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Biochemistry

पॉलीऐक्रिलमाइड जेल्स में एक पोस्टस्टेनिंग विधि के माध्यम से आम-टैग किए गए आरएनए का फ्लोरोसेंट विजुअलाइजेशन

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59112
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक संवेदनशील, तेजी से प्रस्तुत करते हैं, और भेदभाव के बाद जेल धुंधला विधि आरएनए मैं Mango aptamers मैं, द्वितीय, III, या चतुर्थ के साथ टैग छवि के लिए, या तो देशी या denaturing polyacrylamide जेल electrophoresis (पेज) जैल का उपयोग कर. मानक पृष्ठ जैल चलाने के बाद, मैंगो-टैग आरएनए आसानी से TO1-बायोटिन के साथ दाग ासाकीय हो सकता है और फिर सामान्य रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रीडर्स का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है.

Abstract

देशी और denaturing polyacrylamide जैल नियमित रूप से ribonucleoप्रोटीन (RNP) जटिल गतिशीलता की विशेषता के लिए और आरएनए आकार को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, क्रमशः. के रूप में कई जेल-इमेजिंग तकनीक गैर विशिष्ट दाग या महंगी फ्लोरोफोर जांच का उपयोग करें, संवेदनशील, भेदभाव, और किफायती जेल-इमेजिंग तरीके अत्यधिक वांछनीय हैं. आरएनए मैंगो कोर अनुक्रम छोटे होते हैं (19-22 nt) अनुक्रम रूपांकनों कि, जब एक मनमाना आरएनए स्टेम द्वारा बंद कर दिया, बस और सस्ते ब्याज की एक आरएनए करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. ये मैंगो टैग उच्च आत्मीयता और एक thiazole-नारंगी फ्लोरोफोर ligand TO1-बायोटिन कहा जाता है, जो बाध्यकारी पर अधिक फ्लोरोसेंट के हजारों हो जाता है करने के लिए विशिष्टता के साथ बाँध. यहाँ हम दिखाते हैं कि मैं, द्वितीय, तृतीय, और चतुर्थ विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता के साथ जैल में आरएनए छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. देशी जैल में आरएनए के 62.5 एफमोल और डेनिंग जैल में आरएनए के 125 एफमोल के रूप में एक इमेजिंग बफर में जैल भिगोने से पता लगाया जा सकता है जिसमें पोटेशियम और 20 एनएम TO1-बायोटिन 30 मिनट के लिए होता है। हम कुल जीवाणु आरएनए के एक जटिल मिश्रण के संदर्भ में एक आम टैग 6S जीवाणु आरएनए इमेजिंग द्वारा आम टैग प्रणाली की विशिष्टता का प्रदर्शन.

Introduction

मैंगो एक आरएनए टैगिंग प्रणाली है जिसमें चार छोटे फ्लोरोसेंट आरएनए एप्टीमर्स का एक सेट होता है जो थायाज़ोल-नारंगी (टीओ1-बायोटिन, चित्रा 1A)1,2,3 के सरल डेरिवेटिव ्स ्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स ्स्स्स ्स . बाइंडिंग पर, इस लिगन्ड का फ्लोरोसेंट विशिष्ट उपयुक्त पर निर्भर करते हुए 1,000 से 4,000 गुना बढ़ जाता है। मैंगो प्रणाली की उच्च चमक, जो मैंगो III के लिए बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) से अधिक है, आरएनए मैंगो aptamers के नैनोमोलर बंधन संबंध के साथ संयुक्त, यह दोनों इमेजिंग और आरएनए की शुद्धि में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है परिसर2,4.

मैंगो I,II6, और III7 की एक्स-रे संरचनाओं को उच्च संकल्प के लिए निर्धारित किया गया है, और सभी तीन aptamers एक आरएनए चौगुनी का उपयोग करने के लिए TO1-बायोटिन बाँध (चित्र 1B-D) . सभी तीन aptamers के कॉम्पैक्ट कोर कॉम्पैक्ट अनुकूलक रूपांकनों के माध्यम से बाहरी आरएनए अनुक्रम से अलग कर रहे हैं। मैं मैं और द्वितीय दोनों एक लचीला GNRA की तरह पाश अनुकूलक का उपयोग करने के लिए एक मनगो कोर एक मनकी आरएनए डुप्लेक्स से कनेक्ट (चित्र 1 बी,सी). इसके विपरीत, मैंगो III एक कठोर ट्रिपलेक्स आकृति का उपयोग करता है एक मनमाना आरएनए हेलिक्स के लिए अपने कोर कनेक्ट (चित्र 1 डी, बैंगनी अवशेषों), जबकि मैंगो चतुर्थ की संरचना वर्तमान में ज्ञात नहीं है. चूंकि इन aptamers में से प्रत्येक के लिगन्ड बाध्यकारी कोर इन कुंडलिनी एडेप्टर द्वारा बाहरी आरएनए अनुक्रम से अलग है, यह संभावना है कि वे सब बस आरएनए की एक किस्म में शामिल किया जा सकता है प्रकट होता है. बैक्टीरियल 6S नियामक आरएनए (मैंगो I), खमीर spliceosome के घटकों (मैंगो मैं), और मानव 5S आरएनए, U6 आरएनए,और एक सी / जैविक आरएनए को आरएनए मैंगो एप्टीमर सिस्टम का उपयोग करके टैग किया जा सकता है।

Denaturing और देशी जैल आमतौर पर आरएनए का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। Denaturing जैल अक्सर आरएनए आकार या आरएनए प्रसंस्करण न्यायाधीश के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन आम तौर पर, एक उत्तरी दाग के मामले में, उदाहरण के लिए, कई धीमी गति से और अनुक्रमिक कदम की आवश्यकता के लिए एक छवि उत्पन्न करने के लिए. जबकि अन्य आरएनए फ्लोरोजेनिक aptamers, जैसे आरएनए पालक और ब्रोकोली, जेल इमेजिंग9के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, कोई fluorogenic aptamer प्रणाली की तारीख करने के लिए उच्च चमक और आम प्रणाली की समानता के पास, यह काफी ब्याज की बना रही है मैंगो की जेल-इमेजिंग क्षमताओं की जांच करने के लिए। इस अध्ययन में, हमने सोचा कि अगर आरएनए मैंगो प्रणाली बस जेल इमेजिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है, के रूप में उत्तेजना और TO1-बायोटिन के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (510 एनएम और 535 एनएम, क्रमशः) eGFP चैनल में इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं सबसे फ्लोरोसेंट के लिए आम जेल स्कैनिंग इंस्ट्रूमेंटेशन।

यहाँ प्रस्तुत पोस्ट जेल धुंधला प्रोटोकॉल विशेष रूप से देशी में मैंगो टैग आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए एक तेजी से तरीका प्रदान करता है और polyacrylamide जेल electrophoresis (पेज) जैल denaturing. इस धुंधला विधि पोटेशियम और TO1-बायोटिन युक्त एक बफर में जैल भिगोने शामिल है. आरएनए मैंगो एप्टीमर्स जी-क्वीवरेक्स आधारित हैं और ऐसी संरचनाओं को स्थिर करने के लिए पोटेशियम की आवश्यकता होती है। न्यूनतम मैंगो-एन्कोडिंग डीएनए टेम्पलेट्स से लिखित आरएनए का उपयोग करना (प्रोटोकॉल अनुभाग देखें), हम बस के रूप में कम के रूप में कम के रूप में पता लगा सकते हैं 62.5 देशी जैल में आरएनए के fmol और denaturing जैल में आरएनए के 125 fmol, एक सीधा धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर. आम nonspecific न्यूक्लिक एसिड दाग के विपरीत (सामग्री की तालिकादेखें, यहाँ से एसजी को भेजा), हम स्पष्ट रूप से मैंगो टैग आरएनए की पहचान कर सकते हैं यहां तक कि जब कुल untagged आरएनए की उच्च सांद्रता नमूने में मौजूद हैं.

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. TO1-बायोटिन poststaining समाधान (जेल धुंधला समाधान)
    1. थ् 7.2 पर 1 ल ल का 1 ल, न2एचपीओ4 का 1 उ का 342 उल तथा1 उ छ 2 पीओ4का 158 एमएल जोड़कर 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाइए। उपयुक्त फॉस्फेट विलयन जोड़कर 50 म पर थ् को 7-2 तक समायोजित करें। एक 0.2 डिग्री फिल्टर का उपयोग कर बाँझ फिल्टर और कमरे के तापमान पर प्लास्टिक के बर्तन में समाधान की दुकान.
    2. 5x जेल धुंधला समाधान (TO1-बायोटिन के बिना) इस प्रकार तैयार करें। डीडीएच 2 ओ के 2, 700 एमएल1 एम केसीएल, 1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.2) के 50 एमएल, और ट्वीन 20 के 2.5 एमएल को मिलाकर 1 एल घोल बनाएं। स्टराइल फिल्टर एक 0.2 डिग्री फिल्टर का उपयोग कर और प्लास्टिक के बर्तन में समाधान की दुकान. यह कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है.
      नोट: MgCl2 इस समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है यदि आवश्यक हो के रूप में यह संभावित आरएनए परिसरों को स्थिर कर सकते हैं. इसका फ्लोरोसेंट सिग्नल2पर मामूली प्रभाव पड़ेगा .
    3. एक 1x जेल धुंधला समाधान चरण से 5x जेल धुंधला समाधान का उपयोग कर बनाओ 1.1.2 और, तुरंत उपयोग करने से पहले, यह TO1-बायोटिन फ्लोरोफोर के साथ पूरक (सामग्री की तालिकादेखें) 20 एनएम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए. उदाहरण के लिए, 1x जेल धुंधला समाधान के 100 एमएल बनाने के लिए deionized पानी के 80 एमएल के लिए 5x जेल धुंधला समाधान के 20 एमएल जोड़ें, और एक 1 एमएम TO1-बायोटिन स्टॉक के 2 $L जोड़ें (डिमेथिलफॉर्मामिड में तैयार)।
      नोट: 500 एनएम पर TO1-बायोटिन डाई के लिए विलुप्त होने गुणांक 63,000 M-1 सेमीहै, जो धुंधला समाधान1में मापा जाता है।
  2. Denaturing PAGE (2x denaturing जेल लोड हो रहा है समाधान और समाधान ए, बी, सी, अमोनियम persulfate, और टेट्रामेथिलीथिलीन)
    1. 40 एमएल फॉर्मामिडी, 0.5 एमएल 0.5 एमएल एथिलीनडिऐलोडिमिनेट्रासेटिक एसिड (ईडीटीए, पीएच 8.0) और 9.5 एमएल डीएच2हे को मिलाकर 2x डेनेरिंग जेल लोडिंग समाधान की 50 एमएल तैयार करें। समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। लोड हो रहा है रंगों इस समाधान के लिए नहीं जोड़ रहे हैं के रूप में यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग अस्पष्ट हो सकता है.
    2. तैयार 2x denaturing जेल लोडहोज डाई इस प्रकार के रूप में. आरएनए और डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को शुद्ध करते समय, 0.5 एमएल 2.5% (w/v) ब्रोमोफेनोल ब्लू (बीबी) और 0.5 एमएल 2.5% (w/v) xylene cyanol (XC) को चरण 1.2.1 में वर्णित समाधान के लिए जोड़ें, और 9.5 एमएल के बजाय डीडीएच2ओ के 8.5 एमएल जोड़ें। समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. 200.2 ग्राम यूरिया (सूत्र वजन: 60.06 ग्राम) का वजन करके समाधान A के 100 एमएल तैयार करें और इसे 40% 19:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide के 312.5 एमएल में जोड़ दें। इसे अधिकतम गति पर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ हिलाएं जब तक भंग (लगभग 3 ज) और ddH2O. नोट का उपयोग करके 500 एमएल का समाधान करें कि अंतिम सांद्रता 6.667 एम यूरिया और 25% 19:1 ऐक्रिलमाइड:N,N'-methylenebisacrylamide हैं। साफ प्लास्टिक के बर्तन में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    4. 400.4 ग्राम यूरिया का वजन करके 1 ल समाधान ख तैयार की 1 ल तैयार की है और डीडीएच2हे के साथ 1 ल तक का घोल बना लें; यूरिया भंग होने तक हलचल करें। हल बी कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है।
    5. समाधान C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) निम्नानुसार तैयार करें। 10x TBE के 4 L को Tris बेस के 432 ग्राम और 220 ग्राम बोरिक एसिड का वजन करके तैयार करें, 0.5 M EDTA के 160 एमएल को 8 (फिल्टर्ड) के पीएच के साथ जोड़कर, और डीडीएच2ओ के साथ 4 एल के लिए समाधान तैयार करें। इस बफर का एक बड़ा स्टॉक बनाया जाता है के रूप में यह भी जेल बफर चल के रूप में प्रयोग किया जाता है.
    6. 10% अमोनियम पर्सुलफेट (एपीएस) को 1 ग्राम एपीएस को 4 डिग्री सेल्सियस पर डीडीएच2ओ स्टोर के 10 एमएल की कुल मात्रा में भंग करके तैयार करें।
    7. टेट्रामेथिलीथिलीनडिमिन (टीईएमईडी) काम रखें। एपीएस समाधान के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. देशी पेज (2x देशी जेल लोड हो रहा है समाधान)
    1. 100% ग्लिसरोल के 25 एमएल, 5x जेल धुंधला समाधान के 10 एमएल, और 50 एमएल के समाधान बनाने के लिए डीडीएच2ओ के 15 एमएल को मिलाकर 2x देशी जेल लोडिंग समाधान के 50 एमएल तैयार करें।
      नोट: denaturing जेल अनुभाग में के रूप में, लोड रंगों इस शेयर करने के लिए जोड़ा जा सकता है, लेकिन उनके अलावा संभावित जेल में फ्लोरोसेंट संकेत अस्पष्ट कर सकते हैं और, इस प्रकार, से बचा जाना चाहिए.

2. तैयारी और denaturing जैल की लोडिंग

  1. सारणी 1का अनुसरण करते हुए उचित प्रतिशत के साथ एक डेनेचर जेल तैयार करें। विशिष्ट जेल कास्टिंग प्रणाली पर विचार करें; 30 एमएल जैल आमतौर पर उपयोग किया जाता है. उपयुक्त जेल प्रतिशत तालिका 2का उपयोग करके अनुमान लगाया जा सकता है: polyacrylamide प्रतिशत का चयन करें जहां बी बी और XC रंगों motilities तेजी से और धीमी है, क्रमशः, ब्याज की आरएनए की तुलना में, प्रासंगिक आकार में उच्च बैंड जुदाई सुनिश्चित करने के लिए श्रेणी.
  2. मिक्स समाधान ए, बी, और सी तालिका 1 के अनुसार और एपीएस और TEMED जोड़ने के तुरंत पहले जेल डालने से पहले. स्वच्छ प्लास्टिक के बर्तन में अच्छी तरह से समाधान मिक्स.
  3. एक उचित जेल कास्टिंग उपकरण में जेल समाधान डालो, यह सुनिश्चित करने के बाद कि सभी घटकों को ईमानदारी से साफ कर रहे हैं. उपकरण के एक तरफ लिफ्ट इतना है कि जेल थोड़ा झुका हुआ है जब डालने का कार्य, किसी भी हवा बुलबुले जेल के भीतर ही फंस बनने से बचने के लिए.
  4. वांछित कंघी डालें और यह बहुलक (लगभग 30 मिनट) के लिए छोड़ दें। जेल कुओं के चारों ओर अपवर्तन के सूचकांक में परिवर्तन के लिए बारीकी से देख कर बहुलकीकरण का निरीक्षण करें। 1x समाधान सी (1x TBE) का उपयोग करके जेल टैंक बनाओ और ध्यान से कंघी हटा दें। एक सिरिंज का उपयोग करना, तुरंत नमूना लोड करने से पहले कुओं बाहर aspirate.
  5. इस प्रकार के रूप में नमूने denaturing तैयार करें. एक thermocycler या पानी स्नान का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर denaturing जेल लोडिंग समाधान 1x और गर्मी-denature बनाने के लिए ब्याज के आरएनए नमूनों के लिए 2x denaturing जेल लोडहोसिंग समाधान जोड़ें।
  6. नमूने लोड करने से पहले, हवा उन्हें कई मिनट ठंडा जब तक वे स्पर्श करने के लिए शांत कर रहे हैं. जेल लोडिंग युक्तियाँ का उपयोग कर, प्रत्येक अच्छी तरह से के तल पर उन्हें layering द्वारा नमूने लोड.
    नोट: दौर युक्तियाँ 1 मिमी मोटाई या अधिक के जैल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; पतले जैल के लिए फ्लैट युक्तियाँ का उपयोग करें.
  7. कमरे के तापमान पर denaturing जैल चलाते हैं. सुनिश्चित करें कि वाटेज पर्याप्त रूप से कम है ताकि जेल प्रणाली की कांच की प्लेटें दरार न करें।
    नोट: हमारी प्रयोगशाला में, 20 सेमी x 16 सेमी प्लेटों के लिए 28 डब्ल्यू इस उद्देश्य के लिए पर्याप्त था।

3. तैयारी और देशी जैल की लोडिंग

  1. सारणी 3का हवाला देकर एक उचित प्रतिशत के साथ देशी जेल तैयार की। विशिष्ट जेल कास्टिंग प्रणाली पर विचार करें, लेकिन ध्यान रखें कि 30 एमएल जैल आमतौर पर उपयोग किया जाता है। 1x TBE के समाधान मिक्स, 40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide, और ग्लिसरोल तालिका 3के अनुसार, और जोड़ें एपीएस और TEMED तुरंत जेल डालने से पहले. चरण 2.3 और 2.4 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
  2. समाधान 1x बनाने के लिए ब्याज के आरएनए नमूनों के लिए 2x देशी जेल लोडिंग समाधान जोड़कर देशी नमूने तैयार करें और इसे जेल चलाने से पहले 100 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें ताकि पूरा आरएनए तह सुनिश्चित किया जा सके।
  3. एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में देशी जेल चलाने के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि वाटेज जेल गर्मी नहीं करने के लिए पर्याप्त रूप से कम है।
    नोट: हमारी प्रयोगशाला में, 14 डब्ल्यू के लिए 20 सेमी x 16 सेमी प्लेटें इस उद्देश्य के लिए पर्याप्त था.

4. रन-ऑफ T7 प्रतिलेखन द्वारा आरएनए तैयारी

नोट: आरएनए मैंगो निर्माण के रन-ऑफ प्रतिलेखन10 के लिए इस्तेमाल किया डीएनए दृश्यों वाणिज्यिक आदेश दिए गए थे। इस विधि में, डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड दोनों अनुक्रम के रिवर्स पूरक (आरसी) युक्त प्रतिलेखन किया जा करने के लिए और T7 प्रमोटर एक T7 प्रमोटर शीर्ष किनारा अनुक्रम करने के लिए संकरित कर रहे हैं और फिर इन विट्रो में प्रतिलेखन. नीचे, प्रत्येक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के लिए, मैंगो कोर अनुक्रम की आर सी बोल्ड में दिखाया गया है और T7 प्रमोटर क्षेत्र की आर सी इटैलिक में दिखाया गया है। नियमित फ़ॉन्ट में अवशिष्ट अन्यथा मनमाने ढंग से पूरक कुंडलिनी क्षेत्रों के अनुरूप हैं जो मैंगो कोर को ठीक से गुना करने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है।

मैं मैं: जीसीए सीसीटी एसीसीटीसी सीटीसी टीसी सीसी सी सी सी सी सी सी सी सी सी सी सी टी टी जी टी सीटी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी ए एजी
मैंगो द्वितीय: जीसीए सीसीटी एसी सीटीसी सीटीसी सीटीसी टीसी टीसी टीसी सीसी सीसी सीसीटी सीटी सी टी ए सी टी टी टी टीटी टी टी टी टी टी टी जी टी टी टी टी ए एजी
मैंगो III: जीजीसी एसीजी टीएसी जीए टी ए टी ए ए एसीए टीएसी सी सी टी सी सी सी सी टी टीटी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी टी जी टी जी टी जी टी जी टी टी टी टी ए टी ए ए
मैंगो चतुर्थ: जीसीए सीजीटी एसीटी सी जी सी सी सीटीसी एटीसी सीटीसी एसीसी अधिनियम सीसीसी टीसीजी जीटीए जीसीटी जीसी टी एटी एजी जी टी टी टी टी टी टी ए एजी
T7 शीर्ष स्ट्रैंड: CTT TAA टीएसी GAC TCA CTA टैग जी

  1. डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की तैयारी जेल शुद्धि
    1. 0.2 $मोल-स्केल डीएनए संश्लेषण के लिए, डीडीएच2ओ के 100 डिग्री एल में deprotected डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और 2x डेनेरिंग लोडिंग डाई के 100 डिग्री एल (चरण 1.2.2 से) को पुन: स्फूर्त ीकृत करें। इस मामले में, चरण 1.2.2 में के रूप में एक ही एकाग्रता पर लोडिंग समाधान में जेल लोडिंग रंगों सहित पसंद किया जाता है.
    2. डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड को 50 एमएल की तैयारी पैमाने पर उचित पॉलीक्रिलमाइड प्रतिशत के जेल का उपयोग करके शुद्ध करें; जेल प्रतिशत का चयन करने के लिए तालिका 2 का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, एक 50 nt अनुक्रम के लिए एक 8% जेल का उपयोग करें. आदर्श रूप में, ब्रोमोफेनोल ब्लू ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की तुलना में तेजी से चलना चाहिए, और xylene cyanol धीमी चलाना चाहिए।
      नोट: हमारी प्रयोगशाला में, इस तरह के जैल कास्टिंग स्पेसर्स कि 1.5 मिमी मोटी और कुओं कि 2-2.5 सेमी चौड़ा थे के साथ एक जेल लोडिंग कंघी थे का उपयोग कर डाली गई.
    3. चरण 4.1.2 प्रति तैयारी जेल में तैयार डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड समाधानों का 100 $L लोड करें, साथ ही चरण 2-4-2.7 में वर्णित करें।
    4. सावधानी से जेल के बाहर सूखी, कांच की प्लेटें हटा दें, और प्लास्टिक की चादर में जेल के दोनों पक्षों को कवर. इसे फ्लोरोसेंट इमेजिंग स्क्रीन पर रखें (एल्यूमिनम समर्थित पतली-परत क्रोमैटोग्राफी प्लेटें फ्लोरोफोर के साथ गर्भवती एक किफायती समाधान हैं) और यूवी छाया द्वारा डीएनए बैंड को विज़ुअल करने के लिए एक लघु-तरंग लंबाई यूवी हाथ से आयोजित दीपक का उपयोग करें।
    5. एक कुरकुरा, अच्छी तरह से परिभाषित छाया मनाया जाना चाहिए अगर डीएनए संश्लेषण उच्च गुणवत्ता का है. एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर, प्लास्टिक की चादर पर बैंड मार्क.
      नोट: यूवी प्रकाश से त्वचा और आंखों की रक्षा और जोखिम कम रखने के लिए न्यूक्लिक एसिड नमूना हानिकारक से बचने के.
    6. एक साफ कांच की थाली पर जेल रखकर, ध्यान से बाहर चिह्नित बैंड में कटौती और 300 एम NaCl के 400 $L में प्रत्येक जेल टुकड़ा जगह है. कमरे के तापमान पर एक रोटेटर का उपयोग कर, रात भर डीएनए को एल्यूट करें।
    7. एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में एलुएंट को पुनर्प्राप्त करें और डीएनए को वेग देने के लिए इथेनॉल के 2.5 समकक्ष जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब जगह है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 156,000 x ग्राम पर एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में नमूना गोली। ध्यान से supernatant को दूर करने और ddH में गोली resuspend2ओ. सही डीएनए oligonucleotide एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर सुविधा के लिए नमूने को 10 डिग्री सेल्सियस के स्टॉक के रूप में स्टोर करें।
  2. आरएनए नमूनों की रन-ऑफ प्रतिलेखन और जेल शोधन
    1. 40 एमएम ग्वानोसाइन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी, 11,400 एम-1सेमी-1), 25 मीटर साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट (सीटीपी, 7,600 एम -1 सेमी -1 ), 25 एम एम की अंतिम सांद्रता से बने तरल एनटीपी स्टॉक को मिलाकर 5x न्यूक्लिओसाइड ट्राइफॉस्फेट (सीटीपी, 7,600 एम-1सेमी-1), 25 एम एम एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी, 5,000 एम-1सेमी-1), और 10 एमएम यूरीडीन ट्राइफॉस्फेट (यूटीपी, 10,000 एम-1सेमी-1); 260 एनएम पर सभी विलुप्त होने गुणांक.
      नोट: तरल या पाउडर स्टॉक वाणिज्यिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है। यदि पाउडर से प्राथमिक स्टॉक तैयार कर रहा है, तो ध्यान से 7.9 के एक अंतिम पीएच करने के लिए पीएच समायोजित, 1 एम NaOH का उपयोग कर. अलीकोट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टॉक को स्टोर करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1 एम ट्राइस-एचसीएल के 25.6 एमएल, 1 एम ट्राइस बेस के 14.4 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2के 26 एमएल, 10 एमएल 10% ट्राइटन एक्स-100, और 0.637 ग्राम स्पर्मिडीन के मिश्रण से 100 एमएल की 100 एमएल तैयार करें। ddH2O जोड़कर 100 एमएल के अंतिम खंड के लिए स्टॉक को बनाएं।
      नोट: 1x समाधान के 7.9 के एक अंतिम पीएच एक calibrated पीएच मीटर का उपयोग कर की पुष्टि की जानी चाहिए. 10x बाँझ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और उपयुक्त आकार alicots में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    3. प्रतिलेखन निम्नानुसार करें।
      1. 10x T7 प्रतिलेखन बफर का उपयोग कर 1x T7 प्रतिलेखन बफर का एक अंतिमएकाग्रता बनाने के लिए निम्न अभिकर्मकों जोड़ें (चरण 4.2.2 से), 1x NTPs, 10 m dthiothreitol के (DTT), 1 $M T7 शीर्ष किनारा अनुक्रम (अनुभाग 4 नोट के लिए देखें अनुक्रम), 1 $M जेल-शुद्ध मैंगो डीएनए अनुक्रम (चरण 2.1), और T7 आरएनए पॉलिमरेज एंजाइम (1 U/
      2. भंवर, नीचे स्पिन, और 2 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान इनक्यूबेट या जब तक यह बादल हो जाता है और ट्यूब के तल पर एक सफेद वेग रूपों. जेल शोधन के बाद 50 डिग्री सेल्सियस आरएनए का 50 डिग्री एल में परिणाम होना चाहिए। 2x denaturing डाई के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और जेल शोधन के लिए तैयार जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान.
    4. GEL-purif the resulting RNA as where where in where in the DNA ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स जेल शुद्धि अनुभाग में निम्न चरणों का पालन करके 4.1.220124.1.8, डीएनए के लिए आरएनए नमूने का प्रतिस्थापन।
      नोट: आरएनए आरएनए गिरावट के प्रति बेहद संवेदनशील है, इसलिए सुनिश्चित करें कि सभी चरणों में, दस्ताने और एक साफ प्रयोगशाला कोट हर समय पहना जाता है। सुनिश्चित करें कि सभी नमूने तैयार कर रहे हैं और एकल उपयोग प्लास्टिक के बर्तन में संग्रहीत RNase संदूषण के खिलाफ की रक्षा के लिए, और गर्म साबुन और पानी के साथ सावधानी से कांच की प्लेटों धोने का उपयोग करने से पहले, उन्हें अच्छी तरह से ddH2O के साथ कुल्ला, और के साथ कांच के बर्तन सूखी एक निचोड़ बोतल से लागू इथेनॉल की सहायता.
    5. अंतिम आरएनए नमूने के 1 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें और, एक छोटी बूंद आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर, 260 एनएम पर अवशोषण निर्धारित करते हैं। निकटतम पड़ोसी विधि द्वारा निर्धारित विलुप्त िराही गुणांक का उपयोग करके, आरएनए सांद्रता की गणना करें तथा सुविधा के लिए डीडीएच2व् के साथ नमूना सांद्रता को 10 े उ तक समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए के नमूनों को संग्रहीत करें।
  3. एस्चेरीचिया कोली संपूर्ण अपरिष्कृत न्यूक्लिक अम्ल निष्कर्षण
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल एक उदाहरण है। इस प्रोटोकॉल में ई. कोलाईमें एक प्लाज्मिड से आम आई-टैग ्ड 6 एस आरएनए का उपयोग किया गया है, और इस प्लाज्मिड से प्रेरण का विस्तार सेवर्णन कियागया है 4 .
    1. इस अध्ययन के प्रयोजनों के लिए, पीकोली-आरएनए मैंगो और पीकोली-टी 1 प्लाज्मिड दोनों के लिए प्रेरित कोशिकाओं के 500 एमएल तैयार करें (कोशिकाओं को 1 के ओडी600एनएम पर प्रेरित किया जाता है)। कोशिकाओं को गोली और उपयोग करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर।
    2. आरएनए निष्कर्षण निम्नानुसार करें।
      1. प्रेरित पीकोली सेल पेलेट का 0.5 उल लीजिये और 500 ल् बराबर फीनॉल मिलाइये। फिर, नमूना भंवर; समाधान दूधिया सफेद हो जाएगा. परतों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज।
      2. ऊपर की परत निकालें, जो थोड़ा पीला हो जाएगा, और फीनॉल, centrifuging के एक बराबर मात्रा जोड़कर चरण 4.3.2.1 दोहराएँ, और 5x की कुल के लिए निकालने (या मध्य परत, जो अपारदर्शी सफेद है जब तक, दूर हो जाता है और केवल दो स्पष्ट परतों छोड़ दिया जाता है).
      3. फीनॉल-निष्कर्षित जलीय आयतन को क्लोरोफॉर्म, भ्रमिल की बराबर मात्रा में जोड़ें, और फिर, 2 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रण।
      4. जलीय परत निकालें और 300 m की एक अंतिम एकाग्रता के लिए NaCl जोड़ें. इथेनॉल, भंवर, स्पिन नीचे के 2.5 समकक्ष के अलावा द्वारा जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड की भविष्यवाणी, और कम से कम 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर वेग।
      5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15.6 x 1,000 x g पर एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में गोली ध्यान से supernatant निकालें और डीडीएच2हे के 100 डिग्री एल में गोली resuspend।
      6. एक DNase मैं पाचन इस प्रक्रिया के लिए कदम जोड़ें, संदर्भित प्रोटोकॉल11का पालन, कुल आरएनए प्राप्त करने के लिए.
        नोट: भंवर जोरदार जब तक गोली पूरी तरह से ddH2हे में भंग कर दिया है.

5. पोस्ट जेल धुंधला

  1. चरण 1.1.3 में नुस्खा के अनुसार 1x जेल धुंधला समाधान तैयार करें और इसे एक साफ ग्लास कंटेनर में जोड़ें जो जेल को आराम से फिट करने के लिए काफी चौड़ा है।
    नोट: स्नैप फिट ढक्कन के साथ Borosilicate ग्लास कंटेनर इस उद्देश्य को अच्छी तरह से सेवा करते हैं।
  2. कंटेनर के लिए पर्याप्त 1x जेल धुंधला समाधान जोड़ें ताकि जेल पूरी तरह से समाधान और तरल जेल के शीर्ष पर sloshes के साथ कवर किया जाता है जब यह कक्षीय रोटेटर पर रखा गया है.
    नोट: कंटेनर इतना है कि यह चारों ओर ले जाने के लिए और पूरी तरह से जेल को कवर करने के लिए कंटेनर में पर्याप्त बफर कर सकते हैं जेल फिट करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए।
  3. एक बार देशी या denaturing जेल चल समाप्त हो गया है (अनुभाग 2 या 3, क्रमशः), उपकरण से जेल को हटाने और उसके कुओं में कटौती. यह विश्लेषण में बाद में अभिविन्यास के लिए जेल के एक कोने को दूर करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
  4. सावधानी से कदम 5.2 में तैयार 1x जेल धुंधला समाधान करने के लिए जेल हस्तांतरण।
    नोट: जैल नाजुक और तोड़ने के लिए प्रवण हैं तो सावधान रहना जब जेल स्थानांतरित. हर समय धुंधला कंटेनर पर ढक्कन रखें ताकि जेल को दूषित न किया जा सके।
  5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 100 आरपीएम की गति से एक कक्षीय रोटेटर पर जेल रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि जेल खुद पर वापस गुना नहीं करता है; अन्यथा, आरएनए जेल से बाहर फैलाना और इसलिए जेल का एक अलग हिस्सा लेबल हो सकता है.

6. जेल में मैंगो-टैग ्ड आरएनए को इमेजिंग करना

  1. ध्यान से इमेजिंग बफर decant. जेल को पानी के साथ जल्दी से कुल्ला करें, यह सुनिश्चित करना पर्याप्त तरल रहता है कि जेल को कंटेनर में थोड़ा मोबाइल रखा जाए।
  2. ध्यान से छविपर पर जेल हस्तांतरण. सावधानी से जेल के पक्षों उठा और यह imager ट्रे पर रखकर स्थानांतरण; वैकल्पिक रूप से, जेल धीरे धीरे ट्रे पर डाला जा सकता है. सुनिश्चित करें कि जेल के नीचे कोई बुलबुले हैं और जेल के नीचे कोई अतिरिक्त तरल नहीं है। जेल पर लुढ़का एक पिपेट किसी भी अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
    नोट: अतिरिक्त तरल पदार्थ को सोखने के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग करें।
  3. एक जेल छवि ले लो, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 510 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 535 एनएम के बीच फ्लोरोसेंट देख (उदाहरण के लिए, 520 एनएम तरंगदैर्ध्य फ्लोरोसेंट सेटिंग्स पर हरी प्रकाश छविर पर). सेटिंग्स पूरी तरह से साधन पर अनुकूलित कर रहे हैं सुनिश्चित करें और ध्यान से इस्तेमाल साधन के लिए निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

लघु आम टैग आरएनए प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में तैयार किए गए थे। यह मानते हुए कि डेंजिंग स्थितियों में फ्लोरोसेंट को जैल में यूरिया की उपस्थिति के कारण देखना सबसे कठिन होगा, हमने सबसे पहले यूरिया के लिए मैंगो एप्टीमर्स के प्रतिरोध का अध्ययन किया, जो एक न्यूक्लिक एसिड विकृत के रूप में कार्य करता है। हमने पाया कि मैंगो एप्टीमर्स लगभग 1 उ (चित्र 2क) की यूरिया सांद्रता तक विकृतीकरण के लिए पर्याप्त रूप से प्रतिरोधी हैं । एक denaturing जेल के लिए जेल धुंधला समाधान जोड़ने से पहले, जेल में यूरिया की अंतिम एकाग्रता है 6 एम 1 एम करने के लिए इस एकाग्रता को कम करने के लिए पर्याप्त धुंधला समाधान जोड़ना, इसलिए, सभी चार aptamers के लिए पूर्ण मैंगो फ्लोरोसेंट सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम होगा. व्यवहार में, धुंधला प्रोटोकॉल यह पूरी तरह से इष्टतम परिणाम से कम हासिल की है, लेकिन यह बस अगर अधिक धुंधला समाधान का उपयोग कर या धुंधला के दौरान एक बार समाधान बदलने के सरल समीचीन द्वारा की जरूरत सुधारा जा सकता है.

एक बार मैंगो-टैग आरएनए निर्माण एक denaturing जेल में चला रहे थे, धुंधला समय अधिकतम जेल फ्लोरोसेंट के लिए एक 8% denaturing जेल में तीन अलग आम III मात्रा लोड करके अनुकूलित किया गया था (चित्र 2B). एक समय पाठ्यक्रम से पता चला है कि जेल धुंधला समाधान में भिगोने के 5 मिनट के बाद, फ्लोरोसेंट स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था. मैंगो III निर्माण की अधिकतम फ्लोरोसेंट धुंधला के 20-40 मिनट के बाद प्राप्त किया गया था, जिसके बाद समय छोटे RNAs इस अध्ययन में इस्तेमाल जेल से बाहर फैलाना शुरू कर दिया, फ्लोरोसेंट संकेत की हानि में जिसके परिणामस्वरूप (चित्र 2B) . नतीजतन, दोनों देशी और denaturing जैल 30 मिनट प्रत्येक के लिए दाग रहे थे. लंबे समय तक आरएनए निर्माण आसानी से अब दाग समय बर्दाश्त कर सकता है के रूप में वे बहुत कम जेल से बाहर फैलाना होने की संभावना होगी.

आरएनए मैंगो aptamers के कुछ दूसरों की तुलना में अधिक तेजी से तह. इस अध्ययन में प्रयुक्त मैंगो aptamers में से प्रत्येक एक जेल बफर में incubated था 1.5 एम यूरिया और 100 एनएम TO1-बायोटिन डाई के साथ पूरक और एक fluorometer का उपयोग कर विश्लेषण किया. मैंगो प्रथम, द्वितीय और तृतीय को 10 मिनट के बाद पूरी तरह से मोड़ा गया, जबकि मानगो चतुर्थ 40 मिनट के बाद ही काफी मुड़ गया (चित्र 3क) । यूरिया के अभाव में तह की अपेक्षा अधिक तीव्र थी (चित्र 3ख) देशी जेल के नमूने पूरी तरह से जोड़ रहे थे कि यह सुनिश्चित करने के लिए, हम उन्हें देशी जैल में चलाने से पहले 100 मिनट के लिए नमूने preincubated. व्यावहारिक रूप से, चित्र 3 के आंकड़ों से पता चलता है कि इस समय का उपयोग किया जाने वाला मैंगो एप्टीमर के आधार पर काफी कम किया जा सकता है।

एक बार प्रोटोकॉल आरएनए मैंगो aptamer फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था, poststaining विधि की संवेदनशीलता दोनों देशी जैल में मैंगो वेरिएंट में से प्रत्येक के लिए निर्धारित किया गया था. देशी जैल में चार मैंगो में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से गुना आरएनए के अनुरूप एकल बैंड देखे गए (चित्र 4क) । धारावाहिक कमजोर पड़ने पर, के रूप में कम के रूप में 62.5 आम द्वितीय के fmol मनाया जा सकता है, जबकि के रूप में कम के रूप में 125 आम मैं, III, और चतुर्थ के fmol आसानी से कल्पना की गई. देशी जैल की मात्रा निर्धारण के बारे में 1.5 परिमाण के आदेश पर लॉग रेखीय था, मैं मैं, द्वितीय के साथ, और चतुर्थ मैं III की तुलना में एक अधिक रैखिक फैशन में व्यवहार (चित्र 4B).

denaturing जैल के परिणाम देशी जैल की तुलना में थोड़ा कम संवेदनशील थे, लेकिन अधिक रैखिक थे. मानगो द्वितीय और तृतीय के 125 फ्मोल का आसानी से पता लगाया गया (चित्र 4 सी) . दिलचस्प बात यह है कि परिमाणीकरण (चित्र 4D) ने संकेत दिया कि डेनेरिंग जैल लॉग-रेखीय या परिमाण के दो आदेश थे। हम hypothesize कि, देशी जैल जहां आरएनए परतों शायद जेल चलाने की प्रक्रिया के दौरान आंशिक विकृतीकरण के अधीन थे के विपरीत, denaturing जेल में यूरिया की उपस्थिति एक और अधिक समरूप तरीका प्रदान करने के लिए aptamers गुना एक बार वे में रखा जाता है हो सकता है TO1-बायोटिन धुंधला समाधान.

सभी जेल धुंधला तरीकों के साथ के रूप में, अगर जेल ध्यान से कंटेनर में स्थानांतरित नहीं है, या घूर्णन गति धुंधला अवधि के दौरान बहुत अधिक है, जेल खुद पर वापस गुना कर सकते हैं (चित्र 5A). यह मैंगो टैग आरएनए नमूना जेल के एक स्थान से दूसरे करने के लिए diffusing में परिणाम कर सकते हैं, लेकिन आसानी से व्यवहार में बचा जा सकता है. देशी जैल में और, विशेष रूप से, मैंगो चतुर्थ के लिए, हमने देखा कि अधूरा तह संभवतःआंशिक रूप से / देशी जैल में तह मुद्दों आरएनए नमूने उचित रूप में पहले वर्णित के रूप में preincubating द्वारा बचा जा सकता है और एक ठंडे कमरे में देशी जैल चल रहा है. डेनेरिंग जैल में, जहां जेल के भीतर सीटू में आरएनए गुना, misfolding एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं थी. अंत में, आरएनए के अभाव में, बहुत कम पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट या तो जेल प्रणाली में मनाया गया.

इसके बाद, आरएनए मैंगो टैग की विशिष्टता बैक्टीरिया में 6S नियामक आरएनए overexpressing द्वारा अध्ययन किया गया था. इस आरएनए को पहले मैंगो I (चित्र 1E)4का उपयोग करके टैग किया गया था . बैक्टीरियल कोशिकाओं को या तो पीकोली-आरएनए मैंगो प्लाज्मिड (इसलिए एम प्लाज्मिड) या पीकोली-टी 1 प्लाज्मिड के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बदल दिया गया था (इसलिए ई प्लास्मिड)। 1.0 के एक OD600 तक पहुँच गया था जब तक परिवर्तित कोशिकाओं तरल लाइसोजेनी शोरबा मध्यम में बड़े हो गए थे। तब संस्कृतियों को 40 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस आइसोप्रोपिल-डी-1-थायोगालैक्टोपाइरानोसाइड (IPTG) के साथ प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से काटा गया था। कुल आरएनए को सेल छर्रों से फीनॉल-फेनोल क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करके निकाला गया थाजैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। कुल आरएनए नमूनों को एथेनॉल वर्षा द्वारा केंद्रित किया गया और फिर डीएनए11को हटाने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए DNase I के साथ इलाज किया गया। उपयोग करने से पहले, आरएनए इथेनॉल वर्षा द्वारा केंद्रित किया गया था.

कुल जीवाणु आरएनए 8% denaturing जैल में चला गया था (चित्र 6) और या तो एसजी13 या TO1-बायोटिन के साथ दाग. एसजी धुंधला के लिए, 10,000x एसजी के 10 $L जेल बफर के 100 एमएल में जोड़ा गया था; अन्यथा, धुंधला प्रोटोकॉल है कि TO1-बायोटिन के लिए इस्तेमाल के समान था. उम्मीद के रूप में, मजबूत एसजी धुंधला RNAs की एक भीड़ के लिए मनाया गया था, लेकिन सबसे प्रमुख रूप से ribosomal (rRNA) और हस्तांतरण RNAs (tRNA) के लिए (चित्र 6, बाएँ पैनल). जबकि मैंगो पर निर्भर धुंधला (एम लेन) इन एसजी सना हुआ जैल में देखा जा सकता है, वे विशिष्ट इस सार्वभौमिक दाग का उपयोग कर मनाया जटिल धुंधला पैटर्न को देखते हुए पहचान नहीं की जा सकती. इसके विपरीत, TO1-बायोटिन दाग जैल सबसे प्रमुख बैंड के रूप में आम पर निर्भर बैंड पर प्रकाश डाला. केवल राइबोसोमल आरएनए बैंड 6 एस मैंगो-निर्भर बैंड के साथ प्रतिस्पर्धा में देखा जाता है। गैर विशेष रूप से दाग बैंड की एक संख्या भी देखा जा सकता है. फिर भी, मैंगो पर निर्भर बैंड फिर से प्रभावी थे, केवल rRNA और tRNA बैंड के रूप में कमजोर प्रतिस्पर्धा प्रतियोगियों होने (चित्र 6, सही पैनल).

Figure 1
चित्र 1: मैंगो aptamer प्रणाली. (ए) TO1-बायोटिन फ्लोरोफोर। (ब) मैंगो I. (C) मैंगो II. (डी) मैंगो III. पैनलों बी-डी प्रत्येक aptamer के माध्यमिक संरचना दिखा. P1 एक मनमाना स्टेम है. जीएनआरए की तरह स्टेम-लूप (यहाँ GAAA) मैं मैं और द्वितीय में पाया लाल रंग में दिखाया गया है, मैंगो III के ट्रिपलेक्स आकृति बैंगनी में दिखाया गया है। (ई) 6S नियामक आरएनए मैंगो I के साथ टैग किया गया है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: मैंगो एप्टीमर फ्लोरोसेंट और इष्टतम धुंधला समय पर यूरिया का प्रभाव। (ए) 50 एनएम आरएनए मैंगो (नारंगी वृत्त), मैंगो द्वितीय (हरी वृत्त), मैंगो III (पूर्ण वृत्त), और मैंगो चतुर्थ (नीले वृत्त) का उपयोग करते हुए यूरिया अनुमापन, 100 एनएम TO1-बायोटिन डाई के साथ और संकेत यूरिया सांद्रता पर। इन नमूनों को फ्लोरोसेंट से पहले 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, 510 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 535 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर पढ़ा गया था। (बी) मैंगो III आरएनए एक 8% denaturing जेल में लोड किया गया था और 20 एनएम अंतिम TO1-बायोटिन डाई युक्त एक जेल समाधान के साथ दाग. प्रत्येक संकेत समय बिंदु के लिए, 0.064, 0.32, और मैंगो III आरएनए के 1.6 pmol बाएँ से दाएँ इस्तेमाल किया गया था. जेल छवि एक 520 एनएम लेजर और एक 10 मिनट जोखिम का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट छविकार के साथ कल्पना की थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: यूरिया की उपस्थिति और अनुपस्थिति में आम aptamers के तह समय. (ए) 1.5 एम यूरिया और 100 एनएम टीओ1-बायोटिन की उपस्थिति में, प्रत्येक आरएनए मैंगो निर्माण के 50 एनएम (आरएनए मैंगो मैं: नारंगी डॉट्स, मैंगो द्वितीय: हरे रंग के डॉट्स, मैंगो III: बैंगनी डॉट्स, और मैंगो चतुर्थ: नीले डॉट्स) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट समय पाठ्यक्रम किए गए थे। (ख) यूरिया के अभाव को छोड़कर पैनल एके लिए स्वतंत्र। सभी समय पाठ्यक्रम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: आरएनए मैंगो निर्माण के साथ देशी और denaturing पृष्ठ के फ्लोरोसेंट छवियों. (ए) एक 8% देशी जेल जिसमें क्रमिक रूप से पतला आरएनए मैंगो निर्माण होता है। लेन मैं, द्वितीय, तृतीय, और चतुर्थ प्रत्येक आरएनए मैं प्रथम, द्वितीय, तृतीय, और चतुर्थ के 8 pmol अंतिम मात्रा में क्रमशः होते हैं। सही पैनल दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने वाले हैं जिनमें 4 पीओल, 2 पीओल, 1 पीओल, 0.5 पीओल, 0.25 पीमोल, 0.125 पीमोल, और मानगो I, II, III या IV के 0.0625 पीमोल शामिल हैं, जैसा कि संकेत दिया गया है। लेन 12 कोई आरएनए शामिल हैं. (ख) देशी जेल की तीन प्रतिकृतियां का परिमाणीकरण (प्रत्येक के लिए दिखाए गए माध्य का मानक विचलन)। (C) पैनल एमें लोड किए गए एक ही नमूने के साथ एक 8% denaturing जेल , तथ्य यह है कि denaturing जेल लोडिंग समाधान के बजाय देशी जेल लोडिंग समाधान के बजाय इस्तेमाल किया गया था के अलावा. (घ) डेनेरिंग जेल की तीन परिमाणित प्रतिकृतियां (प्रत्येक के लिए दिखाए गए माध्य का मानक विचलन)। सभी जेल छवियों एक 520 एनएम लेजर और एक 10 मिनट जोखिम के साथ एक जेल imager कल्पना कर रहे थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: Suboptimal जैल और एक 8% देशी जेल में मैंगो चतुर्थ की अधूरी तह. (क) मैंगो II के लिए चित्र 4 में दिखाए गए प्रकार का एक क्रमिक कमजोर पड़ने लेकिन धुंधला प्रोटोकॉल के दौरान जेल तह का प्रभाव दर्शाता है. (बी) मैंगो चतुर्थ देशी जेल के नमूने है कि देशी बफर में काफी लंबे समय के लिए गुना करने की अनुमति नहीं थी जेल लोड करने से पहले प्रदर्शन डबल बैंड लोड हो रहा है. अन्यथा, ये परिणाम चित्र 4Aमें दिखाए गए आम IV परिणामों के समान हैं। सभी जेल छवियों एक 520 एनएम लेजर और एक 10 मिनट जोखिम के साथ एक जेल imager का उपयोग कर कल्पना की गई. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: आम टैग आरएनए कुल आरएनए की उपस्थिति में पता लगाया जा सकता है, TO1-बायोटिन धुंधला का उपयोग कर. 8% denaturing जैल कुल आरएनए के 100 एनजी के साथ भरी हुई थी और 30 मिनट के लिए चला रहे थे. बाएं जेल एसजी और TO1-बायोटिन के साथ सही पैनल के साथ दाग ासाकीये की गई थी। दोनों पैनलों के लिए, लेन लेबल ई pEcoli-T1 के 100 एनजी (कोई आम टैग) के साथ भरी हुई थी और गलियों लेबल एम pEcoli-RNA मैंगो (6S आरएनए एक मैं गोगो के साथ टैग) के 100 एनजी के साथ भरी हुई थी। TO1-Biotin दाग जेल छवियों एक 520 एनएम लेजर और एक 10 मिनट जोखिम के साथ एक imager का उपयोग कर कल्पना की गई. एसजी सना हुआ जेल छवियों एक 460 एनएम लेजर और एक 10 मिनट जोखिम का उपयोग कर एक जेल छविकार का उपयोग कर कल्पना की गई. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रतिशत GEL VOLUME
20 एमएल 30 एमएल 50 एमएल
5% ए 4 6 10
बी 14 21 35
सी २ 3 5
6% ए 4.8 7.2 12
बी 13.2 19.8 33
सी २ 3 5
8% ए 6.4 9.6 16
बी 11.6 17.4 29
सी २ 3 5
10% ए 8 12 20
बी 10 15 25
सी २ 3 5
12% ए 9.6 14.4 24
बी 8.4 12.6 21
सी २ 3 5
15% ए 12 18 30
बी 6 9 15
सी २ 3 5
20% ए 16 24 40
बी २ 3 5
सी २ 3 5
ए पी एस (जेडएल) 48 72 १२०
TEMED (जेडएल) 20 30 50

तालिका 1: Denaturing पृष्ठ जेल कास्टिंग तालिका. A ] हल A, ठ ] हल ठ, ब् र् हल C.

डेनिंग जेल % बी बी ($मोबिलिटी nt) XC (एनटी में $मोबिलिटी)
5 35 130
6 26 106
8 19 70-80
10 12 55
20 8 28
23 5-6

तालिका 2: ब्रोमोफेनोल ब्लू (बीबी) और xylene cyanol (XC) जेल की अनुमानित जेल mobilities polyacrylamide denaturing जैल में रंगों लोड हो रहा है.

प्रतिशत GEL VOLUME
20 एमएल 30 एमएल 50 एमएल
5% 1X TBE 16.5 24.75 41.25
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 2.5 3.75 6.25
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
6% 1X TBE 16 24 40
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 3 4.5 7.5
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
8% 1X TBE 15 22.5 37.5
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 4 6 10
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
10% 1X TBE 14 21 35
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 5 7.5 12.5
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
12% 1X TBE 13 19.5 32.5
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 6 9 15
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
15% 1X TBE 11.5 17.25 28.75
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 7.5 11.25 18.75
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
20% 1X TBE 9 13.5 22.5
40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide 10 15 25
ग्लिसरोल 1 1.5 2.5
ए पी एस (जेडएल) 48 72 १२०
TEMED (जेडएल) 20 30 50

तालिका 3: मूल पृष्ठ जेल कास्टिंग तालिका।

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Discussion

मैंगो फ्लोरोसेंट टैग का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक एकल टैग कई मायनों में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन एप्टीमरों की उच्च चमक और आत्मीयता उन्हें न केवल सेल दृश्य2 में बल्कि इन विट्रो आरएनए या आरएनपी शुद्धि4के लिए भी उपयोगी बनाती है . इसलिए, जेल इमेजिंग एक सीधा तरीका में मैंगो टैग की बहुमुखी प्रतिभा फैली हुई है. मैंगो जेल इमेजिंग संवेदनशीलता एक उत्तरी धब्बा की तुलना में थोड़ा कम है14 लेकिन आसानी से आरएनए नमूना के 60-120 fmol का पता लगा सकते हैं, लंबी और थकाऊ झिल्ली हस्तांतरण और कदम की जांच की जरूरत के बिना. यह जेल15में छोटे RNAs के लिए पहले पाया संकरीकरण आधारित जांच दक्षता के बराबर है. जबकि अन्य fluorogenic aptamer तरीके-विशेष रूप से, आरएनए पालक अधिक से अधिक संवेदनशीलता और विशिष्टता9है, कोई भी वर्तमान में एक साथ उच्च चमक और आम aptamer प्रणाली है, जो एक एकल आरएनए टैग की अनुमति देता है की समानता है सेलुलर इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया, RNP शुद्धि, और अब जेल इमेजिंग.

इस जेल धुंधला प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. आरएनए समाधान के साथ काम करते समय, समाधान बाँझ फ़िल्टर किया जाना चाहिए, और एकल उपयोग प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग किया जाना चाहिए. Catuion, परिसरों या आरएनए संरचनाओं के रूप में देशी जैल चल रहा है आसानी से विकृत किया जा सकता है अगर जेल के लिए बिजली का स्तर बहुत अधिक है और जेल हीटिंग में परिणाम. सुनिश्चित करें कि किसी भी इस्तेमाल कांच के बर्तन साफ है और RNases के साथ दूषित नहीं है. इसके अतिरिक्त, हमेशा सावधान रहना जब स्थानांतरित करने और जैल उठा के रूप में वे नाजुक हैं और टूटना करने के लिए प्रवण हो सकता है.

TO1-बायोटिन दाग तेजी से जैल प्रवेश, लेकिन यहाँ प्रस्तुत डेटा भी संकेत मिलता है कि मैंगो चतुर्थ तह, विशेष रूप से, दर सीमित किया जा सकता है (चित्र 2 और चित्र 3). प्रोटोकॉल अनुभाग में कहा गया शर्तों का उपयोग करते हुए, हम denaturing जैल में परिमाण के दो आदेश पर सभी चार aptamers के लिए लॉग रेखीय व्यवहार मनाया, परिमाणीकरण के लिए उपयोगी विधि बनाने (चित्र 4C,डी). चूंकि इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए छोटे मैंगो aptamers आसानी से जेल मैट्रिक्स से बाहर फैलाना, हम मात्रा अब आरएनए निर्माण के लिए सुधार करने की उम्मीद है.

मैंगो टैग जेल इमेजिंग पद्धति यहाँ का प्रदर्शन मजबूत है और बस संवेदनशीलता और विशिष्टता के मामले में बढ़ाया जा करने में सक्षम होने की उम्मीद है. मैंगो मैं, द्वितीय, और तृतीय मज़बूती से गुना, जबकि मैंगो चतुर्थ नहीं करता है. हालांकि हम destaining प्रोटोकॉल का पता लगाया नहीं है, हम आशा करते हैं कि इस तरह के एक दृष्टिकोण भी बस विशिष्टता में सुधार कर सकता है. जबकि इस काम के दायरे से परे, फ्लोरोसेंट और बायोटिन टैग आम टैग आरएनए को सम्मानित किया जब TO1-बायोटिन फ्लोरोफोर का उपयोग कर अत्यधिक जेल विश्लेषण और शुद्धि को कारगर बनाने की संभावना प्रतीत होता है. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध माध्यमिक biotin-लेबलिंग तकनीक, उदाहरण के लिए, आगे इस सरल आरएनए मैंगो-टैगिंग प्रणाली का पता लगाने की सीमा को बढ़ाने के लिए वादा करता हूँ. इसी तरह, यह संभव प्रतीत होता है कि देशी मैंगो टैग आरएनए प्रोटीन परिसरों एक जेल से eluted किया जा सकता है और streptavidin चुंबकीय मोती का उपयोग कर बरामद इतनी के रूप में eluted आरएनए परिसर पर कब्जा करने के लिए. यह आगे ब्याज की आरएनए के लिए एक आम टैग जोड़ने के सरल समीचीन द्वारा जैविक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए और आरएनए परिसरों की नियमित शुद्धि को सरल होगा.

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Disclosures

एक पेटेंट मैंगो फ्लोरोजेनिक प्रणाली पर लंबित है.

Acknowledgments

लेखकों ने अपनी तकनीकी सहायता के लिए रज़वान कोजोकारू और अमीर अबोलाहज़ादेह और लीना डोल्गोशेएना को पांडुलिपि के सबूत के लिए धन्यवाद दिया। इस परियोजना के लिए कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) द्वारा पी.जे.यू.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels LabRepCo 11956042
101-1000 µL  tips Fisher 02-707-511
20-200 µL low retention  tips Fisher Scientific 02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) Bioreagents BP1406-1 Acute toxicity
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) Fisher BP1408-1 Acute toxicity
Agar Anachemia 02116-380
Aluminium backed TLC plate Sigma-Aldrich 1164840001
Amersham Imager 600 GE Healthcare Lifesciences 29083461
Ammonium Persulfate Biorad 161-0700 Harmful
BL21 cells NEB C2527H
Boric Acid ACP B-2940
Bromophenol Blue sodium salt Sigma B8026-25G
Chloloform ACP C3300
Dithiothreitol Sigma Aldrich Alcohols D0632-5G
DNase I ThermoFisher EN0525
EDTA Disodium Salt ACP E-4320
Ethanol Commerial  P016EAAN
Flat Gel Loading tips Costar CS004854
Formamide 99% Alfa Aesar A11076
Gel apparatus set with spacers and combs LabRepCo 41077017
Glass Dish with Plastic lid Pyrex 1122963 Should be large enough to fit your gel piece
Glycerol Anachemia 43567-540
HCl Anachemia 464140468
ImageQuanTL GE Healthcare Lifesciences 29000605
IPTG Invitrogen 15529-019
KCl ACP P-2940
MgCl2 Caledron 4903-01
MgSO4 Sigma-Aldrich M3409
NaCl ACP S-2830
NaOH BDH BDH9292
Orbital Rotator Lab-Line
Phenol Invitrogen 15513-039
Round Gel Loading tips Costar CS004853
Sodium Phosphate dibasic Caledron 8120-1
Sodium Phosphate monobasic Caledron 8180-01
SYBRGold ThermoFisher S11494
T7 RNA Polymerase ABM E041
TEMED Sigma-Aldrich T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore ABM G955
Tris Base Fisher BP152-500
Tryptone Fisher BP1421-500
Tween-20 Sigma P9496-100
Urea Fisher U15-3
Xylene Cyanol Sigma X4126-10G
Yeast Extract Bioshop YEX401.500

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References

  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

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जैव रसायन अंक 148 आरएनए मैंगो फ्लोरोसेंट डेनेरिंग जैल देशी जैल जेल धुंधला पता लगाने की विधि पृष्ठ
पॉलीऐक्रिलमाइड जेल्स में एक पोस्टस्टेनिंग विधि के माध्यम से आम-टैग किए गए आरएनए का फ्लोरोसेंट विजुअलाइजेशन
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Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. … More

Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. J. Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method. J. Vis. Exp. (148), e59112, doi:10.3791/59112 (2019).

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