Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Retrograde vervoer van eiwitten uit het celoppervlak naar het Golgi is essentieel voor het handhaven van de membraan homeostase. Hier beschrijven we een methode om biochemically cel oppervlak-te-Golgi vervoer van recombinante eiwitten matiemaatschappij nanobodies met HeLa cellen te analyseren.

Abstract

Vervoer van eiwitten en membranen van het celoppervlak naar het Golgi en daarbuiten is essentieel voor de homeostase, organel identiteit en fysiologie. Studeren retrograde eiwit verkeer, hebben we onlangs een veelzijdig nanobody gebaseerde toolkit voor het analyseren van vervoer van het celoppervlak naar het Golgi-complex, hetzij door vaste en levende cel imaging, door elektronenmicroscopie of biochemically ontwikkeld. We ontworpen matiemaatschappij anti-groen fluorescente proteïne (GFP) nanobodies — kleine monomeer, hoge-affiniteit eiwit bindmiddelen — dat kan worden toegepast op cellijnen uiting van membraaneiwitten van belang met een extracellulaire GFP-groep. Derivatized nanobodies gebonden aan het GFP-verslaggevers specifiek zijn geïnternaliseerd en piggyback op de reporters sorteren traject vervoerd. Nanobodies waren matiemaatschappij met fluorophores te volgen retrograde vervoer door fluorescentie microscopie en beeldbewerking, met ascorbaat peroxidase 2 (APEX2) om te onderzoeken de ultrastructurele lokalisatie van verslaggever-nanobody complexen door elektron live microscopie, en met tyrosine sulfation (TS) motieven om te beoordelen van de kinetiek van trans-Golgi network (TGN) aankomst. In deze methodologische artikel duidelijk naar voren komt de algemene procedure bacterially express en zuiveren matiemaatschappij nanobodies. We illustreren de krachtige gebruik van onze tool met behulp van de mCherry - en TS-gemodificeerde nanobodies endocytotische opname en TGN komst van lading eiwitten te analyseren.

Introduction

Retrograde verkeer van eiwitten en lipiden van het celoppervlak aan verschillende intracellulaire compartimenten is van cruciaal belang voor handhaving van de membraan homeostase tegenwicht secretie en recycleren van onderdelen van anterograde vervoer machineries1 , 2. na de internalisering via clathrin-afhankelijke of -onafhankelijke endocytose, eiwit en lipide-vracht vullen eerst vroeg Endosomen uit waar ze verdere zijn doorverwezen hetzij langs de endo-lysosomale systeem, gerecycleerd aan het plasma-membraan, of gericht aan de trans-Golgi network (TGN). Recycling van Endosomen en/of het celoppervlak naar de TGN maakt deel uit van de functionele cyclus van een aantal anterograde transmembraan lading receptoren, zoals de catie-afhankelijke en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptoren (CDMPR en CIMPR) leveren nieuw gesynthetiseerd lysosomale hydrolases uit de TGN te laat Endosomen en lysosomen3,4,5, sortilin en SorLA6,7, Wntless (WLS) vervoer van Wnt liganden aan het celoppervlak 8 , 9 , 10 , 11. andere eiwitten ontvangen terug naar de TGN zijn TGN46 en haar aanverwante isoforms12,13,14, SNAREs (oplosbare N- ethylmaleimide-gevoelige fusion factor bijlage receptoren) 15 , 16 , amyloïde precursor eiwit (APP)18,19, progressieve ankylose (ANK) eiwit20, 17, metalen vervoerders zoals ATP7A/B of DMT121,22, en transmembraan verwerking van enzymen waaronder carboxypeptidase D, furin of BACE123,24,25. Afgezien van deze endogene proteïnen kapen bacteriële en plant toxines (bv, Shiga en cholera-toxine, ricine en Abrine) retrograde vervoer machines om te bereiken van de ER voor retrotranslocation in het cytosol26,27, 28,29.

Om direct retrograde verkeer analyseren, hebben we eerder een nanobody gebaseerde toolkit om te etiketteren en volg lading eiwitten van het celoppervlak naar intracellulaire compartimenten30ontwikkeld. Nanobodies vertegenwoordigen een nieuwe familie van eiwit bindmiddelen afgeleid van homodimeric zware-keten-alleen antilichamen (hcAbs) die van nature in kameelachtigen en cartilaginous vissen31,-32 voorkomen. Zij vormen het veranderlijke domein voor zware-keten (VHH) van hcAbs en hebben veel voordelen boven conventionele antilichamen (bijvoorbeeld IgGs): ze zijn monomeer, kleine (~ 15 kDa), zeer goed oplosbaar, verstoken van disulfide bindingen, kan worden bacterially uitgedrukt, en geselecteerd voor hoge-affiniteit bindende33,34,35,,36. Om onze tool nanobody veelzijdig en breed toepasbare, we matiemaatschappij anti-GFP nanobodies aan oppervlak-label en track eiwitten gelabeld met GFP op hun extracellulaire/lumenal domein gebruikt. Door functionalization van nanobodies met mCherry, ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)37, of tyrosine sulfation (TS) sequenties, retrograde vervoer van bonafide transmembraan lading eiwitten kan worden geanalyseerd door een vaste en live cel imaging, door elektronenmicroscopie, of biochemically. Aangezien tyrosine sulfation gemedieerd door tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 en TPST2) een posttranslationele wijziging beperkt tot de trans-Golgi is/TGN, we kan rechtstreeks studie vervoer en kinetiek van proteïnen van belang uit het celoppervlak daartoe intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.

In dit artikel methoden beschrijven we het gemak van de productie van matiemaatschappij nanobodies (VHH-2xTS - APEX2, - mCherry en derivaten) geschikt voor een aantal toepassingen voor het analyseren van retrograde vervoer in zoogdiercellen30. We vooral gericht op het gebruik van TS site-gewijzigd nanobody voor analyse van het intracellulair verkeer van het celoppervlak tot het compartiment van de sulfation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bacteriële transformatie met matiemaatschappij Nanobodies

Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de expressie, zuivering en analyse van matiemaatschappij anti-GFP nanobodies als eerder beschreven30. Bewerking met andere eiwit wordt wellicht wijziging van dit standaard protocol.

  1. Ontdooien van chemocompetent bacteriën (~ 100 µL) geschikt voor eiwit expressie (bijvoorbeeld Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellen) door ze te plaatsen op het ijs.
    Opmerking: Voorbereiden chemocompetent bacteriecellen volgens standaard lab procedures. Als alternatief kunnen chemisch bevoegde bacteriecellen commercieel worden gekocht.
  2. Voeg 50 ng van een plasmide matiemaatschappij nanobodies codering. Om voldoende site-specific biotinylation van de nanobody-verslaggever tijdens bacteriële expressie toe te voegen ook een drievoudige overmaat (150 ng) van een bacteriële expressie plasmide Biotine ligase BirA codering (Zie ook de plasmide informatie in tabel 1 ). Pipet zachtjes op en neer.
    Opmerking: Of nanobody biotinylation is niet nodig, maar de nanobody verslaggevers zijn verstoken van een Biotine acceptor peptide (BAP), is co transformatie met een plasmide BirA codering niet vereist.
  3. Incubeer de bacteriecellen gedurende 30 minuten op het ijs.
  4. Warmte schok de bacteriecellen door ze te plaatsen voor 1 min op 42 ° C in een waterbad of een blok van de verwarming.
  5. Voeg vervolgens 1 mL van kamertemperatuur (RT) Luria Bouillon (LB) middellange en broeden van het getransformeerde bacteriën in een thermoshaker gedurende 1 uur bij 37 ° C fenotypische expressie van resistentiegenen mogelijk te maken. Te bereiden 1 L LB middellange, balans 5 g gist extract, 10 g trypton en 10 g NaCl, met water vullen en steriliseren in autoclaaf. Als de functionalized nanobody heeft zijn subcloned in een vector van de expressie met resistentie tegen ampicilline/carbenicillin, kan stap 1.5 worden weggelaten.
  6. Pellet de bacteriën bij 11.000 x g gedurende 1 minuut en resuspendeer in 100 µL van verse LB medium.
  7. Plaat van de zwevende bacteriën op LB platen met de respectieve antibiotica (bijvoorbeeld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL carbenicillin wanneer de bacteriën zijn Co getransformeerd met nanobody verslaggever en BirA zoals aangegeven vorenstaand (stap 1.2)).
  8. Plaats de LB-platen in een incubator bij 37 ° C en laat groeien overnachting (O/N).
    Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken doordat de LB-plaat met volwassen kolonies bij 4 ° C. Parafilm te verzegelen LB platen gebruiken

2. de vloeibare bacteriecultuur en inductie van matiemaatschappij Nanobody expressie

  1. Pluk een bacteriële kolonie met de vector van belang van de plaat en laten groeien in een kolf met 20 mL van LB medium aangevuld met antibiotica O/N in een schudden incubator bij 37 ° C (Zie ook stap 1.7 met betrekking tot de selectie antibiotica).
  2. Volgende dag, Verdun de bacteriecultuur geteelde 20 mL in een maatkolf van 1 L van LB medium met selectie antibiotica met.
  3. Incubeer de bacteriecultuur bij 37 ° C, totdat zij een OD600 van 0,6-0,7 tot blijven. Toestaan dat de cultuur om af te koelen aan RT voordat inducerende eiwit expressie.
  4. Induceren eiwit expressie van nanobodies matiemaatschappij en BirA door toevoeging van 1 mL van de 1 M isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) om een eindconcentratie van 1 mM van de inductor (1:1, 000 verdunning). Ook het toevoegen van 10 mL van een 20 mM d-biotine stockoplossing resulterend in 200 µM d-biotine in het groeimedium dat biotinylation van het BAP-epitoop aanwezig in matiemaatschappij nanobodies (Zie ook tabel 1 voor plasmide informatie)
    Opmerking: De stockoplossing van d-biotine is voorbereid in ddH2O en door toevoeging van de drop-wise van 500 mM NaH2PO4in oplossing gebracht. U kunt ook kan d-biotine ook worden ontbonden in DMSO. Voor de productie van nanobodies gesmolten tot APEX2 (VHH-APEX2), het LB-medium moet daarnaast worden aangevuld met 1 mM 5-aminolevulinic acid (dALA) hydrochloride ter bevordering van heem opname. dALA is bedoeld als een stamoplossing van 100 mM in ddH2O.
  5. Incubeer de 1 L IPTG-geïnduceerde bacteriecultuur bij 30 ° C gedurende 4 uur voor VHH-2xTS, bij 20 ° C of RT O/N voor VHH-APEX2 of bij 16 ° C O/N voor VHH-mCherry (Zie ook de plasmide informatie in tabel 1 ).
    Opmerking: Expressie voorwaarden voor een nieuwe constructie van de nanobody moeten worden geoptimaliseerd door de experimentator.
  6. Breng de bacteriecultuur uit de kolf in een fles 1 L centrifugeren en pellet de cellen bij 5.000 x g bij 4 ° C voor 45 min. Decant het supernatant en gaat u verder met de zuivering.
    Opmerking: Het protocol kan hier onderbroken worden door de bacteriële pellet-80 ° c voor onbepaalde tijd op te slaan. De pellet voor VHH-APEX2 of VHH-mCherry is meestal bruin (vanwege de opgenomen Heem) of roze, respectievelijk.

