Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Retrograd transport av proteiner fra celleoverflaten til Golgi er avgjørende for å opprettholde membran homeostase. Her beskriver vi en metode for å analysere biokjemisk cellen overflaten til Golgi transport av rekombinante proteinene bruke functionalized nanobodies i HeLa celler.

Abstract

Transport av proteiner og membraner fra celleoverflaten av Golgi og utover er nødvendig for homeostase, organelle identitet og fysiologi. For å studere retrograd protein trafikk, har vi nylig utviklet en allsidig nanobody-baserte verktøykasse for å analysere fra celleoverflaten transport til Golgi komplekset, enten ved faste og levende celle imaging elektronmikroskop, eller biokjemisk. Vi utviklet functionalized anti-grønn fluorescerende protein (GFP) nanobodies-liten, monomerisk, høy affinitet protein bindemidler, som kan brukes på linjer uttrykke membran proteiner av interesse med en ekstracellulære GFP moiety. Derivatized nanobodies bundet til GFP journalister er spesielt internalisert og transportert piggyback langs journalister sortering ruter. Nanobodies var functionalized med fluorophores å følge retrograd transport av fluorescens mikroskopi og live bildebehandling, med ascorbate peroxidase 2 (APEX2) for å undersøke den ultrastructural lokaliseringen av reporter-nanobody komplekser av elektron mikroskopi, og med tyrosin sulfation (TS) motiver å vurdere kinetics trans-Golgi nettverk (TGN) ankomst. I denne metodologiske artikkelen skissere vi de generelle fremgangsmåten for å bacterially express og rense functionalized nanobodies. Vi illustrerer kraftig bruk av våre verktøy bruker mCherry - og TS-endret nanobodies å analysere endocytic opptak og TGN ankomsten av Last proteiner.

Introduction

Retrograd trafikk proteiner og lipider fra celleoverflaten til ulike intracellulær rom er avgjørende for vedlikehold av membran homeostase motvekt sekresjon og resirkulere komponenter i anterograd transport machineries1 , 2. etter internalisering via clathrin-avhengige eller -uavhengig endocytose, protein og lipid Last først fylle tidlig endosomes fra der de er ytterligere Omdirigert enten langs endo-lysosomale systemet, resirkulert til plasma membranen, eller målrettet trans-Golgi nettverket (TGN). Resirkulering fra endosomes og/eller celleoverflaten til TGN er en del av funksjonelle syklusen av en rekke anterograd transmembrane Last reseptorer, som kasjon-avhengig og uavhengig av cation mannose-6-fosfat receptors (CDMPR og CIMPR) levere nylig syntetisert lysosomale hydrolases fra TGN sent endosomes og lysosomer3,4,5, sortilin og SorLA6,7og Wntless (WLS) transport Wnt ligander til celleoverflaten 8 , 9 , 10 , 11. andre proteiner hentet tilbake til TGN er TGN46 og dens relaterte isoformene12,13,14, snarer (løselig N- ethylmaleimide-sensitive fusion faktor vedlegg reseptorer) 15 , 16 , 17, amyloid forløper protein (APP)18,19, progressiv ankylosis (ANK) protein20, metall transportører som ATP7A/B eller DMT121,22, og transmembrane behandler enzymer inkludert karboksypeptidase D, furin eller BACE123,24,25. Bortsett fra disse endogene proteiner kapre bakteriell og plante giftstoffer (f.eks Shiga og kolera gift, Risin og abrin) retrograd transport machineries å nå ER for retrotranslocation i stoffer26,27, 28,29.

For å direkte analysere retrograd trafikk, har vi utviklet et nanobody-baserte verktøysett for å merke og følg Last proteiner fra celleoverflaten til intracellulær rom30. Nanobodies representerer en ny familie av protein bindemidler avledet fra homodimeric tunge-kjede-bare antistoffer (hcAbs) som naturlig oppstår i camelids og cartilaginous fisker31,32. De utgjør variabel tunge-kjeden domenet (VHH) av hcAbs og har mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer (f.eks IgGs): de er monomerisk, liten (~ 15 kDa) svært løselig, uten disulfide obligasjoner, kan bacterially uttrykt og valgt for høy affinitet bindende33,34,35,36. For å gjøre våre nanobody verktøyet allsidig og bredt aktuelt, ansatt vi functionalized anti-GFP nanobodies overflaten-etikett og spore proteiner merket med GFP på deres ekstracellulære/lumenal domene. Ved functionalization av nanobodies med mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfation (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrane Last proteiner kan analyseres av enten fast og lever celle bildebehandling, av elektronmikroskop, eller biokjemisk. Siden tyrosin sulfation formidlet av tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 og TPST2) er en posttranslational endring begrenset til trans-Golgi/TGN, kan vi direkte studere transport og kinetics proteiner av interesse fra celleoverflaten til dette intracellulær Golgi kupé38,39,40.

I denne metoder artikkelen beskriver vi enkel produksjon av functionalized nanobodies (VHH-2xTS-APEX2, - mCherry og derivater) egnet for en rekke programmer til å analysere retrograd transport i pattedyrceller30. We fokusere hovedsakelig på bruk av TS området endret nanobody for analyse av intracellulær trafikk fra celleoverflaten sulfation-rommet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bakteriell transformasjon med Functionalized Nanobodies

Merk: Denne protokollen er optimalisert for uttrykket, rensing og analyse av functionalized anti-GFP nanobodies som beskrevet tidligere30. Derivatization med andre protein moieties kreve endring av denne standardprotokollen.

  1. Tine chemocompetent bakterier (~ 100 µL) egnet for protein uttrykk (f.eks Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) ved å plassere dem på isen.
    Merk: Forberede chemocompetent bakterieceller i henhold til standard lab prosedyrer. Kjemisk kompetent bakterielle celler kan eventuelt kjøpes kommersielt.
  2. Legge 50 ng av en plasmider koding functionalized nanobodies. For at tilstrekkelig stedsbestemte biotinylation av nanobody reporteren under bakteriell uttrykk, også legge til en tredelt overflødig (150 ng) av en bakteriell uttrykk plasmider koding biotin ligase BirA (se også tabell 1 plasmider informasjon). Pipetter forsiktig opp og ned.
    Merk: Hvis nanobody biotinylation er ikke nødvendig eller nanobody journalister er blottet for en biotin acceptor peptid (BAP), er co transformasjon med et plasmider koding BirA ikke nødvendig.
  3. Inkuber bakterieceller i 30 min på is.
  4. Varme sjokk bakterieceller ved å plassere dem i 1 min på 42 ° C i et vannbad og oppvarming blokk.
  5. Legge 1 mL av romtemperatur (RT) Luria kjøttkraft (LB) medium og Inkuber transformert bakterier i en thermoshaker 1t på 37 ° C tillate fenotypiske uttrykket av motstanden gener. For å forberede 1 L LB middels, balanse 5 g av gjær pakke, 10 g tryptone og 10 g av NaCl, fyll opp med vann og sterilisere av autoklavering. Hvis den functionalized nanobody har vært subcloned i et uttrykk vektor inneholder motstand mot ampicillin/carbenicillin, kan trinn 1.5 utelates.
  6. Pellets bakterier 11.000 x g for 1 min og resuspend i 100 µL av fersk LB medium.
  7. Plate suspendert bakterier på LB plater som inneholder de aktuelle antibiotika (f.eks med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL carbenicillin når bakterier har vært co transformert med nanobody reporter og BirA som nevnt ovenfor (trinn 1.2)).
  8. Plasser LB platene i en inkubator på 37 ° C og la vokse overnatting (O/N).
    Merk: Protokollen kan pauses her ved å lagre LB platen med voksen kolonier på 4 ° C. Bruk parafilm til å forsegle LB plater.

2. bakteriell flytende kultur og induksjon av Functionalized Nanobody uttrykk

  1. Plukke en bakterie kolonien inneholder vektoren interesse fra platen og la det vokse i en bolle med 20 mL LB medium med antibiotika O/N i en risting inkubator på 37 ° C (se trinn 1.7 om utvalg antibiotika).
  2. Neste dag, fortynne vokst 20 mL bakteriell kultur i en kolbe som inneholder 1 L LB medium med utvalg antibiotika.
  3. Fortsette å ruge bakteriell kultur på 37 ° C til den når en OD600 av 0.6-0,7. Tillate kulturen avkjølt til RT før inducing protein uttrykk.
  4. Indusere protein uttrykk for functionalized nanobodies og BirA med tillegg av 1 mL 1 M isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) til en siste konsentrasjon 1 mm induser (1:1, 000 fortynning). Også legge til 10 mL av en 20 mM d-biotin lagerløsning resulterer i 200 µM d-biotin i vekst medium å tillate biotinylation av BAP epitope i functionalized nanobodies (se også tabell 1 plasmider informasjon)
    Merk: D-biotin lager løsningen er utarbeidet i ddH2O og brakt i løsning av drop-wise tillegg av 500 mM NaH2PO4. Alternativt, d-biotin kan også forsvinne i DMSO. Å produsere nanobodies del APEX2 (VHH-APEX2), LB mediet må suppleres i tillegg med 1 mM 5-aminolevulinic syre (dALA) hydrochloride å fremme måltema innlemmelse. dALA er utarbeidet som en 100 mM lagerløsning i ddH2O.
  5. Inkuber IPTG-indusert 1 L bakteriell kultur på 30 ° C 4 h for VHH-2xTS, 20 ° C eller RT O/N for VHH-APEX2, eller på 16 ° C O/N for VHH-mCherry (se også tabell 1 plasmider informasjon).
    Merk: Uttrykket betingelsene for en ny nanobody konstruksjon må optimaliseres ved eksperimentator.
  6. Overføre bakteriell kultur fra flasken i en 1 L sentrifugering flasken og pellets cellene på 5000 x g ved 4 ° C i 45 min. Decant nedbryting og fortsette med rensing.
    Merk: Protokollen kan pauses her ved å lagre den bakterielle pellet ved-80 ° C på ubestemt tid. Pellets for VHH-APEX2 eller VHH-mCherry er vanligvis brunaktig (på grunn av den innlemmet måltema) eller rosa, henholdsvis.

3. rensing av Functionalized Nanobodies

  1. Hvis nødvendig, tine frosne bakteriell pellet på is (se trinn 2.6).
  2. Legge til 30 mL av iskalde bindende buffer (20 mM imidazole i 1 x PBS) til bakteriell celle pellets og resuspend av pipettering opp og ned. Overføre resuspended bakterier i en merket 50 mL tube.
  3. Supplement 30 mL bindingen buffer med 200 µg/mL lysozyme, 20 µg/mL DNase jeg, 1 mM MgCl2 og 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) og Inkuber første for 10 min på RT og deretter 1 h på 4 ° C på en over-gjennomgående shaker.
  4. Mekanisk lyse bakterieceller i en 50 mL tube ved å plassere en tips sonicator i suspensjon. Bruke konstant 3 x 1 min pulser med 1 min kjøling perioder i mellom.
  5. Sentrifuge bakteriell lysate på 15 000 x g ved 4 ° C i 45 min til pellets de rusk og intakt. Overføre sonicated bakteriell cellen lysate enten i en passende sentrifugering flaske for sentrifugering eller deler av lysate i flere 5 mL rør for tabletop sentrifugering.
  6. Overføre nedbryting til en ny 50 mL tube og kast pelleted rusk.
  7. Lagre de ryddet lysate på is klargjøring av rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC). For å isolere histidin-merket functionalized nanobodies, benytter engangs hans kolonner (se Tabell for materiale) gir rask og enkel gravity-flow rensing.
    Merk: Alternativt kan satsvise rensing i stedet for kommersielle kolonner også brukes.
  8. Montering hans kolonner på en metall Stand.
    1. Avta kolonnene lagringsløsning, og equilibrate hans kolonne med 10 mL av bindende buffer (20 mM imidazole i 1 x PBS).
    2. Tom av gravitasjon flow (gjennomflytsenhet kan bli forkastet).
  9. Gradvis laste det ryddet bakteriell lysate (~ 30 mL) på kolonnen. Tom av gravitasjon flow (gjennomflytsenhet kan bli forkastet).
  10. Vaske sin kolonne 2 x med 10 mL av bindende buffer (20 mM imidazole i 1 x PBS).
  11. Elute nanobodies med 2 mL elueringsbufferen (500 mM imidazole i 1 x PBS) i en 2 mL tube og bruke en buffer utveksling.
  12. Buffer Exchange.
    1. Equilibrate en avsalte kolonne (se Tabell for materiale) plassert i et 50 mL tube kolonnen kort 5 ganger med 5 mL 1 x PBS.
    2. At bufferen til å angi pakket sengen. Kast gjennomflytsenhet.
    3. Etter den femte PBS balanse, spinne kolonnen 1000 x g i 2 minutter.
    4. Kast gjennomflytsenhet.
    5. Plass kolonnen med kortet på en ny 50 mL tube. Legg de 2 mL elut functionalized nanobody (fra trinn 3.11) på PBS-equilibrated avsalting kolonne og spinn på 1000 x g i 2 minutter og samle eluate.
      Merk: I stedet for kommersielle avsalting kolonner, kan dialyse brukes til å utveksle buffer komposisjon.
  13. Bestemme protein (nanobody) konsentrasjonen av eluate bicinchoninic (BCA) eller Bradford analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: Nanobody opptak analyser av GFP reporter cellelinjer er en lager konsentrasjon av 2-10 mg/mL optimal.

4. validering av Functionalized Nanobody uttrykk (Coomassie farging)

  1. Forberede 10-12,5% gels natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) ifølge standardprotokoller.
    Merk: Alternativt bruke kommersielt tilgjengelige precast gradient gels.
  2. Pipetter 20 µg av renset functionalized nanobody i en 1,5 mL tube og kok i prøven buffer ved 95 ° C i 5 min.
    Merk: Som et eksempel, legger du til 10 µL av en 2 mg/mL nanobody lager løsning i en 1,5 mL tube med 10 µL av 2 x prøve buffer. Hvis volumet er for lite, ytterligere fortynne nanobody i PBS før du legger til eksempel buffer.
  3. Laste det renset nanobody kokte i prøven buffer på en SDS-polyakrylamid gel, og kjøre i henhold til standard siden protokollen til referanse fargestoff (f.eks bromophenol blå) har nådd slutten av skiller gel, etterfulgt av Coomassie flekker og destaining.
  4. Coomassie Gel flekker og Destaining.
    1. Uncast gel og flekk det med Coomassie flekker løsning (5% på en 10 g/L Coomassie lagerløsning i 10% eddiksyre og 45% metanol i ddH2O) for 20-30 minutter til RT på en bevegelig risting plattform. Gel bør være fullstendig dekket av flekker løsningen.
    2. Destain gel 2 - 3 ganger med destain løsning (7,5% eddiksyre og 15% metanol i ddH2O) for 1 h hver på RT, før avreise gel O/N til ytterligere destaining.
      Merk: Overflødig Coomassie kan være effektivt flommet opp ved å plassere kjøkken papirhåndklær rundt gel.
  5. Bilde gel med imager eller kamera av valget.
    Merk: Nanobody uttrykk kan videre valideres av immunoblot analyse ved hjelp av antistoffer målretting sin epitopes (se også figur 1A).

