic kontroll kulturer odlas på färska N8-NH4 medelstora21, i samarbete kultur med bakterier Azospirillum brasilense, medium kompletteras med 50 mg/L av indol-3-ättiksyra och tillbringade medium från A. brasilense. A. brasilense är kända för att producera indol-3-ättiksyra, en växttillväxt att främja hormon, som också främjar tillväxt i vissa mikroalger. Dock på 50 mg/L hämmade IAA behandling helt A. protothecoides tillväxt. Följaktligen, optisk densitet data var tillgänglig, men mängden alger var otillräckligt för att erhålla en korrekt torrvikt koncentration. I det här fallet korrelationen för kontroll kulturen kan tillämpas eller optisk densitet data kan rapporteras direkt. Eftersom OD data samlades vid båda 550 nm och 680 nm absorbans, antingen datamängd får användas för sambandet mellan OD och torr vikt. Typiskt, OD 550 används eftersom det nästan helt utesluter absorbansen av klorofyll26, därmed undertrycka bias från förändringar i klorofyllhalt. Däremot OD 680 inkluderar absorbansen av klorofyll och hög nyckeltal av OD 680/550 indikerar hög klorofyllhalt i Alger. Figur 4 d visar en uppsättning av tolv alger kulturer växer i den bubbla kolumn photobioreactors. Även med bara tre biologiska replikat per behandling uppnåddes snäva standardavvikelser, möjliggör hög känslighet för skillnader mellan behandlingar.
Figur 4. Algtillväxt resulterar i bubbla kolumn photobioreactors. (A) optiska densitet (550 nm) tillväxtkurvan av Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) visar kulturer in sent logaritmisk tillväxt på 120 timmar. Kontroll kulturer odlades på färska N8-NH4 medium, behandling 1 är samtidig kulturer av A. protothecoides och Azospirillum brasilense odlas på färska N8-NH4 medium, behandling 2 är axenic A. protothecoides odlas på N8-NH4 medium kompletteras med 50 mg/L indol-3-ättiksyra (IAA) och behandling 3 är axenic A. protothecoides odlas på förbrukade medium från A. brasilense. Det förbrukade mediet förbereddes av odlingsskålar A. brasilense i 96 timmar på N8-NH4 medium kompletteras med 2 g/L-äppelsyra. Celler togs bort, och medlet var åter kompletterade med ammonium att återställa dess ursprungliga nivå, pH justerades och medlet var steril filtrerade (0,2 μm). Observera att 50 mg/L IAA behandling helt hämmade algtillväxt. (B) korrelation kurvor mellan OD 550 nm och slutliga torrvikt koncentration med hjälp av en andra beställning polynom passform. Ingen korrelation visas för behandling 2 eftersom inga alger kunde skördas i slutet av perioden kultur. (C) tillämpningen av polynom korrelationen till optisk densitet data ger en tillväxtkurva med torr vikt koncentration på y-axeln. Kontroll kultur korrelationen tillämpades i OD data för behandling 2. Felstaplar är standardavvikelser baserat på 3 biologiska replikat. (D) foto av den bubbla kolumn photobioreactors strax efter kultur inympning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Neutrala lipid data visas två exempel experiment i figur 5. Denna analys har visat sig korrelera väl med neutrala fettinnehållet, särskilt triacyglycerol (TAG) innehåll. Detta kan ses genom att jämföra neutrala lipid analysen (figur 5A) till en motsvarande tunt lager kromatografi tallrik (figur 5B). Samma trend kan ses i andra försöket (figur 5 c och 5 D). I alla dessa experiment, rapsolja användes som en standard och resulterade i en linjär korrelation (R2 0,98 för första experimentet och 0,99 för andra) mellan fluorescens och raps olja samlas i brunnen. Observera att om alla prover har låga fettinnehållet, sedan högsta punkt eller två på standarden kan tas bort. Detta samband kan användas för att beräkna kvantiteten av neutrala lipider (µg) i varje alger prov brunnarna. Den olja samlas kan sedan omvandlas till en lipid extraktet tillämpas på mikroplattan väl. Detta värde multipliceras med utspädningsfaktorn används (t.ex. 3 x) att få den neutral fettinnehållet i den ursprungliga Folch extrakt. Denna koncentration är sedan multipliceras med volymen av extraktet (bör vara nära till 4 mL) och sedan dividerat med den totala massan av alger biomassa används för lipid utvinning (bör vara nära 20 mg). Resultatet är den neutrala fettinnehållet i mikroalgen.
Figur 5. Neutrala lipid uppgifter erhållits från kulturer av Chlorella sorokiniana (UTEX 2714). (A) Neutral fettinnehållet (% torrvikt) för alger i experiment 1 i som alger har vuxit i 120 timmar. Kontroll var axenic och odlade färska N8 medium23, behandling 1 var en samtidig kultur av C. sorokiniana och A. brasilense på färska N8 medium, behandling 2 var färska N8 medium kompletteras med 50 mg/L IAA och behandling 3 ägnades medium från A. brasilense. Använt medlet var beredd av odlingsskålar A. brasilense i 96 timmar i N8 medium kompletteras med 2 g/L-äppelsyra, att ta bort celler, komplettera förlorade nitrat, justera pH, och steril filtrering medium (0,2 μm). Till skillnad från A. protothecoideshämmade 50 mg/L av IAA inte C. sorokiniana tillväxt. (B), TLC plattan bild för experiment 1 visar relativa TAG överflöd. (C) Neutral fettinnehållet (% torrvikt) för alger i experiment 2 som hade samma behandlingar som experimentera 1 men cellerna skördades efter 72 timmar av tillväxt. (D), TLC plattan bild för experiment 2 visar relativa TAG överflöd. Felstaplar är standardavvikelser baserat på 3 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessutom är det god praxis att beräkna variationskoefficienten (standardavvikelsen dividerat med medelvärdet) av rå fluorescens avläsningar över alla tekniska replikat i neutrala lipid-analysen. Förutsatt att tekniska replikat genomfördes i mikroplattan i fyra exemplar som anges i förfarandet, bör variationskoefficienten normalt inte överstiga 10%. Hög variationskoefficienter är oftast resultatet av dålig blandning (särskilt under tillsats av isopropylalkohol) och potentiellt felaktig användning av en flerkanalspipett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktigaste när odla alger är en förståelse för de särskilda behoven hos den organism eller grupp av organismer. Alger odling systemet beskrivs här kan användas till kultur ett brett utbud av alger men de särskilda abiotiska faktorerna (temperatur, media, pH, ljusintensitet, CO2 -nivå, luftning rate) måste anpassas till behoven hos organismen. Observera de parametrar som beskrivs här användes för odling av Chlorella och Auxenochlorella. Dessa organismer är av industriellt intresse eftersom de är tolerant mot hög näringsämne, ljus och temperatur nivåer27. Men ljuset nivåer kan reduceras genom avlägsnande av lysrör och dag/natt cykel kan justeras för att representera säsongsvariationer. Likaså kan varmvattenberedare slås upp eller ned kontroll bad vattentemperaturen på systemet. Medan systemet beskrivs här inte anställer sådan funktion, är det möjligt att kyla fisk tank vatten badet under rumstemperatur genom en låg kostnad kylsystem. Placera en hink med vatten i ett litet kylskåp och använda en variabel hastighet pumpen att pumpa vatten från kallt vatten hinken till fisk tank och tillbaka. Desto snabbare pumpning kursen blir kallare fisk tank reservoaren.
Även alger odling systemet ger generellt konsekventa resultat, finns det ett par viktiga varningar som bör övervägas. Först är vatten häverteffekt som uppstår i händelse att luftning systemet upplever en plötslig förlust av tryck (t.ex. en blåst passande eller ett luftkompressor fel). Trycket i luftfuktare kommer att driva luftfuktare vatten bakåt genom slangen, bland annat genom rotameter. Installera en uppströms fälla eller återflödet preventer kan hjälpa. Observera att häverteffekt inte kommer att påverka bioreaktorerna själva eftersom de är verksamma vid atmosfäriskt tryck. Rutinmässig inspektion av rörledningar och armatur kan lindra systemfel. En annan viktig faktor är att rutinmässigt kontrollera och ersätta luftfilter och backventiler på bioreaktorerna. Var noga med att följa tillverkarens rekommendation för antalet autoklav cykler tillåtna. Detta är särskilt viktigt om underhåll av axenic kulturer är kritisk till experimentet. Slutligen är det rekommenderat att köpa eller bygga ett autoklaverbart rack för säker transport av bioreaktorerna mellan vattenbad, autoklav och biosäkerhet skåp. En rostfritt stål tråd rack kan tjäna detta syfte.
Bioreaktor systemet beskrivs här har flera begränsningar. En viktig begränsning är behovet av att hantera reaktorerna i ett biosäkerhet skåp med steril teknik. Reaktorerna saknar en anti-häverteffekt provtagning port, som kräver att användaren kan flytta reaktorn till en biosäkerhet skåp till provet utan att förorena kulturen. Reaktorerna kommer också att kräva manuell pH läsning och justering som inför risken för mänskliga fel.
Bioreaktor systemet beskrivs här fyller en nisch mellan enkel kolv odling och fullt kontrollerade bioreaktorer. Bioreaktor systemet utvecklades som svar på behovet av mer enhetliga resultat än var möjligt med hjälp av flaskor. Data visar att detta system genererar konsekvent tillväxt resultat när den används på rätt sätt. Observera att kolsyrat flaskor var anställda i förfarandet för odling av alger lager, men detta gjordes endast för att producera inokulum för experimentet. Detta är acceptabelt eftersom lager flaskor var för inympningen och därmed variationsrikedomen bland reaktorer är inte en fråga.
Som många alger forskare är intresserade av att övervaka både tillväxt och neutrala fettinnehållet, har vi inkluderat vår metod för att mäta båda dessa parametrar här. Användning av optiska densitet att mäta tillväxt är standardförfarande och saknar motstycke i sin enkelhet. Dock korrelationer mellan torrvikt och optisk densitet förändras över tid och beroende av kultur villkor. Det rekommenderas att producera en korrelation ekvation för varje experimentell behandling inom varje experimentellt batch. Detta är möjligt i det föreslagna förfarandet eftersom frysa torkade alger kommer att erhållas efter varje kultur experiment. Ett kritiska antagande av optisk densitet strategi är att korrelationen mellan optisk densitet och torr vikt håller konstant under loppet av batch tillväxt. Så länge som avvikelser från detta antagande är små, blir resultatet någorlunda korrekt. Den relativa precisionen kan bedömas genom att jämföra den beräkna alger torrvikt koncentrationen vid tiden noll. Förutsatt att kulturer var väl blandade och pipettering var korrekt, alla kulturerna bör ha samma inledande inympning densitet. Metoden optisk densitet kan också ifrågasättas när bakgrundsabsorbansen av medlet är hög (dvs när du arbetar med vissa avloppsvatten). Subtraktion av medelstora absorbans (före ympningen) från varje OD behandlingen kan hjälpa till med problemet.
Utvinning av lipider från torr algerna följer den väletablerade Folch strategi21,24; Det finns dock viktiga överväganden. Olika alger arter har olika cellväggar med varierande grad av seghet. Zirconia/kvarts pärlor används här är vassa och är utformade för att genomborra stark, polysackarid cellväggar. En mjukare bead typ (t.ex. glas) eller färre pärla störningar cykler kan användas på alger med svagare cellväggar. En tumregel är dock att den resulterande cellpelleten efter extraktion bör fritt av pigment, som anger att alla klorofyll extraherades. En av de vanligaste källorna för misslyckande under lipid utvinning steg uppstår på grund av felaktig frysa torkning. Om provet smälter i frysa torktumlare innan den är helt torr, blir resultatet en mycket hård, mörk, vaxartad pellet. Detta är resultatet av celler som lyserat vakuum villkor vid frysningen torktumlare. Pelleten kan vägas för att få en torr vikt, men det kan inte användas för extraktion av lipid som vaxartad partiklarna inte bryta i Folch lösningsmedel. För att säkerställa att frystorkningsanläggningar alltid avkastning mjuk, pudrig prover, är det viktigt att frysa alla prover till-80 ° C och utan dröjsmål överföra dem till frysningen torktumlare. Dessutom kommer att använda parafilm (med ett hål som petade i det) snarare än lossade röret locken säkerställa att fukt kontinuerligt kan avlägsnas från provet innan det tinar.
Den neutrala lipider-analysen som beskrivs här har publicerats tidigare och innehåller en diskussion om alternativa lipid analyser22. Dock har några viktiga förbättringar gjorts till det förfarandet sedan publikationen. Framför allt, var Nile röd lösning koncentrationen ökade från 0,5 µg/mL till 1 µg/mL. Effekten av denna förändring var högre signalintensitet, förbättrad repeterbarhet och en eliminering av signal nedgång över tid under inkubationstiden. Resultaten visar att analysen jämför väl till resultat från kvalitativa tunnskiktskromatografi. Denna analys har utvecklats och validerats med olika arter av Chlorella och Auxenochlorella så dess tillämplighet på arter av väsentligt olika sammansättning inte har fastställts. Alla gröna pigment bör tas bort helt från analysen under blekmedel ruvning, leder till prover som är tydlig eller mycket blekt gul. Observera också att lipid extrakt som är förstörd (som visas en förändring från grön till brun färg) vanligtvis misslyckas med att leverera korrekta resultat i denna analys. Det är således absolut nödvändigt att lagra lipid prover utan högre än-20 ° C i mörker.
De metoder som presenteras här för odling av alger, mäta tillväxt och kvantifiera neutrala lipider är användbar för en mängd olika tekniska tillämpningar av alger, men lämpar sig särskilt för forskning om produktion av biodrivmedel. Dessa metoder används också för att studera algtillväxt hämning på avloppsvatten28 samt effekterna av organismen interaktion på tillväxten och sammansättning av mikroalger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Stöd för denna forskning lämnades av USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk Hatch projektet ALA0HIGGINS och Auburn University kontor profossen, Vice President för forskning och i Samuel Ginn College of Engineering. Stöd gavs också av NSF bevilja CBET-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).