3. de zuivering van Nanobodies matiemaatschappij

  1. Indien nodig, de bevroren bacteriële pellet op ijs ontdooien (Zie ook stap 2.6).
  2. Voeg 30 mL ijskoud bindende buffer (20 mM imidazol in 1 x PBS) tot de bacteriële cel pellet en resuspendeer door pipetteren omhoog en omlaag. Pipetteer geresuspendeerde bacteriën in een gelabelde 50 mL-buis.
  3. Supplement de binding van 30 mL buffer met 200 µg/mL lysozym, 20 µg Mo/mL DNase 1 mM MgCl2 en 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en incubeer eerst voor 10 min op RT, en vervolgens gedurende 1 uur bij 4 ° C op een eind over shaker.
  4. Mechanisch lyse bacteriële cellen in een tube van 50 mL door het plaatsen van een tip ultrasoonapparaat in de opschorting. Toepassing van constante 3 x 1 min pulsen met 1 min koeling periodes daar tussenin.
  5. Centrifugeer de bacterietelling lysate bij 15.000 x g bij 4 ° C voor 45 min aan de pellet van het puin en de cellen intact. Overdracht van de sonicated bacteriële cel lysate ofwel in een fles van de passende centrifugeren voor centrifugeren of verdeel de lysate in verschillende buizen van 5 mL voor tafelblad centrifugeren.
  6. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe tube van 50 mL en gooi het Ingehuld puin.
  7. Slaan de gewiste lysate op ijs bij de voorbereiding van zuivering door geïmmobiliseerdet metal affiniteitchromatografie (IMAC). Isoleren van histidine-gelabelde matiemaatschappij nanobodies, dienst eenmalig gebruik zijn columns (Zie Tabel van materialen) waardoor snel en eenvoudig zwaartekracht-flow zuivering.
    Opmerking: U kunt ook de batch zuivering in plaats van commerciële kolommen kan ook worden gebruikt.
  8. Montage zijn kolommen op een metalen Stand.
    1. Conus uit de kolommen opslagoplossing, en equilibreer zijn kolom met 10 mL van bindende buffer (20 mM imidazol in 1 x PBS).
    2. Leeg door zwaartekracht stroom (de doorstroom kan worden genegeerd).
  9. Geleidelijk laden de gewiste bacteriële lysate (~ 30 mL) op de kolom. Leeg door zwaartekracht stroom (de doorstroom kan worden genegeerd).
  10. Was het zijn kolom 2 x met 10 mL van bindende buffer (20 mM imidazol in 1 x PBS).
  11. Elueer de nanobodies met 2 mL elutie buffer (500 mM imidazol in 1 x PBS) in een tube 2 mL en een uitwisseling van de buffer toe te passen.
  12. Buffer Exchange.
    1. Equilibreer een ontzouten kolom (Zie Tabel van materialen) geplaatst in de kolom adapter van de buis van een 50 mL 5 keer met 5 mL 1 x PBS.
    2. Toestaan dat de buffer te voeren het ingepakte bed. Gooi de doorstroming.
    3. Na de vijfde PBS evenwichtsinstelling, draaien de kolom bij 1.000 x g gedurende 2 min.
    4. Gooi de doorstroming.
    5. Plaats van de kolom met de adapter op een nieuwe tube van 50 mL. Laad de 2 mL geëlueerd matiemaatschappij nanobody (uit stap 3.11) op de PBS-geëquilibreerd demineralisatie kolom en de spin bij 1.000 x g gedurende 2 min en verzamelen van het eluaat.
      Opmerking: In plaats van commerciële demineralisatie kolommen, kan dialyse worden toegepast om te wisselen van de samenstelling van de buffer.
  13. Bepaal de eiwitconcentratie (nanobody) van het eluaat met behulp van de bicinchoninic (BCA) of de analyse van Bradford volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Voor nanobody opname testen door GFP verslaggever cellijnen is een voorraad concentratie van 2-10 mg/mL optimaal.

4. bevestiging van matiemaatschappij Nanobody meningsuiting (Coomassie kleuring)

  1. 10-12,5% gels voorbereiden op natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) volgens standaardprotocollen.
    Opmerking: Anderzijds gebruiken verkrijgbare geprefabriceerd kleurovergang gels.
  2. Pipetteer 20 µg gezuiverde matiemaatschappij nanobody in een tube 1,5 mL en kook in monster buffer bij 95 ° C gedurende 5 min.
    Opmerking: Als voorbeeld, voeg toe 10 µL van een stamoplossing van 2 mg/mL nanobody in een 1,5 mL-buis met 10 µL van 2 x monster buffer. Als het volume te klein is, verder verdund nanobody in PBS voordat monster buffer wordt toegevoegd.
  3. Laden van de gezuiverde nanobody gekookt in monster buffer op een SDS-polyacrylamide-gel en uitgevoerd volgens het standaardprotocol van pagina tot de referentie kleurstof (bv bromophenol blauwe) heeft bereikt het einde van de scheitrechter gel, gevolgd door Coomassie kleuring en destaining.
  4. Coomassie Gel kleuring en Destaining.
    1. Uncast van de gel en vlek het met Coomassie kleurstofoplossing (5% van een stamoplossing van het Coomassie in 10% azijnzuur en 45% methanol in ddH2O 10 g/L) voor 20-30 min op RT op een bewegende schudden platform. De gel moet volledig worden gedekt in de kleurstofoplossing.
    2. Destain van de gel 2 - 3 keer met destain oplossing (7.5% azijnzuur en 15% methanol in ddH2O) gedurende 1 uur bij RT, vóór het verlaten van de gel O/N voor verdere destaining.
      Opmerking: Overmaat Coomassie kan worden efficiënt opgezogen door het plaatsen van de keuken papieren handdoeken rond de gel.
  5. Het imago van de gel met een imager of camera van keuze.
    Opmerking: Nanobody expressie kan verder worden gevalideerd door immunoblot analyse met behulp van antilichamen gericht op haar epitopes (Zie ook figuur 1A).

5. opname van matiemaatschappij Nanobodies door gekweekte cellen voor fluorescentie kleuring

  1. In een cel cultuur kap, zaad ~ 400.000 tot 500.000 HeLa cellen stabiel uiting geven aan een eiwit GFP-gelabeld verslaggever op 18 mm glas coverslips (nr. 1,5 H) in 35-mm gerechten of 6-well clusters met volledige medium dat antibiotica (Dulbecco van bewerkt Eagle medium, DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 100 eenheden/mL streptomycine, 2 mM l-glutamine en puromycin van 1,5 µg/mL).
    Opmerking: We gebruiken hier, HeLa cellen stabiel uiting van EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR en TfR-EGFP ter illustratie. Behalve stabiel cellijnen, kunnen ook Transient transfected HeLa cellen worden gebruikt. Stabiele cellijnen mag worden mede verbouwd bij deze stap met ouderlijke niet-getransduceerde HeLa cellen, voor directe vergelijking.
  2. Incubeer de cellen O/N bij 37 ° C in een 7,5% CO2 incubator te verspreiden.
    Opmerking: Cellen moeten een confluentie ~ 80% de volgende dag.
  3. Pipetteer 2 µL van een 2 mg/mL nanobody-stockoplossing in een tube van 15 tot 50 mL met 2 mL van volledige medium (dit volume is voldoende om de dekking van een 35 mm-schotel of een putje van een cluster 6-well, het volume van medium en nanobody proportioneel te nemen meer cel cultuur d ishes of clusters).
    Opmerking: Voor de toepassing van illustratie gebruiken we hier VHH-mCherry, aangezien geen verdere antilichaam kleuring vereist om te zien nanobody geëigd maken door de verslaggevers van de EGFP is (Zie figuur 2C).
  4. Verwijder groeimedium uit de cellen en voeg toe 2 mL voorverwarmde volledige opslagmedium met 2 µg/mL matiemaatschappij nanobody per schotel van 35 mm of 6-well eenheid.
  5. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 7,5% CO2 incubator toe verslaggever-gemedieerde nanobody opname.
    Opmerking: Afhankelijk van het geplande experiment moet het tijdstip van opname van de nanobody worden aangepast. Voor het experiment dat hier wordt weergegeven, is 1 h voldoende om het bereiken van de stationaire toestand van nanobody ICT door EGFP-CDMPR en TfR-EGFP.
  6. Verwijder het medium en wassen van de cellen 2 - 3 keer met 1 mL 1 x PBS op RT.
  7. Herstellen van de cellen met 1 mL van 3% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten op RT.
  8. PFA oplossing verwijderen en doven resterende fixeer met 1 mL 50 mM NH4Cl in 1 x PBS voor 5 min op RT.
    Opmerking: 3% PFA afzonderlijk als kleefpoeders afval moet worden verwijderd.
  9. Wassen van de cellen 3 keer met 1 mL 1 x PBS op RT.
  10. De cellen met 1 mL 0,1% permeabilize Triton X-100 in 1 x PBS voor 10 min op RT.
    Opmerking: Hoewel geen permeabilization vereist is, is EGFP en mCherry fluorescentie beter wanneer daarna de cellen zijn ingesloten in montage medium.
  11. Wassen van de cellen 3 keer met 1 mL 1 x PBS op RT.
  12. Plaats van de coverslips met een tang op een drop (~ 100 µL) van 1% BSA in 1 x PBS met 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) voor 5 min op RT.
  13. Plaats het coverslips terug in de schotel/put en was 3 keer met 1 mL 1 x PBS op RT.
  14. Label van de dia's van glas en monteren van de cellen met Fluoromount-G. Laat de montage medium harden in het donker voor 3-4 h en slaan van de glazen dia's bij 4 ° C onder lichte bescherming.
  15. Afbeelding kleuring van patronen met behulp van een Microscoop van keuze (bijvoorbeeld punt scannen Confocal rechtop Microscoop).

6. opname van matiemaatschappij Nanobodies door gekweekte cellen (p.a. Sulfation)

  1. In een cel cultuur kap, seed ~ 400.000 tot 500.000 HeLa cellen stabiel uiting van een verslaggever GFP-gelabeld eiwit in 35 mm gerechten of op 6-well clusters met volledige middellange met antibiotica (Dulbecco van bewerkt Eagle medium, DMEM, aangevuld met 10% foetale kalf serum (FCS), 100 eenheden/mL streptomycine, 2 mM l-glutamine en puromycin van 1,5 µg/mL).
    Opmerking: Zoals hierboven vermeld, gebruiken we hier HeLa cellen stabiel uiting van EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR en TfR-EGFP ter illustratie. Behalve stabiel cellijnen, kan ook Transient transfected HeLa worden gebruikt.
  2. Incubeer de cellen O/N bij 37 ° C in een 7,5% CO2 incubator te verspreiden.
    Opmerking: Cellen moeten een confluentie ~ 80%, 's anderendaags.
  3. Het volledige medium verwijderen, spoel 2 keer met 1 x PBS op RT en verhongeren de cellen met sulfaat-vrije medium (SFM) gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 7,5% CO2 incubator.
    Opmerking: SFM wordt bereid door het toevoegen van 10 mL MEM aminozuren (50 x) oplossing, 5 mL van L-glutamine (200 mM), 5 mL van de vitamine-oplossing (100 x) en 900 µL CaCl2·2H,2O aan 500 mL Eagle's evenwichtige zouten. Passeren van een 0,22 µm filter en aliquot deel.
  4. Bereiden in een geventileerde kap of Bank aangewezen voor radioactiviteit werk, sulfaat opslagmedium met 0.5 mCi/mL [35S]-sulfaat als natriumzout in SFM labeling.
    Let op: Zorgvuldig omgaan met alle oplossingen met radioactiviteit. Alleen werken in aangewezen afzuigkappen of banken. Alle materiaal (tips, buizen, platen, enz.) of wassen buffers in contact met radioactiviteit moeten worden verzameld en verwijderd afzonderlijk. Doe dit ook voor alle volgende stappen (stap 6.5-6.20).
  5. Voeg VHH-2xTS in 1 x PBS in sulfaat labeling middellange tot een uiteindelijke concentratie van 2 µg/mL.
    Opmerking: Als de controle, ook VHH-std of een ander nanobody verstoken van TS sites om aan te tonen specifieke etikettering.
  6. SFM vervangen door 0,7 mL van sulfaat middellange met 0.5 mCi/mL [35S] sulfaat en 2 µg/mL VHH-2xTS benoemen en Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 7,5% CO2 incubator aangewezen voor werk met radioactiviteit.
    Opmerking: Afhankelijk van het geplande experiment moet de tijd van de nanobody sulfation worden aangepast. Bovendien, om te bepalen TGN aankomst kinetiek, wordt labeling uitgevoerd voor verschillende tijdstippen (bv. voor 10 min, 20 min, 30 min, enz.).
  7. Verwijder het labeling medium en wassen van de cellen 2 - 3 keer met ijskoude 1 x PBS op een koeling plaat of ijs.
  8. Voeg 1 mL lysisbuffermengsel (PBS met 1% Triton X-100 en 0,5% deoxycholate) aangevuld met 2 mM PMSF en 1 x proteaseinhibitor cocktail en Incubeer de cellen gedurende 10-15 minuten op een rockende platform bij 4 ° C.
  9. Schrapen en breng de lysate in een tube van 1,5 mL, vortex de lysate, en plaats voor 10-15 min op een eind over rotator bij 4 ° C.
  10. Een postnuclear bereiden lysate door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  11. Met behulp van een nieuwe 1,5 mL-buis, bereiden van 20-30 µL van een gier van nikkel parels in een tube van 1,5 mL en een keer wassen met 1 x PBS door zachtjes pillering hen bij 1.000 x g gedurende 1 min.
    Opmerking: In plaats van nikkel kunnen kralen, daar kralen (als nanobody biotinyleerd) of eiwit A kralen met een IgG tegen een epitoop van de nanobody (T7 - of HA-tag) worden gebruikt.
  12. Overdracht van de postnuclear lysate in een 1,5 mL-buis met nikkel kralen en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C op een eind over rotator te isoleren van de nanobodies. Verwijder een aliquoot gedeelte (50-100 µL) van de postnuclear lysate en kook in SDS monster buffer voor latere immunoblot analyse van totale cel-geassocieerde nanobody, GFP verslaggever en laden van de controle.
  13. De parels 3 keer met 1 x PBS of lysis buffer wassen door zachtjes pillering bij 1.000 x g gedurende 1 minuut.
    Opmerking: Voor strengere wassen van kralen, kan 20 mM imidazool worden opgenomen in PBS of lysis buffer.
  14. Verwijder voorzichtig alle wassen buffer van de kralen, voeg 50 µL van 2 x monster buffer, en kook gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
  15. Belasting, zowel gekookt parels op een midi 12,5% SDS-pagina gel en uitgevoerd volgens het standaardprotocol van pagina tot de referentie kleurstof (bv bromophenol blauwe) heeft bereikt het einde van de scheitrechter gel.
    Opmerking: Immunoblot analyse van totale cel-geassocieerde nanobody, GFP verslaggever en laden van de controle kan ook worden uitgevoerd met behulp van een mini 12,5% SDS-pagina of geprefabriceerd kleurovergang gel.
  16. Hersteld de scheitrechter gel in ~ 30 mL fixatie buffer (10% azijnzuur en 45% methanol in ddH2O) gedurende 1 uur bij RT de gel driemaal met ~ 50 mL gedeïoniseerd water wassen en bereiden voor het drogen van de gel.
  17. SDS-pagina gelen drogen.
    1. Zorgvuldig plaatst de vaste gel op uitgerekt cling film en bedek het met voorgesneden filtreerpapier.
    2. Plaats de gel met het koffiefilter naar beneden op de top van het drogen platform, plaats de vacuüm cover, en zet de vacuümpomp voor het drogen van de gel. Droog de gel gedurende 3-5 uur.
    3. Verwijder de zelfklevende folie en leg de gedroogde gel in een autoradiografie cassette uitgerust met een scherm van fosfor.
  18. Afbeelding autoradiograph met behulp van een Phosphor Screen Imager. Volg de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Afhankelijk van de sterkte van het signaal, gedroogd gels moeten langer worden blootgesteld met fosfor schermen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om te onderzoeken retrograde eiwit transport naar diverse intracellulaire bestemmingen, hebben we onlangs een anti-GFP nanobody gebaseerde instrument om te etiketteren en volg recombinante fusion eiwitten van de cel-oppervlakte30opgericht. Hier tonen we de bacteriële productie van dergelijke derivatized nanobodies en tonen hun toepassing te bestuderen endocytotische ICT door fluorescentie microscopie en immunoblotting, alsmede het gebruik ervan te onderzoeken TGN aankomst door sulfation analyse. De laatste toepassing is de methodologische focus van dit protocol.

We hebben een werkset van verschillende matiemaatschappij anti-GFP nanobodies met gemeenschappelijke kenmerken gegenereerd door standaard moleculaire klonen30. Onze eenvoudigste (standaard) nanobody, VHH-std, bevat het domein VHH, een T7 en een epitoop HA voor latere detectie van specifieke antilichamen, een carboxyterminal hexahistidine (His6)-tag voor de zuivering, en een Biotine acceptor peptide (BAP) volgorde voor biotinylation en hoge-affiniteit daar pull-down experimenten (figuur 1A). Bewerking van VHH-std levert verschillende nanobody varianten te onderzoeken endocytotische opname- en retrograde vervoer biochemically, door vaste en levende cel imaging en elektronenmicroscopie.

Om te beoordelen van verkeer van het eiwit van het plasma-membraan naar de trans-Golgi/TGN, we profiteerde van de exclusieve lokalisatie van tyrosylprotein sulfotransferases in deze compartimenten en aldus gewijzigd VHH-std met een tandem tyrosine sulfation site (2xTS) afgeleid rat procholecystokinin €41. Terwijl wijziging van VHH-std met mCherry de mogelijkheid directe visualisatie van retrograde vervoer per vaste en levende cel imaging biedt, functionalization met een peroxidase, zoals APEX237, kunt elektronenmicroscopie studies, cytochemische compartiment ablatie, of nabijheid-afhankelijke biotinylation reacties. Daarnaast, kunt invoeging van een breukzijde voor de tabak etch virus (TEV) protease biochemically onderscheid maken tussen intracellulaire en oppervlakte-gebonden nanobodies (figuur 1A). Wij hebben vroeger VHH-tev endocytotische recycling kinetiek van nanobody-gebonden EGFP-CDMPR en TfR-EGFP30controleren. Wederverschijning van de Nanobody op het celoppervlak na opname kan gewoon worden beoordeeld door het jagen met extracellularly toegepaste recombinante TEV protease waardoor een omgekeerde verlies van de nanobody de carboxyterminal epitoop cassette. Met inbegrip van een breukzijde in de mCherry of APEX2 nanobody fusion is handig om te bestuderen van recycling kinetiek van EGFP verslaggevers door levende cel imaging op een gelijkaardige manier aan VHH-tev, of te beperken van cytochemische reacties op intracellulaire compartimenten, respectievelijk. Functionalization met andere eiwitten domeinen (bijvoorbeeld andere fluorophores of enzymen) of doel sequenties voor andere posttranslationele modificaties kunnen gemakkelijk worden bereikt door een respectieve invoegen in het plasmide subcloning vector coderen VHH-std (Zie ook Tabel 1 voor plasmide informatie) met behulp van beschikbare SpeI en EcoRI beperkingsplaatsen.

Met het protocol zoals hierboven beschreven, kan alle nanobodies geïllustreerd hier worden geïsoleerd voor hoge zuiverheid en rendement (figuur 1B). Alleen mCherry samensmeltingen toonde kleine knippen van eiwit domeinen post zuivering (figuur 1B, zie rijstroken 7-8). Bij gebrek aan BirA expressie verkregen we meestal 25-35 mg voor VHH-std, VHH-2xTS en hun tegenhangers tev gemodificeerde of ~ 20 mg voor VHH-APEX2 en VHH-mCherry en hun derivaten tev-bevattende. Onze ervaring leert dat BirA coexpression nanobody rendement door een derde tot de helft verlaagt.

Om te illustreren verslaggever-gemedieerde nanobody opname, hebben we gebruikt HeLa cellijnen stabiel uiten EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR en TfR-EGFP (figuur 2A en B). EGFP was gesmolten het extracellulaire/lumenal einde van elke proteïne (d.w.z., tussen het signaal en verslaggever opeenvolging van CNX of CDMPR) en de carboxyterminus van de TfR, de cytosolische sorteren signalen ongehinderd verlaten. Al deze lading EGFP-gelabelde moleculen hebben verschillende intracellulaire handel routes na ER gericht op. Aangezien EGFP-Calnexin woont in de ER en normaal gesproken niet bericht-Golgi compartimenten bereikt, dient het als een negatieve controle voor opname van de potentiële en niet-specifieke nanobody. In tegenstelling, zowel EGFP-CDMPR TfR-EGFP hebben vervoer functies buiten het Golgi en lijken derhalve gestaag aan het plasma-membraan. Zoals verwacht, toen VHH-mCherry werd toegevoegd aan een gemengde bevolking van ongewijzigde HeLa en cellen stabiel uiten EGFP-CNX, kon geen internalisering nanobody worden waargenomen in beide gevallen. Echter zowel EGFP-CDMPR TfR-EGFP gevangen VHH-mCherry bij het celoppervlak en vervoerde hen Rail aan de verslaggever van homing compartimenten (figuur 2C).

VHH-mCherry colocalization met een resident TGN marker kan in principe worden gebruikt ter beoordeling van TGN aankomst. Nog, we een biochemische aanpak op basis van tyrosine sulfation opgericht. Om te profiteren van deze wijziging voordoet in de trans-Golgi/TGN, nanobodies waren matiemaatschappij met TS sites (figuur 1A). Om aan te tonen de specificiteit en de functionaliteit van deze eiwitten bindmiddelen, geïncubeerd we ongewijzigde HeLa cellen en cellen stabiel uit te spreken met EGFP-CNX, EGFP-CDMPR en TfR-EGFP met VHH-std of VHH-2xTS 1 h in de aanwezigheid van radioactieve sulfaat. Radiolabeling van VHH-2xTS treedt alleen op wanneer een verslaggever vervoert de nanobody retrogradely aan de TGN waar het wordt blootgesteld aan de tyrosine-sulfation-machine. HeLa uiting van EGFP-CNX en hun ouderlijke cellen weergeven geen nanobody-opname- en dus geen sulfation. Zowel de EGFP-CDMPR en de TfR-EGFP geïnternaliseerd nanobodies, de laatste aanzienlijk meer dan de eerste. Echter enige EGFP-CDMPR veroorzaakt VHH-2xTS te worden sulfated (figuur 3A). Dit bevestigt efficiënte retrograde transport van CDMPR van het celoppervlak naar de TGN en levert het bewijs tegen de TfR terug te keren naar de TGN (zoals is gesuggereerd in sommige studies42,43).

Kinetiek van internalisering en TGN komst van verslaggever eiwitten kunnen ook worden bepaald door het analyseren van cel lysates na verschillende tijden van opname van de nanobody- en sulfation. Met behulp van EGFP-CDMPR als verslaggever, vonden we sulfation start pas na een periode van de vertraging van ~ 15 min en te bereiken van verzadiging alleen na > 75 min (figuur 3B, rijstroken 1-6, en C, vierkante symbolen). Kinetiek van opname- en sulfation verscheen verschoven door bijna 30 min, als gevolg van het transport naar de TGN. Verder staat de methode te onderzoeken van de sorteer machine betrokken bij MPR vervoer van farmacologische storing of eiwit silencing benaderingen zoals knockdown, knock-out of knocksideways. Hier, we gewend brefeldin A (BFA), een inhibitor van de omwenteling van guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs) van verschillende Arf GTPases, over het algemeen interfereren met retrograde transport naar de TGN. Wanneer behandeld met BFA, werd sulfation afgeschaft, terwijl de opname bleef onaangetast kinetiek zowel in omvang (figuur 3B, rijstroken 7-12, en C, ronde symbolen).

Figure 1
Figuur 1: ontwerp en productie van matiemaatschappij nanobodies voor het bijhouden van EGFP gemodificeerde cel oppervlakte eiwitten. (A) Schematische weergave van de derivatized nanobodies. De standaard nanobody bestaat uit het GFP-specifieke VHH domein, T7 en HA epitoop tags een BAP en een hexahistidine (His6) reiniging tag. Andere nanobodies omvatten daarnaast twee TSs, APEX2 of mCherry, elk met of zonder een breukzijde voor TEV protease (tev). Schaal bar is aminozuren (aa). (B) Bacterially uitgedrukt en gezuiverde nanobodies (50 μg) werden geanalyseerd door kleurovergang SDS-gel-elektroforese en gekleurd met Coomassie. Marker eiwitten met moleculaire massa in kDa worden weergegeven aan de linkerkant. Alleen VHH-mCherry en VHH-tev-mCherry toonde minimale knippen tussen de VHH en de mCherry domeinen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: opname- en intracellulaire lokalisatie van VHH-mCherry door verschillende EGFP verslaggever eiwitten. (A) Schematische weergave van EGFP fusion eiwitten. Afgeleid van secretoire membraaneiwitten reeksen worden weergegeven in zwart met N-terminale signaal peptiden en interne transmembraan segmenten in geel, en EGFP wordt geïllustreerd in het groen. EGFP was gesmolten full-length CDMPR, TfR en Calnexin (CNX). Schaal bar in aminozuren (aa). EGFP-CDMPR en TfR-EGFP zijn beschreven30. (B) HeLa cellen stabiel uiten EGFP verslaggever eiwitten zijn geoogst, lysed en geanalyseerd door SDS-gelelektroforese en immunoblotting met anti-GFP en anti-actine antilichamen. Moleculaire massa in kDa is aangegeven op het recht. (C) HeLa cellen stabiel uiten de EGFP-gelabeld verslaggever eiwitten waren gemengd met ouderlijke HeLa cellen, geïncubeerd met 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) voor 1 uur bij 37 ° C en verwerkte voor fluorescentie microscopie. Schaal bar = 10 μm. Opname gebeurt alleen door cellen uiten van een verslaggever met EGFP blootgesteld aan het celoppervlak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: analyse van Sulfation en kinetiek van retrograde transport naar de TGN met behulp van TS-gelabeld nanobodies. (A) ouderlijke HeLa cellen en stabiel uiten EGFP gemodificeerde verslaggever eiwitten waren gelabeld met behulp van 0.5 mCi/mL [35S] sulfaat voor 60 min met 2 μg/mL VHH-std of VHH-2xTS. Nanobodies werden geïsoleerd met behulp van nikkel kralen, gescheiden op een 12,5% SDS-pagina gevolgd met behulp van autoradiografie. Aliquots van cel lysates werden verzameld vóór de nikkel pull-down- en immunoblotted voor cel-geassocieerde nanobody (His6), EGFP en actine. (B en C) HeLa cellen stabiel uiten EGFP-CDMPR waren gelabeld met 0.5 mCi/mL [35S] sulfaat voor maximaal 75 min in het bijzijn van 2 μg/mL VHH-2xTS met en zonder 2 μg/mL BFA vóór de analyse als in (A). Kwantificatie van VHH-2xTS opname- en sulfation uit drie onafhankelijke experimenten wordt weergegeven in percentage van de waarde zonder BFA na 75 min (gemiddelde en SD). Zwarte vierkantjes, zonder BFA; grijze cirkels, met BFA; symbolen, open opname; symbolen, gevuld sulfation. Dit cijfer is gewijzigd en uitgebreid van Buser et al., 2018, PNAS30. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: proteïne sequenties van de functionalized nanobodies in deze studie weergegeven. T7 epitoop in grijs, VHH in zwart, HA epitoop in blauw, BAP volgorde in oranje, hexahistidine (His6) in rood, TEV protease breukzijde in paars, myc epitoop in magenta, de sulfation van tyrosine volgnummer in geel, APEX2 in het groen, en mCherry in roze. De codering van deze anti-GFP matiemaatschappij nanobodies expressievectoren zijn neergelegd (Zie ook de plasmide informatie in tabel 1 ). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies vertegenwoordigen een opkomende klasse van eiwitten binder steigers met vele voordelen ten opzichte van conventionele antilichamen: ze zijn kleine, stabiele, monomeer, kunnen worden geselecteerd voor hoge affiniteit en ontbreken bisulfide obligaties33,35, 44 , 45. ze worden gebruikt in een aantal toepassingen, zoals in cel cultuur systemen en organismen in Ontwikkelingsbiologie46,47,48,49, als kristallisatie chaperones aan stabiliseren conformationele Staten in structurele biologie50,51,52,53, als remmers of activiteit modulatoren van enzymen54,55, 56, als immunohistochemische reagentia voor biochemische analysen57of als "secundaire nanobodies" te detecteren anti-muis en anti-konijn immunoglobulinen op immunoblots en immunofluorescentie58. In onze eerdere studie, wij hebben ontwikkeld en toegepaste matiemaatschappij nanobodies geproduceerd door bacteriële expressie aan oppervlak-label eiwitten en bijhouden van hun intracellulaire route naar verschillende compartimenten, in het bijzonder naar de TGN30. Wij een anti-GFP-nanobody gebruikt om het hulpprogramma veelzijdige, kunnen aan target fusie-eiwitten met extracellulaire GFP, YFP of mCerulean die mogelijk al beschikbaar en gekarakteriseerd. Wijziging van de anti-GFP nanobodies met mCherry, APEX2 of TS sites konden we controleren verslaggever opname door vaste en levende cel imaging, tot ultrastructurally visualiseren retrograde vervoer compartimenten, lasertherapie van deze vakken of studie van vervoer Kinetiek aan de TGN. Één nadeel van onze tool is dat recombinante wijziging van doel cellijnen (stabiele expressie of endogene tagging) nodig is alvorens matiemaatschappij anti-GFP nanobodies kunnen worden toegepast. Functionalization kan natuurlijk ook worden toegepast op het snel toenemende aantal nanobodies gericht tegen niet-gelabelde endogene doel eiwitten door dierlijke immunisatie of door ribosoom-display en faag-display selectie van synthetische VHH bibliotheken59. Met behulp van nanobodies bewerkt met TS sites (bijvoorbeeld VHH-2xTS), kunnen we direct meten vervoer en kinetiek van TGN komst van uiteenlopende EGFP gemodificeerde doel eiwitten. Wij hebben VHH-2xTS om te bestuderen van de bijdrage van de adapter eiwit complex 1 (AP-1) in retrograde vervoer van MPRs door directe kinetische analyse in knocksideways cellen waardoor snelle inactivatie van de gegeven vervoer machines30toegepast. Nanobody sulfation en vandaar retrograde vervoer van EGFP-geëtiketteerden MPRs was gedeeltelijk, maar niet volledig geblokkeerd. Onze nanobody gebaseerde benadering met behulp van sulfation als TGN aankomst sensor bevestigde de resultaten van de vorige van andere laboratoria die aangeeft van een functionele bijdrage voor AP-1 in retrograde endosome-naar-TGN vervoer17,60, 61. Sulfatable nanobodies kan dus verstrekt een nuttige biochemische hulpmiddel om te ontleden de bijdrage van andere retrograde vervoer machineries, zoals epsinR, Rab9/TIP47 of SNX-BAR/retromer complexen, op vracht eiwitten door genomic en chemische en genetische manipulaties. Het hier gepresenteerde protocol biedt een basis van hoe een gebruik van matiemaatschappij nanobodies in het algemeen maken kan om te bepalen van de doelgroep compartimenten, paden, en vervoer kinetiek in gekweekte cellen.

Andere fracties hebben al gebruik gemaakt van TS sites te volgen van vervoer uit de cel oppervlak aan de TGN. Ricine, Shiga of kinkhoest toxine subeenheden zijn eerder gewijzigd met sulfation plaatsen om aan te tonen een transportroute via de TGN62,63,,64,,65,66. Bovendien, TS peptiden had ook zijn chemisch gekoppeld aan IgGs te assay retrograde vervoer van GFP-CIMPR en endogene TGN46 de TGN67,68. Onze sulfatable nanobodies hebben het voordeel van eenvoudig en reproduceerbare bacteriële productie en de stoichiometrie van een 1:1 met de doel-eiwit. Integendeel, het is bijvoorbeeld bekend dat divalente eiwit bindmiddelen, zoals IgGs, kan dwarslijn cel oppervlakte eiwitten en veranderen hun intracellulaire mensenhandel aan lysosomen na endocytose69,70, markeren de betekenis van de monomere eiwit bindmiddelen ten opzichte van bestaande methoden. Een kritische stap van onze techniek is dat behandeling met radioactiviteit vereist is voor het uitvoeren van sulfaat labeling van nanobodies. Echter kan onze tool van matiemaatschappij nanobodies met TS sites te bestuderen TGN aankomst mogelijk worden toegepast zonder de radioactiviteit met behulp van anti-sulfotyrosine antilichamen.

Onze vorige studie suggereert dat nanobody sulfation zijn niet zeer efficiënt, omdat sulfation van MPRs had nog niet bereikt een maximum na 75 min, hoewel nanobody opname werd verzadigd na 45 min30. Screening op andere natuurgebieden van TS kan sulfation efficiëntie verbeteren. U kunt ook om potentieel sulfation-efficiëntie te verbeteren, misschien onderdelen van de sulfation machine zelf, zoals TPST1 en TPST2, worden overexpressie. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat overexpressie van een van de vervoerders leveren van de 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS), het substraat voor TPSTs, uit het cytosol naar het lumen van het Golgi kan het wijzigen van de status van de sulfation van proteoglycans 71.

Afgezien van sulfatable nanobodies toestaan andere derivatizations ook tracering vervoer via endocytotische compartimenten en voor de TGN. APEX2 kan worden toegepast als een ongeordende labeling enzym voor nabijheid-afhankelijke biotinylation voor proteoom analyse van retrograde vervoer. APEX2 nanobody die door een reporter van de lading van belang is geïnternaliseerd zal label eiwitten in de nabijheid binnen de doelgroep compartimenten. Vergelijkende proteomics moet kunnen identificeren van de andere endogene eiwitten in de verschillende soorten Endosomen en de TGN waarmee het nanobody wordt geopend. Er zijn vele variaties van nanobodies in combinatie met haar doel eiwit denkbaar. Een recent rapport, bijvoorbeeld een omgekeerde benadering toegepast op de hier beschreven: derivatized GFP werd gebruikt om te studeren en trap-cellularly uitgesproken anti-GFP nanobody-gelabeld vacuolar sorteren receptoren in anterograde en retrograde compartimenten van de plant endomembrane systeem72. Matiemaatschappij nanobody-traps kunnen ook worden ontworpen in zoogdiercellen cultuur systemen te vangen en accumuleren EGFP gemodificeerde verslaggevers in verschillende compartimenten tijdens het retrograde vervoer.

Ons hier gepresenteerd methode en protocol met de focus op TS site-gelabeld nanobodies kunnen kwantitatieve en kwalitatieve bijhouden van eiwitten van de lading van het celoppervlak endocytotische compartimenten en de TGN in gekweekte zoogdiercellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door Grant 31003A-162643 door de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Nicole Beuret en de Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) voor steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

Immunologie en infecties probleem 144 nanobodies retrograde vervoer Golgi complex tyrosine sulfation bacteriële expressie radiolabeling EGFP HeLa cellen
Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter