Summary
Здесь мы представляем протокол, чтобы вызвать и оценка болезни в ксеногенных трансплантата против хозяина болезни (xenoGVHD) модели. xenoGVHD обеспечивает модель in vivo для изучения иммуносупрессии Т-клеток человека. Кроме того, мы описываем, как обнаружить человеческие Т-клетки в тканях с помощью цифрового ПЦР в качестве инструмента количественной оценки иммуносупрессии.
Abstract
Острая трансплантация против хозяина болезни (GVHD) является значительным ограничением для пациентов, получающих гематопоитической трансплантации стволовых клеток в качестве терапии гематологических недостатков и злокачественных новообразований. Острый GVHD происходит, когда донор Т-клетки признают ткани хозяина как чужеродный антиген и монтировать иммунный ответ на хозяина. Текущее лечение включает токсичные иммуносупрессивные препараты, которые делают пациентов восприимчивыми к инфекции и рецидива. Таким образом, в настоящее время проводятся исследования, чтобы обеспечить острую терапию GVHD, которая может эффективно ориентироваться на донорские Т-клетки и уменьшить побочные эффекты. Большая часть этой доклинической работы использует ксеногечную модель murine GVHD (xenoGVHD), которая позволяет проводить тестирование иммуносупрессивных методов лечения на клетках человека, а не на мориновых клетках в системе in vivo. В этом протоколе описывается, как вызвать xenoGVHD и как ослепить и стандартизировать клинический скоринг для обеспечения последовательных результатов. Кроме того, этот протокол описывает, как использовать цифровые ПЦР для обнаружения Т-клеток человека в тканях мыши, которые впоследствии могут быть использованы для количественной оценки эффективности тестируемых методов лечения. Модель xenoGVHD не только обеспечивает модель для тестирования терапии GVHD, но любая терапия, которая может подавлять человека Т-клеток, которые затем могут быть применены ко многим воспалительным заболеваниям.
Introduction
Аллогенная гематопоатическая трансплантация стволовых клеток (HSCT) стала рутинным лечением для пациентов, страдающих гематологическими злокачественными новообразованиями, такими как лейкемия с плохим прогнозом. Значительным осложнением ВпГТ является острая трансплантата против принимающей болезни (GVHD). Исследование 2012 года сообщило, что острый GVHD разработан в 39% пациентов HSCT, получающих трансплантации от братьев и сестер доноров и 59% пациентов, получающих трансплантации от неродственных доноров1. Острый GVHD происходит, когда полученные донором Т-клетки атакуют органы реципиента. Единственной успешной терапией Для GVHD являетсялечение высокоиммуносупрессивными препаратами 2, которые являются высокотоксичными и повышают риск заражения и рецидива опухоли. Таким образом, несмотря на улучшения, которые были сделаны в острой выживания GVHD в последние годы3,4,5, есть еще критическая потребность в улучшении Терапии GVHD с минимальной токсичностью, которые способствуют долгосрочной ремиссии.
Общая цель следующих методов заключается в том, чтобы побудить и забить ксеногенных GVHD (xenoGVHD). Модель xenoGVHD была разработана как инструмент для индуцирования острого GVHD с человеческими клетками, а не murine клетки, что позволяет более прямой перевод доклинических исследований GVHD клинических испытаний6. Эта модель включает в себя внутривенно инъекционные человеческие периферические клетки крови (PBMC) в NOD-SCID IL-2R null (NSG) мышей, которые сублетально облучены. Введенные т-клетки человека активируются человеческими антигенами, представляющими клетки (APCs), представляющие антиген мурин,и активированные Т-клетки мигрируют в отдаленные ткани, что приводит к системному воспалению и, в конечном счете, смерти 6,7, 8 , 9 До 9 , 10. Патология болезни и прогрессирование в модели xenoGVHD тесно имитируют острое ГВГД человека. В частности, патогенные человеческие Т-клетки реагируют на мурин основных гистосовместимости комплекса (MHC) белков, который похож на т-клеток аллелореактивность в человека GVHD6,9. Основным преимуществом модели xenoGVHD по сравнению с моделью мыши MHC-mismatch, другой широко используемой моделью GVHD, является то, что она позволяет проводить тестирование терапии на клетках человека, а не на моринклетках. Это позволяет для тестирования продуктов, которые могут быть непосредственно переведены в клинику без каких-либо изменений, потому что они сделаны для целевой человеческих клеток. Недавно эта модель была использована для тестирования человека анти-IL-2 антитела11, человека тимических регуляторных Т-клеток (Tregs)12 и человека мезенхимальных стволовых клеток13 в качестве потенциального лечения острой GVHD. В более широком контексте, эта модель может быть использована в качестве in vivo подавления асссы для любого препарата или типа клеток, которые могут подавить активность Т-клеток человека. Например, Stockis et al.14 использовали модель xenoGVHD для изучения влияния блокирования интергрина ЗВЗ8 на супрессивную активность Treg in vivo. Таким образом, модель xenoGVHD может дать представление о механизме любой терапии, ориентированной на Т-клетки в условиях in vivo.
Дополнительный метод, описанный в этом протоколе, заключается в том, как обнаружить Т-клетки человека в тканях мыши с помощью цифровой цепной реакции полимеразы (dPCR). Цель этого метода заключается в том, чтобы предложить инструмент для количественной оценки миграции и распространения Т-клеток в целевых тканях, которые измеряют эффективность иммуносупрессивных методов лечения, тестируемых в этой модели. dPCR является относительно новым методом количественной оценки нуклеиновых кислот15. Короче говоря, смесь реакции ПЦР делится на разделы, которые содержат небольшое количество целевой последовательности или вообще не нацелена. Затем целевая последовательность усиливается и обнаруживается с помощью интеркалирующихся красителей ДНК или флуоресцентных целевых зондов. dPCR количественно количество копий целевой последовательности на основе доли положительных разделов и статистики Пуассона15,16. Обнаружение Т-клеток с dPCR требует гораздо меньше ткани по сравнению с другими альтернативными методами, включая цитометрию потока и гистологии, и может быть выполнена на замороженных или фиксированных тканей. dPCR не требует стандартной кривой для определения номеров копий, равно как и не требуется техническая реплика. Это уменьшает количество реагента и шаблона ДНК, необходимых для dPCR по сравнению с традиционными количественными ПЦР (qPCR)16. Раздел реакции ПЦР на субреакции в dPCR эффективно концентрирует цели17. Таким образом, dPCR является в первую очередь инструментом для обнаружения редких целей в большом количестве нецелевой ДНК. Например, dPCR используется для обнаружения бактериального загрязнения в молоке18, выявления редких мутаций в гене рецептора эстрогена19, и обнаружить циркулирующую ДНК опухоли в крови пациентов20. В этом протоколе dPCR служит эффективным инструментом для обнаружения и количественной оценки Т-клеток человека в тканях мышей с ксеноГВД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с и с одобрения, Университет Канзаса Медицинский центр институционального ухода за животными и использования комитета. Все здоровые образцы крови человека были получены по информированным согласиям и с одобрения Институционального совета по обзору в Медицинском центре Университета Канзаса.
1. Облучение NSG мышей
- За день до инъекции PBMC, облучать 8-12-недельный NSG мышей (либо пол может быть использован). В стерильной биобезопасности шкаф, место мышей в стерилизованной клетке пирог или микроизолатор. Облучение мышей в источнике Cs137 или мелких животных облятителя (например, RS 2000) с общей дозой 150 cGy с медленным вращением, чтобы обеспечить даже облучение.
- Поместите мышей в чистые клетки в стерильный шкаф биобезопасности.
2. Подготовка человека PBMC для инъекций
- Соберите достаточно здоровой человеческой крови, чтобы изолировать 1,1 х 107 PBMC на мышь. Разбавить гепаринизированную кровь в равном объеме 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в фосфатах буферного солима (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: С этим протоколом, выход PMBC вообще 0.5-1 x 107 в 10 mL всей крови. Каждая мышь получит 107 PBMC в 100 Л PBS. Дополнительные 1 х 106 в 10 л на мышь гарантирует, что каждая мышь получает полную дозировку PBMC, если возникнут какие-либо проблемы с заполнением шприцев. - Добавьте 15 мл лимфоцитов градиентной среды плотности разделения (например, Ficoll) в коническую трубку 50 мл, а затем тщательно налейте до 25 мл разбавленной крови поверх градиента плотности. Центрифуга трубки, содержащей градиент плотности и разбавленной крови на 400 х г в течение 40 минут при комнатной температуре без тормоза.
- Урожай pbMC интерфейс в 10 мл PBS в 50 мл конической трубки. Центрифуги клетки на 400 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант.
- Loosen гранулы, щелкая трубки и resuspend в 10 мл PBS для мытья PBMC. Центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 мин.
- (Необязательно) Откажитесь от супернатанта и лиза красных кровяных телец (РБК) в клеточных гранулах, добавив объем буфера лиза аммиак-хлорид-калия (ACK), который равен объему гранул. Аккуратно resuspend гранулы и закружить трубку в течение 30-60 с. Заполните трубку с сыворотки свободного RPMI средств массовой информации и центрифуги трубки на 400 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и повторно приостановить клеточной гранулы в 5 мл PBS. Подсчитайте клетки, используя трипан синее исключение с гемоситометром и микроскопом.
- Центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и resuspend клеток на 1 х 108 клеток / мл в PBS.
3. Ретро-орбитальная инъекция человека PBMC в мышей21
- Поместите анестезию камеры в ламинарный капот потока для поддержания бесплодия. Предварительно зарядите анестезионную камеру 5% изофлураном и 1 л/мин частотой потока кислорода в течение 5 мин.
- Уменьшить изолюран до 2% и положить мышей из той же клетки в анестезии камеры. После того, как мыши теряют выправление, анестезируют мышей в течение 5 минут в камере. В течение этого времени предварительно заполняйте шприц с 100 зл (1 х 107 ячеек) клеточной суспензии.
- Поместите мышь на грелку с носом в носовой конус для поддержания анестезии. Проверьте потерю сознания, щипать подножку и проверки на отсутствие рефлекса.
- Удерживай мышь большим и средним пальцем. Вставьте 28 G 1/2 в игле с скотом вниз боковой к медиальной canthus, через конъюнктивальную мембрану до тех пор, пока задняя часть глаза не будет достигнута. Слегка ввязайте иглу и медленно впрысните 100 л клеток (1 х 107 клеток).
- Полностью ввейд иглы и правильно распоряжаться шприц и иглы. Закройте веко и нанесите мягкое давление на место инъекции марлевой губкой.
- Изучите место инъекции на отек или другие видимые травмы. Позвольте мыши прийти в сознание в стерильной клетке выстроились с бумажными полотенцами, чтобы предотвратить стремление постельных принадлежностей перед переездом в домашнюю клетку. После любого кровотечения остановился, применять одну каплю пропаракаина в глаз для обезболивающего.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция хвостовой вены является альтернативным методом внутривенной инъекции PBMC для этого протокола, как описано Macholz и др.22.
4. Клиническая скоринг острой ГВГД у мышей(рисунок 1)23
- Измерение GVHD оценка через день, пока мыши достичь оценка 2, а затем каждый день до дня жертвоприношения.
- Поместите клетку в ламинарный капот потока, удалить пищу и воду и положить крышку обратно. Оценка деятельности, наблюдая мышей в течение 5 минут и назначить оценки следующим образом: 0 мышь начинает ходить в течение нескольких минут и продолжает ходить вокруг клетки, 1 мышь занимает более пары минут, чтобы встать и медленно ходит вокруг клетки, 2 мыши не вставать в 5 мин и только ходит при прикосновении.
- Взвесьте каждую мышь в стакане и дайте оценку потери веса: 0 й lt;10% изменения, 1 й 10-25% изменения и 2 йgt;25% изменения.
- В то время как мышь все еще находится в стакане, проинспектировать для осанки: 0 - нормально, 1 й горб в покое, 2 и горб ухудшает движение; текстура меха: 0 - нормальная, 1 - от легкой до умеренной ruffling, 2 - сильный ruffling, и целостность кожи : 0 - нормальный, 1 - масштабирование лап/хвоста, 2 - очевидные участки оголенной кожи (посмотрите на уши, хвост и лапы для масштабирования).
- С пятью категориями и счетом 0-2 для каждой категории, мышь может достичь максимального балла 10. Когда мышь достигает оценки 7 или больше или достигает 42 дней после инъекции, эвтаназии мыши с помощью CO2 эвтаназии или другой метод, утвержденный местным институциональным комитетом по уходу и использованию животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности результатов, оценка выполняется исследователем, который ослеплен на лечение групп24. Кроме того, хотя 20% потери веса тела является рекомендуемой гуманной конечной точкой для многих протоколов IACUC, с дополнительным обоснованием одобрения IACUC этого протокола могут быть получены.
5. Сбор тканей для геномной ДНК у эвтанированных мышей и изоляция геномной ДНК
- Вскрыть мышей с помощью стерильных хирургических инструментов. Отрежьте небольшой кусочек ткани размером около 3 мм х 0,5 мм от интересуемого органа, например, легких, печени или селезенки. Взвесьте образец ткани и поместите кусок ткани в стерильную трубку 1,5 мл. При сборе нескольких тканей, мыть инструменты с этанолом между резки каждого органа.
- Заморозить ткани, погружая трубки, содержащие ткани в жидком азоте, пока он не останавливается восходящей и хранить в -80 градусов по Цельсию на ночь. Оттепель образцы тканей и лизаих их в соответствии с геномной ДНК (gDNA) изоляции комплект.
- Изолировать геномную ДНК в соответствии с инструкциями производителя, как описано в комплекте. Не забудьте отметить количество ткани, которая была обработана на микролитр элеты гДНК (мг/Л).
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные ткани могут храниться при -80 градусах По Цельсию для обработки в более позднее время.
6. Количественная оценка Т-клеток человека с использованием цифровых ПЦР(рисунок 2)
- Подготовка цифровых реакций ПЦР в соответствии с протоколом для ДНК связывающих красителей для цифровой машины ПЦР используется. Используйте следующие праймеры, специфические для геномной ДНК CD3 epsilon (NCBI Reference Sequence: NG-007383.1); Форвард Праймер: AGGCTCTTAACTAAGAAG, Обратный праймер: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Эти праймеры дадут одну полосу 105 bp.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,5 л фермента ограничения, такого как HindIII, к каждой реакции, чтобы переварить геномную ДНК. Обязательно протестируйте различные разбавления гДНК, чтобы оптимизировать разделение положительных и отрицательных капель. Кроме того, подмножество инфильтрации Т-клеток может быть непатогенным регулятивным Т-клеток. Эти клетки могут быть количественно с помощью дополнительных грунтовок для регуляторных маркеров Т-клеток. - Провести цифровую реакцию ПЦР при следующих условиях: Lid при 105 градусах По кВ, 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин (1 цикл); 95 градусов по Цельсию на 30 с, рампа 2 КС/с и 55 градусов по Цельсию в течение 1 мин, пандус 2 КС/с (40 циклов); 72 КК в течение 10 мин, 12 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры, возможно, должны быть скорректированы в зависимости от цифрового оборудования ПЦР. - Приобретение цифровых данных ПЦР с помощью аналитического программного обеспечения. Отчетные данные как цифры копий на мг ткани с использованием следующего уравнения: (количество копий/КЛ) x (КЛ гДНК в реакции) x (фактор разбавления)/(мг ткани/Л общего гДНК)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сублетально облученных 8-12-недельный NSG мышей обоих полов, которые получили человека PBMC начал показывать клинические признаки GVHD около дня 10 после инъекции по сравнению с отрицательным контроля мышей, которые получили PBS только (Рисунок 1A). XenoGVHD мышей было среднее выживание 23,5 дней(рисунок 1B). С помощью цифровых ПЦР, CD3 epsilon положительные человеческие Т-клетки могут быть обнаружены в легких и печени образцы мышей, которые получили человека PBMC. Образцы тканей у мышей, вводимых с помощью PBS, использовались в качестве элементов управления(рисунок2).
Рисунок 1: Прогрессирование заболевания GVHD. Сублетально облученные 8-12-недельных мышей NSG были ретро-орбитально введены с 1 х 107 человека PBMC (n No 6) или PBS (n No 4) в качестве отрицательного контроля. Показанные данные являются комбинированными результатами трех независимых экспериментов. (A) Оценка GVHD измерялась через день, пока мыши не достигли оценки 2, а затем каждый день до дня жертвоприношения. Данные, представленные в каждый момент времени для GVHD оценка является средним - SEM оценка живых мышей в сочетании с последними оценками любых умерших мышей в каждой группе. p qlt; 0.05, как определено испытанием Mann Whitney U. (B) Каплан-Мейер кривой выживания. Смерть была отмечена, когда оценка GVHD была No7. р-р злт; 0,05, как это определено тестом ранга журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обнаружение Т-клеток человека с использованием цифровых ПЦР. Образцы легких и печени были собраны у мышей, которые были ретро-орбитально введены с PBS (n No 3) или 1 х 10человека PBMC (n No 3), когда мыши достигли GVHD оценка 7 или 42 дней после инъекции. Данные были собраны в ходе 3 независимых экспериментов. gDNA был изолирован и цифровой ПЦР был использован для определения копий человеческого CD3 эпсилон на миллиграмм ткани. (A) Представитель цифровой участок ПЦР легких и печени образцов из мыши вводят с PBS или PBMC. (B) Количественная оценка копий человеческого EP3 epsilon на милзер ткани от мышей, вводимых с PBS или PBMC. р 0,05 в порядке, установленном тестом Mann Whitney U. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прогрессирование заболевания, как правило, последовательно в модели xenoGVHD, даже с инъекцией PBMC от различных доноров, так что несколько экспериментов могут быть объединены. Ключевыми шагами, необходимыми для поддержания этой последовательности, являются правильный i.v. метод инъекций, ослепляющий и последовательный скоринг. Исследование Nervi et al.25 показало, что по сравнению с инъекционными инъекциями хвостовой вены ретро-орбитальные инъекции PBMC привели к более последовательному прививок и более тяжелым ГВБД. Leon-Rico et al.26 также продемонстрировали, что ретроорбитальные инъекции привели к более последовательному гематопоитическим прививкам стволовых клеток у мышей по сравнению с инъекцией хвостовой вены. Однако, при необходимости, инъекции хвостовой вена могут быть использованы в качестве альтернативного метода в модели xenoGVHD27,28,29.
Проблема изменчивости исходов, связанных с инъекциями хвостовой вена, может быть уменьшена за счет увеличения числа испытуемых. Кроме того, важно, чтобы человек забил мышей ослеплен лечения мыши, чтобы избежать предвзятости в скоринга более субъективные критерии, такие как деятельность или текстуры меха. Важность ослепленного GVHD скоринга также была продемонстрирована в клинике24. Человек инъекционных мышей не должно быть тем же человеком забил мышей. Если это невозможно, контроль и лечение трубки могут быть рандомизированы и помечены с новым ID другим человеком (т.е., контроль является, лечение B), так что инъекции могут быть ослеплены. Мышь скоринга должны быть выполнены примерно в то же время каждый день и в те же дни после инъекции между различными экспериментами.
Одним из потенциальных препятствий в этой модели является отсутствие разработки GVHD. Это может быть связано с снижением жизнеспособности PBMC, которые могут быть решены путем проверки жизнеспособности PBMC путем подсчета ячеек с трипан синий. Если возникают проблемы с жизнеспособностью клеток, клетки могут быть помещены в PBS дополнены 2% FBS для улучшения выживания. Кроме того, меньше мышей можно вводить в то время, чтобы уменьшить время клетки сидят при комнатной температуре. Проблема может быть связана с эффективностью ретроорбитальной инъекции. Мыши, которые вводят с ПБМК, но не развиваются GVHD могут быть усыплены и иммунные клетки изолированы от их селезенки могут быть проанализированы на наличие человеческих клеток через dPCR или поток цитометрии. Если есть плохой прививования, то, вероятно, проблема с инъекционной техникой. В качестве теста методинъекционных, мышей можно вводить ретро-орбитально с 200 Зл Эванс синий краситель. Если инъекция будет успешной, уши, лапы и хвост мыши посинели.
Модель xenoGVHD тесно имитирует человеческий острый патогенез болезни ГВХЗ и прогрессирование30. В отличие от модели Murine MHC, модель XenoGVHD позволяет проверить влияние иммуносупрессивных методов лечения, в ключая терапию клеток человека, на клетки человека, а не на морины. Это уменьшает различия из-за различий видов при применении результатов исследований в клинике. Модель xenoGVHD также может служить в качестве проверки подавления in vivo в других областях исследования Т-клеток. Таким образом, результаты экспериментов с использованием модели xenoGVHD могут быть применены к любому человеку Т-клеточного опосредованного воспалительного заболевания в дополнение к GVHD.
Существуют ограничения модели xenoGVHD. К ним относятся экспериментальная изменчивость и возможные различия в лечении GVHD по сравнению с клиникой. Экспериментальные несоответствия могут вытекать из различий в штамме мыши, участках инъекций PBMC, дозе радиации и микробной среде30,31. Таким образом, лаборатории, использующие эту модель, должны попытаться стандартизировать эти параметры для обеспечения последовательных результатов. В этом протоколе мы описываем методы скоринга, которые помогают уменьшить изменчивость в скоринге. Факторы, которые могут ограничить сопоставимость данных xenoGVHD к клиническим исходам, включают отсутствие контрольных групп, обработанных профилактическими препаратами GVHD, и использование облучения в качестве единственного источника кондиционирования в модели xenoGVHD31. Кроме того, механизм xenoGVHD не полностью резюмирует основной патогенез в ГВГД человека. Например, это донорские БТР, а не принимающие БТР, которые активируют Т-клетки человека в модели xenoGVHD, в то время как хост БТРы играют значительную роль в GVHD7человека. Таким образом, как и в большинстве доклинических моделей, существуют несоответствия и несовместимость между xenoGVHD и гВХД человека, которые могут ограничить применение данных, полученных от xenoGVHD в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не было заявлено.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить лабораторию Lane Christenson за предоставление цифровой машины ПЦР, используемой в этих экспериментах, и за техническую поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Томаса Янки за его руководство и наставничество. Эти исследования были поддержаны Фондом семьи Трипп.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
References
- Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
- Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).
- Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).
- Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).
- Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).
- Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).
- Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).
- Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).
- Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).
- Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).
- Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).
- Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).
- Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).
- Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).
- Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).
- Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).
- van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).
- Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation? Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).
