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Biochemistry

培养细胞功能化纳米化对跨 golgi 网络的内分泌吸收和逆行迁移分析

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

蛋白质从细胞表面逆行运输到 golgi 是维持膜稳态所必需的。在这里, 我们描述了一种方法, 生物化学分析细胞地对golgi 的重组蛋白运输使用功能化纳米棒在海拉细胞。

Abstract

蛋白质和膜从细胞表面输送到 golgi 和更远的地方对于稳态、细胞器身份和生理是必不可少的。为了研究逆行蛋白的流量, 我们最近开发了一个基于纳米生物的多功能工具包, 通过固定和活细胞成像、电子显微镜或生化方法来分析从细胞表面到 golgi 复合体的迁移。我们设计了功能化的抗绿色荧光蛋白 (gfp) 纳米棒--小的、单体的、高亲和力的蛋白质粘合剂--它可以应用于细胞外 gfp 分子表达感兴趣的膜蛋白的细胞系。衍生纳米棒绑定到 gfp 记者是专门内化和运输搭载沿记者的排序路线。用荧光显微镜和活体成像技术对纳米无孔进行了功能化, 以跟踪荧光的逆行迁移, 并利用抗坏血酸过氧化物酶 2 (apex2) 研究了报告-纳米-机器人复合物电子的超微结构定位显微镜, 并与酪氨酸硫化 (ts) 的主题, 以评估动力学跨 golgi 网络 (tgn) 的到来。在这篇方法性文章中, 我们概述了细菌表达和纯化功能化纳米棒的一般程序。我们说明了我们的工具的强大用途, 使用 mcherry-l 和 ts 修饰纳米生物来分析内循环吸收和货物蛋白的 tgn 到达。

Introduction

蛋白质和脂质从细胞表面逆行到不同的细胞内隔间, 对于维持膜内的稳态以平衡分泌和回收前级运输机械的成分至关重要 1,2. 通过环素依赖性或-独立性依赖性的内化后, 蛋白质和脂质货物首先填充早期内质体, 从那里它们沿着溶酶体系统进一步重定向, 回收到质膜,或针对跨 golgi 网络 (tgn)。从内质体和细胞表面或细胞表面到 tgn 的回收是一些前品位跨膜货物受体的功能循环的一部分, 例如依赖阳离子和与阳离子无关的曼鼻-6-磷酸盐受体 (cdmpr 和 cimpr)新合成的从 tgn 到晚期内生体和溶酶体 3、4、5、旋毛蛋白和索拉6、7和 Wntless (wls) 的溶酶体水解酶将 wnt 配体输送到细胞表面8,9,10,11. 回收回 tgn 的其他蛋白质是 tgn46 及其相关的异形12、13、14、snares (可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感的融合因子附着受体)15,16,17、淀粉样体前体蛋白 (app)18,19, 进行性强直 (ank) 蛋白20, 金属转运体如 atp7a/b 或 dmt121、22和跨膜加工酶, 包括羧肽酶 d, 呋喃或 bce123,24,25。除了这些内源性蛋白质外, 细菌和植物毒素 (如滋贺和霍乱毒素、黄素和阿林) 还劫持逆行运输机械, 使其到达 er, 以便逆行进入细胞溶胶26、27, 28,29。

为了直接分析逆行交通, 我们以前开发了一个基于纳米生物的工具包, 用于标记和跟踪从细胞表面到细胞内隔间的货物蛋白质.纳米生物是一种新的蛋白质粘合剂家族, 它们来源于同源重链的抗体 (hcabs), 自然存在于骆驼和软骨鱼类中 31,32。它们构成了 hcabs 的可变重链域 (vhh), 与传统抗体 (例如 igg) 相比具有许多优点: 它们是单体、小 (~ 15 kda)、高度溶解性、无二硫键、可细菌表达, 并可选择高亲和力结合33,34,35,36。为了使我们的纳米机器人工具用途广泛, 我们使用功能化的抗 gfp 纳米机器人在表面标记和跟踪标记为 gfp 的蛋白质在他们的外皮膜内。通过纳米棒与 mcherry、抗坏血酸过氧化物酶 2 (apex2)或酪氨酸硫化 (ts) 序列的功能化, 可以通过固定和活细胞成像分析真正跨膜货物蛋白的逆行迁移, 通过电子显微镜, 或生物化学。由于酪氨酸磺酸硫化介导的酪氨酸蛋白磺酸盐转移酶 (tpst1 和 tpst2) 是一种后置修饰, 仅限于跨 golgi/tgn, 我们可以直接研究感兴趣的蛋白质从细胞表面到这个的迁移和动力学。细胞内的 golgi隔间38,39,40。

在这篇方法的文章中, 我们描述了功能化纳米棒模具 (vh-2xts,-apex2,-mcherry 和衍生物) 的易用性, 适用于许多应用, 以分析哺乳动物细胞中的逆行运输30。我们主要研究了 ts 位修饰纳米无菌分析细胞内交通从细胞表面到硫化室的方法。

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Protocol

1. 功能化纳米化的细菌转化

请注意:该协议针对功能化抗 gfp 纳米波模的表达、纯化和分析进行了优化, 如前面所述.与其他蛋白质分子的衍生化可能需要修改这个标准协议。

  1. 解冻化学主管细菌 (~ 100μl), 适合于蛋白质表达 (例如, 罗塞塔bl21 (de3) 细胞), 将它们放在冰上。
    请注意:根据标准实验室程序制备具有化学能力的细菌细胞。或者, 化学上有能力的细菌细胞可以通过商业方式购买。
  2. 加入50纳克的质粒编码功能化纳米棒。为了使纳米体记者在细菌表达过程中具有足够的位特异性生物素化, 还添加了细菌表达质粒的三倍过剩 (150 纳克) 编码生物素连接酶 bira (关于质粒信息, 另见表 1 )。轻轻向上和向下移出。
    请注意:如果纳米生物素化不是必要的, 或者纳米生物检测人员没有生物素受体肽 (bap), 则不需要与质粒编码 bira 共同转化。
  3. 在冰上培养细菌细胞30分钟。
  4. 在42°c 的温度下将细菌细胞放置在水浴或加热块中, 热休克细菌细胞1分钟。
  5. 加入1毫升室温 (rt) 尿液 (lb) 培养基, 在37°c 条件下将转化后的细菌在热莫沙克中孵育 1小时, 使耐药基因表型表达。制备 1 l lb 培养基, 平衡5克酵母提取物、10克色氨酸和10克氯化钠, 加满水, 并进行高压灭菌。如果功能化纳米体被克隆在含有抗氨基西霉素/卡比西林的表达载体中, 则可以省略步骤1.5。
  6. 将细菌以 11, 000 x g 的速度将其颗粒状 1分钟, 并在100μl 的新鲜 lb 培养基中重新悬浮。
  7. 将悬浮细菌刻在含有各自抗生素的 lb 板上 (例如, 当细菌与纳米体记者和 bira 共同转化时, 用50μgml 卡那霉素和50μgml 卡比西林 (步骤 1.2))。
  8. 将 lb 板放入37°c 的孵化器中, 让它们在夜间生长 (o n)。
    请注意:该协议可以在这里暂停通过存储 lb 板与生长的殖民地在4°c。使用副管密封 lb 板。

2. 细菌液体培养及功能化纳米体表达的诱导

  1. 从盘子中挑选含有感兴趣载体的细菌菌落, 让它在含有20毫升 lb 培养基的烧瓶中生长, 并在37°c 的晃动孵化器中补充抗生素 obe (另见关于选择抗生素的步骤 1.7)。
  2. 第二天, 用选择抗生素将生长的20毫升细菌培养体稀释成含有1升 lb 培养基的烧瓶。
  3. 继续在37°c 孵育细菌培养, 直到它达到0.6-0.7 的 od600 。在诱导蛋白质表达之前, 让培养物冷却到 rt。
  4. 通过在感应器的 1 mm (1:1000 稀释) 的最终浓度中加入 1 m 异丙基β-d-硫代土豆酸盐 (iptg), 诱导功能化纳米粉和 bira 的蛋白质表达。还加入一个 20 mm d-biotin 库存溶液的 10 ml, 从而在生长介质中产生 200μm d-生物素, 以允许功能化纳米机器人中存在的 bap 表位的生物素化 (质粒信息另见表 1 )
    请注意:在 ddh2o中制备了 d-生物素库存溶液, 并通过滴加 500 mm nah2po4 将其转化为溶液。另外, d-生物素也可以溶解在 dmso 中。要生产与 apex2 (vh-apex2) 融合的纳米孔, 还必须补充 lb 介质, 并补充 1 mm 5-氨基甲烯丙酸 (dala) 盐酸, 以促进血红素的加入。dala 是在 ddh2o中制备的 100 mm 库存解决方案。
  5. 在30°c 下培养 iptg 诱导的 1 l 细菌培养, 为 vhh-2xts, 在20°c 或 rt on 为 vh-apex2, 或在 16°c on 为 vh-mcherry (另见表 1的质粒信息)。
    请注意:实验者必须优化新纳米机器人结构的表达条件。
  6. 将细菌培养从烧瓶中转移到1升离心瓶中, 在4°c 下将细胞以 5, 000 x 克的速度颗粒 45分钟, 并对上清液进行解码, 并继续进行纯化。
    注: 通过将细菌颗粒无限期地存储在-80°c, 可以在此处暂停该协议。vh-apex2 或 vh-mchry 的颗粒通常分别为褐色 (因为合并的血红素) 或粉红色。

3. 功能化纳米化的纯化

  1. 如有必要, 在冰上解冻冷冻细菌颗粒 (另见步骤 2.6)。
  2. 在细菌细胞颗粒中加入30毫升的冰凉结合缓冲液 (1x pbs 中的 20 mm 咪唑), 通过上下移液重新悬浮。将重新悬浮的细菌转移到标记为50毫升的管中。
  3. 用200μgl 溶菌酶补充 30 ml 结合缓冲液, 20μgml dnase i、1 mm mgcl2和 1 mm 苯基甲基甲基磺酰氟 (pmsf), 在 rt 上先孵育 10分钟, 然后在端端过端振动台上孵育1小时。
  4. 通过将尖端声纳放入悬浮液中, 机械地将细菌细胞溶解在50毫升管中。应用恒定的 3x 1分钟脉冲, 中间有1分钟的冷却时间。
  5. 在4°c 条件下, 以 15, 000 x克离心细菌裂解液 45分钟, 将碎片和完整的细胞颗粒状。将超声细菌细胞裂解液物转移到适当的离心瓶中进行离心, 或将裂解液分成几个5毫升管进行桌面离心。
  6. 将上清液转移到新的50毫升管中, 并丢弃颗粒碎片。
  7. 固定化金属亲和层析 (immobilized) 在制备纯化过程中, 将清除过的裂解液储存在冰上。要分离有组织标记的功能化纳米棒, 请使用单用他的色谱柱 (见材料表), 从而快速而简单地进行重力流净化。
    请注意:或者, 也可以使用批量纯化而不是商业柱。
  8. 把他的柱子安装在金属支架上
    1. 逐渐减弱柱的存储液, 并将他的柱与10毫升的结合缓冲液 (在 1x pbs 中的 20 mm 咪唑) 进行平衡。
    2. 重力流动为空 (流经可丢弃)。
  9. 将清除后的细菌裂解液 (~ 30 毫升) 逐渐加载到柱上。重力流动为空 (流经可丢弃)。
  10. 用10毫升的结合缓冲液 (在 1x pbs 中使用 20 mm 咪唑) 清洗他的色谱柱2x。
  11. 将2毫升洗脱缓冲液 (1x pbs 中的 500 mm 咪唑) 的纳米棒洗成2毫升管, 并应用缓冲液交换。
  12. 缓冲区交换。
    1. 平衡脱盐柱 (见材料表) 放置在50毫升管柱适配器5次, 5 毫升的 1x pbs。
    2. 允许缓冲器进入包装的床。放弃流通。
    3. 在第五次 pbs 平衡后, 将柱旋转为 1, 000 x g , 5分钟。
    4. 放弃流通。
    5. 将带有适配器的立柱放置在新的50毫升管上。将洗脱功能化纳米机器人的2毫升 (从第3.11 步开始) 加载到 pbs-equil滚落脱盐柱上, 以 1, 000 x 克的速度旋转 2分钟, 并收集洗脱液。
      请注意:透析可以应用于交换缓冲液的组成, 而不是商业脱盐柱。
  13. 根据制造商的说明, 使用双氯联 (bca) 或布拉德福德检测方法确定洗脱液的蛋白质 (纳米体) 浓度。
    请注意:对于 gfp 记者细胞系的纳米机器人吸收检测, 库存浓度为 2-10 mg/ml 是最佳的。

4. 功能化纳米体表达的验证 (骨染色)

  1. 根据标准协议制备10-12.5% 的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 凝胶。
    请注意:或者, 使用市售的预制梯度凝胶。
  2. 将20μg 纯化的功能化纳米孔放入 1.5 ml 管中, 在95°c 样品缓冲液中煮沸5分钟。
    请注意:例如, 在具有10μl 的2x 样品缓冲液的 1.5 ml 管中加入2mgml 纳米无菌库存溶液的10μl。如果体积太小, 在添加样品缓冲液之前, 进一步稀释 pbs 中的纳米无菌。
  3. 将在样品缓冲液中煮沸的纯化纳米体加载到 sds-聚丙烯酰胺凝胶上, 并按照标准 page 协议运行, 直到参考染料 (例如, 溴酚蓝) 达到分离凝胶的末端, 然后进行库莫西染色;下角。
  4. 库马西凝胶染色和命运。
    1. 用 coomassie 染色溶液 (10% gl coomassie 库存溶液中的5% 在10% 的醋酸和45% 的甲醇在 ddh2o中) 在移动晃动平台上的 rt 中去除凝胶并将其染色20-30。凝胶应完全覆盖在染色溶液中。
    2. 用毁灭溶液 (7.5% 的醋酸和15% 的甲醇在 ddh2o 中) 在 rt 中每次 1小时, 然后离开凝胶 on 作进一步的脱氧时间。
      注: 通过将厨房纸巾放在凝胶周围, 可以有效地吸收多余的库马西。
  5. 用首选的成像仪或相机对凝胶进行成像。
    请注意:纳米抗体的抗体针对其表位进行免疫印迹分析, 可以进一步证实纳米抗体的表达 (另见图 1 a)。

5. 荧光染色培养细胞对功能化纳米化的吸收

  1. 在细胞培养罩中, 种子 ~ 400, 000 至 500, 000个 h. la 细胞在35毫米盘子或含有抗生素的全介质6孔集群 (dulbecco 的改性鹰介质, dmem) 中, 在18毫米的玻璃盖板 (第 1.5 h 号) 上稳定地表达了 gfp 标记的记者蛋白, 补充10% 胎儿小牛血清 (fcs)、100 unitsml 链霉素、2mm l-谷氨酰胺和 1.5μgml puromycin)。
    请注意:在这里, 我们使用 h延细胞稳定地表达 egfp-calnexin、egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 进行说明。除了稳定的细胞系外, 还可以使用瞬时转染的海拉细胞。在这一步中, 稳定的细胞系可以与父母非转染的平移平细胞共同培养, 以便进行直接比较。
  2. 在37°c 条件下将细胞 o 孵育在 7.5% co2 孵化器中增殖。
    请注意:第二天细胞的融合度应该是 ~ 80%。
  3. 将2mgml 纳米无菌的液滴入含有2毫升完整介质的15或 50 ml 管中 (该体积足以覆盖35毫米的盘子或6孔簇的一口井, 按比例调整中和纳米无的体积, 以包括更多的细胞培养 d或集群)。
    请注意:为了说明起见, 我们在这里使用 vh-mcherry, 因为没有进一步的抗体染色是由 egfp 记者内化的 (见图 2c)。
  4. 从细胞中取出生长介质, 加入每35毫米或6孔单位含有2μgml 功能化纳米体的预热完整培养基2毫升。
  5. 在37°c 条件下将细胞孵育在7.5% 的 co2 孵化器中 1小时, 以允许接受报告介导的纳米单体。
    请注意:根据计划中的实验, 纳米体吸收的时间需要调整。对于这里所显示的实验, 1小时足以达到 egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 吸收纳米单体的稳态。
  6. 取出培养基, 用1毫升的 1x pbs 在 rt 中清洗细胞2-3 次。
  7. 在 rt 中将含有1毫升3% 甲醛 (pfa) 的细胞固定10分钟。
  8. 在 1x pbs 中, 用 50 mm nh 4 cl的1 ml 去除 pfa 溶液和淬火剩余固定剂, 在 rt 中停留5分钟。
    注: 3% 的 pfa 应作为固定废物单独处置。
  9. 用1毫升的 1x pbs 在 rt 清洗细胞3次。
  10. 在 1x pbs 中, 用 0.1% triton x-100 的 1 ml 对细胞进行一次渗透10分钟。
    请注意:虽然不需要渗透, egfp 和 mcherry 荧光是更好的, 当细胞被嵌入到安装介质。
  11. 用1毫升的 1x pbs 在 rt 清洗细胞3次。
  12. 将带有钳子的盖板放在含有 5μgml dapi (4 ', 6 '-双二胺-2-苯二咪唑) 的 1x pbs 中的 1% (~ 100μl) 上, 在 rt 中放置5分钟。
  13. 将盖板放回洗碗井, 用1毫升的 1x pbs 在 rt 清洗3次。
  14. 给玻璃滑梯贴上标签, 并用氟通 g 安装电池。让安装介质在黑暗中硬化3-4 小时, 并在光保护下将玻璃幻灯片存放在4°c。
  15. 使用首选显微镜 (例如, 点扫描共聚焦直立显微镜) 的图像染色模式。

6. 培养细胞吸收功能化纳米免疫 (用于硫化分析)

  1. 在细胞培养罩中, 种子 ~ 40万至50万例 hela 细胞在35毫米盘子或含有抗生素的全培养基6孔簇上稳定地表达了 gfp 标记的记者蛋白 (dulbecco 的修饰鹰培养基, dmem, 补充10% 的胎儿小牛血清 (fcs)、100 unitsml 链霉素、2mm l-谷氨酰胺和 1.5μgml puromycin)。
    请注意:如上所述, 我们在这里使用 hela 细胞稳定地表示 egfp-calnexin、egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 的目的。除了稳定的细胞系外, 还可以使用瞬时转染的海拉。
  2. 在37°c 条件下将细胞 o 孵育在 7.5% co2 孵化器中增殖。
    请注意:第二天细胞的融合度应该是80% 左右。
  3. 取出完整的培养基, 在 rt 用 1x pbs 清洗 2次, 并在7.5% 的 co2 孵化器中, 在37°c 下使用无硫酸盐培养基 (sfm) 将细胞挨饿 1小时。
    请注意:sfm 是通过添加10毫升的 mL 氨基酸 (50x) 溶液、5毫升的 l-谷氨酰胺 (200 mm)、5毫升的维生素溶液 (100x) 和900μl 的 ccl 2·2h 2H 到500 ml 的平衡盐制备的.通过0.22μm 的过滤器和等位器。
  4. 在指定用于放射性工作的通风罩或工作台中, 制备含有 0.5 mci/ml [35s] 硫酸盐作为 sfm 中钠盐的硫酸盐标记介质。
    注意事项:小心处理所有含有放射性的溶液。只在指定的头套或长椅上工作。所有与放射性接触的材料 (尖端、管、板等) 或洗涤缓冲液必须单独收集和处置。对以下所有步骤 (第6.5-6.20 步) 也这样做。
  5. 在 1x pbs 中加入 vhh-2xts 到硫酸盐标记介质中, 最终浓度为2μgml。
    请注意:作为控制, 还包括 vhh-std 或另一个纳米诺博没有 ts 站点, 以证明具体的标签。
  6. 将含有 0.5 mciml [35s] 硫酸盐的硫酸盐标签介质的 0.7 ml 替换为 ffm, 并在指定用于放射性的 7.5% co2 孵化器中, 在37°c 孵育细胞 1小时.
    请注意:根据计划的实验, 纳米孔硫化的时间需要调整。此外, 为了确定 tgn 到达动力学, 标记是在不同的时间 (例如, 10分钟, 20分钟, 30分钟等)。
  7. 取下标签介质, 用冰凉的 1x pbs 在冷却板或冰上清洗细胞2-3 次。
  8. 加入1毫升裂解缓冲液 (含有 1% triton x-100 和0.5% 脱氧胆酸的 pbs), 辅以 2 mm pmsf 和1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 并在4°c 的摇杆平台上孵育细胞10-15。
  9. 将裂解液刮成 1.5 ml 管, 使裂解液旋转 10-15, 放置在4°c 的端端旋转器上。
  10. 在4°c 条件下, 以 10, 000 x g离心 10分钟, 准备核裂解后。
  11. 使用新的 1.5 ml 管, 在 1.5 ml 管中制备20-30μl 的镍珠浆料, 用 1x pbs 清洗一次, 在 1, 000 x克的情况下轻轻将其粒化1分钟。
    请注意:而不是镍珠, 链球珠 (如果纳米生物化) 或蛋白质一个珠子与 igg 反对纳米无菌的表位 (t7-或 ha 标签) 可以使用。
  12. 将核裂解物转移到含有镍珠的 1.5 ml 管中, 在4°c 时在端端旋转器上孵育 1小时, 以分离纳米孔。取出核裂解物中的一个脂肪 (50-100μl), 在 sds 样品缓冲液中煮沸, 以便随后对与细胞相关的全部纳米对照、gfp 报告和负载控制进行免疫印迹分析。
  13. 用 1x pbs 或裂解缓冲液将珠子洗 3次, 轻轻以 1, 000 x克的速度轻轻造粒1分钟。
    请注意:对于更严格的珠子清洗, 20 mm 咪唑可包含在 pbs 或裂解缓冲液中。
  14. 小心地从珠子中取出所有洗涤缓冲液, 加入50μl 的2x 样品缓冲液, 在95°c 下煮沸5分钟。
  15. 将两个煮珠装上 mdi 12.5% sds-page 凝胶, 并按照标准 page 协议运行, 直到参考染料 (例如, 溴酚蓝) 达到分离凝胶的末端。
    请注意:还可以使用微型 12.5% sds-page 或预制梯度凝胶进行总细胞相关纳米瘤、gfp 报告和负载控制的免疫印迹分析。
  16. 将固定缓冲液 ~ 30 毫升 (ddh2o 中10% 的醋酸和45% 甲醇) 中的分离凝胶固定 1小时, 用 ~ 50 毫升的去离子水清洗凝胶 3次, 并准备凝胶干燥。
  17. 干燥 sds-页凝胶。
    1. 小心地将固定凝胶放在拉伸的保鲜膜上, 并用预切滤纸覆盖。
    2. 将带滤纸的凝胶放在干燥平台的顶部, 放置真空盖, 并打开真空泵进行凝胶干燥。将凝胶擦干3-5小时。
    3. 取出保鲜膜, 并将干燥的凝胶放入配备荧光屏的自动摄影盒式磁带中。
  18. 使用荧光屏成像仪的图像黑角图。按照制造商的说明进行操作。
    请注意:根据信号的强度, 干燥的凝胶需要用荧光粉筛暴露更长的时间。

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Representative Results

为了研究逆行蛋白运输到各种细胞内目的地, 我们最近建立了一个抗 gfp 纳米生物为基础的工具, 以标记和跟踪重组融合蛋白从细胞表面30。在这里, 我们展示了这种衍生纳米棒的细菌生产, 并演示了它们在荧光显微镜和免疫印迹法研究内循环吸收方面的应用, 以及它们在硫化分析研究 tgn 到达方面的应用。后一种适用是本议定书的方法重点。

通过标准分子克隆30,我们已经生成了一个具有共同特征的不同功能化抗 gfp 纳米棒的工具箱。我们最简单的 (标准) 纳米抗体, vhh-std, 包含 vhh 域, t7 和 ha 表位, 用于随后检测的特定抗体, 一个羧基端己基替丁 (his6)-标签纯化, 和生物素受体肽 (bap) 序列生物素化和高亲和力链霉素下拉实验 (图 1a)。vhh-std 的衍生物产生不同的纳米生物学变异, 通过固定和活细胞成像和电子显微镜检查内细胞吸收和逆行运输生化。

为了评估从质膜到跨 golgi/tgn 的蛋白质流量, 我们利用了酪氨酸蛋白硫转移酶在这些隔间中的独家定位, 从而与串联酪氨酸硫酸盐 (2xts) 一起修改了 vhh-std。从大鼠原生血囊素41。虽然使用 mcherry 对 vhh-std 进行修改, 可以通过固定和活细胞成像直接显示逆行运输, 而带有过氧化物酶 (如 apex237)的功能化使电子显微镜研究、细胞化学隔间消融, 或近似相关的生物素化反应。此外, 为烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶插入裂解位点, 可以通过生物化学区分细胞内和表面结合的纳米机器人 (图 1 a)。我们以前使用 vhh-tev 来监测纳米链式 egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 30 的内生循环动力学.在吸收后, 可以简单地通过追逐外应用的重组 tev 蛋白酶来评估纳米体在细胞表面的再现, 从而导致纳米体的羧端表位盒的反向丢失。在 mcherry 或 apex2 纳米股骨融合中包括一个裂解位点, 对于研究 egfp 记者的回收动力学有一定的帮助, 这种成像方式与 vhh-tev 相似, 或者分别限制细胞内隔间的细胞化学反应。通过将各自的插入子并入编码 vhh-std 的质粒载体, 可以很容易地实现与其他蛋白质域 (如其他荧光素或酶) 或其他翻译后修饰的目标序列的功能化 (另请参见表 1的质粒信息) 使用可用的 spei 和 ecri 限制站点。

使用上述协议, 这里所示的所有纳米波都可以分离到高纯度和高产量 (图 1b)。只有 mcherry 融合显示纯化后蛋白质域的轻微剪切 (图 1 b, 见7-8 车道)。在没有 bira 表达的情况下, 我们通常获得25-35 毫克的 vhh-std, vh-2xts 及其 tev-2xts, 或 ~ 20 毫克的 vh-apex2 和 vh-速ex2 和 vh-mherry 及其含 teve 衍生物。我们的经验表明, bira 协同表达将纳米体的产量降低了三分之一到一半。

为了说明报告者介导的纳米单核细胞的吸收, 我们使用了 hela 细胞系稳定地表达 egfp-calnexin (cnx)、egfp-cdmpr 和 tfr-egfp (图 2a 和 b)。TfR 融合到每个蛋白质的外腔端 (即 cnx 或 cdmpr 的信号和报告序列之间) 和 tfr 的羧酸盐, 使细胞质分选信号不受阻碍。所有这些 gfp 标记的货物分子都有不同的细胞内贩运行程后, er 目标。由于 egfp-calnexin 是驻留在 er, 通常不会到达后 golgi 隔间, 它作为一个负控制的潜在和非特异性纳米体吸收。相反, egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 都具有 golgi 以外的运输功能, 因此稳定地出现在质膜上。正如预期的那样, 当 VHH-mCherry 被添加到未修饰的维拉和稳定表达 egfp-cnx 的细胞的混合种群中时, 无论哪种情况, 都无法观察到纳米体内化。然而, egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 都在细胞表面捕获了 vhh-mchery, 并将它们搭载回记者的家室 (图 2c)。

VHH-mCherry 共聚与常驻 tgn 标记可原则上用于评估 tgn 到达量。然而, 我们建立了一种基于酪氨酸硫化的生化方法。为了利用跨 golgi/tgn 中发生的这种改性, 用 ts 位点对纳米模进行了功能化 (图 1a)。为了证明这些蛋白质粘合剂的特异性和功能, 我们在存在硫酸放射性的情况下, 用 vhh-std 或 vhh-2xts 孵育未改性的 hala 细胞和细胞稳定地表达了 TfR-EGFP、egfp-cdmpr 和 tfr-egfp, 时间为1小时。只有当记者将纳米体逆行地输送到 tgn 时, 才会发生 vhh-2xts 的辐射标记, 在那里它暴露在酪氨酸硫化机械中。hela 表示 egfp-cnx 和它们的亲本细胞没有纳米单核细胞的吸收, 因此没有硫化。egfp-cdmpr 和 tfr-egfp 都将纳米波化, 后者大大多于前者。然而, 只有 egfp-cdmpr 导致 vhh-2xts 被硫化 (图 3 a)。这证实了 cdmpr 从细胞表面向 tgn 的有效逆行运输, 并提供了证据, 不利于 tfr 返回 tgn (正如一些研究中所建议的那样, 42、43)。

通过分析不同时期纳米体吸收和硫化后的细胞裂解物, 还可以确定报告蛋白的内化动力学和 tgn 到达。以 egfp-cdmpr 为记者, 我们发现硫化仅在滞后时间 ~ 15分钟后开始, 只有在 gt;75 分钟后才达到饱和度 (图 3b, 1-6 车道和 c, 正方形符号)。吸收和硫化动力学出现了近30分钟的转移, 反映了向 tgn 的迁移。此外, 该方法允许通过药物干扰或蛋白质沉默方法 (如击倒、击倒或侧翻) 来研究 mpr 运输中涉及的分选机械。在这里, 我们使用 brefeldin a (bfa), 一种由几个 arf gtpase 组成的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (gef) 抑制剂, 通常干扰逆行转运到 tgn。在使用 bfa 处理时, 硫化被完全废除, 而吸收在动力学和范围上都不受影响 (图 3b、车道7-12 和 c, 圆形符号)。

Figure 1
图 1: 设计和生产功能化纳米棒, 以跟踪 egfp 修饰细胞表面蛋白.(a) 衍生纳米波模的原理图表示。标准纳米博由 gfp 特定的 vhh 域、t7 和 ha 表位标记、bap 和六角蛋白 (his6) 纯化标记组成。此外, 其他纳米棒还包括两个 tev、apex2 或 mcherry, 每个都有或没有 tev 蛋白酶 (tev) 的裂解位点。刻度条是氨基酸 (aa)。(b) 采用梯度 sds-凝胶电泳分析细菌表达纯化的纳米棒 (50μg), 并用库马西染色。左边显示了在 kda 中具有分子质量的标记蛋白。只有 vh-mcherry 和 vh-tev-mchery 在 vhh 和 mcherry 域之间显示出最小的剪辑。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 不同 egfp 报告蛋白对 vhh-mcherry 的吸收和细胞内定位.(a) egfp 融合蛋白的原理图表示。从分泌膜蛋白中提取的序列以黑色显示为 n 端信号肽, 内部跨膜段以黄色显示, egfp 以绿色显示。TfR 与全长 cdmpr、tfr 和 nexnin (cnx) 融合在一起。氨基酸中的刻度条 (aa)。已介绍了 egfp-cdmpr 和 tfr-egfp。(b) 用 sds-凝胶电泳和免疫印迹法, 用抗 gfp 和抗肌动蛋白抗体, 稳定地表达 egfp 报告蛋白的海拉细胞进行了提取、裂解和分析。在 kda 的分子质量显示在右边。(c) 在37°c 下, 用 5μml vh-mchherry (~ 100 nm) 孵育 1小时, 稳定地表达 egp 标记的记者蛋白的海拉细胞进行荧光显微镜加工。刻度杆 = 10μm。只有在细胞表面暴露的 egfp 的 cepr 表示记者的细胞才会发生吸收。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 硫化分析和利用 ts 标记纳米粉末状纳米粉末状向 tgn 逆行运输的动力学.(a) 用 0.5 mciml [35s] 硫酸盐标记父母和 hela 细胞稳定表达 egf 修饰的报告蛋白 60分钟, 用 2μgml vhh-std 或 vhh-2xts。采用镍微珠分离纳米波, 在 12.5% sds-page 上分离, 然后进行自动影像学检查。在镍被拉下来并为细胞相关的纳米体 (his6)、egfp 和肌动蛋白进行免疫印迹之前, 收集了细胞裂解液的酸液。(b和c) 在分析 (a) 之前, 在存在 2μgml vhh-2xts 并不存在2μgml vhh-2xts 的情况下, 将稳定表示 egfp-cdmpr 的海拉细胞标记为 0.5 mciml [35 s] 硫酸盐, 时间长达75分钟。在 75分钟 (平均值和 sd) 后, 用没有 bfa 的数值百分比显示了三个独立实验对 vhh-2xts 吸收和硫化的定量。黑色方块, 没有 bfa;灰色圆圈, 带 bfa;开放符号, 吸收;填充符号, 硫化。对这一数字进行了修改, 并从 buser 等人 (2018年 pnas30) 进行了修改和扩大。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 本研究中显示的功能化纳米棒的蛋白质序列.t7 表位灰色, vhh 在黑色, ha 表位在蓝色, bap 序列在橙色, 六角蛋白 (his6) 在红色, tev 蛋白酶裂解位点在紫色, myc 表位在品红色, 酪氨酸硫化序列在黄色, apex2 在绿色, 和 mcherry 在粉红色。编码这些功能化抗 gfp 纳米波的表达载体已经沉积 (质粒信息见表 1 )。请点击此处下载此文件.

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Discussion

纳米机器人代表了一类新兴的蛋白质粘合剂支架, 与传统抗体相比具有许多优点: 它们体积小、稳定、单体化, 可选择高亲和力和缺乏二硫键33,35,44,45. 它们被用于许多应用, 例如在发育生物学的细胞培养系统和生物体中,46、47、48、49作为结晶伴侣, 以稳定构象状态在结构生物学50,51,52,53, 作为酶的抑制剂或活性调节剂54,55, 56、作为免疫组织化学试剂进行生化分析 57, 或作为 "次生纳米棒" 检测抗鼠免疫球蛋白和抗兔免疫球蛋白对免疫细胞和免疫荧光58。在我们之前的研究中, 我们已经开发并应用了由细菌表达产生的功能化纳米生物到表面标签蛋白, 并跟踪它们的细胞内路线到不同的隔间, 特别是 tgn30。我们使用抗 gfp 纳米模块使工具用途广泛, 能够针对融合蛋白与细胞外 gfp, yfp, 或 mcerulean, 可能已经可用和表征。使用 mcherry、apex2 或 ts 站点修改抗 gfp 纳米棒, 使我们能够通过固定和活细胞成像监测记者的吸收情况, 从超结构上可视化逆行运输隔间, 消融这些隔间, 或研究运输到 tgn 的动力学。我们的工具的一个缺点是, 在应用功能化的抗 gfp 纳米模之前, 需要对目标细胞系进行重组修饰 (稳定表达或内源标记)。当然, 功能化也可以应用于针对动物免疫或核糖显示和噬酶体显示和噬酶体显示选择所建立的无标记内源性目标蛋白的纳米机器人数量的迅速增加库59。利用用 ts 位点 (如 vhh-2xts) 修饰的纳米糖, 我们可以直接测量不同的 egfp 修饰靶蛋白 tgn 到达的迁移和动力学。我们已经应用 vhh-2xts 研究适配器蛋白复合物 1 (ap-1) 在 mpr 逆行运输的贡献, 通过直接动力学分析在敲侧向细胞允许快速失活给定的运输机械 30.纳米硫化, 因此逆行运输的 egfp 标记的 mpr 是部分, 但没有完全堵塞。我们使用硫化作为 tgn 到达传感器的纳米模型方法证实了其他实验室先前的研究结果, 表明 ap-1 在逆行内索与 tgn 运输中的功能贡献 17,60, 61岁因此, 可硫酸盐纳米波模可以提供一个有用的生化工具, 以剖析其他逆行运输机械的贡献, 如 epsinr、rab9p47 或 snx-bar/重组剂复合物, 通过基因组、遗传或化学操作对货物蛋白质的贡献。这里介绍的协议提供了一个基础, 一个人如何可以利用功能化纳米机器人一般来确定目标室, 路径, 和运输动力学的培养细胞。

其他团体已经利用 ts 站点跟踪从细胞表面到 tgn 的传输。ricin、滋贺或百日咳毒素亚基以前曾使用硫化位点进行过修改, 以显示通过 tgn62、63、64、65、66的运输路线。此外, ts 肽还与 igg 进行了化学耦合, 以测定 gfp-cimpr 和内源性 tgn46 逆行转运到 tgn67,68。我们的硫酸盐纳米棒具有简单和可重复的细菌生产和1:1 化学计量与目标蛋白的优势。相反, 众所周知, 二价蛋白粘合剂, 如 igg, 可以交联细胞表面蛋白, 并改变细胞内贩运到细胞内的巨细胞群体后, 内吞 69, 70, 突出单体蛋白粘合剂相对于现有方法的意义。我们的技术的一个关键步骤是, 使用放射性处理是必要的, 以执行硫酸盐标记的纳米棒。然而, 我们的功能化纳米棒工具与 ts 站点研究 tgn 到达可能是潜在的应用没有放射性使用抗亚硫酸盐肌酸抗体。

我们先前的研究表明, 纳米无菌物硫化的效率不是很高, 因为在75分钟后, mpr 的硫化尚未达到最大值, 尽管纳米无菌的吸收在45分钟后饱和。对其他天然 ts 位点进行筛选可能会提高硫化效率。或者, 为了有可能提高硫化效率, 硫化机械本身的成分, 如 tpst1 和 tpst2, 可能会被夸大。事实上, 此前已经有证据表明, 从细胞溶胶到 golgi 的腔, 其中一个运输者将 3 '-phoshoo苷-5 '-磷硫酸盐 (paps) 作为 tpst 的底物, 其过度表达可能会改变蛋白聚糖的硫化状态。71岁

除了硫化纳米棒, 其他衍生产品还允许通过内生室和 tgn 追踪运输。apex2 可作为一种杂乱的标记酶, 用于近似依赖的生物素化反应, 用于逆行运输的蛋白质组学分析。由感兴趣的货物记者内化的 apex2 纳米板将在目标隔间内紧密地标记蛋白质。比较蛋白质组学应允许识别其他内源性蛋白质在不同类型的内质体和 tgn, 纳米体访问。纳米孔与其目标蛋白的许多变化是可以想象的。例如, 最近的一份报告对这里描述的方法采用了一种倒置的方法: 衍生的 gfp 被用来研究和捕获植物前部和逆行隔间中细胞表达的抗 gfp 纳米波标记的空泡分选受体内膜系统72。同样, 在哺乳动物细胞培养系统中, 可以设计功能化的纳米陷阱, 以便在逆行运输过程中在不同的隔间捕获和积累 egfp 修饰的记者。

我们这里提出的方法和协议, 重点是 ts 站点标记纳米生物, 允许定量和定性跟踪货物蛋白质从细胞表面到内源性隔间和 tgn 在培养的哺乳动物细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了瑞士国家科学基金会31003a-162643 赠款的支持。我们感谢 nicole beuret 和 biozentrum 成像核心设施 (imcf) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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免疫学与感染 第144期 纳米孔菌 逆行运输 golgi 复合物 酪氨酸硫化 细菌表达 放射性标记 egfp 健康细胞
培养细胞功能化纳米化对跨 golgi 网络的内分泌吸收和逆行迁移分析
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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