Summary
Nous présentons ici un protocole visant à construire le laboratoire bulle colonne photobioréacteurs et utilisez-les pour la culture micro-algues. Il fournit également une méthode pour déterminer le taux de croissance de la culture et de la teneur en lipides neutres.
Abstract
Il y a des intérêts importants dans l’étude des microalgues pour applications d’ingénierie tels que la production de biocarburants, produits à haute valeur et pour le traitement des déchets. Comme la plupart des nouveaux efforts recherche commencent à l’échelle du laboratoire, on a besoin de méthodes rentables pour la culture des microalgues de façon reproductible. Ici, nous communiquons une approche efficace de la culture de microalgues dans des photobioréacteurs de laboratoire et pour mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Instructions figurent également sur la façon de mettre en place le système Photobioréacteur. Bien que les organismes de l’exemple sont les espèces de Chlorella et Auxenochlorella, ce système peut être adapté pour cultiver une large gamme de microalgues, y compris des cultures d’algues avec des espèces non-algues. Cultures mères sont tout d’abord cultivés dans des bouteilles pour produire l’inoculum pour le système Photobioréacteur. Inoculum algues est concentrée et transféré dans les photobioréacteurs pour la culture en mode batch. Les échantillons sont recueillis pour les lectures de densité optique. À la fin de la culture de lot, les cellules sont récoltées par centrifugeuse, lavé et lyophilisé pour obtenir une concentration finale de poids sec. La concentration en poids sec final sert à créer une corrélation entre la densité optique et la concentration de matière sèche. Une méthode de Folch modifiée est ensuite utilisée pour extraire les lipides totaux de la biomasse lyophilisée et l’extrait est analysé pour sa teneur en lipides neutres à l’aide d’un test de la microplaque. Cet essai a été publié précédemment mais les étapes du protocole ont été inclus ici pour mettre en évidence les étapes critiques de la procédure où les erreurs se produisent fréquemment. Le système de bioréacteur décrit ici comble un créneau entre culture simple fiole et bioréacteurs commerciales entièrement contrôlé. Même avec seulement 3-4 biologique réplicats par traitement, notre approche de la culture d’algues conduit à des écarts serrés dans les essais de croissance et de lipides.
Introduction
L’application des microalgues dans l’ingénierie et de la biotechnologie a suscité un grand intérêt ces dernières années. Les microalgues sont étudiées pour une utilisation dans le traitement des eaux usées traitement1,2,3,4, biofuel production5,6,7,8et le production de nutraceutiques et d’autres produits de haute valeur9,10. Algues sont également génétiquement modifiés à des taux plus élevés dans le but d’améliorer leur condition physique spécifique engineering applications11,12. Par conséquent, il y a beaucoup d’intérêt dans l’expérimentation avec des organismes industriellement pertinentes en milieu contrôlé. Le but de cette méthode est de communiquer une approche efficace de la culture de microalgues dans un environnement de laboratoire contrôlées et de mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Améliorer la croissance taux et teneur en lipides neutres des micro-algues ont été identifiés comme les deux principaux goulets d’étranglement vers la commercialisation des biocarburants algues13.
Un large éventail d’approches ont été utilisés à des algues de culture à des fins expérimentales. En général, ces approches peuvent être divisés entre culture extérieure à grande échelle et de la culture en intérieur à petite échelle. Culture en plein air dans des photobioréacteurs et étangs ouverts est appropriée pour l’expérimentation vise à intensifier les processus qui ont déjà été éprouvées à l’échelle laboratoire (par exemple, pour tester l’intensification d’une nouvelle souche haute-lipide d’algues)14. Cependant, culture en intérieur à petite échelle est appropriée lors du développement de souches d’algues nouveaux ou améliorés ou des expériences visant à comprendre les mécanismes biologiques. Dans ces derniers cas, un haut-niveau de contrôle expérimental est nécessaire pour isoler les changements subtils de comportement biologique. À cette fin, les cultures axéniques doivent souvent afin de minimiser les facteurs biotiques complexes associés avec d’autres organismes (p. ex. bactéries, algues) qui poussent inévitablement dans les systèmes extérieurs à grande échelle. Même lorsque l’étude des interactions entre les algues et autres organismes, nous avons trouvé qu’utilisation des conditions expérimentales très contrôlé est utile lorsqu’on examine les échanges moléculaires entre organismes15,16,17.
Dans la catégorie des cultures d’algues indoor à petite échelle, un éventail d’approches ont été utilisées. Peut-être l’approche la plus courante consiste à cultiver des algues dans des flacons Erlenmeyer sur un tableau de dispositif trembleur sous une lumière banque18,19. Échange d’oxygène et de CO2 se déroule par diffusion passive grâce à un bouchon de mousse dans la partie supérieure du ballon. Certains chercheurs ont amélioré ce set-up une aération active des flacons20. Une autre approche consiste à cultiver des algues dans des bouteilles, mixés par barre de remuer et aération active. Malgré leur simplicité, nous avons trouvé que l’utilisation de flacons et bouteilles conduit souvent à des résultats incohérents entre les réplicats biologiques. C’est sans doute en raison des effets de position - différentes positions reçoivent des quantités différentes de la lumière, qui affectent également les températures internes de réacteur. La rotation quotidienne de réacteurs vers de nouvelles positions peuvent aider mais n’allège pas le problème car certaines étapes de la croissance des algues (par exemple, au début exponentielle) sont plus sensibles aux effets de position que d’autres (par exemple, la phase logarithmique).
À l’opposé du spectre de la sophistication technologique sont photobioréacteurs commercial entièrement contrôlé. Ces systèmes en permanence surveillent et ajuster les conditions dans le réacteur afin d’optimiser la croissance des algues. Ils ont d’éclairage programmable, régulation de température en temps réel et contrôle du pH. Malheureusement, ils sont coûteux et coûtent généralement plusieurs milliers de dollars par réacteur. Plus de revues scientifiques et d’ingénierie nécessitent réplication biologique des résultats, ce qui nécessite l’achat de plusieurs bioréacteurs. Nous présentons ici un système de réacteur de colonne de bulles qui comble le fossé entre les simples (fiole) et sophistiqué (entièrement contrôlée par bioréacteur) s’approche pour la culture d’algues-l’échelle du laboratoire. Colonnes de bulles permet de faciliter les échanges gazeux et de mélanger le réacteur hausse des bulles de gaz. Cette approche fournit un degré de contrôle sur l’éclairage et la température, mais le fait d’une manière peu onéreuse. En outre, nous avons trouvé ce système pour donner des résultats très cohérents entre les réplicats biologiques, réduisant le nombre de réplicats biologiques nécessaires afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs par rapport à l’approche de la fiole ou une bouteille. Nous avons également utilisé ce système pour cultiver avec succès des mélanges d’algues et de bactéries21. En plus de culture d’algues, nous décrivons une procédure pour mesurer la teneur en lipides neutres dans les algues cultivées. Cette dernière méthode a été publiée ailleurs22, mais nous incluons la procédure ici pour fournir des instructions pour savoir comment employer avec succès.
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Protocol
1. installation de bulle colonne photobioréacteurs
- Construire un jeu de couvercles ventilés des couvercles en plastique fourni avec les bouteilles de verre de 1 L et les tubes d’hybridation (voir Figure 1 schéma et photos). Construire des couvercles pour l’humidificateur, piège, chaque air lift Photobioréacteur et chaque réacteur bouteille de mélange.
- ¼" trous dans le couvercle : 2 trous sont nécessaires pour les couvercles bioréacteur et humidificateur ; 3 trous sont nécessaires pour le mélange de piège.
- Glisser un ¼" o-ring sur le filetage d’un raccord Luer de montage de panneau 1/8" et cela glisser dans le trou de ¼" foré dans le couvercle (Figure 1 a).
- Glisser un deuxième ¼" o-ring sur les filets afin que le couvercle est pris en sandwich entre les deux joints toriques. Glisser un écrou de blocage sur le filetage et serrer pour fixer le panneau Montage Luer en place.
- Emboîter les anneaux de verrouillage sur le projetant Luer mâle exposé du couvercle. Répétez les étapes 1.1.2-1.1.4 pour chaque trou dans le couvercle.
- Pour les couvercles qui seront utilisées pour des réacteurs de colonne et bouteille bulle, joignez 1/8" femelle Luer pour raccords cannelés à 1.5" morceaux de 1/8" tube PVC ID. Fixer à chacun des raccords Luer mâles exposés sur le couvercle.
- Connecter un clapet anti-retour (pointant à l’écart du couvercle) à l’extrémité libre de l’un des 1/8" morceaux.
NOTE : Ceci servira de l’orifice d’échappement pour le bioréacteur. - Connecter un Luer mâle à laissé sur le raccord à la deuxième pièce de 1/8" tube saillie sur le couvercle. Cliquez sur la bague rotative de la serrure en place et fixer un filtre à air 0,2 mm pour cela.
NOTE : Ceci servira de l’orifice d’entrée du réacteur.
Figure 1. Schéma et photos pour construire des bioréacteurs. Schéma (A) pour la construction du bioréacteur couvercles (B) photo du couvercle assemblé bioréacteur et (C) photo du couvercle assemblé utilisé pour l’humidificateur. Notez que les raccords de l’humidificateur doivent revêtir en silicone imperméable à l’eau pour assurer un joint étanche avec le couvercle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Monter le système de livraison air (voir Figure 2 a et 2 b pour un schéma et la photo).
- Attacher 1/8" NPT filetée pour raccords cannelés pour les entrées et sorties à l’arrière de chaque rotamètre.
NOTE : 200-2 500 cm3/min rotamètres pour moduler la pression air en amont de l’humidificateur, 100-1 000 cm3/min rotamètres sont pour les réacteurs de la bouteille, de 50 à 500 cm3/min rotamètres sont pour air lift bioréacteurs et 5-50 cm3/ min rotemeters sont pour la régulation du débit CO2 . Il est recommandé de Mont rotamètres à une surface fixe (par exemple feuille de plastique) afin qu’ils ne tombent pas au cours de l’opération. - Couper la source d’air comprimé, puis connecter ¼" ID PVC tuyau flexible à la source d’air comprimé avec un collier de serrage. Descendez le diamètre de tuyau de 1/8" tuyau flexible PVC ID en utilisant un ¼" femelle pour raccord cannelé et une mâle-raccord cannelé 1/8".
- Raccorder l’extrémité libre du tuyau ID 1/8" à l’entrée de rotamètre 200-2 500 cm3/min.
Remarque : La sortie de cette rotamètre nourrira la bouteille humidificateur via 1/8" tube ID. - Connecter le tuyau à une entrée à un couvercle ventilé (utilisez un raccord Luer femelle à barb raccord pour établir la connexion) 1/8". Connectez ensuite un deuxième morceau de 1/8" tube à l’intérieur de la monture du panneau montage.
NOTE : Cette pièce va pendre dans l’humidificateur et l’air des bulles dans l’eau. - Attacher 1/8" femelle Luer à barb raccords à chaque extrémité d’un morceau de 1/8" tube ID et utiliser ce morceau pour raccorder la sortie de l’humidificateur à l’entrée du piège du mélange.
- De la même manière que 1.2.5, raccorder la sortie du régulateur2 CO à une deuxième voie le piège de mélange.
- Construire un collecteur à l’aide de 1/8" tube et 1/8" barb multiport (voir Figure 2 C) pour alimenter l’air dans les banques de rotamètre.
Remarque : Ces rotamètres serviront à fournir les bioréacteurs. Éviter la construction de plus de 6 rotamètres de série. Utilisez plutôt des bords parallèles de rotamètres pour étendre le système. S’assurer que la demande de débit total de tous les réacteurs est inférieur à 2 500 cm3/min (ou sinon il faudra un rotamètre plu en amont de l’humidificateur). - Raccorder la sortie (3rd port) du piège du mélange aux banques rotamètre nouvellement construit à l’aide de 1/8" tube et un 1/8" femelle à barb Luer.
- Se connecter suffisamment longue 1/8" tube sur les prises de chaque rotamètre dans la banque de rotamètre pour alimenter en air les bioréacteurs. Étiqueter les extrémités de la tuyauterie ainsi que les rotamètres dans la banque.
- Appliquer du silicone imperméable à l’eau autour de tous les ports sur l’humidificateur et le brassage des couvercles de piège pour s’assurer qu’ils sont étanche à l’air.
- Attacher 1/8" NPT filetée pour raccords cannelés pour les entrées et sorties à l’arrière de chaque rotamètre.
Figure 2. Schéma et photos pour le montage de système de colonne de bulles. Schéma (A) de la photo de système (B) d’aération de l’humidificateur, mélange de piège et banque de rotamètre et (C) photo des collecteurs utilisés pour relier les rives rotamètre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Mettre en place les réservoirs à poisson, remuer les plaques et les lumières (Figure 3).
Attention : Ce système requiert un grand nombre de points de vente et de la capacité du circuit suffisante à l’appui de tous les composants. Évitez les enchaînant plusieurs multiprises et rallonges de façon guirlande parce qu’il s’agit d’un danger électrique. Utilisation du type sorties de GFI et multiprises est fortement encouragée en raison de la présence d’eau dans le système.- Organiser les agitateurs magnétiques de profil bas sur une surface plane qui est assez fort pour supporter le poids des aquariums remplis d’eau.
- Placer des petits en bois ou en plastique blocs (qui sont légèrement plus grands que les plaques de remuer) autour du périmètre des plaques remuer pour supporter le poids des citernes à poisson.
Attention : Évitez les réservoirs à poisson directement sur les plaques de remuer comme le poids va les écraser. - Placez les réservoirs à poisson sur les plaques de remuer et soutenir les blocs et remplir les réservoirs d’eau.
- Couper un morceau d’une feuille de plastique rigide pour s’adapter sur le dessus de l’aquarium comme un couvercle. Couper des trous dans ce couvercle pour glisser les tubes d’hybridation dedans et dehors. Également un trou pour le chauffage de réservoir de poissons.
- Organiser les banques lumière fluorescentes à côté de l’aquarium pour fournir un éclairage horizontal de bioréacteurs. Branchez la banque léger dans une lumière minuterie pour programmer un cycle jour/nuit.
Figure 3. Système schématique pour les bioréacteurs de bouteille (à gauche) et la bulle colonne photobioréacteurs (à droite). Ce chiffre a été modifié par Higgins et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
2. préparation de l’Inoculum de microalgues
- Microalgues inoculum provenir d’une culture cryoconservés, plaquée ou liquide.
Remarque : Il est recommandé que les organismes cryoconservés être plaqué avant l’utilisation comme inoculum pour s’assurer que les cellules sont viables et que la culture qui en résulte est axénique. Milieu gélosé (e.g., ATCC #5 sporulants agar)21 est un milieu riche qui fonctionne bien pour faire revivre des espèces de Chlorella et Auxenochlorella de cryo-stockage. - Préparer 2.4 L de milieu minéral qui est approprié pour les espèces de microalgues particulière.
NOTE : Exemples incluent N8 moyen23 espèces de Chlorella, N8-NH4 moyenne21 espèces de Auxenochlorella. Utilisation d’un support approprié pour la souche d’algues est une des étapes plus importantes pour assurer la croissance des algues robuste. - Aliquote 2,4 L de milieu minéral également dans trois bouteilles de verre de 1 L, ajouter remuer les barres pour chaque bouteille et assembler les couvercles ventilés (Figure 1) pour chaque bouteille. Vérifier que le tube d’aération est sur le côté de l’entrée et chaque bouteille dispose d’un bar de remuer en elle.
- Autoclave les flacons à l’aide d’une stérilisation liquide cycle (121 ° C) pour 30 min. Autoclave 100 mL d’eau désionisée (dH2O) et quelques tubes de 1,5 mL à la fois, qui sera plus tard utilisée pour le placage. Laisser le milieu refroidir jusqu’au lendemain. Vous pouvez refroidir le réacteur à la température ambiante et ensuite aérer pendant 2 h avant l’inoculation.
- Dans une armoire biosafety (BSC), ensemencer microalgues d’une plaque ou une culture axénique de liquide dans les bouteilles en stock. Technique stérile permet de maintenir les cultures axéniques dans les étapes suivantes.
- Ajouter 20 mL d’autoclave dH2O dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Utilisez une boucle jetable stérile de 10 µL de choisir plusieurs colonies individuelles de la plaque à l’étape 2.1. Trempez la boucle dans le tube de 50 mL et rincer les cellules d’algues dans le 20 mL d’autoclave dH2O. secouez le tube de 50 mL pour faire une solution homogène de microalgues.
- Pipetter 6 mL de solution de microalgues dans chaque solution concentrée avec une pipette sérologique stérile de 10 mL. Agiter le flacon pour mélanger les microalgues uniformément dans le milieu.
- Utiliser une pipette sérologique stériles de 2 mL pour dessiner des échantillons de 1 mL de chaque solution concentrée et le transfert dans des tubes stériles de 1,5 mL.
Remarque : Micropipettes ne sont pas recommandés pour cette étape en raison du risque de contamination. Serrez le couvercle ventilé sur les flacons. - Placer les flacons sur plaques de remuer (~ 150 tr/min) et ajuster le débit d’air, CO2et niveaux d’éclairage en fonction de l’espèce. Tourner la position de solution concentrée de tous les jours.
- Diluer les échantillons de 1 mL obtenus au cours de l’étape 2.6 (100 fois dilution dans l’eau stérile fonctionne généralement bien) et la propagation de la plaque sur un milieu gélosé riche.
Remarque : Ces plaques peuvent être utilisés pour rechercher les cas de contamination, ainsi que servir de source d’inoculum algues futures pour plus expérimente. - Prélever des échantillons des bouteilles (dans la GCS) tous les deux jours pour vérifier la croissance des microalgues.
Placer les échantillons dans une microplaque 96 puits en triple exemplaire (200 µL) et mesurer la densité optique (Do) à 550 nm et 680 nm tous les deux jours jusqu'à OD atteint 0,2-0,3 (ce qui nécessite généralement de 5 à 7 jours). - Arrêter l’incubation et placer les flacons sur un banc pendant 24 à 48 heures permettre à des cellules d’algues à régler par gravité.
Remarque : Les cellules sédentarisés servira ensuite pour ensemencer les photobioréacteurs colonne de bulles. Si vous souhaitez un prélèvement de cellules plus rapide, les cellules peuvent être centrifugés à pas plus de 1 000 x g à prélever des cellules.
3. la culture des microalgues dans bulle colonne photobioréacteurs
- La veille de l’inoculation de bioréacteur, préparer un milieu approprié et transfert 200 mL (ou volume désiré) à la bulle colonne Photobioréacteur tubes (tubes d’hybridation). Tubes d’autoclave avec les médias et les couvercles ventilés en place.
Remarque : Si vous utilisez des eaux usées comme un milieu de croissance, autoclave vide bioréacteurs et ajouter stérile filtré des eaux usées (si la culture axénique est souhaitée). - Concentrer le stock de microalgues sédentarisés en enlevant le surnageant à l’aide d’une pompe à vide. Laissez moins de 100 mL de milieu dans chaque bouteille, mais éviter de retirer les algues sédentarisés.
NOTE : Mener cette procédure à l’intérieur d’un BSC et suivre une technique stérile. Un simple appareil sous vide peut être construit à l’aide d’une fiole à vide ou une bouteille. Monter une pipette stérile sérologique à l’extrémité de la tubulure. - Suspendre et transférer la boue d’algues à tubes à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à concentrer davantage les algues.
- Dans la GCS, retirez suffisamment surnageant pour obtenir un volume total d’environ 80 mL de concentré d’algues pour 12 photobioreacters. Évitez de passer l’aspirateur sur le culot. Transférer le concentré d’algues dans un récipient stérile (ou la solution concentrée d’algues utilisées).
- Ajouter 6 mL de boue d’algues dans chaque Photobioréacteur avec une pipette sérologique stérile de 10 mL.
- Filtres stériles (filtre de seringue ou passer l’aspirateur de 0,2 mm) et ajouter une quantité appropriée de tout autres composés (par exemple les stocks de vitamine) qui ne peuvent pas être stérilisés à l’autoclave.
- Agiter pour mélanger les algues dans le milieu des bioréacteurs.
- Obtenir un échantillon de 2 mL de chaque bioréacteur à l’aide d’une pipette sérologique et transférez dans un tube de 2 mL. Prélever un échantillon de 2 mL (dans un BSC) toutes les 24 h pour surveiller la progression de la culture. Vérifiez l’échantillon pour le pH à l’aide de bandelettes de test, puis ajustez le réacteur requis avec soit 3 NaOH M ou 3 M HCl.
- Serrer les couvercles de bioréacteur et placer tous les bioréacteurs dans le bain d’eau de réservoir poisson. Régler l’aération, CO2et éclairage au niveau approprié pour les espèces. Tourner la position de bioréacteur chaque jour après le prélèvement (étape 3.8).
- Appliquer 200 µL de chaque échantillon de culture en triple exemplaire aux puits d’une microplaque 96 puits. Mesurer la densité optique (Do) à 550 nm et 680 nm.
- Le dernier jour de la période de culture, mesurer OD sous facteurs de dilution différent (par exemple, un 1 x, x 2, 4 x, 8 x, 16 x et 32 x) à établir une corrélation entre le diamètre extérieur et le poids sec après la récolte (étape 4).
- Centrifuger le tube d’échantillon de 2 mL à 12 000 x g pendant 5 min.
- Filtrer le liquide surnageant par filtre de seringue non stérile 0,2 µm et stocker le liquide surnageant (et pellet si nécessaire) sans aucun supérieure à-20 ° C pour le stockage à long terme et des analyses postérieures de changements dans la composition des médias.
4. récolter et lyophilisation de biomasse de microalgues
- Mesurer un volume fixe de la culture d’algues de chaque bioréacteur avec une éprouvette graduée (p. ex., 160 mL d’un bioréacteur qu’initialement confinée 200 mL du milieu) et transvaser dans des bouteilles de centrifugeuse. Rincer l’éprouvette graduée avec dH2O entre chaque mesure.
- Centrifuger à 4 696 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant en passant l’aspirateur soigneusement dehors.
- Transférer les boulettes à tubes étiquetés 50 mL. Rincer les bouteilles de centrifugeuse avec dH2O et transfert de contenu aux tubes de 50 mL. S’assurer que le volume total de tube ne dépasse pas 45 mL.
- Laver les pellets algues avec dH2O pour enlever les sels.
- Centrifuger les tubes de 50 mL à 4 696 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Ajouter 40 mL dH2O dans chaque tube de 50 mL ; vortex pour mélanger. Centrifuger à nouveau à 4 696 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Répétez l’étape 4.4.2 à nouveau.
- Étiqueter et peser des tubes à centrifuger vide 15 mL sur une balance de 4 décimales (le couvercle et le tube de l’étiquette et pesez-les ensemble). Peser un tube par la culture d’algues. Peser chaque tube de 15 mL deux fois pour minimiser l’erreur.
- Après le dernier lavage, éliminer le surnageant et ajouter 7,5 mL de dH2O dans chaque tube de 50 mL. Vortex et transfert les coulis d’algues dans le pré-pesés 15 mL tubes. Rincer les tubes de 50 mL avec supplémentaires dH2O et transférer le liquide sur les tubes de 15 mL. Éviter de dépasser 12 mL de volume total dans les tubes de 15 mL.
- Centrifuger les tubes de 15 mL à 4 696 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Geler les tubes avec des boulettes à-80 ° C pendant au moins 30 min en préparation pour la lyophilisation.
- Gel sécher pendant la nuit ou jusqu'à ce que séché.
- Pesez et consignez les tubes de 15 mL lyophilisé avec des algues.
5. lipid Extraction à l’aide d’une méthode de Folch modifiée24
- Peser de 20 mg de la biomasse algale lyophilisée dans un tube en polypropylène à bouchon à vis 2 mL (étiquette de fabricant de vérification pour s’assurer que le produit est approprié pour les extractions de perle).
- Ajouter 1,5 mL de solvant Folch (chloroforme/méthanol de 2:1) dans chaque tube de 2 mL (qui contient 20 mg d’algues lyophilisées). Versez ~0.5 perles de zircone/silice mL (0,5 mm) dans chaque tube jusqu'à ce que le niveau de liquide dans le tube s’élève à 2 mL.
Attention : Gérez chloroforme / méthanol sous une hotte et éviter de respirer les vapeurs ou contact avec la peau. - Homogénéiser les échantillons d’algues dans un moulin de perle pour 20 s à une vitesse de tuyaux de transfert 6,5 m/s. à la glace pendant 30 s pour refroidir les échantillons. Répéter cinq fois plus d’extraire complètement les lipides.
- Filtrer l’homogénat au moyen d’une seringue de 5 mL contenant un disque de maille de fil d’acier inoxydable (#60 mesh) à souche sur les perles, en recueillant le filtrat dans un tube de 15 mL.
- Laver les billes avec 1,5 mL de solvant Folch, poussant le liquide à travers avec la seringue si nécessaire. Répétez ce laver deux fois plus et recueillir le filtrat tous dans le tube de 15 mL, ce qui donne un volume final d’environ 6 mL.
- Ajouter 1,2 mL de 0,9 % (p/v) solution de NaCl à l’extrait de Folch dans le tube de 15 mL et vortex pour bien mélanger.
Remarque : Si nécessaire, plus Folch solvant peut servir à laver les perles (utilisation de 0,2 x le volume total de lavage de la solution de NaCl à 0,9 % pour induire la séparation des phases). - Centrifuger les tubes de 15 mL à 6 000 x g pendant 5 min. Record le volume de phase (vert) de chloroforme inférieur à 0,1 mL près à l’aide de lignes sur le côté du tube de 15 mL. Transférer la phase inférieure un flacon en verre (avec le couvercle) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
- Stocker les lipides à-20 ° C ou -80 ° C s’il est prévu d’utiliser cet extrait pour l’analyse des acides gras.
6. dosage de lipide neutre en utilisant une méthode de microplaque (adapté de Higgins et coll. 201422)
- Préparer les solutions. Préparer l’étalon de 10 mL 1 mg/mL d’huile végétale dans le chloroforme et conserver à-20 ° C.
Remarque : N’importe quelle huile végétale peut servir dans ce test parce qu’il n’est pas sensible aux types d’acides gras. 10 mL de 200 µg/mL de solution de rouge de Nil dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) de préparer et stocker dans l’obscurité à température ambiante. - Microplaque sec de préchauffage du bloc à 55 ° C sous une hotte. Pendant que cela chauffe, diluer les extraits lipidiques et huile végétale standard 3 fois avec du méthanol.
Remarque : Cette dilution peut être modifiée en fonction de la teneur en lipides des algues, mais ce niveau fonctionne bien pour la plupart Chlorella. - Pour chaque échantillon dilué, ajouter 80 µL dans une microplaque 96 bien en polypropylène en quatre exemplaires.
Attention : Utiliser des contenants de plastique polystyrène n’est pas recommandé pour une utilisation avec des solvants organiques. - Pour le blanc de solvant, appliquer 80 µL du méthanol de 2:1 / chloroforme en quatre exemplaires. Pour les normes, ajouter 10, 30, 60, 90 et 120 µL de l’huile végétale diluée standard en quatre exemplaires.
- Placer la microplaque dans un chauffe-bloc sec à 55 ° C pendant 20-30 min jusqu'à ce que tous les solvant s’est évaporée. Alors que le solvant s’évapore, préparer le travail solution rouge Nil (nécessité 200 µL de solution de 1 µg/ml par plaque bien). À titre d’exemple, douze échantillons et un ensemble complet de normes nécessite 16 mL de 1,0 µg/mL de solution ; préparer en dissolvant 80 µL du stock 200 µg/mL (dans le DMSO) dans 16 mL dH2O.
- Retirer le bloc de chauffage de la microplaque et laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 30 µL de l’alcool isopropylique dans chaque puits et mélanger par pipetage de haut en bas. S’assurer que tous les canaux de pipette sont la solution de mélange et resuspendant les lipides, ce qui donne un liquide vert homogène.
- Ajouter 200 µL de solution de rouge de Nil (1 µg/mL) à chaque puits, pipette montée/descente 10 fois pour mélanger. Incuber la plaque pendant 5 min à température ambiante. En attendant, préparer une solution de 50 % eau de Javel en mélangeant l’eau de Javel (hypochlorite de 6 %) avec dH2O. 20 µL / puits sont nécessaires. Préparation de 3 mL d’eau de Javel de 50 % est suffisante pour 12 échantillons et un ensemble complet de normes.
- Ajouter 20 µL de solution d’eau de Javel à chaque microplaque bien et pipeter monter et descendre 5 fois pour bien mélanger. Incuber 30 min à température ambiante.
- Après 30 min, lu fluorescence dans les échantillons toutes les 5-10 min à émission 530 nm à excitation/575 nm avec coupure automatique définie à 570 nm jusqu'à ce que le signal provenant d’échantillons d’algues se stabilise. 60 min d’incubation totale est généralement suffisante.
- Créer une courbe d’étalonnage pour les normes de l’huile végétale (de l’ordre de 0 à 40 ng/puits de pétrole).
Nota : Si placer un linéaire fonctionne bien pour basse (< 30 ng/puits) concentration de l’huile et un polynôme d’ajustement peuvent être utilisés si la norme est supérieur à 30 ng/puits. Cette corrélation permet de quantifier les lipides neutres dans les puits de l’échantillon.
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Representative Results
Cette procédure donne une évolution temporelle des données de densité optique algues à OD 550 nm (Figure 4 a). La densité optique et le poids sec concentration les données peuvent être corrélés (Figure 4 b). Ceci est accompli en premier calcul de la concentration d’algues poids sec final après l’étape de lyophilisation. Ensuite, la densité optique de la dilution en série culture (effectuée le dernier jour de l’échantillonnage) et les concentrations réelles de poids sec peut être corrélée. Pour des concentrations faibles cellule, une corrélation linéaire peut être utilisée que pour des concentrations plus élevées de cellule, une corrélation polynôme de second ordre peut être utilisée. Il est recommandé de créer une corrélation distincte pour chaque condition de culture. Enfin, la corrélation peut être appliquée aux données de densité optique cours temps afin d’obtenir une courbe de croissance de poids sec (Figure 4). Dans cette expérience de l’exemple, Auxenochlorella protothecoides (2341 UTEX25) ont été cultivés sous quatre conditions : cultures axéniques contrôle sur frais N8-NH4 moyenne21, en co-culture avec les bactéries Azospirillum brasilensedans un milieu additionné de 50 mg/L d’acide indole-3-acétique et dépensé en moyenne de a. A est connu pour produire l’acide indole 3-acétique, une croissance des plantes hormone, ce qui favorise également la croissance des microalgues. Toutefois, à 50 mg/L, le traitement de l’IAA complètement inhibé la croissance protothecoides a. . En conséquence, on disposait de données de densité optique, mais la quantité d’algues était insuffisante pour obtenir une concentration en poids sec précis. Dans ce cas, la corrélation pour la culture de contrôle peut être appliquée ou données de densité optique peuvent être déclarées directement. Parce que OD données ont été recueillies à la fois 550 nm et 680 nm absorbance, un dataset peut être utilisé pour la corrélation entre OD et poids sec. En général, OD 550 est utilisée car elle exclut presque complètement l’absorption de la chlorophylle26, supprimant ainsi les biais de modifications de la teneur en chlorophylle. En revanche, OD 680 inclut l’absorption de la chlorophylle et des rapports élevés de OD 680/550 indiquent la teneur en chlorophylle élevé dans les algues. La figure 4 montre un ensemble de douze des cultures d’algues qui poussent dans les photobioréacteurs colonne de bulles. Même avec seulement trois répétitions biologiques par traitement, écarts serrés ont été réalisés, permettant une forte sensibilité aux différences entre les traitements.
Figure 4. Croissance des algues se traduit par la bulle colonne photobioréacteurs. (A), la densité optique (550 nm) la courbe de croissance de protothecoides de Auxenochlorella (UTEX 2341) montre des cultures entrant dans le retard de croissance logarithmique à 120 heures. Cultures de contrôle ont été cultivées sur un milieu frais N8-NH4 , traitement 1 est co-cultures d’a. protothecoides et Azospirillum brasilense cultivé sur un milieu4 N8-NH frais, traitement 2 axéniques protothecoides a. cultivé sur N8-NH4 additionné de 50 mg/L d’acide indole-3-acétique (AIA) et le traitement 3 est axénique protothecoides a. cultivé sur milieu usé de a. Le milieu usé a été préparé par mise en culture a 96 heures sur N8-NH4 additionné de 2 g/L d’acide malique. Les cellules ont été supprimés et le milieu a été re-additionné d’ammonium pour restaurer son niveau initial, pH a été ajusté et le milieu était stérile filtrée (0,2 μm). Notez que le traitement de 50 mg/L IAA complètement inhibé la croissance des algues. (B) corrélation courbes entre OD 550 nm et concentration en poids sec final en utilisant un ajustement polynomial de deuxième ordre. Aucune corrélation n’est affichée pour le traitement 2 car aucune algues ne pourraient être récoltés à la fin de la période de culture. (C) Application de la corrélation polynomiale pour les données de densité optique donne une courbe de croissance avec la concentration de matière sèche sur l’axe y. La corrélation de la culture de contrôle a été appliquée aux données pour traitement 2 OD. Barres d’erreur sont réplique les déviations standard basées sur 3 biologique. (D) Photo de la bulle colonne photobioréacteurs peu de temps après l’inoculation de la culture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Données de lipides neutres sont affichées pour deux expériences d’exemple dans la Figure 5. Ce test s’est avéré bien corrélées avec teneur en lipides neutres, notamment des contenus de triacylglycérols (TAG). Ceci peut être vu en comparant le dosage des lipides neutres (Figure 5 a) sur une plaque de chromatographie sur couche mince correspondante (Figure 5 b). La même tendance est visible dans la deuxième expérience (Figure 5 et 5D). Dans toutes ces expériences, huile de canola a été utilisé comme un étalon et a donné lieu à une corrélation linéaire (R2 de 0,98 pour la première expérience et 0.99 pour la seconde) entre la fluorescence et la masse de l’huile de canola dans le puits. Notez que si tous les échantillons ont la teneur en lipides faible, ensuite le point culminant ou deux sur la norme peut être supprimé. Cette corrélation peut être utilisée pour calculer la quantité de lipides neutres (µg) dans chaque puits échantillon algues. Le bidon d’huile masse ensuite être converti en une concentration dans l’extrait lipidique appliquée à la microplaque bien. Cette valeur est multipliée par le facteur de dilution utilisé (par exemple, 3 x) pour obtenir la teneur en lipides neutres de l’original Folch extraits. Cette concentration est ensuite multipliée par le volume de l’extrait (devrait être proche de 4 mL) et ensuite divisée par la masse totale de biomasse d’algues utilisées pour l’extraction de lipides (soit près de 20 mg). Le résultat est la teneur en lipides neutres des microalgues.
La figure 5. Lipides neutres données obtenues à partir des cultures de Chlorella sorokiniana (UTEX 2714). Teneur en lipides neutres (A) (% en poids sec) pour les algues dans l’expérience 1 dans les algues ont été cultivées pendant 120 heures. La culture de contrôle était axéniques et cultivés sur des frais N8 moyen23, traitement 1 était une co-culture de c. sorokiniana et a sur un milieu frais N8, traitement 2 était fraîche N8 additionné à 50 mg/L IAA et traitement 3 ont été dépensé moyenne de a. Le milieu usé a été préparée par culture a 96 heures dans N8 additionné à 2 g/L d’acide malique, enlever les cellules, complétant les nitrates perdus, ajustement du pH et stériles, filtrant la (0,2 μm). Contrairement à a. protothecoides, 50 mg/L de l’AIA n’inhibent pas la croissance de c. sorokiniana . (B), TLC image de plaque pour l’expérience 1 montrant l’abondance relative TAG. Teneur en lipides neutres (C) (% en poids sec) pour les algues dans l’expérience 2, qui présentaient les mêmes traitements qu’expérimenter 1 mais les cellules ont été récoltées après 72 heures de la croissance. Image de plaque (D), TLC pour expérience montrant 2 abondance relative de TAG. Barres d’erreur sont réplique les déviations standard basées sur 3 biologique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
En outre, il est conseillé de calculer le coefficient de variation (écart type divisé par la moyenne) des lectures brutes de fluorescence à travers toutes les répétitions techniques dans le dosage des lipides neutres. En supposant que les répétitions techniques ont été réalisées dans la microplaque en quatre exemplaires, comme indiqué dans la procédure, le coefficient de variation typiquement ne doit pas dépasser 10 %. Coefficients de variation élevés sont généralement le résultat d’un mélange pauvre (particulièrement lors de l’ajout de l’alcool isopropylique) et l’utilisation potentiellement inexacte de la pipette multicanaux.
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Discussion
Le facteur le plus important lorsque la culture d’algues est une compréhension des besoins spécifiques de l’organisme ou groupe d’organismes. Les algues, système de culture décrite ici peut être utilisé pour un large éventail d’algues mais des facteurs abiotiques (température, médias, pH, intensité lumineuse, teneur en CO2 , taux d’aération) la culture doivent être ajustés aux besoins de l’organisme. Notez les paramètres décrits ici ont été utilisés pour la culture de la Chlorella et Auxenochlorella. Ces organismes sont d’intérêt industriel parce qu’ils sont tolérants à élevée en nutriments, la lumière et température niveau27. Cependant, niveaux d’éclairage peuvent être réduits grâce à la suppression des ampoules fluorescentes et le cycle jour/nuit peut être ajusté pour représenter la saisonnalité. De même, le chauffe-eau peut être tourné vers le haut ou vers le bas pour contrôle la température du bain de l’eau sur le système. Alors que le système décrit ici n’emploie pas un tel dispositif, il est possible de refroidir les bains-marie de réservoir de poissons sous la température ambiante grâce à un système de refroidissement de faible coût. Placer un seau d’eau dans un petit réfrigérateur et utiliser une vitesse variable pompe pour pomper l’eau dans le seau d’eau froide dans le réservoir de poissons et de retour. Plus vite le taux de pompage, deviendra le plus froid le réservoir réservoir de poissons.
Bien que le système de culture d’algues offre généralement des résultats cohérents, il y a quelques mises en garde importantes qui devraient être considérés. Le premier est l’eau siphon qui se produit dans l’éventualité que le système d’aération subit une perte soudaine de pression (par exemple, un raccord sauté ou une panne de compresseur d’air). La pression qui se trouve dans les humidificateurs poussera eau de l’humidificateur en arrière par l’intermédiaire de la tubulure, notamment par le biais de la rotamètre. Installation d’un piège en amont ou le disconnecteur peut aider. Notez que siphon n’affectera pas les bioréacteurs eux-mêmes parce qu’ils fonctionnent à la pression atmosphérique. Inspection de routine de la tuyauterie et les raccords peut aider à pallier les défaillances du système. Une autre considération importante est d’inspecter régulièrement et de remplacer les filtres à air et de clapets sur les bioréacteurs. N’oubliez pas de suivre les recommandations du fabricant pour le nombre de cycles d’autoclavage admissibles. Cela est particulièrement important si l’entretien des cultures axéniques est essentielle à l’expérience. Enfin, il est recommandé d’acheter ou de construire une grille autoclavable pour la sécurité du transport des bioréacteurs entre les bains-marie, autoclave et prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Une grille en acier inoxydable peut servir à cette fin.