5. opptak av Functionalized Nanobodies av kultivert cellene til fluorescens farging

  1. I celle kultur hette, frø ~ 400 000 til 500.000 HeLa celler stabilt uttrykke et GFP-merket reporter protein på 18 mm glass coverslips (nr 1.5 H) i 35 mm retter eller 6-vel klynger med komplett medium som inneholder antibiotika (Dulbeccos endret Eagle medium, DMEM supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS), 100 enheter/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin og 1,5 µg/mL puromycin).
    Merk: Her bruker vi jakten celler uttrykke stabilt EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR og SFT-EGFP illustrasjon. Bortsett fra stabil cellelinjer, kan også transiently transfekterte jakten celler brukes. Stabil cellelinjer kan dyrkes co på dette trinnet med foreldrekontroll ikke-transduced HeLa celler, for direkte sammenligning.
  2. Inkuber cellene O/N på 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator å spre.
    Merk: Celler bør ha en confluency ~ 80% neste dag.
  3. Pipetter 2 µL av en 2 mg/mL nanobody lager løsning i en 15 eller 50 mL tube med 2 mL komplett medium (dette er tilstrekkelig til å dekke en 35 mm rett eller en brønn av en 6-vel klynge, justere volumet på medium og nanobody proporsjonalt med mer celle kultur d ishes eller klynger).
    Merk: For illustrasjon bruker vi her VHH-mCherry, siden ingen ytterligere antistoffer flekker er nødvendig for å se nanobody internalisert EGFP journalister (se figur 2C).
  4. Fjern oppblomstringen medium fra cellene og tilsett 2 mL prewarmed komplett medium som inneholder 2 µg/mL functionalized nanobody pr. 35 mm parabolen eller 6-og enhet.
  5. Inkuber celler for 1 h på 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator å tillate reporter-mediert nanobody opptak.
    Merk: Avhengig av planlagte eksperimentet må av nanobody opptak justeres. For eksperimentet vises her er 1t tilstrekkelig til å nå stabil for nanobody opptak av EGFP-CDMPR og SFT-EGFP.
  6. Fjerne mediet og vask cellene 2 - 3 ganger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  7. Fastsette cellene med 1 mL av 3% paraformaldehyde (PFA) i 10 min på RT.
  8. Fjerne PFA løsning og slukke gjenværende bindemiddel med 1 mL av 50 mM NH4Cl i 1 x PBS i 5 min på RT.
    Merk: 3% PFA må kastes separat som etappe, den stabiliserende avfall.
  9. Vask cellene 3 ganger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  10. Permeabilize cellene med 1 mL av 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS i 10 min på RT.
    Merk: Selv om ingen permeabilization er nødvendig, er EGFP og mCherry fluorescens bedre når etterpå cellene er innebygd i montering medium.
  11. Vask cellene 3 ganger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  12. Plass i coverslips med tang på en dråpe (~ 100 µL) av 1% BSA på 1 x PBS inneholder 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) for 5 min på RT.
  13. Plasser coverslips tilbake i rett/brønnen og vaske 3 ganger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  14. Etikett på glass lysbilder og montere cellene med Fluoromount-G. La montering mediet stivne i mørket 3-4 h og lagre glass lysbilder på 4 ° C under lys beskyttelse.
  15. Bilde flekker mønstre ved hjelp av et mikroskop valgfrihet (f.eks punkt skanning AC Confocal oppreist mikroskopet).

6. opptak av Functionalized Nanobodies av kultivert celler (for Sulfation analyse)

  1. I celle kultur hette, frø ~ 400 000 til 500.000 HeLa celler stabilt uttrykke et GFP-merket reporter protein i 35 mm retter eller på 6-vel klynger med komplett medium som inneholder antibiotika (Dulbeccos endret Eagle medium, DMEM, supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS), 100 enheter/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin og 1,5 µg/mL puromycin).
    Merk: Som nevnt ovenfor, bruke vi her HeLa celler uttrykke stabilt EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR og SFT-EGFP illustrasjon. Bortsett fra stabil cellelinjer, kan også transiently transfekterte HeLa brukes.
  2. Inkuber cellene O/N på 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator å spre.
    Merk: Cellene må ha en confluency ~ 80% neste dag.
  3. Fjerne det fullstendige mediet, vask 2 ganger med 1 x PBS på RT og sulte cellene med sulfat-fri medium (SFM) 1t på 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator.
    Merk: SFM er utarbeidet ved å legge 10 mL av MEM aminosyrer (50 x) løsning, 5 mL av L-glutamin (200 mM), 5 mL av vitamin løsning (100 x) og 900 µL av CaCl2·2H2O til 500 mL av Eagles balansert salter. Passerer gjennom et 0.22 µm filter og aliquot.
  4. I ventilert hette og benk utpekt for radioaktivitet arbeid, Forbered sulfate merking medium som inneholder 0,5 mCi/mL [35S] sulfate som natrium salt i SFM.
    Forsiktig: Nøye håndtere alle løsninger som inneholder radioaktivitet. Fungere bare i utpekte hetter eller benker. Alt materiale (tips, rør, plater, etc.) eller vaskebuffere i kontakt med radioaktivitet må samles og avhendes separat. Gjør dette for alle trinnene nedenfor (trinn 6.5-6.20) også.
  5. Legge til VHH-2xTS i 1 x PBS i sulfate merking middels til en siste konsentrasjon av 2 µg/mL.
    Merk: Som kontroll, også inkludere VHH-std eller en annen nanobody uten TS områder for å vise bestemte merking.
  6. Erstatt SFM av 0,7 mL sulfate merking medium med 0,5 mCi/mL [35S] sulfat og 2 µg/mL VHH-2xTS og ruge celler for 1 h på 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator utpekt for arbeide med radioaktivitet.
    Merk: Avhengig av planlagte eksperimentet må av nanobody sulfation justeres. I tillegg for å avgjøre TGN ankomst kinetikk, utføres merking på ulike klokkeslett (f.eks for 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
  7. Fjerne merking mediet og vask cellene 2 - 3 ganger med iskald 1 x PBS på en kjøleplate eller is.
  8. Legg 1 mL av lyseringsbuffer (PBS med 1% Triton X-100 og 0,5% deoxycholate) med 2 mM PMSF og 1 x protease hemmer cocktail og ruge celler for 10-15 min på en rocking plattform på 4 ° C.
  9. Skrape og overføre de lysate til en 1,5 mL tube, vortex lysate, og sted i 10-15 minutter på en over-gjennomgående rotator på 4 ° C.
  10. Forberede en postnuclear lysate med sentrifugering 10.000 x g i 10 min på 4 ° C.
  11. Bruker en ny 1,5 mL tube, forberede 20-30 µL av en blanding av nikkel perler i en 1,5 mL tube og vaskes en gang med 1 x PBS av forsiktig pelleting dem på 1000 x g for 1 min.
    Merk: I stedet for nikkel kan perler, streptavidin perler (hvis nanobody biotinylated) eller protein A perler med en IgG mot en epitope av nanobody (T7 - eller HA-tag) brukes.
  12. Overføring av postnuclear lysate i en 1,5 mL tube inneholder nikkel perler og ruge 1t på 4 ° C på en over-gjennomgående rotator å isolere i nanobodies. Fjerne en aliquot (50-100 µL) av den postnuclear lysate og kok i SDS eksempel buffer for påfølgende immunoblot analyse av totale celle-assosiert nanobody, GFP reporter og laster inn kontroll.
  13. Vask perlene 3 ganger med 1 x PBS eller lysis buffer av forsiktig pelleting 1000 x g for 1 min.
    Merk: For strengere vask av perler, kan 20 mM imidazole inkluderes i PBS eller lysis buffer.
  14. Nøye fjerne alle vaske bufferen fra perlene legge 50 µL av 2 x prøve buffer og kok i 5 minutter til 95 ° C.
  15. Last både kokt perler på en midi 12,5% SDS siden gel og kjøre i henhold til standard siden protokollen til referanse fargestoff (f.eks bromophenol blå) har nådd slutten av skiller gel.
    Merk: Immunoblot analyse av totale celle-assosiert nanobody, GFP reporter og laster inn kontroll kan også utføres ved hjelp av en mini 12,5% SDS side eller precast gradient gel.
  16. Fikse skiller gel i ~ 30 mL fiksering buffer (10% eddiksyre og 45% metanol i ddH2O) 1t på RT, vask gel tre ganger med ~ 50 mL deionisert vann og forberede gel tørking.
  17. Tørking SDS side Gels.
    1. Forsiktig plassere fast gel på strukket plastfolie og dekke det med precut filter papir.
    2. Plasser gel filter papir ned på tørking plattformen, plasser vakuum dekselet, og slå på vakuumpumpe gel tørking. Tørr gel for 3-5 h.
    3. Fjern plastfolie og Legg tørket gel i en autoradiography kassett utstyrt med fosfor skjerm.
  18. Bilde autoradiograph bruker en fosfor skjermen Imager. Følg instruksjonene fra produsenten.
    Merk: Avhengig av signalet, tørket gels måtte bli utsatt lenger med fosfor skjermer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Undersøke retrograd protein transport til ulike intracellulær destinasjoner, har vi nylig etablert en anti-GFP nanobody-basert verktøy for å merke og følg rekombinant fusion proteiner fra cellen overflaten30. Her viser vi bakteriell produksjonen av slike derivatized nanobodies og demonstrere programmet å studere endocytic opptak av fluorescens mikroskopi og immunoblotting, i tillegg til deres bruk å undersøke TGN ankomst av sulfation analyse. Sistnevnte programmet er metodologiske fokus for denne protokollen.

Vi har generert en verktøykasse bestående av forskjellige functionalized anti-GFP nanobodies med fellestrekk med standard molekylær kloning30. Våre enkleste (standard) nanobody, VHH-std, inneholder VHH domenet, en T7 og en HA epitope for senere gjenkjenning av spesifikke antistoffer, en carboxyterminal hexahistidine (His6)-koden for rensing og biotin acceptor peptid (BAP) serie for biotinylation og høy affinitet streptavidin rullegardin eksperimenter (figur 1A). Derivatization av VHH-std gir forskjellige nanobody varianter for å undersøke endocytic opptak og retrograd transport biokjemisk, ved faste og levende celle bildebehandling og elektronmikroskop.

Å vurdere protein trafikk fra plasma membranen til trans-Golgi/TGN, vi tok fordel av den eksklusive lokaliseringen av tyrosylprotein sulfotransferases i seksjonene og dermed endret VHH-std med en tandem tyrosin sulfation nettsted (2xTS) kommer fra rotte procholecystokinin41. Mens endring av VHH-std med mCherry tillater direkte visualisering av retrograd transport med faste og levende celle imaging, functionalization med en peroxidase, som APEX237, gjør elektronmikroskop studier, cytochemical rom ablasjon, eller nærhet-avhengige biotinylation reaksjoner. I tillegg lar innsetting av en spalting nettsted for tobakk etse virus (TEV) protease biokjemisk skille mellom intracellulær og overflaten-bundet nanobodies (figur 1A). Vi har brukt VHH-tev overvåke endocytic resirkulering kinetics nanobody-bundet EGFP-CDMPR og SFT-EGFP30. Nanobody tilbakekomst på celleoverflaten etter opptak kan bare vurderes av jage med extracellularly anvendt rekombinant TEV protease forårsaker en omvendt tap av nanobody's carboxyterminal epitope kassett. Inkludert en cleavage området i mCherry eller APEX2 nanobody fusion er nyttig å studere resirkulering kinetics av EGFP journalister av levende celle tenkelig på en lignende måte til VHH-tev eller begrense cytochemical reaksjoner på intracellulær avdelinger, henholdsvis. Functionalization med andre protein domener (f.eks, andre fluorophores eller enzymer) eller målet sekvenser for andre posttranslational endringer kan enkelt oppnås ved subcloning en respektive setter inn plasmider vektor koding VHH-std (se også Tabell 1 for plasmider informasjon) bruker tilgjengelige SpeI og EcoRI begrensning områder.

Ved hjelp av protokollen som beskrevet ovenfor, kan alle nanobodies illustrert her være isolert til høy renhetsgrad og avkastning (figur 1B). Bare mCherry fusjoner viste mindre klipping av protein domener legge rensing (figur 1B, se baner 7-8). I fravær av BirA uttrykk fått vi vanligvis 25-35 mg for VHH-std, VHH-2xTS og papirformat tev endret eller ~ 20 mg for VHH-APEX2 og VHH-mCherry og deres tev inneholder derivater. Vår erfaring viser at BirA coexpression senker nanobody avkastning av en tredel til halvparten.

For å illustrere reporter-mediert nanobody opptak, har vi brukt HeLa cellelinjer stabilt uttrykke EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR og SFT-EGFP (figur 2A og B). EGFP var smeltet ekstracellulære/lumenal slutten av hvert protein (dvs. mellom signal og reporter sekvensen av CNX eller CDMPR) og carboxyterminus av SFT, forlater cytosolic sortering signalene uhindret. Alle disse EGFP-merket Last molekyler har forskjellige intracellulær menneskehandel itineraries etter ER målretting. Siden EGFP-Calnexin er bosatt i ER og normalt ikke når post-Golgi rom, fungerer det som en negativ kontroll for potensielle og ubestemt nanobody opptak. I kontrast både EGFP-CDMPR og SFT-EGFP transport funksjoner utover Golgi og dermed vises jevnt på plasma membranen. Som forventet, når VHH-mCherry ble lagt til en blandet befolkning av uforandret HeLa og celler som uttrykker stabilt EGFP-CNX, kan ingen nanobody internalisering være observert i uansett. Men både EGFP-CDMPR og SFT-EGFP tatt VHH-mCherry til celleoverflaten og transportert dem piggyback til reporterens homing rom (figur 2C).

VHH-mCherry colocalization med en bosatt TGN markør kan brukes i prinsippet for å vurdere TGN ankomst. Likevel, vi etablert en biokjemiske tilnærming basert på tyrosin sulfation. For denne endringen skjer i trans-Golgi/TGN, nanobodies var functionalized med TS områder (figur 1A). For å demonstrere spesifisitet og funksjonaliteten til disse protein bindemidler, ruges vi uforandret HeLa cellene og stabilt uttrykke EGFP-CNX, EGFP-CDMPR og SFT-EGFP med VHH-std eller VHH-2xTS 1t i nærvær av radioaktivt sulfat. Radiolabeling av VHH-2xTS oppstår bare når en reporter transporterer nanobody retrogradely til TGN hvor det utsettes til tyrosin sulfation maskiner. HeLa uttrykke EGFP-CNX og deres foreldre celler viser ingen nanobody opptak og dermed ingen sulfation. Både EGFP-CDMPR og SFT-EGFP internalisert nanobodies, sistnevnte betydelig mer enn tidligere. Likevel, bare EGFP-CDMPR forårsaket VHH-2xTS å være sulfated (figur 3A). Dette bekrefter effektiv retrograd transport av CDMPR fra celleoverflaten til TGN og gir bevis mot SFT tilbake til TGN (som har blitt foreslått i noen studier42,43).

Kinetics av internalisering og TGN ankomst av reporteren proteiner kan også fastslås ved å analysere celle lysates etter forskjellige tider av nanobody opptak og sulfation. Bruker EGFP-CDMPR som reporter, fant vi sulfation å starte etter løpet lag ~ 15 min og nå metning bare etter > 75 min (figur 3B, baner 1-6, og C kvadrat symboler). Opptak og sulfation kinetics dukket skiftet av nesten 30 min, reflekterer at transporten TGN. I tillegg kan metoden undersøke sortering maskiner involvert i MPR transport av farmakologiske forstyrrelser eller protein stanse tilnærminger som knockdown, knockout eller knocksideways. Her har vi brukt brefeldin A (Uteksaminert), en inhibitor av guanine nukleotid exchange faktorer (GEFs) av flere Arf GTPases, generelt forstyrre retrograd transport til TGN. Når behandlet med Uteksaminert, var at sulfation helt avskaffet, mens opptaket forble upåvirket både kinetics og grad (figur 3B, baner 7-12, og C, runde symboler).

Figure 1
Figur 1: Design og produksjon av functionalized nanobodies for å spore EGFP endret cellen overflaten proteiner. (A) skjematisk fremstilling av det derivatized nanobodies. Den standard nanobody består av GFP-spesifikke VHH domenet, T7 og HA epitope koder, en BAP og en hexahistidine (His6) rensing kode. Andre nanobodies omfatter i tillegg to TSs, APEX2 eller mCherry, hver med eller uten en cleavage nettsted for TEV protease (tev). Skala bar er på aminosyrer (aa). (B) uttrykt Bacterially og renset nanobodies (50 μg) ble analysert av gradient SDS-gel geleelektroforese og farget med Coomassie. Markør proteiner med molekylær masse kDa vises til venstre. Bare VHH-mCherry og VHH-tev-mCherry viste minimal klipping mellom VHH og mCherry domener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: opptak og intracellulær lokalisering av VHH-mCherry av ulike EGFP reporter proteiner. (A) skjematisk fremstilling av EGFP fusion proteiner. Sekvenser fra sekretoriske membran proteiner er vist i svart med N-terminal signal peptider og interne transmembrane segmenter i gult, og EGFP er illustrert i grønt. EGFP var smeltet fulle CDMPR, SFT og Calnexin (CNX). Skala for på aminosyrer (aa). EGFP-CDMPR og SFT-EGFP har vært beskrevet30. (B) HeLa celler uttrykke stabilt EGFP reporter proteiner ble høstet, lysed og analyseres av SDS-gel gelelektroforese og immunoblotting med anti-GFP og anti-utgangen antistoffer. Molekylær masse i kDa angis til høyre. (C) HeLa celler uttrykke stabilt EGFP-merket reporteren proteiner ble blandet med foreldrekontroll HeLa celler, inkubert med 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) for 1 h på 37 ° C og bearbeidet for fluorescens mikroskopi. Skala bar = 10 μm. Opptak oppstår bare av celler som uttrykker en reporter med EGFP utsatt på celleoverflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sulfation analyse og kinetics av retrograd transport til TGN bruker TS-merket nanobodies. (A) foreldre og HeLa celler uttrykke stabilt EGFP endret reporter proteiner ble merket med 0,5 mCi/mL [35S] sulfate for 60 min med 2 μg/mL VHH-std eller VHH-2xTS. Nanobodies ble isolert med nikkel perler, atskilt på en 12,5% SDS siden etterfulgt av autoradiography. Dele celle lysates ble samlet før nikkel trekke ned og immunoblotted for celle-assosiert nanobody (His6), EGFP og utgangen. (B og C) HeLa celler uttrykke stabilt EGFP-CDMPR ble merket med 0,5 mCi/mL [35S] sulfate for opp til 75 min i nærvær av 2 μg/mL VHH-2xTS med og uten 2 μg/mL Uteksaminert før analyse som (A). Kvantifisering av VHH-2xTS opptak og sulfation fra tre uavhengige eksperimenter vises i prosent av verdien uten Uteksaminert etter 75 min (betyr og SD). Svarte firkanter, uten Uteksaminert; grå sirkler, med Uteksaminert; Åpne symboler, opptak; fylt symboler, sulfation. Dette tallet har blitt endret og utvidet fra Buser et al., 2018, PNAS30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Protein sekvenser av den functionalized nanobodies i denne studien. T7 epitope grå, VHH i svart, HA epitope i blå BAP rekkefølge i oransje, hexahistidine (His6) i rødt, TEV protease cleavage område i lilla, myc epitope i magenta tyrosin sulfation sekvens gule APEX2 i grønt, og mCherry i rosa. Uttrykket vektorer koding disse functionalized anti-GFP-nanobodies har blitt satt (se tabell 1 for plasmider informasjon). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies representerer en ny klasse av protein dokumentordner stillaser med mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer: de er små, stabil, monomerisk, kan velges for høy affinitet og mangel disulfide obligasjoner33,35, 44 , 45. de brukes i en rekke programmer, slik som i celle kultur systemer og organismer utviklingsbiologi46,47,48,49, som krystallisering chaperones til stabilisere conformational stater i strukturell biologi50,51,52,53, som hemmere eller aktivitet modulatorer enzymer54,55, 56, som immunohistochemical reagensene biokjemiske analyser57, eller "andre nanobodies" å oppdage anti-musen og anti-kanin immunglobuliner på immunoblots og immunofluorescence58. I vår forrige studie, har vi utviklet og anvendt functionalized nanobodies produsert av bakteriell uttrykk overflaten-label proteiner og spore intracellulær turen til ulike avdelinger, spesielt til TGN30. Vi brukte en anti-GFP nanobody å gjøre tool allsidig, kan målet fusion proteiner med ekstracellulære GFP, YFP eller mCerulean som allerede er tilgjengelig og preget. Endring av anti-GFP nanobodies med mCherry, APEX2 eller TS nettsteder tillatt oss å overvåke reporter opptak av faste og levende celle tenkelig, til ultrastructurally visualisere retrograd transport avdelinger, ablate seksjonene eller studere transport Kinetics til TGN. Ettall ulempen av våre verktøyet er at rekombinant endring av målet cellelinjer (stabil uttrykk eller endogene merking) kreves før functionalized anti-GFP nanobodies kan brukes. Functionalization kan selvfølgelig også brukes på det raskt økende antallet nanobodies rettet mot ukodede endogene målet proteiner etablert av dyret immunisering eller ribosom-display og phage-display utvalg av syntetisk VHH biblioteker59. Bruker nanobodies endret med TS områder (f.eks VHH-2xTS), kan vi direkte måle transport og kinetics TGN ankomst av ulike EGFP endret mål proteiner. Vi har brukt VHH-2xTS for å studere bidraget av adapter protein kompleks 1 (AP-1) i retrograd transport av MPRs av direkte kinetisk analyse i knocksideways celler tillater rask inaktivering av gitt transport maskiner30. Nanobody sulfation og dermed retrograd transport av EGFP-merket MPRs ble delvis, men ikke helt blokkert. Våre nanobody tilnærming ved hjelp av sulfation som TGN ankomst sensor bekreftet tidligere resultater fra andre laboratorier som indikerer en funksjonell bidrag av AP-1 i retrograd endosome til TGN transport17,60, 61. Sulfatable nanobodies kan dermed gi et nyttig biokjemiske verktøy for å analysere bidrag av andre retrograd transport machineries, som epsinR, Rab9/TIP47 eller SNX-BAR/retromer komplekser, på Last proteiner av genomisk og kjemiske og genetiske manipulasjoner. Protokollen presenteres her gir grunnlag for hvordan man kan gjøre bruk av functionalized nanobodies generelt å bestemme målet avdelinger, veier, og transportere kinetics i kulturperler celler.

Andre grupper har allerede gjort bruk av TS nettsteder å følge transport fra cellen overflaten til TGN. Risin, Shiga eller kikhoste gift underenheter er tidligere endret med sulfation nettsteder å demonstrere en transportrute gjennom TGN62,63,64,65,66. Videre hadde TS peptider også vært kjemisk kombinert til IgGs til analysen retrograd transport av GFP-CIMPR og endogene TGN46 til TGN67,68. Våre sulfatable nanobodies har fordelen av enkel og reproduserbar bakteriell produksjon og en 1:1 støkiometri med mål protein. Tvert imot, det er for eksempel kjent at divalent protein bindemidler, som IgGs, kan krysskobling celle overflaten proteiner og endre deres intracellulær smuglingen til lysosomer etter endocytose69,70, fremhever den betydningen av monomerisk protein dokumentordnere med hensyn til eksisterende metoder. Et avgjørende skritt i våre teknikk er at håndtering av radioaktivitet er nødvendig for å utføre sulfat merking av nanobodies. Imidlertid kan våre verktøy for functionalized nanobodies med TS nettsteder for å studere TGN ankomst potensielt brukes uten radioaktivitet bruker anti-sulfotyrosine antistoffer.

Vår forrige studie antyder at nanobody sulfation ikke er veldig effektivt, siden sulfation av MPRs ikke hadde ennå nådd maksimalt etter 75 min, selv om nanobody opptak var mettet etter 45 min30. Screening for andre naturlige TS kan forbedre sulfation effektivitet. Alternativt, potensielt bedre sulfation effektivitet, komponenter i sulfation maskiner, som TPST1 og TPST2, kan være overexpressed. Faktisk har tidligere vist at overuttrykte av en av transportører levere 3-phoshoadenosine-5-phosphosulfate (PAPS), substrater for TPSTs, fra stoffer til lumen av Golgi kan endre sulfation status proteoglycans 71.

Bortsett fra sulfatable nanobodies tillate andre derivatizations også sporing transport gjennom endocytic rom og TGN. APEX2 kan brukes som en promiskuøse merking enzymet for nærhet-avhengige biotinylation proteomic analyse av retrograd transport. APEX2 nanobody som er internalisert av en last av interesse vil etiketten proteiner i nærheten i målet seksjonene. Komparativ Proteomikk bør tillate for å identifisere andre endogene proteiner i ulike endosomes og TGN som nanobody åpner. Mange varianter av nanobodies i kombinasjon med sine mål protein er tenkelig. En fersk rapport, brukes for eksempel en invertert tilnærming beskrevet her: derivatized GFP ble brukt til å studere og felle cellularly uttrykt anti-GFP nanobody-merket mer sortering reseptorer i anterograd og retrograd deler av anlegget endomembrane systemet72. Tilsvarende kan functionalized nanobody-feller være utformet på pattedyr celle kultur-systemer for å fange og samle EGFP endret journalister i ulike avdelinger under retrograd transport.

Våre her presentert metoden og protokoll med fokus på TS området-merket nanobodies tillater kvantitative og kvalitative sporing av Last proteiner fra celleoverflaten endocytic rom og TGN i kulturperler pattedyrceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Grant 31003A-162643 av Swiss National Science Foundation. Vi takker Nicole Beuret og den Biozentrum Imaging Core anlegg (IMCF) for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 144 nanobodies retrograd transport Golgi komplekset tyrosin sulfation bakteriell uttrykk radiolabeling EGFP HeLa celler
Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter