Summary
ここでは、異種系移植片対宿主病(xenoGVHD)モデルにおける疾患を誘導し、スコア付けするプロトコルを提示する。xenoGVHDは、ヒトT細胞の免疫抑制を研究するためのインビボモデルを提供する。さらに、免疫抑制を定量化するツールとしてデジタルPCRを用いて組織内のヒトT細胞を検出する方法について述べた。
Abstract
急性移植片対宿主病(GVHD)は、血液学的欠乏および悪性腫瘍の治療として造血幹細胞移植を受けている患者にとって重要な制限である。急性GVHDは、ドナーT細胞が宿主組織を外来抗原として認識し、宿主に免疫応答をマウントするときに起こる。現在の治療には、患者が感染や再発を受けやすくする有毒な免疫抑制薬が含まれます。したがって、ドナーT細胞を効果的に標的にし、副作用を減らすことができる急性GVHD療法を提供するための継続的な研究があります。この前臨床研究の多くは、生体内系のマウス細胞ではなくヒト細胞に対する免疫抑制療法の試験を可能にする異種生成GVHD(xenoGVHD)マウスモデルを使用しています。このプロトコルは、xenoGVHDを誘導する方法と、一貫した結果を確実にするために臨床スコアリングを盲目にし、標準化する方法を概説します。さらに、このプロトコルは、デジタルPCRを使用してマウス組織内のヒトT細胞を検出する方法について説明し、その後、試験された治療の有効性を定量化するために使用することができる。xenoGVHDモデルは、GVHD療法をテストするモデルを提供するだけでなく、ヒトT細胞を抑制できる任意の治療法を提供し、多くの炎症性疾患に適用することができる。
Introduction
同種造血幹細胞移植(HSCT)は、予後不良の白血病などの血液学的悪性腫瘍に苦しむ患者の日常的な治療となっている。HSCTの有意な合併症は急性移植片対宿主病(GVHD)である。2012年の研究では、急性GVHDが兄弟ドナーから移植を受けているHSCT患者の39%と無関係なドナー1からの移植を受けている患者の59%で開発されたと報告されています。急性GVHDは、ドナー由来のT細胞がレシピエントの臓器を攻撃するときに起こる。GVHDの唯一の成功した治療法は、非常に毒性が高く、感染および腫瘍再発のリスクを高める高い免疫抑制薬2による治療である。したがって、近年3、4、5の急性GVHD生存率で行われた改善にもかかわらず、長期寛解を促進する毒性を最小限に抑えたGVHD療法の改善が依然として重要である。
以下の方法の全体的な目標は、異種系GVHD(xenoGVHD)を誘導し、スコア付けすることです。xenoGVHDモデルは、前臨床GVHD研究を臨床試験6に直接翻訳することを可能にするマウス細胞ではなくヒト細胞で急性GVHDを誘導するツールとして開発された。このモデルは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、非致死的に照射されるNOD-SCID IL-2Rγヌル(NSG)マウスに静脈内注入することを含む。注入されたヒトT細胞は、マウス抗原を提示するヒト抗原提示細胞(APC)によって活性化され、活性化されたT細胞は、全身性炎症および最終的に死亡する遠隔組織に移行する6、7、8,9,10.xenoGVHDモデルにおける疾患病理および進行は、ヒト急性GVHDを密接に模倣する。具体的には、病原性ヒトT細胞は、マウス主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質に反応し、ヒトGVHD6、9におけるT細胞アロア活性に類似している。マウスMHCミスマッチモデルに対するxenoGVHDモデルの主な利点は、他の広く使用されているGVHDモデルは、マウス細胞ではなくヒト細胞上の治療法の試験を可能にすることである。これにより、ヒト細胞を標的とするため、変更を加えずに直接クリニックに翻訳できる製品のテストが可能になります。近年、このモデルは、急性GVHDの潜在的な治療法としてヒト抗IL-2抗体11、ヒト胸腺調節T細胞(Tregs)12およびヒト間葉系幹細胞13を試験するために用いられている。より広い文脈において、このモデルは、ヒトT細胞活性を抑制することができる任意の薬物または細胞型に対する生体内抑制アッセイとして使用することができる。例えば、Stockis et al.14はxenoGVHDモデルを用いて、生体内のトレグ抑制活性に対するインテグリンαVβ8のブロッキング効果を研究した。したがって、xenoGVHDモデルは、インビボ設定でT細胞を標的とする任意の治療のメカニズムに関する洞察を提供することができる。
このプロトコルに記載されている追加の方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)を用いてマウス組織中のヒトT細胞を検出する方法である。この方法の目的は、このモデルで試験されている免疫抑制療法の有効性を測定する標的組織におけるT細胞の移動および増殖を定量化するツールを提供することである。dPCRは、核酸15の定量のための比較的新しい方法である。簡単に言えば、PCR反応混合物は、ターゲット配列の少数を含むパーティションに分割されるか、またはターゲットがまったく含まれていません。次に、標的配列を増幅し、DNAインターカシング染料または蛍光標的特異的プローブを用いて検出します。dPCR は、正のパーティションとポアソンの統計15,16の割合に基づいて、ターゲット シーケンスのコピー数を定量化します。dPCRを用いてT細胞を検出することは、フローサイトメトリーおよび組織学を含む他の代替方法と比較してはるかに少ない組織を必要とし、凍結または固定組織上で行うことができる。dPCR は、コピー番号を決定するための標準曲線を必要とせず、技術的な反復も必要ありません。これにより、従来の定量的PCR(qPCR)16と比較して、dPCRに必要な試薬およびテンプレートDNAの量が減少します。pcR反応をdPCRのサブ反応に分割すると、ターゲット17が効果的に濃縮されます。したがって、dPCRは、主に大量の非標的DNA中の希少標的を検出するためのツールである。例えば、dPCRは、牛乳18における細菌汚染を検出し、エストロゲン受容体遺伝子19のまれな変異を同定し、患者20の血液中の循環腫瘍DNAを検出するために使用されている。このプロトコルでは、dPCRはxenoGVHDを有するマウスの組織におけるヒトT細胞を検出および定量するための効率的なツールとして機能する。
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Protocol
すべてのマウス実験は、カンザス大学医療センター機関動物ケア・使用委員会の承認を得て、コンプライアンスに従って行われました。すべての健康なヒト血液サンプルは、インフォームドコンセントの下で、カンザス大学医療センターの機関審査委員会の承認を得ました。
1. NSGマウスの照射
- PBMC注射の1日前に、8〜12週齢のNSGマウスを照射する(どちらの性別も使用することができる)。滅菌バイオセーフティキャビネットに、マウスを滅菌パイケージまたはマイクロアイソレータに入します。Cs137源または小動物照射器(例えば、RS2000)でマウスを照射し、回転が遅い150cGyの総用量を有し、照射さえ確実にする。
- 無菌のバイオセーフティキャビネットにマウスを清潔なケージに入れなさい。
2. 注射のためのヒトPBMCの調製
- マウスあたり1.1 x 107 PBMCを分離するのに十分な健康なヒト血液を収集します。リン酸緩衝生理食生(PBS)で2%の胎児ウシ血清(FBS)の等しい体積でヘパリン化された血液を希釈する。
注:このプロトコルでは、PMBC収率は一般に全血10mL当たり0.5-1 x 107です。各マウスは100 μLのPBSで107 PBMCを受け取ります。マウスあたり10 μLで余分な1 x 106は、各マウスがPBMCの完全な投与量を受け取ることを保証します, 注射器を充填する問題がある場合. - 15 mLリンパ球分離密度グラデーション媒体(例えば、フィコル)を50 mL円錐管に加え、密度勾配の上に25 mLまでの希釈された血液を慎重にオーバーレイします。ブレーキなしで室温で40x gの密度勾配および希釈された血を含んでいる管を遠心分離する。
- PBMC インターフェイスを 50 mL 円錐管で 10 mL の PBS に収穫します。細胞を400 x gで10分間遠心分離し、上清を取り除きます。
- チューブをフリックしてペレットを緩め、10 mL PBSで再サスペンドしてPBMCを洗浄します。細胞を400 x gで5分間遠心分離します。
- (オプション)ペレット体積に等しいアンモニウム-塩化カリウム(ACK)リシスバッファーのボリュームを加えることによって、細胞ペレット内の上清およびlyse赤血球(RBC)を廃棄します。ペレットをゆっくりと再び振り直し、30~60sのチューブを血清フリーのRPMIメディアでチューブを充填し、チューブを400 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を取り出し、PBSの5mLで細胞ペレットを再停止する。血球計と顕微鏡でトリパンブルーの排除を使用して細胞を数えます。
- 400 x gで5分間遠心分離し、PBSで1 x 108細胞/mLで細胞を取り出し、再中断する。
3.マウスへのヒトPBMCのレトロ軌道注入21
- 無菌性を維持するために、層流フードに麻酔室を置きます。5%のイソムランと1 L/min酸素の流量で麻酔室を5分間事前に充電します。
- イソファランを2%に減らし、同じケージからマウスを麻酔室に入れる。マウスが右を失ったら、マウスを5分間麻酔する。この間、細胞懸濁液の100 μL(1 x 107細胞)を含む予備充填注射器。
- 麻酔を維持するために、鼻コーンに鼻を持つ加熱パッドにマウスを置きます。フットパッドをつまみ、反射の欠如をチェックすることにより、意識の損失をチェックします。
- 親指と中指でマウスを拘束します。28 G 1/2 を針に差し込み、眼の後ろに達するまで結膜を通して、中間カンサスに斜め下にベベルを挿入します。針を少し引き込み、100 μLの細胞(1 x 107細胞)をゆっくりと注入します。
- 完全に針を引き込み、注射器と針を適切に処分します。まぶたを閉じ、ガーゼスポンジで注射部位に軽度の圧力を加える。
- 注射部位の腫れやその他の目に見える外傷を調べます。マウスがペーパータオルで裏打ちされた無菌ケージで意識を取り戻し、家庭のケージに移動する前に寝具の吸引を防ぎます。出血が止まったら、一滴のプロパラカインを眼に当てて鎮鎮薬する。
注:尾静脈注射は、Macholzら22によって説明されているように、このプロトコルのためのPBMCの静脈内注射の代替方法である。
4. マウスにおける急性GVHDの臨床スコアリング (図1)23
- マウスが2のスコアに達するまで、1日おきにGVHDスコアを測定し、その後、犠牲の日まで毎日。
- ケージを層状の流れフードに入れ、食べ物と水を取り除き、蓋を戻します。マウスを5分間観察し、スコアを次のように割り当てることによってスコアを割り当てる:0 =マウスは数分以内に歩き始め、ケージの周りを歩き続け、1 =マウスは起き上がるのに数分以上かかり、ケージの周りをゆっくりと歩き回る、2=マウスは起き上がらない5分、触れたときだけ歩きます。
- ガラスビーカーで各マウスを計量し、減量スコアを与える: 0 = <10% 変化, 1 = 10-25% 変化と 2 = >25% 変化.
- マウスがまだビーカーにいる間、姿勢を検査する:0 =正常、1 =安静時のハンチング、2 =ハンチングは動きを損なう。毛皮のテクスチャ: 0 = 通常, 1 = 軽度から中程度のラッフル, 2 = 重度のラッフル,および皮膚の完全性: 0 = 通常, 1 = 足/尾のスケーリング, 2 = 否定された皮膚の明らかな領域(スケーリングのための耳、尾と足を見てください).
- 5つのカテゴリと各カテゴリのスコア0-2で、マウスは10の最大スコアに達することができます。マウスが7以上のスコアに達するか、注射後42日に達すると、CO2安楽死または地元の機関動物管理および使用委員会によって承認された他の方法を介してマウスを安楽死させる。
注:結果の正確性を確保するために、スコアリングは、治療群24に盲目である研究者によって行われる。さらに、体重減少の>20%は多くのIACUCプロトコルに推奨される人道的エンドポイントであるが、このプロトコルの追加正当化IACUC承認を得ることができる。
5. 安楽死マウスからゲノムDNAの組織を採取し、ゲノムDNAを分離する
- 滅菌手術用具を用いてマウスを解剖する。目的の器官(例えば、肺、肝臓、脾臓など)から約3mm x 0.5mmの大きさの小片を切り取る。組織サンプルを計量し、無菌の1.5 mLチューブにティッシュピースを置きます。複数の組織を収集する場合は、各臓器を切断する間にエタノールでツールを洗浄します。
- 組織を液体窒素中に含むチューブを水没させ、バブリングを停止し、一晩-80°Cに保存して凍結します。組織サンプルを解凍し、ゲノムDNA(gDNA)単離キットに従ってそれらをlyseします。
- キットに記載されているように、メーカーの指示に従ってゲノムDNAを分離します。eluted gDNA (mg/μL) のマイクロリットルあたりに処理された組織の量に注意してください。
注:冷凍組織は後で処理するために-80 °Cで貯えることができる。
6. デジタルPCRを用いたヒトT細胞の定量化(図2)
- 使用するデジタルPCRマシンのDNA結合染料のプロトコルに従ってデジタルPCR反応を調製する。ヒトCD3イプシロンゲノムDNAに特異的な以下のプライマーを使用してください(NCBIリファレンス配列:NG_007383.1);。フォワードプライマー: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, リバースプライマー: GCCCTACAGGTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA.これらのプライマーは105 bpの単一のバンドを生み出す。
注:ヒンドIIIなどの制限酵素を各反応に0.5μLを加えてゲノムDNAを消化します。正の液滴と負の液滴の分離を最適化するために、異なるgDNA希釈を必ずテストしてください。さらに、浸潤T細胞のサブセットは、非病原性調節性T細胞であってもよい。これらの細胞は、調節性T細胞マーカーに対する追加のプライマーを用いて定量することができる。 - 次の条件下でデジタルPCR反応を行う:105 °Cで蓋、10分(1サイクル)のための95 °C)30 sのための95 °C、ランプ2 °C/sおよび1分のための55 °C、ランプ2 °C/s(40サイクル);。72 °C 10分、12 °Cホールド。
注: これらのパラメータは、デジタル PCR 機器によって調整する必要がある場合があります。 - 分析ソフトウェアでデジタルPCRデータを取得します。次の式を使用して組織の mg 当たりのコピー数としてデータを報告する: (コピー数/μL) x (反応中の gDNA の μL) x (希釈係数)/(総gDNAの組織/μLのmg)
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Representative Results
ヒトPBMCを受けた両男女の8〜12週齢のNSGマウスを、PBSのみを受け取った陰性対照マウスと比較して10日目のポスト注射の臨床徴候を示し始めた(図1A)。XenoGVHDマウスは23.5日の中央値生存期間を有した(図1B)。デジタルPCRを用いて、CD3イプシロン陽性ヒトT細胞は、ヒトPBMCを受けたマウスの肺および肝臓サンプルで検出することができた。PBSを注射したマウスからの組織サンプルを対照として用いた(図2)。
図1:GVHD疾患の進行。8-12週齢の雄および雌のNSGマウスを皮切り照射し、陰性対照として1 x 107ヒトPBMC(n=6)またはPBS(n=4)をレトロ軌道的に注入した。示されているデータは、3つの独立した実験の組み合わせ結果である。(A)GVHDスコアは、マウスが2のスコアに達するまで1日おきに測定し、その後、犠牲の日まで毎日測定した。GVHDスコアの各時点で報告されたデータは、各群における死亡マウスの最終スコアと組み合わせた生体マウスの平均±SEMスコアである。* p < 0.05 マンホイットニーU検定で判定。(B) 生存のカプラン・マイヤー曲線。GVHDスコアが≥7であったときに死亡がマークされた。* p < 0.05 対数ランク検定で決定。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:デジタルPCRを用いてヒトT細胞を検出する。肺および肝臓試料は、マウスが≥7または42日後注射後のGVHDスコアに達したときに、PBS(n=3)または1 x 107ヒトPBMC(n=3)でレトロ軌道注入されたマウスから採取した。データは3つの独立した実験から収集した。gDNAを単離し、デジタルPCRを用いて組織の1ミリグラム当たりのヒトCD3イプシロンのコピーを決定した。(A) PBSまたはPBMCを注射したマウスからの肺および肝臓サンプルの代表的なデジタルPCRプロット。(B)PBSまたはPBMCを注射したマウスからの組織のミルグラム当たりのヒトCD3イプシロンのコピーの定量。* p ≤ 0.05 マンホイットニーU試験によって決定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
疾患の進行は、一般的に異なるドナーからのPBMCの注入であっても、xenoGVHDモデルで一貫しているので、複数の実験を組み合わせることができます。この一貫性を維持するために必要な重要な手順は、適切なi.v.インジェクション技術、ブラインドと一貫性のあるスコアリングです。Nervi et al.25による研究は、静脈内尾静脈注射と比較して、PBMCのレトロ軌道注射がより一貫性のある生着生着生着生およびより重度のGVHDをもたらすことを実証した。Leon-Rico et al.26はまた、レトロ軌道注射が尾静脈注射と比較してマウスにおける造血幹細胞の生着生着生がより一貫していることを実証した。しかし、必要に応じて、尾静脈注射は、xenoGVHDモデル27、28、29の代替方法として使用することができる。
尾静脈注射に関連する結果の変動性の問題は、被験者の数を増やすことによって減少させることができる。さらに、マウスを採点する人は、活動や毛皮のテクスチャなどのより主観的な基準のスコアリングにおける偏りを避けるために、マウス治療に盲目にすることが重要です。盲目のGVHDスコアリングの重要性は、クリニック24でも実証されています.マウスを注入する人は、マウスを採点する同じ人物であってはならない。これが不可能な場合、制御および治療管は、他の人によって新しいIDでランダム化され、標識することができる(すなわち、コントロールはAであり、治療はBである)ので、注射は盲目にすることができる。マウススコアリングは、毎日同じ時間と異なる実験間の注射後の同じ日に行われるべきである。
このモデルの潜在的な障害の1つは、GVHD開発の欠如です。これは、トリパンブルーで細胞をカウントすることにより、PBMCの生存率をチェックすることによって対処することができるPBMCの生存率の低下に起因する可能性があります。細胞生存率の問題が発生した場合、細胞は生存を改善するために2%FBSを補充してPBSに入れることができます。また、一度に注入できるマウスの数を減らし、細胞が室温で座る時間を減らすことができます。レトロ軌道注入の有効性が問題になりうる。PBMCを注射されるがGVHDを発症しないマウスは安楽死させることができ、脾臓から単離された免疫細胞は、dPCRまたはフローサイトメトリーを介してヒト細胞の存在について分析することができる。不十分な生着がある場合は、注射技術に問題がある可能性があります。注射技術の試験として、マウスは200μLのエバンス色素を用いてレトロ軌道に注入することができる。注射が成功すると、マウスの耳、足、尾が青色に変わります。
xenoGVHDモデルは、ヒト急性GVHD疾患病因および進行30を密接に模倣する。マウスMHCミスマッチGVHDモデルとは異なり、xenoGVHDモデルは、マウス細胞ではなくヒト細胞に対するヒト細胞療法を含む免疫抑制療法の効果の試験を可能にする。これは、クリニックに研究結果を適用する際の種の違いによる変動を低減します。xenoGVHDモデルは、T細胞研究の他の分野における生体内抑制アッセイとしても機能する。したがって、xenoGVHDモデルを用した実験の結果は、GVHDに加えて任意のヒトT細胞媒介性炎症性疾患に適用することができる。
xenoGVHD モデルには制限があります。これらには、診療所と比較した実験的変動性およびGVHD治療の可能な差異が含まれる。実験的な不整合は、マウス株の違い、PBMC注射部位、放射線量および微生物環境30、31に起因する可能性がある。したがって、このモデルを使用するラボは、一貫した結果を確保するためにこれらのパラメータを標準化しようとする必要があります。このプロトコルでは、スコアリングの変動を減らすのに役立つスコアリング方法について説明します。xenoGVHDデータの比較性を臨床結果に制限する可能性のある要因には、GVHD予防薬で治療された対照群の欠如およびxenoGVHDモデル31における調節の唯一の源としての照射の使用が含まれる。さらに、xenoGVHDのメカニズムは、ヒトGVHDにおける基礎となる病因を完全に要約するものではない。例えば、xenoGVHDモデルでヒトT細胞を活性化するのはホストAPCではなくドナーAPCであり、宿主APCはヒトGVHD7において重要な役割を果たす。したがって、ほとんどの前臨床モデルと同様に、xenoGVHDとヒトGVHDとの間には矛盾と非互換性があり、xenoGVHDから診療所へのデータの適用を制限する可能性があります。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
レーン・クリステンソンの研究室では、これらの実験で使用されるデジタルPCRマシンを提供し、提供される技術サポートを提供することを認めしたいと思います。また、トーマス・ヤンキー博士の指導と指導に感謝します。これらの研究は、トリップファミリー財団によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
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