Summary
여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.
Abstract
급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 혈액학적 결핍 및 악성 종양에 대한 치료로서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자에게 상당한 제한이다. 급성 GVHD는 공여자 T 세포가 외국 항원으로 숙주 조직을 인식하고 숙주에게 면역 반응을 장착할 때 발생한다. 현재 처리는 감염과 재발에 영향을 받기 쉬운 환자를 렌더링하는 유독한 면역 억제 약을 관련시킵니다. 따라서, 기증자 T 세포를 효과적으로 표적으로 하고 부작용을 감소시킬 수 있는 급성 GVHD 치료를 제공하기 위한 연구가 진행 중이다. 이 전 임상 작업의 대부분은 생체 내 시스템에서 뮤린 세포보다는 인간 세포에 면역 억제 요법의 테스트를 허용 하는 xenogenic GVHD (xenoGVHD) 뮤린 모델을 사용 합니다. 이 프로토콜은 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님과 표준화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 마우스 조직에 있는 인간 적인 T 세포를 검출하기 위하여 디지털 PCR를 사용하는 방법을 기술합니다, 이후에 시험된 치료의 효험을 정량화하기 위하여 이용될 수 있는. xenoGVHD 모델은 GVHD 요법을 테스트하는 모델뿐만 아니라 인간 T 세포를 억제 할 수있는 모든 치료법을 제공하며, 이는 많은 염증성 질환에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 가난한 예후를 가진 백혈병과 같은 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 환자를 위한 일상적인 처리가 되었습니다. HSCT의 중요한 합병증은 급성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)입니다. 2012년의 한 연구에서는 급성 GVHD가 형제 기증자로부터 이식을 받는 HSCT 환자의 39%와 관련없는기증자로부터 이식을 받는 환자의 59%에서 개발되었다고 보고했습니다 1. 급성 GVHD는 기증자 유래 T 세포가 수령인의 장기를 공격할 때 발생합니다. GVHD에 대한 유일한 성공적인 치료법은 매우 독성이 높고 감염 및 종양 재발의 위험을 증가시키는 고면역 억제 제2로 치료하는 것입니다. 따라서, 최근 몇 년 동안 급성 GVHD 생존에서 이루어진 개선에도 불구하고 3,4,5,장기 완화를 촉진하는 최소한의 독성으로 개선된 GVHD 요법에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다.
다음 방법의 전반적인 목표는 xenogeneic GVHD (xenoGVHD)를 유도하고 점수를 매기는 것입니다. xenoGVHD 모델은 임상 시험 6에 전임상 GVHD 연구를 보다 직접적으로 번역할 수 있도록 뮤린 세포가아닌 인간 세포로 급성 GVHD를 유도하는 도구로 개발되었다. 이 모형은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 SUBlethally 조사되는 NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) 마우스로 주입하는 것을 관련시킵니다. 주입된 인간 T 세포는 인간 항원 제시 세포(APC)에 의해 활성화되어 뮤린 항원과 활성화된 T세포가 전신 염증을 초래하고 궁극적으로 사망하는 먼 조직으로 이동한다 6,7, 8개 , 9개 , 10. xenoGVHD 모델의 질병 병리학 및 진행은 인간의 급성 GVHD를 밀접하게 모방합니다. 구체적으로, 병원성 인간 T 세포는 인간 GVHD6,9에서T 세포 동모활성과 유사한 뮤린 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 반응한다. 마우스 MHC 불일치 모델, 다른 널리 사용되는 GVHD 모델에 비해 xenoGVHD 모델의 주요 장점은, 뮤린 세포보다는 인간 세포에 대한 치료법의 테스트를 허용한다. 이것은 인간 세포를 표적으로 하기 위하여 만들어지기 때문에 어떤 수정도 없이 진료소에 직접 번역될 수 있는 제품의 시험을 허용합니다. 최근, 이 모델은 급성 GVHD에 대한 잠재적 치료제로서 인간 항-IL-2항체(11),인간 흉선 조절 T 세포(Tregs)12 및 인간 중간엽 줄기세포(13)를 시험하는데 사용되고 있다. 더 넓은 맥락에서, 이 모델은 인간 T 세포 활성을 억제할 수 있는 임의의 약물 또는 세포 유형에 대한 생체내 억제 분석법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stockis et al.14는 xenoGVHD 모델을 사용하여 생체 내 트레그 억제 활성에 대한 인테그린 αVβ8 차단 효과를 연구하였다. 따라서, xenoGVHD 모델은 생체 내 설정에서 T 세포를 표적화하는 임의의 치료의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
이 프로토콜에 기재된 추가방법은 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포를 검출하는 방법이다. 이 방법의 목표는 표적 조직에서 T 세포의 이동 및 증식을 정량화하는 도구를 제공하는 것이며, 이는 이 모델에서 시험되는 면역 억제 요법의 효능을 측정하는 것입니다. dPCR은 핵산(15)의 정량화를위한 비교적 새로운 방법이다. 간단히, PCR 반응 혼합물은 타겟 서열의 작은 숫자를 포함하는 파티션으로 분할또는 전혀 타겟이 없다. 표적 서열은 DNA 인터컬레이터 염료 또는 형광 표적 특이적 프로브를 사용하여 증폭및 검출된다. dPCR은 양극분할및 푸아송통계의 분수에 기초하여 대상 시퀀스의 사본 수를 정량화한다15,16. dPCR로 T 세포를 검출하는 것은 유세포 분석 및 조직학을 포함하여 다른 대체 방법에 비해 훨씬 적은 조직을 필요로 하며, 동결 또는 고정 된 조직에서 수행 될 수있다. dPCR은 복사 번호를 결정하기 위해 표준 곡선이 필요하지 않으며 기술 복제가 필요하지 않습니다. 이는 기존의 정량적 PCR(qPCR)16에비해 dPCR에 필요한 시약 및 템플릿 DNA의 양을 감소시킨다. PCR 반응을 dPCR에서 하위 반응으로 분할하는 것은 효과적으로 타겟17을집중시다. 따라서, dPCR은 주로 다량의 비표적 DNA에서 희귀 표적을 검출하기 위한 도구이다. 예를 들어, dPCR은우유(18)에서세균 오염을 검출하고, 에스트로겐 수용체 유전자(19)에서 드문 돌연변이를 식별하고, 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA를 검출하는 데 사용된다(20). 이 프로토콜에서, dPCR은 xenoGVHD를 가진 마우스의 조직에서 인간 T 세포를 검출하고 정량화하기 위한 효율적인 도구역할을 한다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 캔자스 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 거쳐 준수하고 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 건강한 인간 혈액 샘플은 캔자스 대학 의료 센터의 기관 검토 위원회의 승인을 받고 정보에 입각한 동의하에 얻어졌습니다.
1. NSG 마우스의 조사
- PBMC 주입 하루 전에, 조사 8-12 주 오래 된 NSG 마우스 (어느 섹스 사용할 수 있습니다). 멸균 된 생체 안전 성 캐비닛에 살균 된 파이 케이지 또는 마이크로 이졸레이터에 마우스를 놓습니다. Cs137 소스 또는 작은 동물 조사기(예를 들어, RS 2000)에서 마우스를 조사하여 총 투여량 150 cGy의 느린 회전으로 균등한 조사를 보장한다.
- 멸균 된 생체 안전 캐비닛에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다.
2. 주입을 위한 인간 PBMC의 준비
- 마우스 당 1.1 x 107 PBMC를 분리하기에 충분한 건강한 인간의 혈액을 수집합니다. 헤파린화된 혈액을 인산완충식염수(PBS)에서 2% 태아 소 혈청(FBS)의 동일한 부피로 희석합니다.
참고:이 프로토콜을 사용하면 PMBC 수율은 일반적으로 전혈 의 10 mL 당 0.5-1 x 10 7입니다. 각 마우스는 PBS의 100 μL에서 107 PBMC를 받게 됩니다. 마우스당 1x106 in 10 μL을 추가하면 각 마우스가 주사기를 채우는 데 문제가 있을 경우 PBMC의 전체 복용량을 받을 수 있습니다. - 50 mL 원엽 튜브에 15 mL 림프구 분리 밀도 그라데이션 배지 (예 : Ficoll)를 추가 한 다음 밀도 구배 위에 희석 된 혈액을 최대 25 mL까지 조심스럽게 오버레이하십시오. 제동없이 실온에서 40 분 동안 400 x g에서 밀도 그라데이션 및 희석 된 혈액을 포함하는 튜브를 원심 분리합니다.
- PBMC 인터페이스를 50 mL 원추형 튜브에서 10 mL의 PBS로 수확합니다. 세포를 400 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
- 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀고 10 mL PBS에서 다시 일시 중단하여 PBMC를 세척합니다. 세포를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- (선택 사항) 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 완충액을 추가하여 세포 펠릿에 상류층 및 용해 적혈구(RBC)를 폐기하고 펠릿 부피와 동일한 용해 완충액을 제거한다. 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 튜브를 30-60초 동안 소용돌이치면 30-60초 동안 튜브를 세럼프리 RPMI 로 채우고 튜브를 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상급체를 제거하고 PBS의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단시다. 혈세포계와 현미경으로 trypan 파란색 제외를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 세포를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상류세포를 제거하고 PBS에서 1 x 108 셀 / mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
3. 마우스에 인간 PBMC의 복고풍 궤도 주입21
- 무균을 유지하기 위해 마취 챔버를 층류 후드에 놓습니다. 마취 챔버를 5 % 이소플루란 및 1 L / 분 산소 유량으로 5 분 동안 미리 충전하십시오.
- 이소플루란을 2%로 줄이고 같은 케이지에서 생쥐를 마취실에 넣습니다. 일단 마우스가 오른쪽을 분실하면, 챔버에서 5 분 동안 마우스를 마취. 이 시간 동안, 세포 현탁액의 100 μL (1 x 107 세포)로 주사기를 미리 채웁니다.
- 마취를 유지하기 위해 코콘에 코를 가진 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 발 패드를 꼬집고 반사 부족을 확인하여 의식 상실을 확인하십시오.
- 엄지손가락과 가운데 손가락으로 마우스를 제지합니다. 28 G 1/2 바늘에 경사를 내측 캔티스로 측면으로 삽입하고, 눈 뒤쪽에 도달 할 때까지 결막을 통해 삽입하십시오. 바늘을 약간 후퇴시키고 천천히 100 μL의 세포 (1 x 107 세포)를 주입하십시오.
- 바늘을 완전히 철회하고 주사기와 바늘을 적절하게 폐기하십시오. 눈꺼풀을 닫고 거즈 스폰지로 주사 부위에 가벼운 압력을 가합니다.
- 붓기 또는 다른 눈에 보이는 외상에 대 한 주사 사이트를 검사. 홈 케이지로 이동하기 전에 침구의 열망을 방지하기 위해 종이 타월 줄 지어 멸균 케이지에서 의식을 회복 마우스를 할 수 있습니다. 출혈이 멈춘 후 진통을 위해 눈에 프로파라카인 한 방울을 바르고.
참고: 꼬리 정맥 주사는 Macholz 외22에의해 기술된 바와 같이 이 프로토콜을 위한 PBMC의 정맥 주입의 대체 방법이다.
4. 마우스에서 급성 GVHD의임상 점수 (그림 1)23
- GVHD 점수를 격일로 측정하여 마우스가 2점에 도달할 때까지 매일 그리고 희생의 날까지 매일 점수를 측정합니다.
- 케이지를 라미나 흐름 후드에 넣고 음식과 물을 제거하고 뚜껑을 다시 닫습니다. 5 분 동안 마우스를 관찰하고 다음과 같이 점수를 할당하여 점수를 점수 : 0 = 마우스는 몇 분 이내에 걷기 시작하고 케이지 주위를 걷기 시작하고, 1 = 마우스는 일어나서 케이지 주위에 천천히 걷는 데 몇 분 이상 걸립니다, 2 = 마우스는 일어나지 않습니다. 5 분 만 누르면 만져도 걸어야합니다.
- 유리 비커에 각 마우스를 무게와 체중 감소 점수를 제공 : 0 = <10 % 변화, 1 = 10-25 % 변경 및 2 = >25 % 변경.
- 마우스가 여전히 비커에 있는 동안 자세를검사합니다: 0 = 정상, 1 = 나머지에서 굽기, 2 = 직함 운동이 손상됩니다. 모피 질감: 0 = 정상, 1 = 중간 주름에 온화한, 2 = 심한 주름, 피부 무결성 : 0 = 정상, 발 / 꼬리의 1 = 스케일링, 2 = 누드 피부의 명백한 영역 (스케일링을위한 귀, 꼬리 및 발을 보십시오).
- 다섯 가지 범주와 각 카테고리에 대해 0-2의 점수로 마우스는 최대 점수 10에 도달할 수 있습니다. 마우스가 7점 이상에 도달하거나 42일 주사 후 도달하면, CO2 안락사 또는 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 다른 방법을 통해 마우스를 안락사시한다.
참고 : 결과의 정확성을 보장하기 위해, 점수는 치료 그룹24에눈을 멀게 한 연구원에 의해 수행됩니다. 추가적으로, 비록 >20% 체중 감소의 많은 IACUC 프로토콜에 대 한 권장된 인간적인 종점, 이 프로토콜의 추가 정당화 IACUC 승인을 얻을 수 있다.
5. 안락사 된 마우스에서 게놈 DNA를위한 조직을 수확하고 게놈 DNA를 분리
- 멸균 수술 도구를 사용하여 마우스를 해부하십시오. 관심있는 기관(예: 폐, 간 또는 비장)에서 약 3 mm x 0.5 mm 크기의 작은 조직을 잘라냅니다. 조직 샘플을 계량하고 조직 조각을 멸균 된 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 여러 조직을 수집하는 경우, 각 장기를 절단 사이에 에탄올로 도구를 씻어.
- 액체 질소에 조직을 포함하는 튜브를 침수하여 조직을 동결하여 버블링을 멈추고 하룻밤 -80°C에 보관합니다. 조직 샘플을 해동하고 게놈 DNA (gDNA) 격리 키트에 따라 그들을 용해.
- 키트에 기재된 바와 같이 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리합니다. 용출 된 gDNA (mg / μL)의 마이크로 리터 당 처리 된 조직의 양을 주의하십시오.
참고 : 냉동 조직은 나중에 처리를 위해 -80 °C에서 보관 할 수 있습니다.
6. 디지털 PCR을 사용하여 인간 T세포의 정량화 (그림 2)
- 사용되는 디지털 PCR 기계에 대한 DNA 결합 염료에 대한 프로토콜에 따라 디지털 PCR 반응을 준비한다. 인간 CD3 엡실론 게놈 DNA에 특이적인 다음 프라이머를 사용하소서(NCBI 기준 서열: NG_007383.1); 포워드 프라이머: AGGCTGCCTAACTCCCAAG, 역프라이머: GCCCTACCAGCTGTGGAAC. 이 프라이머는 105 bp의 단일 대역을 생성합니다.
참고: 게놈 DNA를 소화하기 위해 각 반응에 HindIII와 같은 제한 효소의 0.5 μL을 추가합니다. 양성 및 음성 방울의 분리를 최적화하기 위해 다른 gDNA 희석을 테스트해야합니다. 부가적으로, 침투하는 T 세포의 서브세트는 비병원성 조절 T 세포일 수 있다. 이들 세포는 조절 T 세포 마커에 대한 추가 프라이머를 사용하여 정량화될 수 있다. - 다음과 같은 조건하에서 디지털 PCR 반응을 수행한다: 105°C에서 뚜껑, 10분 동안 95°C(1사이클); 30초의 경우 95°C, 경사로 2°C/s 및 1분 동안 55°C, 램프 2°C/s(40사이클); 72°C에서 10분, 12°C 를 유지한다.
참고: 이러한 매개 변수는 디지털 PCR 장비에 따라 조정해야 할 수 있습니다. - 분석 소프트웨어로 디지털 PCR 데이터를 수집합니다. 다음 방정식을 사용하여 조직의 mg당 사본 수로 데이터를 보고합니다: (반응시 gDNA의 μL) x (희석 인자)/(총 gDNA의 조직/μL mg)
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Representative Results
인간 PBMC를 받은 남녀 모두의 8-12주 령 NSG 마우스를 치명적으로 조사한 결과, PBS만을 받은 음성 대조군 마우스에비해 10일 전후의 GVHD의 임상 적 징후를 보이기 시작했다(도 1A). XenoGVHD 마우스는 23.5 일의중간 생존을 가졌다 (도 1B). 디지털 PCR을 사용하면, CD3 엡실론 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신한 마우스의 폐 및 간 샘플에서 검출될 수 있었다. PBS를 주사한 마우스로부터의 조직 샘플을대조군으로 사용하였다(도 2).
도 1: GVHD 질환 진행. 8-12주령의 수컷 및 암컷 NSG 마우스를 1 x 107 인간 PBMC(n=6) 또는 PBS(n=4)로 레트로-궤도 주사하였다. 표시된 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 결합된 결과입니다. (A) GVHD 점수는 생쥐가 희생의 날까지 매일 2의 점수에 도달 할 때까지 격일로 측정하였다. GVHD 점수에 대한 각 시점에서 보고된 데이터는 각 그룹에서 사망한 마우스의 마지막 점수와 결합된 살아있는 마우스의 평균 ±SEM 점수이다. * P < 0.05 만 휘트니 U 테스트에 의해 결정. (B) 카플란-마이어 생존 곡선. GVHD 점수가 ≥7일 때 사망이 표시되었다. * p < 0.05 로그 순위 테스트에 의해 결정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 디지털 PCR을 사용하여 인간 T 세포의 검출. 폐 및 간 샘플은 마우스가 ≥7 또는 42일 주사 후 GVHD 점수에 도달했을 때 PBS(n=3) 또는 1 x 107 인간 PBMC(n=3)로 레트로 궤도 주사된 마우스로부터 수집하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 수집되었다. gDNA는 분리되었고 디지털 PCR은 조직의 밀리그램 당 인간 CD3 엡실론의 사본을 결정하기 위해 사용되었다. (a) PBS 또는 PBMC를 주입한 마우스로부터의 폐 및 간 샘플의 대표적인 디지털 PCR 플롯. (B) PBS 또는 PBMC로 주입된 마우스로부터의 조직 밀그램당 인간 CD3 엡실론의 사본을 정량화하였다. * 만 휘트니 U 테스트에 의해 결정된 p ≤ 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
질병 진행은 일반적으로 xenoGVHD 모델에서 일관적이며, 다른 공여자로부터 PBMC를 주사하더라도, 그래서 여러 실험을 결합할 수 있다. 이러한 일관성을 유지하는 데 필요한 주요 단계는 적절한 즉 주입 기술, 눈가리개 및 일관된 점수입니다. Nervi 등25에 의한 연구는 정맥 꼬리 정맥 주사에 비해, PBMC의 복고풍 궤도 주사가 더 일관된 생착과 더 심한 GVHD 귀착되었다는 것을 보여주었습니다. Leon-Rico 외26은 또한 레트로 궤도 주사가 꼬리 정맥 주사에 비해 마우스에서 보다 일관된 조혈 줄기 세포 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 필요한 경우, 꼬리 정맥 주사는 xenoGVHD 모델27,28,29에서대체 방법으로 사용될 수 있다.
꼬리 정맥 주사와 관련되었던 결과의 가변성의 문제는 과목의 수를 증가시킴으로써 감소될 수 있습니다. 추가적으로, 마우스를 득점하는 사람이 활동 또는 모피 질감과 같은 더 주관적인 기준의 득점에 있는 편견을 피하기 위하여 마우스 처리에 눈을 멀게 하는 것이 중요합니다. 맹검 GVHD 점수의 중요성은 또한 진료소24에서입증되었습니다. 마우스를 주입하는 사람은 마우스를 득점하는 동일한 사람이 어서는 안됩니다. 이것이 가능하지 않은 경우에, 통제 및 처리 관은 다른 사람에 의해 새로운 ID의 무작위화되고 표지될 수 있습니다 (즉, 통제는 A, 처리는 B입니다) 그래서 주사는 눈을 멀게 할 수 있습니다. 마우스 채점은 매일 같은 시간 및 다른 실험 들 간의 주입 후 같은 날에 수행되어야 합니다.
이 모델의 잠재적인 장애물 중 하나는 GVHD 개발의 부족입니다. 이것은 trypan 파란색으로 세포를 계수하여 PBMC의 생존 가능성을 확인하여 해결할 수있는 PBMC의 생존력 감소로 인한 것일 수 있습니다. 세포 생존에 문제가 발생하면, 세포는 생존을 개선하기 위해 2 % FBS로 보충 PBS에 넣을 수 있습니다. 또한, 적은 마우스는 실온에 앉아 있는 시간 세포를 감소시키기 위해 한 번에 주입될 수 있다. 레트로 궤도 주입의 효능이 문제가 될 수 있습니다. PBMC로 주입되지만 GVHD를 개발하지 않는 마우스는 안락사될 수 있고 그들의 비장으로부터 분리된 면역 세포는 dPCR 또는 유세포측정을 통해 인간 세포의 존재를 분석할 수 있다. 가난한 생착이있는 경우 주사 기술에 문제가있을 수 있습니다. 주사 기술의 시험으로서, 마우스는 에반스 블루 염료의 200 μL로 레트로 궤도로 주입될 수 있다. 주사가 성공하면 마우스의 귀, 발 및 꼬리가 파란색으로 바뀝니다.
xenoGVHD 모델은 인간의 급성 GVHD 질환 병인 및 진행성30을밀접하게 모방합니다. 뮤린 MHC 불일치 GVHD 모델과는 달리, xenoGVHD 모델은 뮤린 세포가 아닌 인간 세포에 대한 인간 세포 요법을 포함한 면역 억제 요법의 효과를 테스트할 수 있습니다. 이것은 진료소에 연구 결과를 적용할 때 종 다름 때문에 변이를 감소시킵니다. xenoGVHD 모델은 또한 T 세포 연구의 다른 분야에서 생체 내 억제 분석의 역할을 할 수 있습니다. 따라서, xenoGVHD 모델을 이용한 실험으로부터의 결과는 GVHD 이외에 임의의 인간 T 세포 매개 염증성 질환에 적용될 수 있다.
xenoGVHD 모델에는 제한이 있습니다. 이들은 임상 진료소에 비교된 GVHD 처리에 있는 실험적인 가변성 그리고 가능한 다름을 포함합니다. 실험적 불일치는 마우스 균주의 차이, PBMC 주사 부위, 방사선 량 및 미생물 환경30,31에서비롯될 수 있다. 따라서 이 모델을 사용하는 실험실은 일관된 결과를 보장하기 위해 이러한 매개 변수를 표준화하려고 시도해야 합니다. 이 프로토콜에서는 점수 매기기의 가변성을 줄이는 데 도움이 되는 채점 방법을 설명합니다. 임상 결과에 xenoGVHD 데이터의 비교성을 제한할 수 있는 요인은 GVHD 예방 약물로 취급된 대조군의 부족및 xenoGVHD 모델31에서유일한 컨디셔닝 소스로서의 조사의 사용을 포함한다. 추가적으로, xenoGVHD의 기계장치는 인간 GVHD에 있는 근본적인 병인을 완전히 되풀이하지 않습니다. 예를 들어, 제노GVHD 모델에서 인간 T 세포를 활성화시키는 호스트 APC보다는 공여자 APC가 있는 반면,호스트 APC는 인간 GVHD 7에서 중요한 역할을 한다. 따라서 대부분의 전임상 모델과 마찬가지로 xenoGVHD와 인간 GVHD 사이에는 불일치와 비호환성이 있어 xenoGVHD에서 생성된 데이터의 응용을 클리닉으로 제한할 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
우리는 이러한 실험에 사용되는 디지털 PCR 기계를 제공하고 제공되는 기술 지원을 위해 Lane Christenson의 실험실을 인정하고 싶습니다. 또한 토마스 양키 박사님의 지도와 멘토링에 감사드립니다. 이러한 연구는 트립 가족 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
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