Le système de bioréacteur décrit ici présente plusieurs limites. Une limitation clée est la nécessité de traiter les réacteurs dans une armoire de sécurité biologique en utilisant une technique stérile. Les réacteurs n’ont pas un orifice d’échantillonnage anti-siphonnage, obligeant l’utilisateur à déplacer le réacteur d’une biosécurité armoire à échantillon sans contaminer la culture. Les réacteurs nécessitent également une lecture pH manuel et réglage qui introduit le risque d’erreur humaine.
Le système de bioréacteur décrit ici comble un créneau entre culture flacon simple et entièrement contrôlé par les bioréacteurs. Le système de bioréacteur a été développé en réponse à un besoin pour des résultats plus uniformes que sont réalisables à l’aide de bouteilles. Les données montrent que ce système génère des résultats de croissance constante lorsqu’il est utilisé correctement. Notez que gazeuses bouteilles étaient employées dans la procédure pour la culture du stock des algues, mais cela a été fait uniquement pour produire des inoculum pour l’expérience. Ceci est acceptable parce que les flacons ont été regroupées pour l’inoculation et la variabilité des réacteurs n’est donc pas un problème.
Comme de nombreux chercheurs d’algues sont intéressés par la surveillance de la croissance et la teneur en lipides neutres, nous avons inclus notre façon de mesurer ces deux paramètres ici. L’utilisation de la densité optique pour mesurer la croissance est une pratique courante et est inégalée dans sa simplicité. Cependant, les corrélations entre le poids sec et de la densité optique changent au fil du temps et dépendent des conditions de culture. Il est recommandé de produire une équation de corrélation pour chaque traitement expérimental au sein de chaque lot expérimental. Cela n’est possible dans la procédure proposée car gel séché algues seront obtenues après chaque expérience de la culture. Une hypothèse critique de l’approche de la densité optique est que la corrélation entre la densité optique et poids sec détient constante au cours de la croissance du lot. Tant que les déviations de cette hypothèse sont petites, le résultat sera raisonnablement précis. La précision relative peut être évaluée en comparant la concentration de poids sec des algues calculé au temps zéro. En supposant que les cultures sont bien mélangés et pipetage était exacte, que toutes les cultures devraient avoir la même densité d’inoculation initiale. L’approche de la densité optique aussi peut être contestée que lorsque l’absorbance de fond du milieu est élevé (c'est-à-dire, lorsque vous travaillez avec certaines eaux usées). Soustraction de l’absorbance moyenne (avant l’inoculation) de chaque lecture OD peut aider avec cette question.
Extraction des lipides de l’algue sèche suit bien établie Folch approche21,24; Cependant, il y a des considérations importantes. Espèces d’algues différentes ont différentes parois cellulaires avec des degrés de dureté. Les perles de zircone/silice utilisées ici sont pointues et sont conçus pour percer fort, polysaccharide des parois cellulaires. Un type de perle plus doux (par exemple, verre) ou moins perle interruption de cycles peuvent être utilisés sur les algues avec des parois cellulaires plus faibles. Toutefois, une règle de base est que le culot cellulaire obtenue après extraction devrait être libre de pigment, ce qui indique que tous les chlorophylle a été extrait. Une des sources plus courantes d’échec lors de l’étape d’extraction de lipides se produit en raison d’une mauvaise lyophilisation. Si l’échantillon fait fondre le gel sèche avant qu’il soit entièrement sec, le résultat sera une boulette cireuse, sombre et très dure. C’est le résultat de cellules lysées dans les conditions de vide du gel sèche. Le plomb peut être pesé pour obtenir un poids sec, mais il ne peut pas servir pour l’extraction des lipides comme les particules de cireuses ne pas se décomposent dans le Folch solvants. Pour vous assurer que lyophilisation toujours rendements doux et poudreux échantillons, il est essentiel pour geler tous les échantillons à-80 ° C et les transférer rapidement le gel sèche. En outre, à l’aide de parafilm (avec un trou fourré dedans) plutôt que desserré tube couvercles veillera à ce que l’humidité peut être continuellement retirée de l’échantillon avant le dégel.
Le test de lipides neutres décrit dans cette procédure a été publié précédemment et traite des dosages de lipides alternatif22. Cependant, certaines améliorations importantes ont été apportées à cette procédure depuis la publication. Plus particulièrement, la concentration de solution rouge du Nil est passée de 0,5 µg/mL à 1 µg/mL. L’effet de ce changement était plus grande intensité de signal, répétabilité améliorée et une élimination du signal baisse au fil du temps au cours de la période d’incubation. Les résultats montrent que le test se compare bien aux résultats de la chromatographie sur couche mince qualitative. Ce test a été développé et validé à l’aide de diverses espèces de Chlorella et Auxenochlorella donc son applicabilité à l’espèce de composition différente n’a pas été déterminée. Tout le colorant vert devrait être complètement retiré de l’essai au cours de l’incubation de l’eau de Javel, conduisant à des échantillons qui sont d’un jaune clair ou très pâle. Notez également que les extraits lipidiques qui sont généralement des dégradés (comme indiqué par un changement du vert au brun couleur) ne parviennent pas à fournir des résultats précis dans ce test. Il est donc impératif de conserver les échantillons de lipides à n° supérieure à-20 ° C dans l’obscurité.
Les méthodes présentées ici pour la culture des algues, mesurer la croissance et de quantifier les lipides neutres sont utiles pour une variété d’applications d’ingénierie des algues, mais conviennent particulièrement pour la recherche sur la production de biocarburants. Ces méthodes sont également utilisés pour étudier l’inhibition de la croissance algale sur les eaux usées28 ainsi que les impacts de l’interaction d’organisme sur la croissance et la composition des microalgues.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Dans cette recherche, a appuyé par USDA National Institute of Food, Agriculture Hatch projet ALA0HIGGINS et les bureaux de l’Université Auburn de la prévôté, vice-président pour la recherche et le Samuel Ginn College of Engineering. A également appuyé par la NSF accorder CBET-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
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