Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

बुलबुला कॉलम Photobioreactors में ग्रीन सूक्ष्म शैवाल की खेती और तटस्थ लिपिड के लिए एक परख

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/59106
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biosystems Engineering, Auburn University

Summary

यहाँ, हम प्रयोगशाला पैमाने बुलबुला स्तंभ photobioreactors का निर्माण और उन्हें संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । यह भी संस्कृति विकास दर और तटस्थ लिपिड सामग्री के निर्धारण के लिए एक विधि प्रदान करता है ।

Abstract

ऐसे जैव ईंधन, उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन के रूप में इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए सूक्ष्म शैवाल के अध्ययन में महत्वपूर्ण रुचि है, और अपशिष्ट पदार्थों के उपचार के लिए । के रूप में सबसे नए अनुसंधान के प्रयास प्रयोगशाला पैमाने पर शुरू, वहां एक reproducible तरीके से संवर्धन सूक्ष्म शैवाल के लिए लागत प्रभावी तरीकों के लिए एक की जरूरत है । यहां, हम प्रयोगशाला में संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण पैमाने photobioreactors संवाद, और उस शैवाल के विकास और तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए । निर्देश भी photobioreactor प्रणाली स्थापित करने के लिए कैसे पर शामिल किए गए हैं । उदाहरण के जीवों Chlorella और Auxenochlorellaकी प्रजातियों रहे हैं, इस प्रणाली को गैर-शैवाल प्रजातियों के साथ शैवाल की सह संस्कृतियों सहित, सूक्ष्म शैवाल की एक विस्तृत श्रृंखला खेती करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । स्टॉक संस्कृतियों पहले बोतलों में हो रहे है photobioreactor प्रणाली के लिए इनोक्युलम का उत्पादन । शैवाल इनोक्युलम केंद्रित है और बैच मोड में खेती के लिए photobioreactors को हस्तांतरित । नमूने ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के लिए दैनिक एकत्र कर रहे हैं । बैच संस्कृति के अंत में, कोशिकाओं को केंद्रापसारक द्वारा काटा जाता है, धोया, और स्थिर करने के लिए एक अंतिम शुष्क वजन एकाग्रता प्राप्त सूख । अंतिम शुष्क वजन एकाग्रता के लिए ऑप्टिकल घनत्व और शुष्क वजन एकाग्रता के बीच एक संबंध बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक संशोधित Folch विधि बाद में फ्रीज से कुल लिपिड निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है-सूखे बायोमास और निकालने अपने तटस्थ लिपिड एक microplate परख का उपयोग कर सामग्री के लिए परख है । इस परख पहले प्रकाशित किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल कदम यहां शामिल करने के लिए प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम जहां त्रुटियां अक्सर हो प्रकाश डाला गया । प्रतिक्रिया प्रणाली यहां वर्णित सरल कुप्पी खेती और पूरी तरह से नियंत्रित वाणिज्यिक विरोधी के बीच एक आला भरता है । यहां तक कि उपचार के प्रति केवल 3-4 जैविक प्रतिकृति के साथ, संवर्धन शैवाल के लिए हमारे दृष्टिकोण विकास और लिपिड परख में तंग मानक विचलन की ओर जाता है ।

Introduction

इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी में सूक्ष्म शैवाल के आवेदन हाल के वर्षों में बहुत रुचि को आकर्षित किया है । सूक्ष्म शैवाल अपशिष्ट जल उपचार में उपयोग के लिए अध्ययन किया जा रहा है1,2,3,4, जैव ईंधन उत्पादन5,6,7,8, और न्यूट्रास्यूटिकल्स और अंय उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन9,10। शैवाल भी आनुवंशिक रूप से एक विशिष्ट इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए अपनी फिटनेस में सुधार करने के प्रयास में अधिक से अधिक दरों पर संशोधित किया जा रहा है11,12। नतीजतन, नियंत्रित सेटिंग्स में औद्योगिक रूप से प्रासंगिक जीवों के साथ प्रयोग में बहुत रुचि है । इस विधि का उद्देश्य एक नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण में संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण संवाद करने के लिए, और उस शैवाल के विकास और तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए है । विकास दर में सुधार और सूक्ष्म शैवाल के तटस्थ लिपिड सामग्री13मनोरथ जैव ईंधन के व्यावसायीकरण की ओर दो प्रमुख अड़चनों के रूप में पहचान की गई है ।

दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रायोगिक प्रयोजनों के लिए संस्कृति शैवाल के लिए इस्तेमाल किया गया है । सामांय में, इन तरीकों को बड़े पैमाने पर बाहरी खेती और छोटे पैमाने पर इनडोर खेती के बीच विभाजित किया जा सकता है । photobioreactors और खुले तालाबों में बाहरी खेती प्रक्रियाओं है कि पहले से ही प्रयोगशाला पैमाने पर सिद्ध किया गया है स्केलिंग के उद्देश्य से प्रयोग के लिए उपयुक्त है (जैसे, पैमाने पर परीक्षण के लिए एक नए उच्च-शैवाल के लिपिड तनाव के ऊपर)14। हालांकि, इनडोर छोटे पैमाने पर खेती के लिए उपयुक्त है जब विकासशील नए या बेहतर शैवाल उपभेदों या जैविक तंत्र को समझने के उद्देश्य से प्रयोग प्रदर्शन । इन उत्तरार्द्ध मामलों में, प्रयोगात्मक नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के लिए बाहर जैविक व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन चिढ़ाने की आवश्यकता है । कि अंत करने के लिए, axenic संस्कृतियों अक्सर जटिल बायोटिक अंय जीवों (जैसे बैक्टीरिया, अंय शैवाल) है कि अनिवार्य रूप से बड़े पैमाने पर आउटडोर प्रणालियों में विकसित करने के साथ जुड़े कारकों को कम करने के लिए आवश्यक हैं । यहां तक कि जब शैवाल और अंय जीवों के बीच बातचीत का अध्ययन, हमने पाया है कि अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग उपयोगी है जब जीवों के बीच आणविक विनिमय की जांच15,16,17।

छोटे पैमाने पर इनडोर शैवाल की खेती की श्रेणी के भीतर, दृष्टिकोण की एक सीमा का इस्तेमाल किया गया है । शायद सबसे आम दृष्टिकोण एक प्रकाश बैंक के नीचे एक शेखर मेज पर Erlenmeyer कुप्पी में शैवाल विकसित करने के लिए है18,19। ऑक्सीजन और2 सह के आदान प्रदान की कुप्पी के शीर्ष में एक फोम प्लग के माध्यम से निष्क्रिय प्रसार द्वारा जगह लेता है । कुछ शोधकर्ताओं ने इस सेट-अप की कुप्पी20के सक्रिय वातन के माध्यम से सुधार किया है । एक और दृष्टिकोण को बोतलों में शैवाल की खेती, बार और सक्रिय वातन हलचल द्वारा मिश्रित है । अपनी सादगी के बावजूद, हमने पाया है कि कुप्पी और बोतलों का उपयोग अक्सर जैविक प्रतिकृति के बीच असंगत परिणाम की ओर जाता है । संभवतः इस स्थिति के प्रभाव की वजह से है-विभिंन पदों प्रकाश, जो भी आंतरिक रिएक्टर तापमान को प्रभावित के विभिंन मात्रा में प्राप्त करते हैं । नए पदों के लिए रिएक्टरों के दैनिक रोटेशन में मदद कर सकते हैं, लेकिन इस समस्या को कम नहीं है क्योंकि शैवाल विकास के कुछ चरणों (जैसे, जल्दी घातीय) दूसरों की तुलना में स्थिति प्रभाव के लिए और अधिक संवेदनशील होते हैं (उदा., लॉग चरण) ।

तकनीकी परिष्कार के स्पेक्ट्रम के विपरीत पक्ष पर पूरी तरह से नियंत्रित वाणिज्यिक photobioreactors हैं । इन प्रणालियों लगातार निगरानी और रिएक्टर में शर्तों को समायोजित करने के लिए शैवाल विकास का अनुकूलन । वे प्रोग्राम प्रकाश व्यवस्था, वास्तविक समय तापमान नियंत्रण, और पीएच नियंत्रण है । दुर्भाग्य से, वे महंगे है और आम तौर पर रिएक्टर प्रति कई हजार डॉलर की लागत । अधिकांश वैज्ञानिक और इंजीनियरिंग पत्रिकाओं में परिणामों की जैविक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है, अनेक necessitating की खरीद की जाती है । हम यहां एक बुलबुला कॉलम रिएक्टर प्रणाली है कि पुल सरल (कुप्पी) और परिष्कृत (पूरी तरह से नियंत्रित-प्रतिक्रिया) प्रयोगशाला पैमाने पर शैवाल की खेती के लिए दृष्टिकोण के बीच विभाजित । बुलबुला स्तंभों गैस विनिमय की सुविधा के लिए बढ़ती गैस बुलबुले का उपयोग करें और रिएक्टर मिश्रण । इस दृष्टिकोण प्रकाश और तापमान पर नियंत्रण के कुछ डिग्री प्रदान करता है, लेकिन एक तरीका है कि लागत प्रभावी है में ऐसा करता है । इसके अलावा, हम इस प्रणाली के लिए जैविक प्रतिकृति के बीच अत्यधिक सुसंगत परिणाम उपज पाया है, जैविक की आवश्यकता की संख्या को कम करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए जब कुप्पी या बोतल दृष्टिकोण की तुलना में आवश्यक प्रतिकृतियां । हम भी सफलतापूर्वक शैवाल और बैक्टीरिया21के मिश्रण की खेती के लिए इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है । शैवाल की खेती के अलावा, हम संस्कृतिपूर्ण शैवाल में तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए एक प्रक्रिया रूपरेखा । बाद विधि22कहीं प्रकाशित किया गया है, लेकिन हम प्रक्रिया यहां शामिल करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करने के लिए कैसे इसे सफलतापूर्वक रोजगार के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. बबल कॉलम Photobioreactors का सेटअप

  1. प्लास्टिक के ढक्कन है कि 1 एल कांच की बोतलें और संकरण ट्यूबों के साथ आया था से निकाले गए ढक्कन का एक सेट का निर्माण (योजनाबद्ध और तस्वीरों के लिए 1 चित्रा देखें) । humidifier, मिश्रण जाल, प्रत्येक हवा लिफ्ट photobioreactor, और प्रत्येक बोतल रिएक्टर के लिए ढक्कन का निर्माण ।
    1. ड्रिल ¼ "ढक्कन में छेद: 2 छेद और humidifier पलकों के लिए आवश्यक हैं; 3 छेद मिश्रण जाल के लिए आवश्यक हैं ।
    2. पर्ची एक ¼ "O-एक 1/8" पैनल के धागे पर अंगूठी Luer फिटिंग माउंट, और ¼ में यह स्लाइड "ढक्कन में drilled छेद (1a आंकड़ा) ।
    3. पर्ची एक दूसरे ¼ "ओ-धागे पर अंगूठी इतना है कि ढक्कन दो ओ के बीच सैंडविच-छल्ले है । धागे पर एक locknut पर्ची और जगह में पैनल माउंट Luer को ठीक करने के लिए कस ।
    4. ढक्कन से पेश उजागर पुरुष Luer पर ताला बजता स्नैप । दोहराएँ कदम 1.1.2-1.1.4 ढक्कन में प्रत्येक छेद के लिए.
    5. ढक्कन है कि बुलबुला कॉलम और बोतल रिएक्टरों पर इस्तेमाल किया जाएगा के लिए, 1/8 "महिला Luer कंटिया फिटिंग करने के लिए १.५" 1/8 के टुकड़े "आईडी पीवीसी टयूबिंग । ढक्कन पर उजागर पुरुष Luer फिटिंग में से प्रत्येक के लिए इन देते हैं ।
    6. एक जांच वाल्व कनेक्ट (ढक्कन से दूर ओर इशारा करते हुए) 1/8 "टुकड़ों में से एक के मुक्त अंत करने के लिए ।
      नोट: इस प्रतिक्रिया के लिए निकास बंदरगाह के रूप में काम करेंगे ।
    7. 1/8 के दूसरे टुकड़े को कंटिया फिटिंग के लिए एक पुरुष Luer कनेक्ट "ढक्कन से पेश टयूबिंग । जगह में घूर्णन ताला अंगूठी क्लिक करें और इस के लिए एक ०.२ mm हवा फिल्टर जकड़ना ।
      नोट: यह रिएक्टर के लिए प्रवेश बंदरगाह के रूप में सेवा करेंगे ।

Figure 1
चित्र 1. योजनाबद्ध और प्रतिक्रिया के निर्माण के लिए तस्वीरें । (क) एकयोजनाबद्ध प्रतिक्रिया के निर्माण के लिए (ख) के लिए इकट्ठे हुए प्रतिक्रिया ढक्कन के फोटो, और (ग) humidifier के लिए इस्तेमाल किया ढक्कन इकट्ठा की तस्वीर । ध्यान रखें कि humidifier फिटिंग को ढक्कन के साथ एक वाटरप्रूफ सील सुनिश्चित करने के लिए वाटर प्रूफ सिलिकॉन में लेपित किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. हवा वितरण प्रणाली को इकट्ठा (एक योजनाबद्ध और तस्वीर के लिए चित्रा 2a और बी एक देखें) ।
    1. एक कन्ट्रोलर की पीठ पर लेट्स एंड आउटलेट्स को कंटिया फिटिंग करने के लिए 1/8 "एनपीटी थ्रेड संलग्न करें ।
      नोट: 200-2500 cm3लैंडलाइंस rotameters हवा के दबाव मॉडुलन के लिए कर रहे हैं humidifier के ऊपर, 100-1000 सेमी3लैंडलाइंस rotameters बोतल रिएक्टरों के लिए कर रहे हैं, 50-500 सेमी3लैंडलाइंस rotameters एयर लिफ्ट के लिए कर रहे हैं, और 5-50 सेमी3/ मिन rotemeters सह2 प्रवाह विनियमन के लिए कर रहे हैं । यह एक निश्चित सतह (जैसे प्लास्टिक शीट) को माउंट rotameters की सिफारिश की है ताकि वे आपरेशन के दौरान गिर नहीं है ।
    2. संकुचित हवा स्रोत बंद है, तो एक नली दबाना के साथ संकुचित वायु स्रोत के लिए ¼ "आईडी लचीला पीवीसी टयूबिंग कनेक्ट । 1/8 के लिए नली व्यास नीचे चरण "आईडी पीवीसी लचीला एक ¼ का उपयोग कर टयूबिंग" कंटिया फिटिंग के लिए महिला "और एक 1/8 कंटिया फिटिंग के लिए पुरुष" ।
    3. 1/8 के मुक्त अंत कनेक्ट "एक 200 के प्रवेश के लिए आईडी टयूबिंग-2500 cm3लैंडलाइंस कन्ट्रोलर ।
      नोट: इस कन्ट्रोलर के आउटलेट 1/8 "आईडी टयूबिंग के माध्यम से humidifier बोतल फ़ीड जाएगा ।
    4. कनेक्ट 1/8 "एक वेंट ढक्कन के लिए एक प्रवेश के लिए टयूबिंग (कंटिया फिटिंग के लिए एक महिला Luer का उपयोग करने के लिए कनेक्शन बनाने के लिए) । तब पैनल के अंदर के लिए 1/8 "टयूबिंग के एक दूसरे टुकड़ा कनेक्ट फिटिंग माउंट ।
      नोट: यह टुकड़ा नीचे पानी के माध्यम से humidifier और बुलबुला हवा में लटका होगा ।
    5. 1/8 संलग्न "महिला Luer कंटिया फिटिंग करने के लिए 1/8 के एक टुकड़े के प्रत्येक अंत आईडी टयूबिंग और इस टुकड़े का उपयोग करने के लिए मिश्रण जाल के प्रवेश के लिए humidifier के आउटलेट कनेक्ट ।
    6. 1.2.5 के रूप में एक ही तरीके से, मिश्रण जाल पर एक दूसरे बंदरगाह के लिए सह2 नियामक के आउटलेट से कनेक्ट ।
    7. निर्माण 1/8 "टयूबिंग और 1/8" मल्टीपोर्ट कंटिया का उपयोग कई गुना ( चित्रा 2cदेखें) कन्ट्रोलर बैंकों में हवा खिलाने के लिए ।
      नोट: इन rotameters का उपयोग, प्रतिप्रतिक्रियाओं की आपूर्ति के लिए किया जाएगा । श्रृंखला में 6 से अधिक rotameters के निर्माण से बचें । इसके बजाय, rotameters के समानांतर बैंकों का उपयोग करने के लिए प्रणाली का विस्तार । सुनिश्चित करें कि सभी रिएक्टरों के लिए कुल प्रवाह की मांग से कम है २,५०० cm3लैंडलाइंस (या किसी और एक बड़ा कन्ट्रोलर humidifier के ऊपर की आवश्यकता होगी) ।
    8. 1/8 "टयूबिंग और एक 1/8" कंटिया Luer के लिए महिला का उपयोग नव निर्माण कन्ट्रोलर बैंकों को मिश्रण जाल के आउटलेट (3rd बंदरगाह) कनेक्ट ।
    9. कन्ट्रोलर बैंक में प्रत्येक कन्ट्रोलर के आउटलेट के लिए पर्याप्त लंबी 1/8 "ट्यूबिंग कनेक्ट करने के लिए प्रतिक्रिया करने वालों को हवा की आपूर्ति । टयूबिंग के सिरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैंक में rotameters लेबल ।
    10. humidifier पर सभी बंदरगाहों के आसपास पानी प्रूफ सिलिकॉन लागू करें और वे हवा तंग कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए जाल ढक्कन मिश्रण.

Figure 2
चित्र 2. योजनाबद्ध और बुलबुला कॉलम प्रणाली कोडांतरण के लिए तस्वीरें । (क) वातन प्रणाली की योजनाबद्ध (ख) humidifier की तस्वीर, मिश्रण जाल, और कन्ट्रोलर बैंक, और (ग) कन्ट्रोलर बैंकों को एक साथ जोड़ने के लिए इस्तेमाल manifolds की तस्वीर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. मछली टैंक सेट, प्लेटें हलचल, और रोशनी (चित्रा 3) ।
    चेतावनी: इस प्रणाली के आउटलेट और पर्याप्त सर्किट क्षमता की एक बड़ी संख्या में सभी घटकों का समर्थन करने की आवश्यकता है । एक साथ कई शक्ति स्ट्रिप्स और एक डेज़ी-श्रृंखला फैशन में विस्तार डोरियों क्योंकि यह एक बिजली के खतरे है तार से बचें । GFI प्रकार के आउटलेट और शक्ति स्ट्रिप्स का उपयोग अत्यधिक प्रणाली में पानी की उपस्थिति के कारण प्रोत्साहित किया जाता है ।
    1. एक स्तर की सतह पर कम प्रोफ़ाइल चुंबकीय सरगर्मियों की व्यवस्था है कि काफी मजबूत करने के लिए पानी से भरा मछली टैंक का वजन पकड़ है ।
    2. जगह छोटे लकड़ी या प्लास्टिक ब्लॉकों (है कि थोड़े से लंबे है प्लेटें हलचल की परिधि के आसपास) के लिए मछली टैंक के वजन का समर्थन करते हैं ।
      चेतावनी: वजन उंहें कुचल जाएगा के रूप में हलचल प्लेटों पर सीधे मछली टैंक रखने से बचें ।
    3. हलचल प्लेटों और समर्थन ब्लॉकों पर मछली टैंक प्लेस और पानी के साथ टैंकों को भरने ।
    4. एक कड़ी प्लास्टिक शीट के एक टुकड़े में कटौती के लिए एक ढक्कन के रूप में मछली के टैंक के शीर्ष पर फिट । में और बाहर संकरण ट्यूबों स्लाइड करने के लिए इस कवर में छेद में कटौती । इसके अलावा मछली के टैंक हीटर के लिए एक छेद में कटौती ।
    5. के लिए मछली टैंक के बगल में फ्लोरोसेंट प्रकाश बैंकों की व्यवस्था करने के लिए के क्षैतिज रोशनी प्रदान करने के लिए । एक प्रकाश टाइमर में प्रकाश बैंक प्लग करने के लिए एक दिन/

Figure 3
चित्र 3. बोतल (बाएं) और बुलबुला कॉलम photobioreactors (दाएं) के लिए प्रणाली योजनाबद्ध। यह आंकड़ा हिगिंस एट अल से संशोधित किया गया है । 17. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. सूक्ष्म शैवाल इनोक्युलम की तैयारी

  1. एक क्रायो-संरक्षित, मढ़वाया, या तरल संस्कृति से सूक्ष्म शैवाल इनोक्युलम प्राप्त करें ।
    नोट: यह अनुशंसित है कि cryopreserved जीवों इनोक्युलम के रूप में उपयोग करने से पहले चढ़ाया जा करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं और व्यवहार्य है कि परिणामी संस्कृति axenic है । आगर मध्यम (उदा., ATCC #5 sporulating आगार)21 एक समृद्ध माध्यम है जो क्रायो-स्टोरेज से Chlorella और Auxenochlorella की प्रजातियों को पुनर्जीवित करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है ।
  2. खनिज माध्यम के २.४ एल तैयार करें जो कि विशेष सूक्ष्म शैवाल प्रजातियों के लिए उपयुक्त है ।
    नोट: उदाहरण Chlorellaकी प्रजातियों के लिए N8 मध्यम23 , N8- Auxenochlorellaकी प्रजातियों के लिए एनएच4 मध्यम21 शामिल हैं । एक शैवाल तनाव के लिए उपयुक्त माध्यम का उपयोग मजबूत शैवाल वृद्धि सुनिश्चित करने की ओर सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है ।
  3. Aliquot २.४ खनिज मध्यम के एल समान रूप से तीन 1 एल कांच की बोतलों में, प्रत्येक बोतल के लिए सलाखों हलचल जोड़ने के लिए और प्रत्येक बोतल के लिए निकाले गए ढक्कन (चित्रा 1) इकट्ठा । डबल की जांच करें कि वातन ट्यूब प्रवेश पक्ष पर है और प्रत्येक बोतल में एक बार हलचल है ।
  4. आटोक्लेव एक तरल नसबंदी चक्र (१२१ डिग्री सेल्सियस) के लिए 30 min. आटोक्लेव १०० मिलीलीटर पानी (डीएच2O) और एक ही समय में कुछ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर, जो बाद में चढ़ाना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के लिए शेयर बोतलों का प्रयोग करें । मध्यम को रात भर ठंडा करने की अनुमति दें । वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान के लिए रिएक्टर ठंडा और फिर टीका करने के लिए पहले 2 ज के लिए aerate ।
  5. एक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में, inoculate एक प्लेट या axenic तरल संस्कृति से शेयर बोतलों में सूक्ष्म शैवाल । निम्न चरणों में axenic संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग करें ।
    1. एक बाँझ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए autoclaved डीएच2ओ के 20 मिलीलीटर जोड़ें । २.१ कदम से प्लेट से कई एकल कालोनियों लेने के लिए एक बाँझ 10 µ एल डिस्पोजेबल पाश का उपयोग करें. ५० मिलीलीटर ट्यूब में पाश डुबकी और autoclaved डीएच2ओ के 20 मिलीलीटर में शैवाल कोशिकाओं को धो लो ५० मिलीलीटर ट्यूब एक समरूप सूक्ष्म शैवाल समाधान बनाने के लिए ।
    2. पिपेट एक 10 मिलीलीटर बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ प्रत्येक शेयर बोतल में सूक्ष्म शैवाल समाधान के 6 मिलीलीटर । भंवर में समान रूप से मध्यम में सूक्ष्म शैवाल मिश्रण करने के लिए बोतल ।
  6. एक 2 मिलीलीटर बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें प्रत्येक शेयर बोतल से 1 मिलीलीटर नमूने आकर्षित और बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरण ।
    नोट: Micropipettes संक्रमण के जोखिम के कारण इस चरण के लिए अनुशंसित नहीं हैं । शेयर बोतलों पर वेंट ढक्कन कस ।
  7. प्लेटों हलचल (~ १५० rpm) पर शेयर बोतलों प्लेस और वायु प्रवाह दर,2CO समायोजित करें, और प्रजातियों के लिए उपयुक्त के रूप में प्रकाश का स्तर । हर दिन शेयर बोतल की स्थिति घुमाएँ ।
  8. पतला 1 मिलीलीटर २.६ कदम के दौरान प्राप्त नमूनों (१००-बाँझ पानी में कमजोर पड़ने गुना आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है) और एक अमीर आगर मध्यम पर प्लेट फैल गया ।
    नोट: इन प्लेटों को संक्रमण के उदाहरणों के लिए जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आगे प्रयोगों के लिए भविष्य शैवाल इनोक्युलम के एक स्रोत के रूप में सेवा इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  9. सूक्ष्म शैवाल ग्रोथ की जांच के लिए हर दो दिन में बोतलों से नमूने ले (बीएससी में) ।
    एक ९६-अच्छी तरह से microplate में तपसिल (२०० µ एल) में नमूने प्लेस और मापने ऑप्टिकल घनत्व ५५० एनएम और ६८० एनएम में हर दो दिनों तक आयुध डिपो 0.2-0.3 (जो आम तौर पर 5-7 दिन की आवश्यकता है) तक पहुंचता है ।
  10. बंद करो और 24-48 ज के लिए एक बेंच पर शेयर बोतलों जगह शैवाल कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति है ।
    नोट: inoculate बबल कॉलम photobioreactors के बगल में बसे कक्षों का उपयोग किया जाएगा. यदि अधिक तीव्र कक्ष संग्रह वांछित है, तो कक्षों को संग्रहीत करने के लिए कक्षों को १,००० से अधिक x g पर केंद्रापसारक किया जा सकता है ।

3. बबल कॉलम Photobioreactors में सूक्ष्म शैवाल की खेती

  1. दिन पहले प्रतिक्रिया टीका, उपयुक्त मीडिया तैयार करने और २०० मिलीलीटर (या वांछित मात्रा) स्थानांतरित करने के लिए बुलबुला कॉलम photobioreactor ट्यूबों (संकरण ट्यूबों) । मीडिया के साथ आटोक्लेव ट्यूबों और जगह में ढक्कन वेंट ।
    नोट: अगर एक विकास माध्यम के रूप में अपशिष्ट जल का उपयोग कर, खाली प्रतिक्रिया आटोक्लेव और बाँझ-फ़िल्टर्ड अपशिष्ट जल जोड़ें (यदि axenic संस्कृति वांछित है) ।
  2. एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर supernatant को दूर करके बसे सूक्ष्म शैवाल शेयर ध्यान लगाओ । प्रत्येक बोतल में मध्यम से कम १०० मिलीलीटर छोड़ दें, लेकिन बसे शैवाल हटाने से बचें ।
    नोट: एक बीएससी के अंदर इस प्रक्रिया का संचालन और बाँझ तकनीक का पालन करें । एक साधारण वैक्यूम तंत्र या तो एक वैक्यूम कुप्पी या बोतल का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है । ट्यूबिंग के अंत पर एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट फिट.
  3. निलंबित और शैवाल घोल हस्तांतरण करने के लिए बाँझ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों । 5 मिनट के लिए १,००० x जी में केंद्रापसारक आगे शैवाल ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
  4. बीएससी में, पर्याप्त supernatant को दूर करने के लिए कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए ~ ८० मिलीलीटर शैवाल की 12 photobioreacters के लिए ध्यान केंद्रित । बाहर गोली वैक्यूम करने से बचें । एक बाँझ कंटेनर (या प्रयुक्त शैवाल स्टॉक बोतल) के लिए शैवाल ध्यान स्थानांतरण ।
  5. एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ प्रत्येक photobioreactor में शैवाल घोल के 6 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. बाँझ फ़िल्टर (०.२ mm सिरिंज या वैक्यूम फ़िल्टर) और किसी भी अन्य यौगिकों (जैसे विटामिन स्टॉक) जो autoclaved नहीं किया जा सकता की उचित मात्रा में जोड़ें.
  7. भंवर मध्यम में शैवाल मिश्रण करने के लिए प्रतिक्रिया ।
  8. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक प्रतिक्रिया से एक 2 मिलीलीटर नमूना ड्रा और एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण । संस्कृति प्रगति पर नजर रखने के लिए एक 2 मिलीलीटर नमूना (एक बीएससी में) हर 24 एच लीजिए । परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करके पीएच के लिए नमूने की जाँच करें और या तो 3 एम NaOH या 3 एम एचसीएल के साथ जरूरत के रूप में रिएक्टर समायोजित.
  9. एक प्रतिक्रियाकर्ता ढक्कन कस और मछली टैंक पानी स्नान में सभी प्रतिप्रतिक्रियाओं जगह है । वातन, CO2, और प्रजातियों के लिए उचित स्तर पर प्रकाश व्यवस्था को समायोजित करें । नमूना (चरण ३.८) के बाद प्रत्येक दिन के लिए प्रतिप्रतिक्रियाकर्ता स्थिति घुमाएं ।
  10. एक ९६ अच्छी तरह से microplate के कुओं के लिए तपसिल में प्रत्येक संस्कृति के नमूने के २०० µ एल लागू करें । ५५० एनएम और ६८० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने ।
    1. संस्कृति अवधि के अंतिम दिन पर, अलग कमजोर पड़ने कारकों (जैसे, एक 1x, 2x, 4x, 8 x, 16x और 32x) के तहत आयुध डिपो और फसल के बाद वास्तविक शुष्क वजन (चरण 4) के बीच एक संबंध स्थापित करने के लिए ।
  11. 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर 2 मिलीलीटर नमूना ट्यूब केंद्रापसारक ।
  12. ०.२ µm गैर बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से supernatant फ़िल्टर और स्टोर supernatant (और गोली यदि आवश्यक हो तो) लंबी अवधि के भंडारण के लिए कोई अधिक से अधिक-20 डिग्री सेल्सियस और बाद में मीडिया संरचना में परिवर्तन का विश्लेषण.

4. फसल और Microalgal बायोमास के सुखाने फ्रीज

  1. एक एेसे सिलेंडर के साथ एक से अधिक शैवाल संस्कृति के एक निश्चित मात्रा को मापने (उदाहरण के लिए, १६० मिलीलीटर से एक प्रतिक्रिया है कि मूल रूप से निहित २०० मिलीलीटर) और केंद्रापसारक की बोतलों में हस्तांतरण । प्रत्येक माप के बीच में डीएच2ओ के साथ एेसे सिलेंडर कुल्ला ।
  2. 5 मिनट के लिए ४,६९६ x g में केंद्रापसारक. supernatant को ध्यान से वैक्यूम करके छोड़ें ।
  3. ५० मिलीलीटर ट्यूबों लेबल के लिए छर्रों स्थानांतरण । डीएच2ओ, और ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण सामग्री के साथ केंद्रापसारक बोतलें कुल्ला । सुनिश्चित करें कि कुल ट्यूब की मात्रा ४५ मिलीलीटर से अधिक नहीं है ।
  4. डीएच2हे लवण को दूर करने के साथ शैवाल छर्रों धो लें ।
    1. 5 मिनट के लिए ४,६९६ x g पर ५० मिलीलीटर ट्यूबों केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    2. प्रत्येक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए ४० मिलीलीटर डीएच2हे जोड़ें; भंवर मिश्रण करने के लिए । 5 मिनट के लिए ४,६९६ x g पर फिर से केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    3. चरण 4.4.2 फिर से दोहराएँ.
  5. लेबल और एक 4 दशमलव शेष पर खाली 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों तौलना (लेबल दोनों ढक्कन और ट्यूब और उंहें एक साथ तौलना) । शैवाल संस्कृति के अनुसार एक ट्यूब वजन । प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब दो बार त्रुटि को कम करने के लिए वजन ।
  6. पिछले धोने के बाद, supernatant को त्यागें, और प्रत्येक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए डीएच2O की ७.५ मिलीलीटर जोड़ें । भंवर और पूर्व में शैवाल slurries स्थानांतरण 15 मिलीलीटर ट्यूबों तौला । अतिरिक्त डीएच2ओ और 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए तरल हस्तांतरण के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूबों कुल्ला । 15 मिलीलीटर ट्यूबों में कुल मात्रा के 12 मिलीलीटर से अधिक से बचें ।
  7. 5 मिनट के लिए ४,६९६ x g पर 15 मिलीलीटर ट्यूबों केंद्रापसारक और supernatant । फ्रीज-सुखाने के लिए तैयार करने में कम से 30 मिनट के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर छर्रों के साथ ट्यूबों रुक.
  8. सूखी रात भर फ्रीज या सूख जब तक ।
  9. वजन और रिकॉर्ड फ्रीज शैवाल के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूबों सूख ।

5. लिपिड निष्कर्षण एक संशोधित Folch विधि का उपयोग24

  1. बाहर वजन 20 फ्रीज के मिलीग्राम-एक 2 मिलीलीटर पेंच टोपी में बायोमास के सूखे के लिए (निर्माता लेबल की जांच करने के लिए उत्पाद मनका निकालने के लिए उपयुक्त है) ।
  2. प्रत्येक 2 मिलीलीटर ट्यूब (जो फ्रीज-सूखे शैवाल के 20 मिलीग्राम शामिल है) के लिए Folch विलायक (2:1 क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल) के १.५ मिलीलीटर जोड़ें । डालो ~ ०.५ मिलीलीटर zirconia/सिलिका मोती (०.५ mm) प्रत्येक ट्यूब में जब तक ट्यूब में तरल स्तर 2 मिलीलीटर तक पहुंचता है ।
    चेतावनी: एक धुएं डाकू में क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल संभाल और सांस लेने के धुएं या त्वचा के संपर्क से बचने ।
  3. Homogenize एक मनका मिल में शैवाल के नमूनों के लिए 20 एस की गति से ६.५ मी. स्थानांतरण ट्यूबों 30 एस के लिए बर्फ के नमूनों को ठंडा करने के लिए । पूरी तरह से लिपिड निकालने के लिए पांच बार दोहराएँ.
  4. एक 5 मिलीलीटर एक स्टेनलेस स्टील के तार जाल डिस्क युक्त सिरिंज के माध्यम से homogenate फ़िल्टर (#60 मेष) मोतियों को बाहर तनाव, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में छानने का संग्रह ।
  5. Folch विलायक के १.५ मिलीलीटर के साथ मोती धोने, आवश्यक के रूप में सिरिंज के साथ के माध्यम से तरल धक्का । इस धो दो बार दोहराएं और 15 मिलीलीटर ट्यूब में सभी निस्पंदन इकट्ठा, लगभग 6 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा उपज ।
  6. जोड़ें ०.९% की १.२ मिलीलीटर (डब्ल्यू वी) NaCl समाधान 15 मिलीलीटर ट्यूब और भंवर में Folch निकालने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, अधिक Folch विलायक मोती धोने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उपयोग 0.2 x ०.९% NaCl समाधान के कुल धो मात्रा चरण जुदाई प्रेरित करने के लिए) ।
  7. 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर 15 मिलीलीटर ट्यूबों के केंद्रापसारक के लिए नीचे क्लोरोफॉर्म (ग्रीन) चरण की मात्रा को निकटतम ०.१ मिलीलीटर 15 मिलीलीटर ट्यूब के किनारे पर लाइनों का उपयोग कर रिकॉर्ड । एक कांच की शीशी (ढक्कन के साथ) एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए नीचे चरण स्थानांतरण ।
  8. लिपिड में-20 डिग्री सेल्सियस या (-८० ° c अगर वहां फैटी एसिड विश्लेषण के लिए इस निकालने का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं) की दुकान ।

6. तटस्थ लिपिड एक Microplate विधि का उपयोग परख (हिगिंस एट अल. २०१४22से अनुकूलित)

  1. स्टॉक समाधान तैयार करें । क्लोरोफॉर्म में 10 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम/एमएल वनस्पति तेल मानक तैयार करें और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: किसी भी वनस्पति तेल इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह फैटी एसिड के प्रकार के प्रति संवेदनशील नहीं है । dimethyl sulfoxide (DMSO) में २०० µ जी/एमएल नील लाल समाधान के 10 मिलीलीटर तैयार करें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टोर ।
  2. पूर्व हीट ड्राई microplate एक धुएं डाकू में ५५ ° c करने के लिए ब्लॉक । हालांकि इस हीटिंग है, लिपिड अर्क और वनस्पति तेल मानक 3-मेथनॉल के साथ गुना पतला ।
    नोट: इस कमजोर पड़ने शैवाल के लिपिड सामग्री के आधार पर बदला जा सकता है, लेकिन इस स्तर पर सबसे Chlorellaके लिए अच्छी तरह से काम करता है ।
  3. प्रत्येक पतला नमूना के लिए, quadruplicate में एक ९६ अच्छी तरह से microplate के लिए ८० µ एल जोड़ें ।
    चेतावनी: polystyrene plasticware का उपयोग कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ प्रयोग के लिए अनुशंसित नहीं है ।
  4. विलायक रिक्त, के लिए लागू ८० µ एल के 2:1 मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म में quadruplicate । मानकों के लिए, quadruplicate में पतला वनस्पति तेल मानक के 10, 30, ६०, ९०, और १२० µ एल जोड़ें ।
  5. सभी विलायक काफूर हो गया है जब तक 20-30 मिनट के लिए ५५ ° c पर एक सूखी ब्लॉक हीटर में microplate प्लेस । जबकि विलायक वाष्पीकरण, काम कर नील लाल समाधान तैयार (1 µ जी की जरूरत है २०० µ एल/ एक उदाहरण के रूप में, बारह नमूनों और मानकों का एक पूर्ण सेट १.० µ g/एमएल समाधान के 16 मिलीलीटर की आवश्यकता है; २०० µ जी के ८० µ l को भंग करके तैयार करें/एमएल स्टॉक (DMSO में) में 16 मिलीलीटर डीएच2हे.
  6. हीटिंग ब्लॉक से microplate निकालें और कमरे के तापमान को शांत करते हैं । एक अच्छी तरह से isopropyl शराब के 30 µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । सुनिश्चित करें कि सभी पिपेट चैनलों समाधान मिश्रण कर रहे है और लिपिड resuspend, एक सजातीय हरी तरल उपज ।
  7. जोड़ें २०० µ नील लाल समाधान के एल (1 µ g/एमएल) के लिए एक अच्छी तरह से, पिपेट अप/ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए थाली मशीन । जबकि प्रतीक्षा, ब्लीच (6% हाइपोक्लोराइट) के साथ डीएच2ओ 20 µ एल मिश्रण से एक ५०% ब्लीच समाधान की जरूरत है प्रति अच्छी तरह से तैयार कर रहे हैं । ५०% ब्लीच की 3 मिलीलीटर की तैयारी 12 नमूनों और मानकों का एक पूरा सेट के लिए पर्याप्त है ।
  8. प्रत्येक microplate को अच्छी तरह से ब्लीच सॉल्यूशन के 20 µ एल जोड़ें और पिपेट को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 5 बार मिलाएं । कमरे के तापमान पर 30 मिनट की मशीन ।
  9. 30 मिनट के बाद, नमूनों में प्रतिदीप्ति हर 5-10 मिनट में पढ़ें ५३० एनएम उत्तेजना/575 एनएम उत्सर्जन ऑटो cutoff के साथ ५७० एनएम के लिए सेट जब तक शैवाल के नमूनों से संकेत स्थिर । आमतौर पर, कुल मशीन के ६० मिनट पर्याप्त है ।
  10. वनस्पति तेल मानकों के लिए एक अंशांकन वक्र बनाएं (0-40 एनजी तेल की सीमा में/
    ध्यान दें: एक रैखिक फिट के लिए अच्छी तरह से काम करता है कम (< 30 एनजी/) तेल सांद्रता और एक बहुपद फिट इस्तेमाल किया जा सकता है अगर मानक से अधिक 30 एनजी/ इस संबंध का उपयोग करने के लिए तटस्थ लिपिड नमूना कुओं में मात्रा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यह प्रक्रिया आयुध डिपो ५५० एनएम (चित्रा 4a) में मनोरथ ऑप्टिकल घनत्व डेटा का समय पाठ्यक्रम पैदावार । ऑप्टिकल घनत्व और शुष्क वजन एकाग्रता डेटा (चित्रा 4B) को संबद्ध किया जा सकता है । यह पहले स्थिर सुखाने कदम के बाद अंतिम शुष्क वजन शैवाल एकाग्रता की गणना द्वारा पूरा किया है । अगला, संस्कृति धारावाहिक कमजोर पड़ने के ऑप्टिकल घनत्व (नमूने के अंतिम दिन पर प्रदर्शन किया) और वास्तविक शुष्क वजन सांद्रता को संबद्ध किया जा सकता है । कम सेल सांद्रता के लिए, एक रैखिक सहसंबंध जबकि उच्च कोशिका सांद्रता, एक दूसरे क्रम बहुपद सहसंबंध इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह प्रत्येक संस्कृति शर्त के लिए एक अलग सहसंबंध बनाने की सिफारिश की है । अंत में, सहसंबंध समय पाठ्यक्रम ऑप्टिकल घनत्व डेटा के लिए लागू किया जा सकता है एक शुष्क वजन वृद्धि वक्र (आंकड़ा 4c) प्राप्त करने के लिए । इस उदाहरण प्रयोग में, Auxenochlorella protothecoides (UTEX २३४१25) चार शर्तों के तहत संस्कृति था: axenic नियंत्रण ताजा N8 पर उगाई संस्कृतियों-एनएच4 मध्यम21, सह में बैक्टीरिया के साथ संस्कृति Azospirillum brasilense, इण्डोल-3-एसिटिक एसिड के ५० मिलीग्राम/L के साथ पूरक है, और एक. brasilenseसे खर्च माध्यम पर । ए brasilense इण्डोल-3-एसिटिक एसिड, एक संयंत्र वृद्धि हार्मोन को बढ़ावा देने, कि कुछ सूक्ष्म शैवाल में वृद्धि को बढ़ावा देने के उत्पादन के लिए जाना जाता है । हालांकि, पर ५० mg/L, आईएए उपचार पूरी तरह से एक. protothecoides वृद्धि बाधित । नतीजतन, ऑप्टिकल घनत्व डेटा उपलब्ध था, लेकिन शैवाल की मात्रा एक सटीक शुष्क वजन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त था । इस मामले में, नियंत्रण संस्कृति के लिए सहसंबंध लागू किया जा सकता है या ऑप्टिकल घनत्व डेटा सीधे रिपोर्ट किया जा सकता है । क्योंकि ओडी डेटा ५५० एनएम और ६८० एनएम अवशोषक दोनों पर एकत्र किया गया था, या तो डेटासेट ओडी और ड्राई वेट के बीच सहसंबंध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सामांयतया, ओडी ५५० का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह लगभग पूरी तरह से क्लोरोफिल26के अवशोषण को शामिल करता है, इस प्रकार क्लोरोफिल सामग्री में परिवर्तन से पक्षपात को दबा देता है । इसके विपरीत, ओडी ६८० में क्लोरोफिल के अवशोषण और आयुध डिपो 680/550 के उच्च अनुपात शैवाल में उच्च क्लोरोफिल सामग्री का संकेत शामिल है । चित्रा 4d बारह शैवाल बुलबुला कॉलम photobioreactors में बढ़ती संस्कृतियों का एक सेट से पता चलता है । यहां तक कि उपचार के प्रति केवल तीन जैविक प्रतिकृति के साथ, तंग मानक विचलन प्राप्त किया गया, उपचार के बीच मतभेदों को उच्च संवेदनशीलता के लिए अनुमति देता है ।

Figure 4
चित्र 4. बुलबुला कॉलम photobioreactors में शैवाल विकास के परिणाम । (क) Auxenochlorella protothecoides (UTEX २३४१) के ऑप्टिकल घनत्व (५५० एनएम) वृद्धि वक्र संस्कृतियों १२० घंटे में देर लघुगणक वृद्धि दर्ज करने से पता चलता है । नियंत्रण संस्कृतियों ताजा N8 पर बड़े थे-एनएच4 मध्यम, उपचार 1 एक की सह संस्कृतियों है . protothecoides और Azospirillum brasilense पर उगी ताजी N8-nh4 मध्यम, उपचार 2 is axenic A. protothecoides पर उगाया जाता है N8-NH4 मध्यम ५० mg/L इण्डोल-3-एसिटिक अम्ल (आईएए) के साथ पूरक है, और उपचार 3 है axenic a. protothecoides से गुजारे माध्यम पर उगाया जाता है. गुजारे माध्यम को संवर्धन ए. brasilense द्वारा तैयार किया गया N8-एनएच4 मध्यम से 2 जी/L मैलिक अम्ल के पूरक पर ९६ घंटे के लिए । कोशिकाओं को हटा दिया गया था, और मध्यम अपने प्रारंभिक स्तर को पुनर्स्थापित करने के लिए अमोनियम के साथ फिर से पूरक था, पीएच समायोजित किया गया था, और मध्यम (०.२ माइक्रोन) फ़िल्टर बाँझ था. ध्यान दें कि ५० मिलीग्राम/L आईएए उपचार पूरी तरह से बाधा शैवाल विकास । (ख) एक दूसरे क्रम बहुपद फिट का उपयोग कर आयुध डिपो ५५० एनएम और अंतिम शुष्क वजन एकाग्रता के बीच सहसंबंध घटता है । कोई संबंध 2 उपचार के लिए दिखाया गया है क्योंकि कोई शैवाल संस्कृति अवधि के अंत में काटा जा सकता है । (ग) ऑप्टिकल घनत्व डेटा के लिए बहुपद सहसंबंध के आवेदन y-अक्ष पर शुष्क वजन एकाग्रता के साथ एक विकास वक्र पैदावार । नियंत्रण culture सहसंबंध 2 उपचार के लिए ओडी डेटा के लिए लागू किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन 3 जैविक प्रतिकृति पर आधारित हैं । (घ) बबल कॉलम photobioreactors की फोटो शीघ्र ही कल्चरल टीका के बाद. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तटस्थ लिपिड डेटा चित्रा 5में दो उदाहरण प्रयोगों के लिए दिखाया गया है । इस परख के लिए तटस्थ लिपिड सामग्री, विशेष रूप से triacyglycerol (टैग) सामग्री के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी दिखाया गया है । इस तटस्थ लिपिड परख (चित्रा 5) एक इसी पतली परत क्रोमैटोग्राफी प्लेट (चित्रा 5B) की तुलना करके देखा जा सकता है । इसी ट्रेंड को दूसरा प्रयोग (फिगर 5C और 5d) में देखा जा सकता है । इन प्रयोगों के सभी में, canola तेल एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एक रैखिक सहसंबंध के परिणामस्वरूप (०.९८ के पहले प्रयोग के लिए आर2 और दूसरी के लिए ०.९९) प्रतिदीप्ति और canola तेल द्रव्यमान के बीच में अच्छी तरह से । ध्यान दें कि यदि सभी नमूनों कम लिपिड सामग्री है, तो उच्चतम बिंदु या दो मानक पर छोड़ दिया जा सकता है । इस सहसंबंध शैवाल नमूना कुओं में से प्रत्येक में तटस्थ लिपिड (µ g) की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तेल द्रव्यमान तो लिपिड निकालने में एक एकाग्रता में परिवर्तित किया जा सकता है microplate के लिए लागू अच्छी तरह से । यह मान मूल Folch निष्कर्षों की तटस्थ लिपिड सामग्री प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने वाले कारक (उदा., 3x) से गुणा है । इस एकाग्रता तो निकालने की मात्रा से गुणा है (4 मिलीलीटर के करीब होना चाहिए) और फिर लिपिड निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया शैवाल बायोमास के कुल द्रव्यमान से विभाजित (20 मिलीग्राम के करीब होना चाहिए). परिणाम सूक्ष्म शैवाल के तटस्थ लिपिड सामग्री है ।

Figure 5
चित्रा 5. तटस्थ लिपिड Chlorella sorokiniana की संस्कृतियों से प्राप्त डेटा (UTEX २७१४) । (क) प्रयोग 1 में शैवाल के लिए तटस्थ लिपिड सामग्री (% शुष्क वजन) जिसमें शैवाल १२० घंटे के लिए बड़े हो गए थे । नियंत्रण संस्कृति axenic था और संस्कृति पर ताजा N8 मध्यम23, उपचार 1 था एक सह संस्कृति के सी. sorokiniana और ए. brasilense पर ताजा N8 माध्यम, उपचार 2 ताजा N8 माध्यम से पूरक था ५० mg/L आईएए, और 3 उपचार खर्च किया गया था brasilenseसे मध्यम । खर्च माध्यम संवर्धन ए. brasilense द्वारा तैयार किया गया था N8 मध्यम में ९६ घंटे के लिए 2 g/L मैलिक एसिड के साथ पूरक, कोशिकाओं को हटाने, खो नाइट्रेट का सप्लीमेंट, पीएच समायोजन, और बाँझ फ़िल्टरिंग माध्यम (०.२ माइक्रोन). protothecoidesके विपरीत, ५० मिलीग्राम/आईएए के एल सी sorokiniana वृद्धि को बाधित नहीं किया । (ख) प्रयोग 1 सापेक्ष टैग बहुतायत दिखा के लिए टीएलसी प्लेट छवि । (ग) तटस्थ लिपिड सामग्री (% शुष्क वजन) प्रयोग 2 में शैवाल के लिए जो प्रयोग 1 के रूप में एक ही उपचार किया था, लेकिन कोशिकाओं के विकास के ७२ घंटे के बाद काटा गया था । (घ) प्रयोग 2 सापेक्ष टैग बहुतायत दिखा के लिए टीएलसी प्लेट छवि । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन 3 जैविक प्रतिकृति पर आधारित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसके अलावा, यह परिवर्तन के गुणांक की गणना करने के लिए अच्छा अभ्यास है (मानक विचलन माध्य द्वारा विभाजित) में सभी तकनीकी प्रतिकृतियों भर में कच्चे प्रतिदीप्ति रीडिंग के तटस्थ लिपिड परख. मान तकनीकी प्रतिकृति quadruplicate में microplate में किए गए के रूप में कार्यविधि में नोट किया गया, भिन्नता का गुणांक सामान्यतया 10% से अधिक नहीं होना चाहिए । भिंनता के उच्च गुणांक आमतौर पर गरीब मिश्रण (विशेष रूप से isopropyl शराब के अलावा के दौरान) और मल्टीचैनल पिपेट के संभावित गलत उपयोग के परिणाम हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सबसे महत्वपूर्ण विचार जब संवर्धन शैवाल जीव या जीवों के समूह की विशिष्ट आवश्यकताओं की समझ है । शैवाल खेती प्रणाली यहां वर्णित शैवाल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन विशिष्ट अजैव कारकों (तापमान, मीडिया, पीएच, प्रकाश की तीव्रता, सह2 स्तर, वातन दर) जीव की जरूरतों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । नोट यहां वर्णित पैरामीटर्स Chlorella और Auxenochlorellaकी खेती के लिए उपयोग किए गए थे । ये जीव औद्योगिक हित के हैं क्योंकि वे उच्च पोषक तत्व, प्रकाश, और तापमान के स्तर27के लिए सहिष्णु हैं । हालांकि, प्रकाश का स्तर फ्लोरोसेंट बल्ब को हटाने के माध्यम से कम किया जा सकता है और दिन/रात चक्र मौसमी प्रतिनिधित्व करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । इसी तरह, पानी हीटर ऊपर या नीचे करने के लिए प्रणाली पर पानी स्नान के तापमान को नियंत्रित किया जा सकता है । जबकि प्रणाली यहां वर्णित ऐसी सुविधा का काम नहीं करता है, यह संभव है एक कम लागत शीतलक प्रणाली के माध्यम से कमरे के तापमान के नीचे मछली टैंक पानी स्नान सर्द । एक छोटे रेफ्रिजरेटर में पानी की एक बाल्टी प्लेस और एक चर गति पंप का उपयोग करने के लिए मछली टैंक और वापस करने के लिए ठंडे पानी की बाल्टी से पानी पंप । तेजी से पंपिंग दर, ठंडा मछली टैंक जलाशय बन जाएगा ।

हालांकि शैवाल खेती प्रणाली आम तौर पर लगातार परिणाम प्रदान करता है, वहां कुछ महत्वपूर्ण निरंतर है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं । पहली वातन प्रणाली दबाव के अचानक नुकसान (जैसे, एक उड़ा फिटिंग या एक हवा कंप्रेसर विफलता) अनुभव करता है कि घटना में होता है कि पानी का खाना है । दबाव है कि humidifiers में है humidifier टयूबिंग के माध्यम से पिछड़े पानी धक्का, सहित कन्ट्रोलर के माध्यम से होगा । एक नदी के ऊपर जाल या backflow निवारक स्थापित करने में मदद कर सकते हैं । ध्यान दें कि अपनाना स्वयं को प्रभावित नहीं करेगा क्योंकि वे वायुमंडलीय दबाव पर काम करते हैं । पाइपिंग और फिटिंग के नियमित निरीक्षण प्रणाली विफलताओं को कम करने में मदद कर सकते हैं । एक अंय महत्वपूर्ण विचार के लिए नियमित रूप से निरीक्षण और हवा फिल्टर की जगह और वाल्वों की जांच है पर प्रतिक्रिया । आटोक्लेव चक्र अनुमत की संख्या के लिए निर्माता की अनुशंसा का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर axenic संस्कृतियों के रखरखाव के प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है । अंत में, यह पानी स्नान, आटोक्लेव, और सुरक्षा के बीच कैबिनेट के बीच प्रतिक्रिया के सुरक्षित परिवहन के लिए एक autoclavable रैक खरीदने या निर्माण करने के लिए सिफारिश की है । एक स्टेनलेस स्टील के तार रैक इस उद्देश्य की सेवा कर सकते हैं ।

यहां वर्णित प्रतिक्रियात्मक प्रणाली में कई सीमाएं हैं । एक प्रमुख सीमा बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक सुरक्षा के मंत्रिमंडल में रिएक्टरों को संभालने की जरूरत है । रिएक्टरों एक विरोधी अपनाना नमूना बंदरगाह की कमी, उपयोगकर्ता की आवश्यकता के लिए एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए रिएक्टर स्थानांतरित करने के लिए संस्कृति प्रदूषित बिना नमूना । रिएक्टरों भी मैनुअल पीएच पढ़ने और समायोजन जो मानव त्रुटि के लिए संभावित परिचय की आवश्यकता है ।

इस प्रतिक्रिया प्रणाली यहां वर्णित सरल कुप्पी की खेती और पूरी तरह से नियंत्रित विरोधी के बीच एक आला भरता है । इस प्रतिक्रिया प्रणाली की तुलना में अधिक सुसंगत परिणाम के लिए एक की जरूरत के जवाब में विकसित किया गया था प्राप्त बोतलों का उपयोग कर । डेटा से पता चलता है कि इस प्रणाली लगातार वृद्धि जब उचित रूप से संचालित परिणाम उत्पंन करता है । ध्यान दें कि वातित बोतलों शैवाल स्टॉक की खेती के लिए प्रक्रिया में कार्यरत थे, लेकिन यह केवल प्रयोग के लिए इनोक्युलम उत्पादन किया गया था । यह स्वीकार्य है क्योंकि शेयर की बोतलें टीका के लिए परित और इसलिए रिएक्टरों के बीच परिवर्तनशीलता एक मुद्दा नहीं है ।

के रूप में कई शैवाल शोधकर्ताओं दोनों विकास और तटस्थ लिपिड सामग्री की निगरानी में रुचि रखते हैं, हम इन दोनों मापदंडों के यहां मापने के लिए हमारे दृष्टिकोण शामिल है । विकास को मापने के लिए ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग मानक अभ्यास है और अपनी सादगी में अद्वितीय है । हालांकि, समय के साथ शुष्क वजन और ऑप्टिकल घनत्व परिवर्तन और संस्कृति की स्थिति पर निर्भर के बीच सहसंबंध । यह हर प्रयोगात्मक बैच के भीतर प्रत्येक प्रयोगात्मक उपचार के लिए एक सहसंबंध समीकरण का उत्पादन करने के लिए सिफारिश की है । यह प्रस्तावित प्रक्रिया में संभव है क्योंकि फ्रीज शैवाल हर संस्कृति प्रयोग के बाद प्राप्त किया जाएगा । ऑप्टिकल घनत्व दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण धारणा यह है कि ऑप्टिकल घनत्व और शुष्क वजन के बीच संबंध बैच विकास के पाठ्यक्रम पर लगातार रखती है । जब तक इस धारणा से विचलन छोटे हैं, परिणाम काफी सटीक होगा. सापेक्ष सटीकता समय शूंय पर परिकलित शैवाल शुष्क वजन एकाग्रता की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । संभालने संस्कृतियों अच्छी तरह से मिश्रित थे, और pipetting सटीक था, संस्कृतियों के सभी एक ही प्रारंभिक टीका घनत्व होना चाहिए । ऑप्टिकल घनत्व दृष्टिकोण भी चुनौती दी जा सकती है जब मध्यम के पृष्ठभूमि अवशोषक उच्च है (यानी, जब कुछ अपशिष्ट जल के साथ काम) । मध्यम अवशोषक के घटाव (से पहले टीका) प्रत्येक आयुध डिपो पढ़ने से इस मुद्दे के साथ मदद कर सकते हैं ।

शुष्क शैवाल से लिपिड के निष्कर्षण अच्छी तरह से स्थापित Folch दृष्टिकोण21,24के बाद; हालांकि, वहां महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । विभिन्न शैवाल प्रजातियों मुश्किल की डिग्री बदलती के साथ अलग सेल दीवारों है । zirconia/सिलिका मोती यहाँ इस्तेमाल तेज कर रहे हैं और मजबूत, polysaccharide सेल दीवारों पियर्स करने के लिए डिजाइन किए हैं । एक नरम मनका प्रकार (जैसे, कांच) या कम मनका विघटन चक्र कमजोर सेल दीवारों के साथ शैवाल पर इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, अंगूठे का एक नियम यह है कि निष्कर्षण के बाद जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली वर्णक से मुक्त होना चाहिए, यह दर्शाता है कि सभी क्लोरोफिल निकाला गया था । एक लिपिड निष्कर्षण कदम के दौरान विफलता का सबसे आम स्रोतों में से एक अनुचित फ्रीज सुखाने के कारण होता है । यदि नमूना फ्रीज ड्रायर में पिघला देता है इससे पहले कि यह पूरी तरह से शुष्क है, परिणाम एक बहुत कठिन, अंधेरा, मोमी गोली होगा । यह कोशिकाओं है कि फ्रीज ड्रायर के निर्वात शर्तों के तहत लीजड ड का परिणाम है । गोली एक सूखी वजन प्राप्त करने के लिए तौला जा सकता है, लेकिन यह मोमी कणों Folch विलायक में टूट नहीं है के रूप में लिपिड निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ्रीज सुखाने हमेशा नरम, पाउडर नमूने पैदावार, यह सभी नमूनों को फ्रीज करने के लिए आवश्यक है-८० ° c और तुरंत फ्रीज ड्रायर के लिए उन्हें हस्तांतरण. इसके अलावा, parafilm का उपयोग (एक छेद में यह poked के साथ) के बजाय ढीला ट्यूब ढक्कन सुनिश्चित करेंगे कि नमी लगातार नमूने से पहले यह गल से हटा दिया जा सकता है ।

तटस्थ लिपिड इस प्रक्रिया में वर्णित परख पहले प्रकाशित किया गया है और वैकल्पिक लिपिड22परख की चर्चा भी शामिल है । हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण सुधार प्रकाशन के बाद से उस कार्यविधि करने के लिए किए गए हैं । सबसे विशेष रूप से, नील लाल समाधान एकाग्रता से बढ़ गया था ०.५ µ g/एमएल के लिए 1 µ g/ इस परिवर्तन के प्रभाव उच्च संकेत तीव्रता, सुधार दोहराया गया था, और समय के साथ मशीन अवधि के दौरान संकेत गिरावट का उन्मूलन । परिणाम बताते है कि परख अच्छी तरह से गुणात्मक पतली परत क्रोमैटोग्राफी से परिणाम की तुलना करता है । यह परख विकसित की है और Chlorella और Auxenochlorella की विभिंन प्रजातियों का उपयोग कर मांय किया गया तो इसकी काफी अलग संरचना की प्रजातियों के लिए लागू नहीं निर्धारित किया गया है । सभी हरे रंग का रंग पूरी तरह से ब्लीच मशीन के दौरान परख से हटा दिया जाना चाहिए, नमूनों कि स्पष्ट या बहुत पीला पीला है के लिए अग्रणी । यह भी ध्यान दें कि लिपिड अर्क है कि नीचा दिखा रहे है (के रूप में हरे रंग से एक परिवर्तन द्वारा संकेत के रूप में ब्राउन कलर) आमतौर पर इस परख में सही परिणाम देने में विफल । यह इस प्रकार आवश्यक है कि अंधेरे में-20 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं पर लिपिड नमूनों की दुकान ।

संवर्धन शैवाल के लिए यहां प्रस्तुत तरीकों, विकास को मापने, और तटस्थ लिपिड को बढ़ाता है शैवाल के इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन जैव ईंधन के उत्पादन पर अनुसंधान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं । इन तरीकों का भी अध्ययन करने के लिए किया जा रहा है मनोरथ विकास निषेध28 अपशिष्ट जल पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास और सूक्ष्म शैवाल की संरचना पर जीव बातचीत के प्रभावों ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध के लिए समर्थन USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि हैच परियोजना ALA0HIGGINS और Auburn विश्वविद्यालय प्रोवोस्ट के कार्यालयों, अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष, और शमूएल Ginn कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग द्वारा प्रदान की गई थी । NSF ग्रांट CBET-१४३८२११ द्वारा भी सहायता प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35x300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars - long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars - medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100x15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24x2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).

Tags

पर्यावरण विज्ञान मुद्दा १४३ सूक्ष्म शैवाल photobioreactor खेती लिपिड निष्कर्षण तटस्थ लिपिड जैव ईंधन
बुलबुला कॉलम Photobioreactors में ग्रीन सूक्ष्म शैवाल की खेती और तटस्थ लिपिड के लिए एक परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T.… More

Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter