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Biochemistry

Analisi dell'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado alla rete Trans-Golgi utilizzando Nanobodies funzionalizzati in cellule coltivate

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Trasporto retrogrado delle proteine di superficie delle cellule di Golgi è essenziale per mantenere l'omeostasi della membrana. Qui, descriviamo un metodo per analizzare biochimicamente trasporti di superficie--Golgi cellulare di proteine ricombinanti utilizzando nanobodies funzionalizzati in cellule HeLa.

Abstract

Trasporto di proteine e membrane dalla superficie delle cellule di Golgi e oltre è essenziale per l'omeostasi, organello identità e fisiologia. Per studiare il traffico della proteina retrograda, abbiamo recentemente sviluppato un versatile basato su nanobody toolkit per analizzare il trasporto dalla superficie delle cellule al complesso di Golgi, mediante imaging cellulare fisso e dal vivo, da microscopia elettronica, o biochimicamente. Abbiamo progettato funzionalizzati anti-verde proteina fluorescente (GFP) nanobodies — raccoglitori di proteine ad alta affinità, monomerico e piccoli — che possono essere applicati alle linee cellulari che esprimono le proteine di membrana di interesse con una parte extracellulare di GFP. Derivatizzato nanobodies associato ai reporter GFP sono specificamente interiorizzato e trasportato sulle spalle lungo rotte ordinamento il reporter. Nanobodies sono stati funzionalizzati con fluorofori seguire trasporto retrogrado mediante microscopia a fluorescenza e immagini, con ascorbato perossidasi 2 (APEX2) per studiare la localizzazione ultrastrutturale dei reporter-nanobody complessi da elettrone dal vivo microscopia e con motivi di solfatazione (TS) di tirosina per valutare la cinetica dell'arrivo di trans-Golgi network (TGN). In questo articolo metodologico, descriviamo la procedura generale per batterico esprimere e purificare nanobodies funzionalizzati. Vi illustriamo l'uso potente del nostro strumento utilizzando il nanobodies mCherry - e TS-modificato per analizzare l'assorbimento endocitosi e TGN arrivo di proteine cargo.

Introduction

Retrogrado traffico di proteine e di lipidi dalla superficie delle cellule ai vari compartimenti intracellulari è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi di membrana per controbilanciare la secrezione e riciclare componenti di anterograda trasporto macchinari1 , 2. a seguito di internalizzazione tramite endocitosi clatrina-dipendente o - indipendente, carico della proteina e del lipido innanzitutto popolare presto endosomes da dove si trovano ulteriori reindirizzamento sia lungo il sistema endolisosomiale, riciclato alla membrana plasmatica, o mirati alla rete trans-Golgi (TGN). Riciclaggio da endosomi e/o di superficie delle cellule a livello di TGN è parte del ciclo funzionale di un numero di recettori transmembrana carico anterograda, quali i recettori di mannosio-6-fosfato catione-dipendenti e indipendenti del catione (CDMPR e CIMPR) consegna recentemente sintetizzato idrolasi lisosomiale da TGN tardi endosomi e lisosomi3,4,5, sortilina e SorLA6,7e Wntless (WLS) trasporto di ligandi di Wnt alla superficie delle cellule 8 , 9 , 10 , 11. altre proteine Estratto torna a TGN sono TGN46 e sue isoforme correlate12,13,14, Rullanti ( N- ethylmaleimide-sensibili fusione fattore allegato recettori solubili) 15 , 16 , 17, precursore dell'amiloide (APP) di proteina18,19, anchilosi progressiva (ANK) proteina20, trasportatori metallici quali ATP7A/B o DMT121,22e del transmembrane elaborazione enzimi tra cui carbossipeptidasi D, furin o BACE123,24,25. Oltre a queste proteine endogene, tossine batteriche e pianta (ad es., tossina Shiga e colera, ricina e abrina) dirottare macchinari di trasporto retrogrado per raggiungere il pronto soccorso per dislocazione nel cytosol26,27, 28,29.

Al fine di analizzare direttamente il traffico retrograda, precedentemente abbiamo sviluppato un kit di strumenti basati su nanobody per etichettare e seguire le proteine cargo dalla superficie delle cellule per compartimenti intracellulari30. Nanobodies rappresentano una nuova famiglia di proteine leganti derivati da omodimeriche pesante-catena-solo gli anticorpi (hcAbs) che si presentano naturalmente in camelidi e pesci cartilaginei31,32. Essi costituiscono il dominio variabile di catene pesanti (VHH) di hcAbs e presentano molti vantaggi sopra gli anticorpi convenzionali (ad es., IgG): sono monomerici, piccolo (~ 15 kDa), altamente solubile, privo di legami bisolfurico, può essere espresso batterico e selezionato per legame ad alta affinità33,34,35,36. Per rendere il nostro strumento di nanobody versatile e ampiamente applicabili, abbiamo impiegato nanobodies funzionalizzati anti-GFP per le proteine di superficie-etichetta e pista con GFP al loro dominio extracellulare/lumenal etichettate. Dalla funzionalizzazione di nanobodies con mCherry, ascorbato perossidasi 2 (APEX2) trasporto retrogrado37, o sequenze di solfatazione (TS) tirosina di proteine transmembrana carico bonafide può essere analizzato da uno fisso e live imaging cellulare, di la microscopia elettronica, o biochimicamente. Poiché la solfatazione di tirosina mediata da tyrosylprotein sulfotransferasi (TPST1 e TPST2) è una modificazione post traduzionale limitato a trans-Golgi/TGN, possiamo studiare direttamente trasporti e cinetica di proteine di interesse dalla superficie delle cellule a questo intracellulare Golgi vano38,39,40.

In questo articolo di metodi, descriviamo la facilità di produzione di nanobodies funzionalizzati (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivati), adatto per un numero di applicazioni per analizzare il trasporto retrogrado in cellule di mammifero30. Ci concentriamo principalmente sull'uso di TS per volta il sito nanobody per l'analisi del traffico intracellulare dalla superficie delle cellule al comparto della solfatazione.

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Protocol

1. batterica trasformazione con Nanobodies funzionalizzati

Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'espressione, la purificazione e l'analisi di nanobodies funzionalizzati anti-GFP come descritto in precedenza30. Derivatizzazione con altre parti di proteine potrebbero essere necessarie modifiche del presente protocollo standard.

  1. Scongelare i batteri chemocompetent (~ 100 µ l) adatti per l'espressione della proteina (ad es., Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellule) posizionandoli sul ghiaccio.
    Nota: Preparare chemocompetent cellule batteriche secondo le procedure standard di laboratorio. In alternativa, le cellule batteriche chimicamente competenti possono essere acquistate in commercio.
  2. Aggiungere 50 ng di un plasmide codifica nanobodies funzionalizzati. Per consentire sufficiente biotinylation site-specific del reporter nanobody durante espressione batterica, anche aggiungere un triplice eccesso (150 ng) di un plasmide di espressione batterica codifica ligasi biotina BirA (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide). Pipetta da delicatamente su e giù.
    Nota: Se nanobody biotinylation non è necessario o i giornalisti nanobody sono privi di un peptide di accettore di biotina (BAP), co-trasformazione con un plasmide codifica BirA non è necessaria.
  3. Incubare le cellule batteriche per 30 min in ghiaccio.
  4. Calore di scossa le cellule batteriche inserendoli per 1 min a 42 ° C in un bagno d'acqua o un blocco di riscaldamento.
  5. Aggiungere 1 mL di temperatura (RT) medio di brodo (LB) di Luria e incubare i batteri trasformati in un agitatore per 1h a 37 ° C per permettere l'espressione fenotipica dei geni di resistenza. Per preparare 1L LB medi, Estratto di equilibrio 5 g di lievito, 10g di tryptone e 10 g di NaCl, riempire con acqua e sterilizzare in autoclave. Se il nanobody funzionalizzati ha stato subclonato in un vettore di espressione contenente resistenza all'ampicillina/carbenicillina, passaggio 1.5 può essere omesso.
  6. A pellet i batteri a 11.000 x g per 1 min e risospendere in 100 µ l di terreno LB fresco.
  7. Piastra i batteri sospesi su piastre LB contenenti i rispettivi antibiotici (ad esempio, con 50 µ g/mL kanamicina e 50 carbenicillina µ g/mL quando i batteri sono stati co-trasformati con nanobody reporter e BirA come indicato in precedenza (punto 1.2)).
  8. Posizionare le piastre di LB in un incubatore a 37 ° C e lasciare crescere durante la notte (O/N).
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui memorizzando la piastra LB con colonie coltivate a 4 ° C. Utilizzare parafilm per sigillare piastre LB.

2. batterica coltura liquida e induzione dell'espressione di Nanobody funzionalizzati

  1. Scegli una colonia batterica contenente il vettore di interesse dalla piastra e lasciarlo crescere in una bottiglia contenente 20 mL di LB supplementato con antibiotici O/N in un agitazione incubatore a 37 ° C (Vedi anche punto 1.7 per quanto riguarda gli antibiotici di scelta).
  2. Giorno successivo, diluire la coltura batterica coltivati da 20 mL in un matraccio contenente 1 L di LB medium con gli antibiotici di scelta.
  3. Continuare a incubare la coltura batterica a 37 ° C fino a raggiungere un OD600 di 0,6-0,7. Consentire la cultura raffreddare a RT prima di indurre l'espressione della proteina.
  4. Indurre l'espressione della proteina di nanobodies funzionalizzati e BirA con l'aggiunta di 1 mL di 1 M di isopropile-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM dell'induttore (1:1, 000 diluizione). Anche aggiungere 10 mL di una soluzione della madre di d-biotina mM 20 conseguente 200 µM d-biotina nel terreno di crescita per consentire biotinylation dell'epitopo BAP presente in nanobodies funzionalizzati (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide)
    Nota: La soluzione di riserva d-biotina è preparata in ddH2O e portata in soluzione da sospensione aggiunta di 500mm NaH2PO4. In alternativa, d-biotina può anche essere sciolto in DMSO. Per produrre nanobodies fusa a APEX2 (VHH-APEX2), il mezzo LB deve essere integrato inoltre con il cloridrato di 1 mM 5-aminolevulinico acido (dALA) per promuovere l'incorporazione del heme. dALA è preparato come una soluzione stock di 100 mM in ddH2O.
  5. Incubare la coltura batterica di IPTG-indotto 1 L a 30 ° C per 4 h per VHH-2xTS, a 20 ° C o RT O/N per VHH-APEX2 o a 16 ° C O/N per VHH-mCherry (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide).
    Nota: Condizioni di espressione per un nuovo costrutto di nanobody devono essere ottimizzate dallo sperimentatore.
  6. Trasferire la coltura batterica dal pallone in una bottiglia di centrifugazione 1L e agglomerare le cellule a 5.000 x g a 4 ° C per 45 min. decantare il supernatante e continuare con la purificazione.
    Nota: Il protocollo può essere sospesa qui memorizzando il pellet batterico a-80 ° C a tempo indeterminato. Il pellet per VHH-APEX2 o VHH-mCherry è tipicamente brunastro (a causa dell'eme incorporato) o rosa, rispettivamente.

3. purificazione di Nanobodies funzionalizzati

  1. Se necessario, scongelare il pellet batterico congelato sul ghiaccio (Vedi anche punto 2.6).
  2. Aggiungere 30 mL di buffer di associazione ghiacciata (imidazolo 20mm in PBS 1X) per il pellet cellulare batterica e risospendere pipettando su e giù. Trasferire batteri sedimento in una provetta con etichetta 50 mL.
  3. Supplemento l'associazione 30 mL Tampone con lisozima di 200 µ g/mL, 20 µ g/mL dnasi I, 1 mM MgCl2 e 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) ed incubare prima per 10 min a RT e poi per 1 h a 4 ° C in un agitatore di over-fine.
  4. Meccanicamente lisare cellule batteriche in un tubo da 50 mL inserendo un sonicatore punta nella sospensione. Applicare impulsi costante 3 x 1 min con periodi di raffreddamento 1 min-tra.
  5. Centrifugare il batterico lisato a 15.000 x g a 4 ° C per 45 min a pellet i detriti e cellule intatte. Trasferire i lisati mediante lysate delle cellule batteriche o in una bottiglia di centrifugazione appropriato per centrifugazione o dividere il lisato in diverse provette 5 mL per centrifugazione da tavolo.
  6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL e scartare i detriti pellettato.
  7. Memorizzare lo sgomberati lisato su ghiaccio mentre si prepara la purificazione dalla cromatografia di affinità immobilizzata di metallo (IMAC). Per isolare nanobodies funzionalizzati istidina-etichettate, impiegano monouso sue colonne (Vedi Tabella materiali) che permette la purificazione di gravitá veloce e semplice.
    Nota: In alternativa, purificazione di batch anziché colonne commerciale può essere anche utilizzato.
  8. Montaggio sue colonne a un supporto in metallo.
    1. Affievolirsi soluzione di archiviazione delle colonne ed equilibrare la sua colonna con 10 mL di buffer di associazione (imidazolo 20mm in PBS 1X).
    2. Vuoto di flusso di gravità (il flusso continuo può essere scartato).
  9. Caricare gradualmente lo sgomberati batterica lisato (~ 30 mL) nella colonna. Vuoto di flusso di gravità (il flusso continuo può essere scartato).
  10. Lavare la sua colonna 2 x 10 ml di buffer di associazione (imidazolo 20mm in PBS 1X).
  11. Eluire il nanobodies con 2 mL di tampone di eluizione (imidazolo 500 mM in 1X PBS) in una provetta da 2 mL e applicare un cambio di buffer.
  12. Cambio di buffer.
    1. Equilibrare un desalificazione colonna (Vedi Tabella materiali) disposta in un adattatore della colonna tubo 50 mL 5 volte con 5 mL di PBS 1X.
    2. Permettere al tampone di entrare nella base imballata. Scartare il flusso continuo.
    3. Dopo il quinto equilibrazione di PBS, girare la colonna a 1.000 x g per 2 min.
    4. Scartare il flusso continuo.
    5. Sistemare la colonna con l'adattatore su un nuovo tubo da 50 mL. Caricare i 2 mL di eluiti nanobody funzionalizzati (dal punto 3.11) nella colonna di dissalazione PBS equilibrati e spin a 1.000 x g per 2 min e raccogliere l'eluato.
      Nota: Invece di colonne di dissalazione commerciali, dialisi possono essere applicato per lo scambio di composizione di buffer.
  13. Determinare la concentrazione di proteina (nanobody) dell'eluato utilizzando il bicinconinico (BCA) o analisi di Bradford secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Per le analisi di assorbimento nanobody di linee cellulari GFP reporter, una concentrazione stock di 2-10 mg/mL è ottima.

4. convalida dell'espressione Nanobody funzionalizzati (colorazione di Coomassie)

  1. Preparare 10-12,5% gel per elettroforesi del gel sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) secondo protocolli standard.
    Nota: In alternativa, utilizzare gel gradiente prefabbricati disponibili in commercio.
  2. Pipettare 20 µ g di nanobody purificato funzionalizzati in una provetta da 1,5 mL e far bollire nel buffer del campione a 95 ° C per 5 min.
    Nota: Ad esempio, aggiungere 10 µ l di una soluzione di riserva nanobody di 2 mg/mL in una provetta da 1,5 mL con 10 µ l di tampone di campione x 2. Se il volume è troppo piccolo, diluire ulteriormente nanobody in PBS prima di aggiungere il tampone del campione.
  3. Caricare il nanobody purificata bollito nel buffer del campione su un gel di SDS-poliacrilammide ed eseguire secondo il protocollo standard di pagina fino a quando la tintura di riferimento (ad esempio, il blu di bromofenolo) ha raggiunto la fine del gel di separazione, seguita dalla macchiatura Coomassie e decolorante.
  4. Coomassie Gel di colorazione e decolorazione.
    1. Uncast il gel e macchia con la soluzione colorante Coomassie (5% di un soluzione di riserva di Coomassie in 10% acido acetico e il 45% di metanolo in ddH2O 10 g/L) per 20-30 min a RT su una piattaforma d'agitazione commovente. Il gel deve essere completamente coperta nella soluzione colorante.
    2. Decolorare il gel 2 - 3 volte con decolorare soluzione (7,5% di acido acetico e 15% metanolo in ddH2O) per 1 h ogni a RT, prima di lasciare il gel O/N per ulteriori decolorante.
      Nota: Eccesso Coomassie può essere efficientemente assorbito mettendo asciugamani di carta cucina intorno il gel.
  5. Immagine il gel con un imager o macchina fotografica di scelta.
    Nota: Nanobody espressione può essere ulteriormente convalidato dall'analisi del immunoblot usando gli anticorpi suoi epitopi di targeting (Vedi anche Figura 1A).

5. l'assorbimento di Nanobodies funzionalizzati dalle cellule coltivate per la macchiatura di fluorescenza

  1. In una cappa di cultura cellulare, cellule HeLa seme ~ 400.000 a 500.000 che esprimono stabilmente una proteina reporter GFP-etichettato su lamelle di vetro di 18 mm (No. 1,5 H) in 35 mm piatti o in gruppi di 6-pozzetti con completo supporto contenente antibiotici (medium di Eagle per volta di Dulbecco, DMEM completati con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 unità/mL di streptomicina, 2 mM l-glutammina e con puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Qui, usiamo le cellule HeLa che esprimono EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP a scopo illustrativo. A parte le linee cellulari stabili, possono essere utilizzate anche transitoriamente transfected le cellule HeLa. Linee cellulari stabilizzate possono essere co-coltivate in questa fase con parentale non trasdotte le cellule HeLa, per confronto diretto.
  2. Incubare le cellule O/N a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 a proliferare.
    Nota: Le cellule dovrebbero avere una confluenza di ~ 80% il giorno successivo.
  3. Pipettare 2 µ l di una soluzione di riserva nanobody 2 mg/mL in una provetta da 15 o 50 mL contenente 2 mL di terreno completo (questo volume è sufficiente a coprire un piatto di 35 mm o un pozzetto di un cluster di 6 pozzetti, regolare il volume del mezzo e nanobody proporzionalmente per includere più cella cultura d pesci o cluster).
    Nota: A scopo illustrativo, usiamo qui VHH-mCherry, poiché nessun ulteriore macchiatura dell'anticorpo è necessaria per vedere nanobody interiorizzato dai reporter EGFP (Vedi Figura 2).
  4. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e aggiungere 2 mL di preriscaldati mezzo completo contenente 2 µ g/mL funzionalizzati nanobody piatto 35 mm o 6 pozzetti unità.
  5. Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 per consentire l'assorbimento nanobody reporter-mediata.
    Nota: A seconda dell'esperimento pianificato, il tempo dell'assorbimento nanobody deve essere regolato. Per l'esperimento mostrato qui, 1h è sufficiente raggiungere stazionario dell'assorbimento nanobody di EGFP-CDMPR e TfR-EGFP.
  6. Rimuovere il supporto e lavare le cellule 2 - 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  7. Fissare le cellule con 1 mL di 3% paraformaldeide (PFA) per 10 minuti a TA.
  8. Rimuovere la soluzione PFA e dissetare rimanente fissativo con 1 mL di 50mm NH4Cl in 1X PBS per 5 minuti a TA.
    Nota: 3% PFA deve essere smaltito separatamente come fissativo rifiuti.
  9. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  10. Permeabilize le cellule con 1 mL di 0.1% Triton X-100 in 1X PBS per 10 minuti a TA.
    Nota: Anche se nessun permeabilizzazione è richiesto, fluorescenza EGFP e mCherry è meglio quando in seguito le cellule sono incorporate in mezzo di montaggio.
  11. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  12. Posizionare i coprioggetti con forcipe su una goccia (~ 100 µ l) di BSA 1% in 1X PBS contenente 5 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) per 5 minuti a TA.
  13. Posizionare i vetrini coprioggetti indietro nel piatto/pozzetto e lavare 3 volte con 1 mL di PBS 1X a TA.
  14. Etichettare i vetrini e montare le cellule con Fluoromount-G. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire al buio per 3-4 h e conservare i vetrini a 4 ° C sotto protezione dalla luce.
  15. Pattern di colorazione utilizzando un microscopio di scelta (ad es., punto scansione confocale microscopio verticale) dell'immagine.

6. l'assorbimento di Nanobodies funzionalizzati dalle cellule coltivate (per analisi di solfatazione)

  1. In una cappa di cultura cellulare, seme ~ 400.000 a 500.000 cellule HeLa che esprimono una proteina reporter GFP-etichettato in piastre da 35 mm o sui cluster 6-pozzetti con completi medi contenenti antibiotici (medium di Eagle per volta di Dulbecco, DMEM, completati con 10% fetale di vitello siero (FCS), 100 unità/mL di streptomicina, 2 mM l-glutammina e con puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Come accennato in precedenza, usiamo qui le cellule HeLa che esprimono EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP a scopo illustrativo. A parte le linee cellulari stabili, può essere utilizzato anche transitoriamente transfected HeLa.
  2. Incubare le cellule O/N a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 a proliferare.
    Nota: Le cellule dovrebbero avere una confluenza di ~ 80% giorno successivo.
  3. Rimuovere la sostanza completa, lavare 2 volte con 1x PBS a RT e morire di fame le cellule con il mezzo di solfati (SFM) per 1 h a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 .
    Nota: SFM è preparato aggiungendo 10 mL di soluzione di MEM aminoacidi (50x), 5 mL di L-Glutammina (200 mM), 5 mL di soluzione di vitamine (100x) e 900 µ l di CaCl2·2H2O a 500 mL di sali bilanciati dell'Aquila. Passare attraverso un 0,22 µm filtro e aliquota.
  4. In un cappuccio ventilato o panca designata per il lavoro di radioattività, preparare solfato etichettatura mezzo contenente solfato di mCi/mL [35S] 0,5 come sale di sodio in SFM.
    Attenzione: Maneggiare con cura tutte le soluzioni contenenti radioattività. Funzionano solo in area cappe o panche. Tutti i materiali (suggerimenti, tubi, piastre, ecc.) o buffer di lavaggio a contatto con la radioattività devono essere raccolti e smaltiti separatamente. Fare questo per tutti i passaggi di seguito (passaggio 6.5-6.20) pure.
  5. Aggiungere VHH-2xTS in 1X PBS in solfato etichettatura medio ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL.
    Nota: Come controllo, includono anche VHH-std o un altro nanobody privo di siti TS per dimostrare etichettatura specifica.
  6. Sostituire SFM da 0,7 mL di solfato di etichettatura contenente 0,5 mCi/mL [35S] medio solfato e 2 µ g/mL VHH-2xTS e incubare le cellule per 1 h a 37 ° C in un incubatore di2 CO 7,5% indicato per il lavoro con la radioattività.
    Nota: A seconda dell'esperimento pianificato, il tempo di solfatazione nanobody deve essere regolato. Inoltre, per determinare la cinetica di arrivo TGN, etichettatura viene eseguito per diverse volte (ad esempio, per 10 min, 20 min, 30 min, ecc.).
  7. Togliere la soluzione di etichettatura e lavare le cellule 2 - 3 volte con PBS 1X ghiacciata su una piastra di raffreddamento o di ghiaccio.
  8. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi (PBS contenente 1% Triton X-100 e 0,5% desossicolato) completati con 2 mM PMSF e 1 x cocktail di inibitore della proteasi e incubare le cellule per 10-15 min su una piattaforma a dondolo a 4 ° C.
  9. Raschiare e trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL, vortice lisato e posto per 10-15 min in un rotatore di fine oltre a 4 ° C.
  10. Preparare un postnuclear lisato mediante centrifugazione a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  11. Utilizzando una nuova provetta da 1,5 mL, preparare 20-30 µ l di un impasto di perle di nichel in una provetta da 1,5 mL e lavare una volta con PBS 1X di cubettatura delicatamente li a 1.000 x g per 1 min.
    Nota: Invece di nichel perline, perline di streptavidina (se nanobody è biotinilato) o A proteine con un IgG contro un epitopo di nanobody (T7 - o HA-tag) può essere utilizzato.
  12. Trasferire la postnuclear lisato in una provetta da 1,5 mL contenente nichel perline e incubare per 1 h a 4 ° C in un rotatore di estremità sopra per isolare il nanobodies. Rimuovere un'aliquota (50-100 µ l) della postnuclear lisata e bollire nel buffer del campione SDS per l'analisi di immunoblot successive di totale associato nanobody, GFP reporter e controllo di carico.
  13. Lavare le perle 3 volte con PBS o lisi 1x di cubettatura delicatamente a 1.000 x g per 1 min.
    Nota: Per il lavaggio più rigorosa delle perline, imidazolo 20 mM possa essere inclusi in tampone PBS o lisi.
  14. Rimuovere tutti i buffer di lavaggio dalle perle con cura, aggiungere 50 µ l di tampone del campione: 2x e bollire per 5 min a 95 ° C.
  15. Carico sia bollite perline su un midi 12,5% gel di SDS-PAGE ed eseguito secondo il protocollo standard di pagina fino a quando la tintura di riferimento (ad esempio, il blu di bromofenolo) ha raggiunto la fine del gel di separazione.
    Nota: L'analisi di immunoblot di totale associato nanobody, GFP reporter e controllo di carico può essere eseguita anche utilizzando un mini 12,5% SDS-PAGE o gel di pendenza prefabbricati.
  16. Difficoltà il gel di separazione in ~ 30 mL di tampone di fissazione (10% acido acetico e 45% metanolo in ddH2O) per 1 h a RT, lavare il gel tre volte con ~ 50 mL di acqua deionizzata e preparare per l'essiccazione del gel.
  17. Asciugatura gel SDS-PAGE.
    1. Posizionare il gel fisso su pellicola trasparente allungato e coprirla con carta da filtro pretagliato.
    2. Posizionare il gel con la carta da filtro verso il basso in cima alla piattaforma di essiccazione, posizionare il coperchio aspiratore e accendere la pompa del vuoto per l'essiccazione del gel. Asciugare il gel per 3-5 h.
    3. Rimuovere la pellicola trasparente e mettere il gel essiccato in una cassetta di autoradiografia dotata di schermo al fosforo.
  18. Autoradiograph di immagine utilizzando un Imager di schermo al fosforo. Seguire le istruzioni del produttore.
    Nota: A seconda della forza del segnale, secchi gel c'è bisogno di essere esposto più a lungo con schermi di fosforo.

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Representative Results

Per studiare il trasporto retrogrado proteina per varie destinazioni intracellulare, recentemente abbiamo stabilito uno strumento anti-GFP nanobody per etichettare e seguire le proteine di fusione ricombinante dalla superficie cellulare30. Qui, dimostriamo la produzione batterica di tali derivatizzati nanobodies e dimostrare la loro applicazione per studiare l'assorbimento endocitosi di microscopia di fluorescenza e immunoblotting, nonché il loro uso di investigare TGN arrivo dall'analisi di solfatazione. L'applicazione di quest'ultimo è il fuoco di questo protocollo metodologico.

Abbiamo generato una serie di strumenti di nanobodies di diversi anti-GFP funzionalizzati con caratteristiche comuni di clonazione molecolare standard30. La nostra più semplice nanobody (standard), VHH-std, contiene il dominio VHH, un T7 e un epitopo HA per successivo rilevamento dagli anticorpi specifici, un carboxyterminal hexahistidine (His6)-tag per purificazione e una sequenza del peptide (BAP) biotina acceptor per biotinylation e ad alta affinità streptavidina discesa esperimenti (Figura 1A). Derivatizzazione di VHH-std produce nanobody diverse varianti per esaminare l'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado biochimicamente, da formazione immagine fissa e diretta delle cellule e da microscopia elettronica.

Per valutare il traffico di proteina da membrana plasmatica a trans-Golgi/TGN, abbiamo approfittato della localizzazione esclusiva di tyrosylprotein sulfotransferasi in questi compartimenti e così modificato VHH-std con un sito di solfatazione tirosina tandem (2xTS) derivato da ratto procholecystokinin41. Mentre modifica di VHH-std con mCherry permette la visualizzazione diretta del trasporto retrogrado da fisso e live cell imaging, funzionalizzazione con una perossidasi, come APEX237, permette studi di microscopia elettronica, citochimico vano ablazione, o reazioni di biotinilazione vicinanza-dipendente. Inoltre, inserimento di un sito di clivaggio per il tabacco etch proteasi virus (TEV) permette di distinguere biochimicamente intracellulare e associato a superficie nanobodies (Figura 1A). In precedenza abbiamo usato VHH-tev per monitorare la cinetica endocitico riciclaggio di nanobody associato EGFP-CDMPR e TfR-EGFP30. Nanobody riapparizione alla superficie delle cellule dopo l'assorbimento potrebbe essere valutato semplicemente inseguendo con proteasi TEV extracellularly applicata ricombinante causando una perdita inversa della cassetta di epitopo carboxyterminal di nanobody. Incluso un sito di clivaggio del mCherry o APEX2 nanobody fusione è utile per studiare la cinetica riciclaggio dei reporter EGFP da formazione immagine di cellule vive in un modo simile a VHH-tev, o di limitare le reazioni citochimiche per compartimenti intracellulari, rispettivamente. Funzionalizzazione con altri domini proteici (ad es., altri fluorofori o enzimi) o sequenze bersaglio per altre modifiche di posttranslational possono essere facilmente raggiunto da subcloning un inserto rispettivo nel plasmide vettore codifica VHH-std (veda inoltre Tabella 1 per informazioni di plasmide) utilizzando siti di restrizione SpeI ed EcoRI disponibili.

Utilizzando il protocollo come descritto in precedenza, tutte le nanobodies qui illustrato può essere isolato a elevata purezza e rendimento (Figura 1B). Solo mCherry fusioni ha mostrate minore ritaglio di domini proteici post purificazione (Figura 1B, Vedi corsie 7-8). In assenza di espressione di BirA, abbiamo ottenuto in genere 25-35 mg per VHH-std, VHH-2xTS e le loro controparti di tev-modificato o ~ 20 mg per VHH-APEX2 e VHH-mCherry e loro derivati contenenti tev. La nostra esperienza dimostra che il coexpression di BirA abbassa nanobody resa da un terzo alla metà.

Per illustrare l'assorbimento nanobody reporter-mediata, abbiamo utilizzato linee di HeLa cellulari che esprimono stabilmente EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR e TfR-EGFP (Figura 2A e B). EGFP è stato fuso alla fine extracellulare/lumenal di ogni proteina (cioè, tra la sequenza segnale e reporter di CNX o CDMPR) e per la carboxyterminus del TfR, lasciando i segnali ordinamento citosolici sgomberata. Tutte queste molecole di EGFP-etichetta cargo hanno diversi itinerari di traffici intracellulari dopo ER targeting. Poiché EGFP-Calnexin è residente al pronto soccorso e normalmente non raggiunge scomparti post-Golgi, serve come controllo negativo per l'assorbimento nanobody potenziali e non specifici. Al contrario, sia EGFP-CDMPR e TfR-EGFP hanno funzioni di trasporto oltre il Golgi e appaiono così costantemente alla membrana del plasma. Come previsto, quando VHH-mCherry è stato aggiunto a una popolazione mista di HeLa non modificato e le cellule che esprimono EGFP-CNX, nessuna interiorizzazione nanobody potrebbe essere osservato in entrambi i casi. Tuttavia, sia EGFP-CDMPR e TfR-EGFP catturato VHH-mCherry alla superficie delle cellule e li trasporta sulle spalle ai compartimenti homing del reporter (Figura 2).

VHH-mCherry colocalizzazione con un marcatore TGN residente potrebbe essere utilizzato in linea di principio per valutare arrivo TGN. Ancora, abbiamo stabilito un approccio biochimico basato su solfatazione della tirosina. Al fine di trarre vantaggio di questa modifica che si verificano nel trans-Golgi/TGN, nanobodies sono stati funzionalizzati con siti TS (Figura 1A). Per illustrare la specificità e la funzionalità di questi leganti della proteina, abbiamo incubato non modificate cellule HeLa e le cellule che esprimono EGFP-CNX, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP con VHH-std o VHH-2xTS per 1 h in presenza di solfato di radioattivo. Radiomarcatura di VHH-2xTS si verifica solo quando un reporter trasporta il nanobody retrogradely a TGN dove è esposto per il macchinario di solfatazione della tirosina. HeLa che esprimono EGFP-CNX e loro cellule parentali Visualizza nessun assorbimento di nanobody e così nessun solfatazione. Sia EGFP-CDMPR e TfR-EGFP interiorizzato nanobodies, quest'ultimo considerevolmente più di quella precedente. Tuttavia, solo EGFP-CDMPR causato VHH-2xTS essere solfatate (Figura 3A). Questo conferma efficiente trasporto retrogrado di CDMPR dalla superficie delle cellule a livello di TGN e fornisce la prova contro il TfR tornando a TGN (come è stato suggerito in alcuni studi42,43).

Cinetica di internalizzazione e TGN arrivo di proteine reporter può anche essere determinati analizzando lisati cellulari dopo diversi tempi di assorbimento nanobody e solfatazione. Usando EGFP-CDMPR come reporter, abbiamo trovato la solfatazione di avviare solo dopo un periodo di ritardo di ~ 15 min e di raggiungere la saturazione solo dopo > 75 min (Figura 3B, corsie 1-6 e C, simboli quadrati). Cinetica di assorbimento e solfatazione apparsa spostato di quasi 30 min, riflettendo il trasporto a livello di TGN. Inoltre, il metodo permette di indagare l'ordinamento macchine coinvolte nel trasporto MPR di interferenza farmacologica o proteina silenziamento approcci come l'atterramento, Ko o knocksideways. Qui, abbiamo usato brefeldina A (BFA), un inibitore di fattori di scambio di nucleotide della guanina (GEF) di diversi Arf GTPases, generalmente interferire con trasporto retrogrado di TGN. Quando trattati con BFA, solfatazione completamente è stata abolita, mentre l'assorbimento è rimasto inalterato sia nella cinetica e nel limite (Figura 3B, corsie 7-12 e C, simboli rotondi).

Figure 1
Figura 1: progettazione e produzione di nanobodies funzionalizzati per tenere traccia di proteine della superficie cellulare per volta EGFP. (A) rappresentazione schematica del derivatizzato nanobodies. La nanobody standard è costituito dal dominio specifico GFP VHH, T7 ed epitopo Tag HA, un BAP e un tag di purificazione di hexahistidine (His6). Altri nanobodies comprendono inoltre due TSs, APEX2 o mCherry, ciascuna con o senza un sito di clivaggio per proteasi TEV (tev). Barra della scala è in aminoacidi (aa). (B) batterico espresso e purificato nanobodies (50 μg) sono stati analizzati mediante elettroforesi in gel di SDS gradiente e macchiato con Coomassie. Proteine marker con massa molecolare in kDa sono indicate sulla sinistra. Solo VHH-mCherry e VHH-tev-mCherry hanno mostrato ritaglio minimo tra gli inquinamenti e i domini mCherry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: l'assorbimento e la localizzazione intracellulare di VHH-mCherry di diverse proteine di reporter EGFP. (A) rappresentazione schematica delle proteine di fusione di EGFP. Sequenze derivate da proteine di membrana secretiva sono visualizzati in nero con peptidi di segnale N-terminale e segmenti transmembrane interni in giallo, ed EGFP è illustrata in verde. EGFP è stata fusa a full-length CDMPR, TfR e Calnexin (CNX). Barra della scala in aminoacidi (aa). EGFP-CDMPR e TfR-EGFP sono stati descritti30. HeLa (B) sono state raccolte le cellule che esprimono proteine reporter EGFP, lisati e analizzati mediante elettroforesi in gel di SDS e immunoblotting usando gli anticorpi anti-GFP e anti-actina. Massa molecolare in kDa è indicata sulla destra. Cellule HeLa di (C) che esprimono stabilmente il reporter EGFP-etichettato proteine sono state mescolate con le cellule HeLa parentale, incubate con 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) per 1 h a 37 ° C e trasformati per microscopia di fluorescenza. Barra della scala = 10 μm. L'assorbimento si verifica solo da cellule che esprimono un reporter con EGFP esposti alla superficie delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: analisi di solfatazione e cinetica di trasporto retrogrado di TGN utilizzando TS-etichetta nanobodies. Parental Control (A) e le cellule HeLa che esprimono stabilmente reporter EGFP-modificato proteine sono state etichettate con solfato di mCi/mL [35S] 0,5 per 60 min con 2 μg/mL VHH-std o VHH-2xTS. Nanobodies sono state isolate usando le perle di nichel, separate su un 12,5% SDS-PAGE seguita da autoradiografia. Le aliquote di lisati cellulari sono stati raccolti prima del nichel pull down e immunoblotted per l'actina, EGFP e associato nanobody (His6). (B e C) le cellule HeLa che esprimono EGFP-CDMPR sono state etichettate con solfato di mCi/mL [35S] 0,5 per fino a 75 min in presenza di 2 μg/mL VHH-2xTS con e senza 2 μg/mL BFA prima analisi come in (A). Quantificazione dell'assorbimento VHH-2xTS e solfatazione da tre esperimenti indipendenti è indicata in percentuale del valore senza BFA dopo 75 min (media e DS). Quadrati neri, senza BFA; cerchi grigi, con BFA; aprire i simboli, l'assorbimento; pieno di simboli, solfatazione. Questa figura è stata modificata e ampliata da Buser et al., 2018, PNAS30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: sequenze proteiche della nanobodies funzionalizzati indicato in questo studio. T7 epitopo in grigio, VHH in nero, HA epitopo in sequenza BAP blu, arancione, hexahistidine (His6) in rosso, sito di clivaggio della proteasi TEV in viola, myc epitopo a magenta, la solfatazione di tirosina sequenza in giallo, APEX2 in verde e mCherry in rosa. I vettori di espressione codifica questi nanobodies funzionalizzati anti-GFP sono stati depositati (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Nanobodies rappresentano una classe emergente di proteina legante ponteggi con molti vantaggi rispetto ai convenzionali anticorpi: sono piccole, stabile, monomerico, possono essere selezionati per legami disolfuro ad alta affinità e mancanza33,35, 44 , 45. sono utilizzati in numerose applicazioni, come nei sistemi di coltura delle cellule e negli organismi in biologia dello sviluppo46,47,48,49, come cristallizzazione chaperoni a stabilizzare gli stati conformazionali in biologia strutturale50,51,52,53, come inibitori o modulatori di attività di enzimi54,55, 56, come reagenti di immunohistochemical per le analisi biochimiche57, o come "secondaria nanobodies" per rilevare le immunoglobuline anti-topo e anti-coniglio su immunoblots e immunofluorescenza58. Nel nostro studio precedente, abbiamo sviluppato e applicato nanobodies funzionalizzati prodotta dall'espressione batterica alle proteine di superficie-etichetta e tracciare il loro percorso intracellulare ai vari compartimenti, in particolare al TGN30. Abbiamo usato un nanobody anti-GFP per rendere lo strumento versatile, in grado di proteine di fusione di destinazione con GFP extracellulare, YFP o mCerulean che potrebbe già essere disponibile e caratterizzato. Modificazione di anti-GFP nanobodies con mCherry, APEX2 o TS siti ci ha permessi di monitorare l'assorbimento reporter da imaging cellulare fisso e dal vivo, a ultrastrutturalmente visualizzare trasporto retrogrado scomparti, per l'ablazione di questi comparti, o per studiare il trasporto cinetica di TGN. Uno svantaggio del nostro strumento è che ricombinante modificazione delle varietà di cellula bersaglio (codifica endogena o espressione stabile) è necessario prima di poter applicare nanobodies funzionalizzati anti-GFP. Funzionalizzazione naturalmente può essere applicata anche al numero rapidamente crescente di nanobodies diretti contro proteine endogene senza tag di destinazione stabiliti tramite immunizzazione di animali o da selezione ribosoma-display e phage-display di VHH sintetico le librerie59. Utilizzando nanobodies modificato con siti TS (ad es., VHH-2xTS), possiamo misurare direttamente trasporti e cinetica di arrivo TGN delle proteine bersaglio per volta EGFP diversificata. Abbiamo applicato VHH-2xTS per studiare il contributo della proteina adattatore complesso 1 (AP-1) nel trasporto retrogrado di MPRs di analisi cinetica diretta in knocksideways cellule consentendo di inattivazione rapida del trasporto fornito macchinari30. Nanobody solfatazione e trasporto quindi retrogrado di EGFP-labeled MPRs è stato parzialmente, ma non completamente bloccato. Nostro approccio nanobody usando la solfatazione come sensore di arrivo TGN ha confermato i risultati precedenti da altri laboratori che indica un contributo funzionale di AP-1 nel trasporto retrogrado endosome-a-TGN17,60, 61. Sulfatable nanobodies così è in grado di fornire un utile strumento di biochimico per sezionare il contributo di altri macchinari di trasporto retrogrado, come epsinR, Rab9/TIP47 o SNX-BAR/retromer complessi, su proteine cargo da manipolazioni genomiche, genetiche o chimiche. Il protocollo presentato qui offre una base di come uno possa fare uso di nanobodies funzionalizzati in generale per determinare i comparti di destinazione, le vie e cinetica in cellule coltivate di trasporto.

Altri gruppi hanno già fatto uso di TS siti da seguire trasporto dalla cella in superficie a livello di TGN. Subunità di tossina ricina, Shiga o pertosse sono state modificate in precedenza con siti di solfatazione per dimostrare una via di trasporto attraverso il TGN62,63,64,65,66. Inoltre, peptidi TS anche avevano stato chimicamente accoppiati a IgG test trasporto retrogrado di GFP-CIMPR e TGN46 endogeni ai TGN67,68. Il nostro nanobodies sulfatable hanno il vantaggio di produzione batterica semplice e riproducibile e di una stechiometria 1:1 con la proteina dell'obiettivo. Al contrario, per esempio è ben noto che leganti della proteina bivalenti, quali IgG, può crosslink proteine di superficie di cella e alterano il loro traffico intracellulare lisosomi dopo endocitosi69,70, evidenziando il significato dei raccoglitori di proteina monomerica per quanto riguarda i metodi esistenti. Un passaggio fondamentale della nostra tecnica è che gestione con radioattività è necessaria per eseguire solfato etichettatura di nanobodies. Tuttavia, il nostro strumento di nanobodies funzionalizzati con siti di TS per studiare arrivo TGN può essere applicato potenzialmente senza radioattività usando gli anticorpi anti-sulfotyrosine.

Il nostro studio precedente suggerisce che solfatazione nanobody non sono molto efficienti, poiché la solfatazione di MPRs non aveva ancora raggiunto un massimo dopo 75 min, anche se l'assorbimento nanobody era saturo dopo 45 min30. Screening per altri siti naturali di TS potrebbe migliorare l'efficienza di solfatazione. In alternativa, per potenzialmente migliorare efficienza di solfatazione, componenti del macchinario di solfatazione, quali TPST1 e TPST2, potrebbero essere sovraespressi. Infatti, è stato precedentemente dimostrato che la sovraespressione di uno dei trasportatori offrendo 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS), il substrato per TPSTs, dal cytosol al lume del Golgi potrebbe alterare lo stato di solfatazione dei proteoglicani 71.

Oltre a sulfatable nanobodies, altri derivatizzazioni consentono anche l'analisi trasporto attraverso compartimenti endocitosi e a livello di TGN. APEX2 può essere applicato come un enzima etichettatura promiscuo per prossimità-dipendente biotinylation per analisi proteomica di trasporto retrogrado. Nanobody APEX2 che è interiorizzato da un reporter di carico di interesse verrà assegnata l'etichetta proteine nella prossimità vicina all'interno dei vani di destinazione. Proteomica comparativa dovrebbe consentire di identificare altre proteine endogene in diversi tipi di endosomi e TGN che accede il nanobody. Molte varianti di nanobodies in combinazione con la proteina bersaglio sono immaginabili. Un recente rapporto, ad esempio, applicato un approccio invertito a quello descritto qui: derivatizzata GFP è stato usato per studiare e intrappolare recettori ordinamento vacuolar nanobody-etichetta di cellularly espresso anti-GFP in anterograda e retrograde scomparti della pianta sistema di endomembrane72. Allo stesso modo, funzionalizzati nanobody-trappole possono essere progettati in sistemi di coltura di cellule di mammifero per catturare e accumulare i reporter EGFP-modificato in diversi compartimenti durante il trasporto retrogrado.

Nostra qui presentato metodo e protocollo con lo stato attivo su TS nanobodies sito-Tag permette monitoraggio quantitativa e qualitativa di proteine cargo dalla superficie delle cellule per endocitosi scomparti e il TGN in cellule di mammiferi coltivate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da Grant 31003A-162643 di Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Nicole Beuret e Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) per il supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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Analisi dell'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado alla rete Trans-Golgi utilizzando Nanobodies funzionalizzati in cellule coltivate
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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