Summary
여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.
Abstract
네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔은 리보뉴클레오프로테인(RNP) 복합 이동성을 특성화하고 RNA 크기를 측정하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 많은 젤 이미징 기술이 비특이적 얼룩 또는 고가의 형광공 프로브를 사용하므로 민감하고 차별적이며 경제적인 젤 이미징 방법론이 매우 바람직합니다. RNA 망고 코어 서열은 임의RNA 줄기에 의해 폐쇄될 때, 관심 있는 RNA에 간단하고 저렴하게 추가될 수 있는 작은(19-22 nt) 서열 모티프이다. 이 망고 꼬리표는 TO1-Biotin에게 불린 티아졸 오렌지 형광공 리간드에 높은 친화력 및 특이성과 결합합니다, 결합시 수천 배 더 형광이 됩니다. 여기서 우리는 망고 I, II, III 및 IV가 고감도를 가진 겔에서 RNA를 구체적으로 이미지화하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 네이티브 겔에서 RNA의 62.5 fmol과 변성 겔에서 RNA의 125 fmol만큼 적은 30 분 동안 칼륨 및 20 nM TO1-비오틴을 포함하는 이미징 버퍼에 겔을 담가 검출 할 수 있습니다. 우리는 총 세균 RNA의 복잡한 혼합물의 맥락에서 망고 태그가 달린 6S 세균 RNA를 이미징함으로써 망고 태그가 지정된 시스템의 특이성을 입증합니다.
Introduction
망고는 티아졸 오렌지(TO1-Biotin, 도 1A)의 단순 유도체에 단단히 결합하는 4개의 작은 형광 RNA aptamers 세트로 구성된 RNA태깅 시스템(TO1-Biotin, 도 1A)1,2,3 . 결합시, 이 리간드의 형광은 특정 압타머에 따라 1,000-4,000배 증가한다. 망고 III에 대한 망고 시스템의 높은 밝기는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 초과, RNA 망고 aptamers의 나노 몰 바인딩 친화도와 결합, 그것은 이미징 및 RNA의 정제 모두에 사용할 수 있습니다 단지2,4.
망고 I 5, II6및 III7의 X선 구조는 고분해능으로 결정되었으며, 세 압타머 는 모두 RNA 사중 플렉스를 사용하여 TO1-Biotin을 결합합니다 (도1B-D). 세 압타머의 컴팩트 코어는 컴팩트 어댑터 모티프를 통해 외부 RNA 서열로부터 분리됩니다. 망고 I 및 II 둘 다 임의의 RNA 양면에 그들의 망고 코어를 연결하는 유연한 GNRA 같이 루프 어댑터를 이용합니다 (그림1B,C). 대조적으로, 망고 III는 망고 IV의 구조가 현재 알려져 있지 않은 동안, 임의의 RNA 나선 (그림1D,보라색 잔류물)에 코어를 연결하는 단단한 트리플렉스 모티프를 사용합니다. 이들 각 aptamers의 리간드 결합 코어는 이러한 헬리컬 어댑터에 의해 외부 RNA 서열로부터 분리됨에 따라, 그들은 모두 단순히 다양한 RNA에 통합될 수 있는 것으로 보인다. 세균6S 조절 RNA(망고 I), 효모 스플리세오좀(망고 I) 및 인간 5S RNA, U6 RNA 및 C/D scaRNA(망고 II 및 IV)의 성분이 모두 이 방식으로 성공적으로 태그가 지정되어 2,8,많은 것을 시사합니다. 생물학적 RNA는 RNA 망고 압타머 시스템을 사용하여 태그가 지정될 수 있다.
변성 및 네이티브 젤은 일반적으로 RNA를 연구하는 데 사용됩니다. 치수화 겔은 종종 RNA 크기 또는 RNA 처리를 판단하는 데 사용되지만, 전형적으로, 북부 블롯의 경우, 예를 들어, 이미지를 생성하기 위해 몇 가지 느리고 순차적인 단계가 필요하다. RNA 시금치 및 브로콜리와 같은 다른 RNA 형광 압타머는 젤 이미징9에 성공적으로 사용되었지만 현재까지 는 망고 시스템의 높은 밝기와 친화성을 가지고 있지 않으며 상당한 관심을 가지고 있습니다. 망고의 젤 이미징 능력을 조사하기 위해. 이 연구에서는, 우리는 RNA 망고 시스템이 TO1-Biotin의 여기 그리고 방출 파장 (각각 510 nm 및 535 nm)이 대부분의 형광에 일반적인 eGFP 채널에 있는 화상 진찰을 위해 적당하기 때문에, 단순히 젤 화상 진찰에 확장될 수 있었다는 것을 궁금했습니다 겔 스캐닝 계측.
여기에 제시된 포스트 겔 염색 프로토콜은 망고 태그가 달린 RNA 분자를 네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에서 특이하게 검출하는 신속한 방법을 제공한다. 이 염색 방법은 칼륨과 TO1-비오틴을 포함하는 완충제에 젤을 담그는 것을 포함합니다. RNA 망고 압태머는 G-사중플렉스 기반이며 칼륨은 이러한 구조를 안정화하는 데 필요하다. 최소한의 망고 인코딩 DNA 템플릿에서 전사 된 RNA를 사용하여 (프로토콜 섹션 참조), 우리는 간단하고 염색 프로토콜을 사용하여 네이티브 젤에서 RNA의 62.5 fmol과 RNA의 125 fmol을 간단하게 염색하여 간단하게 검출 할 수 있습니다. 일반적인 비특이적 핵산 얼룩과는 대조적으로(본명으로부터 SG라고 하는 물질 표참조), 우리는 총 태그가 없는 RNA의 고농도가 샘플에 존재하는 경우에도 망고 태그가 지정된 RNA를 명확하게 식별할 수 있다.
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Protocol
1. 시약의 준비
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TO1-비오틴 포스트염색액(젤 염색용액)
- 1 M Na2 HPO 4의 1M의 342 mL 및 1 M NaH2 PO 4의 158 mL을 추가하여25°C에서 pH 7.2에서 1M 인산염 완충액을 확인하였다. 적절한 인산염 용액을 추가하여 50 mM에서 pH를 7.2로 조정합니다. 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 필터를 사용하여 용액을 실온에서 플라스틱 용기에 보관하십시오.
- 다음과 같이 5x 젤 염색 용액(TO1-Biotin 제외)을 준비합니다. ddH 2O의 247.5 mL, 1M KCl의 700 mL, 1 M 인산완충제(pH 7.2) 50 mL, 그리고 2.5 mL의 트웬 20을 혼합하여 1L 용액을 구성한다. 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 필터를 플라스틱 용기에 보관하십시오. 실온에서 보관할 수 있습니다.
참고: MgCl2는 잠재적으로 RNA 복합체를 안정화시킬 수 있으므로 필요한 경우 이 솔루션에 추가할 수 있습니다. 이것은 형광 신호 2에 적당한 영향을미칠 것입니다. - 1.1.2 단계에서 5x 젤 염색 용액을 사용하여 1x 젤 염색 용액을 만들고 사용하기 직전에 TO1-Biotin 불소 불소 (재료 표참조)로 보충하여 최종 농도20 nM으로 보충하십시오. 예를 들어, 탈이온수 80 mL에 5x 젤 염색 용액 20 mL을 추가하여 1x 젤 염색 용액 100 mL을 만들고 1 mMTO1-Biotin 스톡 2 μL을 추가합니다(디메틸포마미드로 제조).
참고: 500 nm에서 TO1-비오틴 염료의 소멸 계수는 63,000 M-1~cm-1이며, 염색 용액1에서측정된다.
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변성 페이지 (2 x 변성 젤 로딩 솔루션 및 용액 A, B, C, 황산 암모늄, 및 테트라메틸레틸렌디아민)
- 포르마미드 40 mL, 0.5 mm 의 0.5 ml 의 0.5 ml (EDTA, pH 8.0) 및 9.5 mL ddH2O를 혼합하여 2x 변성 겔 로딩 용액의 50 mL을 준비합니다. 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다. 로딩 염료는 형광화상진상구를 모호하게 할 수 있으므로 이 솔루션에 첨가되지 않습니다.
- 다음과 같이 2x 변성 겔 로딩 염료를 준비합니다. RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드를 정화할 때, 브로모페놀 블루(BB)와 0.5 mL의 브로모페놀 블루(BB)와 0.5 mL의 2.5%(w/v) 자일렌 시안놀(XC)을 단계 1.2.1에 기재한 용액에 추가하고, 9.5mL 대신 ddH2O의 8.5 mL를 추가한다. 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다.
- 200.2 g의 요소(분유 중량: 60.06 g/mol)를 계량하고 40% 19:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌네비사클라미드의 312.5 mL에 추가하여 용액 A의 100 mL을 준비합니다. 용해 될 때까지 최대 속도로 자기 교반 막대로 저어 (약 3 시간) ddH2O.를 사용하여 500 mL에 용액을 구성하십시오. 깨끗한 플라스틱 제품에 4 °C에서 보관하십시오.
- 400.4 g의 우레아를 계량하여 용액 B의 1 L을 준비하고 ddH2O로 1 L에 대한 용액을 구성; 우레아가 녹을 때까지 저어줍니다. 용액 B는 실온에서 보관할 수 있습니다.
- 다음과 같이 솔루션 C(10x 트리스-보레이트-EDTA[TBE])를 준비합니다. 트리스 베이스 432g과 붕산 220g의 무게를 측정하고, 8(여과)의 pH로 0.5M EDTA의 160mL를 추가하고 ddH2O로 4L에 대한 용액을 만들어 10x TBE의 4L을 준비합니다. 이 버퍼의 큰 주식은 젤 실행 버퍼로도 사용되기 때문에 만들어집니다.
- 10% 황산암모늄(APS)을 4°C에서 ddH2O. 저장소의 총 부피10 mL로 APS 1 g을 용해시킴으로써 준비한다.
- 테트라메틸레틸렌디아민(TEMED)을 편리하게 보관하세요. APS 용액과 함께 4°C에서 보관하십시오.
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네이티브 페이지(2x 네이티브 젤 로딩 솔루션)
- 100% 글리세롤 25 mL, 5x 젤 염색 용액 10 mL, ddH2O 15 mL을 혼합하여 50 mL의 2x 네이티브 젤 로딩 용액을 50 mL를 준비하여 50 mL로 용액을 구성합니다.
참고 : 변성 젤 섹션에서와 같이, 로딩 염료는이 주식에 추가 될 수 있지만, 그 추가는 잠재적으로 젤의 형광 신호를 모호하게 할 수 있으므로 피해야한다.
- 100% 글리세롤 25 mL, 5x 젤 염색 용액 10 mL, ddH2O 15 mL을 혼합하여 50 mL의 2x 네이티브 젤 로딩 용액을 50 mL를 준비하여 50 mL로 용액을 구성합니다.
2. 변성 젤의 준비 및 적재
- 표1을 따라 적절한 비율로 변성 겔을 준비한다. 특정 겔 주조 시스템을 고려; 30 mL 젤은 일반적으로 사용됩니다. 적절한 겔 백분율은 표 2를사용하여 추정할 수 있습니다 : BB 및 XC 염료가 관심 있는 RNA보다 각각 더 빠르고 느린 운동성을 가지는 폴리아크릴아미드 백분율을 선택하여 관련 크기에서 높은 대역 분리를 보장합니다. 범위.
- 표 1에 따라 액약 A, B 및 C를 혼합하고 겔을 붓기 직전에 APS 및 TEMED를 첨가합니다. 깨끗한 플라스틱 제품에 솔루션을 잘 섞는다.
- 모든 성분이 꼼꼼하게 깨끗한지 확인 한 후 적절한 젤 주조 장치에 젤 용액을 붓습니다. 젤이 부을 때 젤이 약간 기울어지도록 장치의 한쪽면을 들어 올려 젤 자체에 끼워지는 기포를 피하십시오.
- 원하는 빗을 삽입하고 중합 (약 30 분)에 둡니다. 겔 웰 주위의 굴절 지수의 변화를 면밀히 관찰하여 중합을 관찰합니다. 1x 용액 C (1x TBE)를 사용하여 젤 탱크를 만들고 조심스럽게 빗을 제거하십시오. 주사기를 사용하여 시료 로딩 직전에 우물을 흡인합니다.
- 다음과 같이 변성 샘플을 준비합니다. 관심 있는 RNA 샘플에 2x 변성 겔 로딩 용액을 추가하여 열순환기 또는 수조를 사용하여 95°C에서 변성 겔 로딩 용액을 1x 및 열 변성으로 만듭니다.
- 샘플을 로딩하기 전에 터치가 식을 때까지 몇 분 간 공기를 식힙니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에 층을 겹쳐서 샘플을 로드합니다.
참고 : 둥근 팁은 1mm 두께 이상의 젤에 사용할 수 있습니다. 얇은 젤에 플랫 팁을 사용하십시오. - 실온에서 변성 젤을 실행합니다. 젤 시스템의 유리 판이 깨지지 않도록 와트량이 충분히 낮습니까?
참고 : 우리의 실험실에서, 20cm x 16cm 플레이트에 대한 28 W는이 목적을 위해 충분했다.
3. 네이티브 젤의 준비 및 로딩
- 표3을 참조하여 적절한 비율로 네이티브 젤을 준비합니다. 특정 젤 주조 시스템을 고려, 하지만 명심 30 mL 젤 일반적으로 사용 됩니다. 표3에 따라 1x TBE, 40% 29:1 아크릴아미드:N, N'-메틸렌네비사크릴라미드 및 글리세롤의 용액을 혼합하고, 젤을 붓기 직전에 APS와 TEMED를 첨가합니다. 단계 2.3 및 2.4에 설명된 대로 진행합니다.
- 관심 있는 RNA 샘플에 2x 네이티브 겔 로딩 솔루션을 추가하여 네이티브 샘플을 준비하여 용액을 1x로 만들고 완전한 RNA 폴딩을 보장하기 위해 겔을 실행하기 전에 100분 동안 실온에서 배양할 수 있도록 하십시오.
- 4°C 의 차가운 방에서 기본 젤을 실행하여 와트수만으로도 젤을 가열하지 않도록 합니다.
참고 : 우리의 실험실에서, 20cm x 16cm 플레이트에 대한 14 W는이 목적을 위해 충분했다.
4. 런오프 T7 전사에 의한 RNA 제제
참고: RNA 망고 구조의 유출 전사10에 사용되는 DNA 서열은 상업적으로 주문되었다. 이 방법에서, 전사되는 서열과 T7 프로모터의 역보체(RC)를 함유하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 T7 프로모터 상부 가닥 서열로 혼성화되고 이어서 시험관내에서 전사된다. 아래, 각 올리고뉴클레오티드에 대해, 망고 코어 서열의 RC는 대담하게 도시되고 T7 프로모터 영역의 RC는 기울임꼴로 도시된다. 일반 글꼴의 잔류물은 망고 코어가 제대로 접히도록 하는 데 필요한 임의의 상호 보완적인 헬리칼 영역에 해당합니다.
망고 I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC TT CGT TGC TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT 개그 TCG TAT TAA AG
T7 상단 가닥: CTT TAA TAC GAC TCA CTA 태그 G
- DNA 올리고뉴클레오티드의 준비 젤 정제
- 0.2 μmol 스케일 DNA 합성을 위해, ddH2O의 100 μL 및 2x 변성 로딩 염료의 100 μL에서 보호되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드를 다시 중단한다(단계 1.2.2로부터). 이 때, 1.2.2단계에서와 동일한 농도로 로딩 용액 내의 겔 로딩 염료를 포함하는 것이 바람직하다.
- 적절한 폴리아크릴아미드 백분율의 50 mL 예비 척도 변성 겔을 이용하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 정제하는; 표 2를 사용하여 젤 백분율을 선택합니다. 예를 들어, 50 nt 서열에 대해 8% 겔을 사용한다. 이상적으로, 브로모페놀 블루는 올리고뉴클레오티드보다 더 빨리 실행되어야 하며, 자일렌 시안올은 느리게 실행되어야 한다.
참고 : 우리의 실험실에서, 이러한 젤은 두께 1.5mm의 주조 스페이서와 2-2.5 cm 폭의 우물과 젤 로딩 빗을 사용하여 캐스팅되었다. - 단계 2.4-2.7에 기재된 바와 같이, 준비 겔 당 4.1.2단계에서 제조된 DNA 올리고뉴클레오티드 액의 100 μL을 로드한다.
- 조심스럽게 젤의 외부를 건조 유리 판을 제거하고, 플라스틱 랩에 젤의 양쪽을 커버. 형광 이미징 스크린(불소로 함침된 알루미늄 지지 얇은 층 크로마토그래피 플레이트는 경제적인 해결책)에 놓고 단파장 UV 핸드 헬드 램프를 사용하여 UV 섀도우로 DNA 밴드를 시각화합니다.
- DNA 합성이 고품질인 경우 선명하고 잘 정의된 그림자를 관찰해야 합니다. 영구 마커를 사용하여 플라스틱 랩에 밴드를 표시합니다.
참고: 자외선으로부터 피부와 눈을 보호하고 노출을 짧게 유지하여 핵산 시료를 손상시키지 않도록 하십시오. - 깨끗한 유리 판에 젤을 놓고, 표시된 밴드를 조심스럽게 잘라내고 각 겔 조각을 300 μL의 400 μL에 놓습니다. 실온에서 회전을 사용하여 밤새 DNA를 용해시다.
- 깨끗한 원심분리기 튜브에서 용리액을 회수하고 2.5 상당의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시합니다. 소용돌이를 잘 하고 튜브를 -20°C에서 30분 동안 놓는다.
- 4 °C에서 30 분 동안 156,000 x g에서 벤치 상부 원심 분리기에 샘플을 펠렛. 조심스럽게 상류를 제거하고 ddH2O. 분광광도계를 사용하여 DNA 올리고뉴클레오티드 농도를 정확하게 결정하십시오. 샘플을 -20°C에서 편리하게 10 μM 스톡으로 보관하십시오.
- RNA 샘플의 전사 및 젤 정제
- 40 mM의 최종 농도로 구성된 액체 NTP 주식을 혼합하여 5x 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 주식을 준비 (GTP, 11,400 M-1~cm-1),25 mMSM 사이티딘 트리포스페이트 (CTP, 7,600 M-1~1 cm-1),25mM 아데노신 삼인산 (ATP, 5,000 M-1~cm-1),및 10 mM 우리딘 트리포스페이트 (UTP, 10,000 M-1~cm-1); 260 nm의 모든 소멸 계수.
참고 : 액체 또는 분말 주식은 상업적으로 얻을 수 있습니다. 분말에서 1 차 주식을 준비하는 경우, 조심스럽게 1 M NaOH를 사용하여, 7.9의 최종 pH로 pH를 조정합니다. 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 육수를 알리쿼트하고 -20°C에 보관한다. - 10x T7 전사 완충제 스톡 100 mL을 1M Tris-HCl의 25.6 mL, 1 M Tris-HCl의 14.4mL, 1 M MgCl 2의 26 mL, 10% 트리톤 X-100의 10 mL, 및 0.637 g의 스페르미딘을 혼합하여 준비한다. ddH2O를 추가하여 100 mL의 최종 볼륨에 주식을 구성합니다.
참고: 1x 용액의 7.9의 최종 pH는 교정된 pH 미터를 사용하여 확인되어야 합니다. 10x는 멸균 여과되어 -20°C에서 적당한 크기의 aliquots에 보관해야 합니다. - 다음과 같이 전사를 수행합니다.
- 다음 시약을 추가하여 10x T7 전사 완충제 스톡 및 ddH2O(단계 4.2.2부터), 10mMMM의 디티오트레이톨(DTT), 1 μM T7 상부 가닥 서열을 사용하여 1x T7 전사 완충제의 최종 농도를 구성한다(섹션 4 참고 서열), 1 μM 겔 정제 망고 DNA 서열 (단계 2.1), 및 T7 RNA 폴리머라제 효소 (1 U/μL).
- 소용돌이, 스핀다운, 용액을 37°C에서 2시간 동안 또는 흐리게 될 때까지 배양하고 튜브 의 바닥에 백색 침전물 형태가 형성된다. 50 μL 전사는 겔 정제 후 ~ 50 μM RNA의 50 μL을 초래한다. 동일한 부피의 2배 변성 염료를 첨가하고 젤 정제가 준비될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
- 겔-DNA에 대한 RNA 샘플을 치대체하는 4.1.2\u20124.1.8 단계에 의해 DNA 올리고뉴클레오티드 겔 정제 부에 기재된 바와 같이 생성된 RNA를 정제한다.
참고: RNA는 RNase 분해에 매우 민감하므로 모든 단계에서 장갑과 깨끗한 실험실 코트를 항상 착용하십시오. 모든 시료를 RNase 오염으로부터 보호하기 위해 일회용 플라스틱 제품에 준비및 보관하고 사용하기 전에 뜨거운 비누와 물로 조심스럽게 유리 판을 세척하고 ddH 2O로 철저히 헹구고 유리 제품을 건조시고 유리 제품을 건조시고 스퀴즈 병에서 적용 된 에탄올의 도움. - 최종 RNA 샘플의 1 μL을 사용하고 액적 기반 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 결정합니다. 가장 가까운 이웃 방법에 의해 결정된 소멸 계수를 사용하여, RNA 농도를 계산하고 편의를 위해 ddH2O로 시료 농도를 10 μM으로 조정한다. RNA 샘플을 -20°C에 저장합니다.
- 40 mM의 최종 농도로 구성된 액체 NTP 주식을 혼합하여 5x 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 주식을 준비 (GTP, 11,400 M-1~cm-1),25 mMSM 사이티딘 트리포스페이트 (CTP, 7,600 M-1~1 cm-1),25mM 아데노신 삼인산 (ATP, 5,000 M-1~cm-1),및 10 mM 우리딘 트리포스페이트 (UTP, 10,000 M-1~cm-1); 260 nm의 모든 소멸 계수.
- 대장균 총 원유 핵산 추출
참고: 다음 프로토콜이 예입니다. 이 프로토콜은 대장균의플라스미드로부터 내인성 발현 된 망고 I-태그 6S RNA를 사용하며, 이 플라스미드로부터의 유도는 상세4.- 본 연구의 목적을 위해, pEcoli-RNA 망고 및 pEcoli-T1 플라스미드 둘 다에 대한 유도 된 세포의 500 mL을 준비하십시오 (세포는 1의 OD600nm에서 유도됩니다). 펠렛 세포를 사용하기 전에 -80°C에 보관하였다.
- 다음과 같이 RNA 추출을 수행합니다.
- 유도된 pEcoli 세포 펠릿의 0.5 mL를 취하고 평형 페놀 500 μL을 첨가합니다. 이어서, 시료를 소용돌이; 용액은 유백색이 될 것입니다. 최대 속도로 원심분리기를 2분 간 사용하여 레이어를 분리합니다.
- 약간 노란색이 될 상단 층을 추출하고 페놀, 원심 분리 및 총 5 배 (또는 불투명 한 흰색인 중간 층까지) 동일한 부피를 추가하여 4.3.2.1 단계를 반복하십시오.
- 페놀 추출 수성 부피를 클로로포름, 소용돌이, 원심분리기의 동일한 부피에 2분 동안 추가합니다.
- 수성 층을 추출하고 300 mM의 최종 농도에 NaCl을 추가합니다. 생성된 핵산을 2.5 등가의 에탄올, 와류, 스핀다운, 및 -20°C에서 30분 이상 침전시킴으로써 침전한다.
- 벤치 상부 원심분리기에서 15.6 x 1,000 x g에서 30분 동안 4°C에서 펠릿을 조심스럽게 제거하고 ddH2O의 100 μL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
- 참조된 프로토콜11에따라 이 절차에 DNase I 소화 단계를 추가하여 총 RNA를 얻었다.
참고 : 펠릿이 ddH2O에 완전히 용해 될 때까지 소용돌이.
5. 포스트 젤 염색
- 1.1.3단계의 레시피에 따라 1x 젤 염색 용액을 준비하고 젤에 편안하게 맞을 수 있을 만큼 넓은 깨끗한 유리 용기에 추가하십시오.
참고 : 스냅 맞춤 뚜껑이있는 Borosilicate 유리 용기는이 목적을 잘 제공합니다. - 용기에 충분한 1x 젤 염색 용액을 추가하여 젤이 용액으로 완전히 덮여 있고 궤도 회전자 위에 놓일 때 젤 의 상단에 액체가 슬로슈됩니다.
참고: 용기는 젤을 충분히 넣을 수 있을 만큼 커야 이동이 간수하고 용기에 충분한 버퍼가 있어 젤을 완전히 덮을 수 있습니다. - 네이티브 또는 치화 겔이 실행을 완료하면 (섹션 2 또는 3, 각각), 장치에서 젤을 제거하고 우물을 잘라. 분석의 후반부 방향에 대한 겔의 모서리를 제거하는 것이 유용할 수 있다.
- 5.2단계에서 제조된 1x겔 염색용액에 겔을 조심스럽게 옮김을 옮김.
참고: 젤은 깨지기 쉽고 깨지기 쉽기 때문에 젤을 옮길 때주의하십시오. 젤을 오염시키지 않도록 항상 염색 용기에 뚜껑을 보관하십시오. - 실온에서 30 분 동안 100rpm의 속도로 궤도 회전자위에 젤을 놓습니다.
참고: 젤이 다시 접히지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 RNA가 겔에서 확산되어 젤의 다른 부분을 라벨로 지정할 수 있습니다.
6. 젤에 있는 화상 진찰 망고 태그 RNA
- 이미징 버퍼를 신중하게 디펜더합니다. 젤을 물로 빠르게 헹구고 충분한 액체가 남아 있어 젤을 용기에 약간 이동상태로 유지합니다.
- 젤을 이미저에 조심스럽게 옮김을 옮김. 조심스럽게 젤의 측면을 집어 와 이미저 트레이에 배치하여 전송; 또는, 젤을 트레이에 천천히 부을 수 있다. 젤 아래에 거품이 없고 젤 아래에 여분의 액체가 없는지 확인하십시오. 겔 위에 압연된 파이펫은 여분의 액체를 제거하는 데 유용할 수 있습니다.
참고: 종이 타월을 사용하여 여분의 액체를 흡수하십시오. - 겔 이미지를 가지고, 여기 파장 510 nm와 방출 파장 535 nm 사이의 형광을 관찰 (예를 들어, 520 nm 파장 형광 설정에서 녹색 빛 은 이미저에). 설정이 기기에서 완전히 최적화되어 있는지 확인하고 사용된 기기의 지침을 주의 깊게 따르십시오.
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Representative Results
짧은 망고 태그RNA는 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 제조되었다. 변성 조건에서 형광이 젤에 있는 우레아의 존재 때문에 관찰하기 위하여 가장 어려울 것이라는 점을 가정하는, 우리는 먼저 핵산 denaturant로 작용하는 우레아에 망고 aptamers의 저항을 공부했습니다. 우리는 망고 aptamers가 대략 1 M (그림 2A)의 우레아농도까지 변성에 실질적으로 저항한다는 것을 것을을 발견했습니다. 변성 겔에 겔 염색 용액을 첨가하기 전에, 겔내의 우레아의 최종 농도는 6M. 이 농도를 1M로 감소시키기에 충분한 염색 용액을 첨가하면, 따라서, 4개의 압타머 모두에 대해 완전한 망고 형광을 보장하기에 최적이될 것이다. 실제로, 염색 프로토콜은 이 완전히 최적의 결과보다 적게 달성되었지만, 더 많은 염색 용액을 사용하거나 염색 중에 한 번 솔루션을 변경하는 간단한 편의에 의해 필요한 경우 이를 간단히 해결할 수 있습니다.
망고 태그RNA 구성이 변성 겔로 실행되면, 염색 시간은 3개의 상이한 망고 III 양을 8% 변성 겔로 로딩함으로써 최대겔 형광에 최적화되었다(도 2B). 시간 과정은 젤 염색 용액에 담근 5 분 후에 형광이 명확하게 보였다는 것을 밝혔습니다. 망고 III 구성물의 최대 형광은 염색의 20-40 분 후에 얻어졌으며, 그 후 본 연구에서 사용된 작은 RNA가 겔에서 확산되기 시작하여 형광신호의 손실을 초래했습니다 (그림 2B). 결과적으로, 네이티브 및 변성 겔은 각각 30 분 동안 염색되었습니다. 더 긴 RNA 구조물은 젤에서 확산하기 위하여 훨씬 적게 확률이 높을 것이기 때문에 더 긴 염색시간을 쉽게 견딜 수 있었습니다.
RNA 망고 aptamers의 일부는 다른 사람 보다 더 신속 하 게 접혀. 본 연구에 사용된 망고 압태머각각은 1.5M 우레아 및 100 nM TO1-비오틴 염료로 보충된 겔 완충액으로 배양하고 형광계를 사용하여 분석하였다. 망고 I, II 및 III는 10분 후에 완전히 접힌 반면 망고 IV는40분 후에만 실질적으로 접혀졌다(그림 3A). 우레아가 없는 경우, 접는 것이 예상한대로 훨씬 더 빨랐다(도 3B). 네이티브 젤 샘플을 완전히 접을 수 있도록, 우리는 네이티브 젤로 실행하기 전에 100 분 동안 샘플을 미리 인큐베이션했습니다. 실질적으로, 그림 3의 데이터는 사용된 망고 압타머에 따라 이 시간이 실질적으로 감소될 수 있음을 시사한다.
프로토콜이 RNA 망고 aptamer 형광을 검출하도록 최적화되면, 포스트스테인링 방법의 감도는 두 네이티브 겔 모두에서 망고 변이체 각각에 대해 결정되었다. 잘 접힌 RNA에 대응하는 단일 밴드는 네이티브 겔에서 4개의 망고각각에 대해 관찰되었다(도 4A). 직렬 희석시, 망고 II의 62.5 fmol만큼 적게 관찰 될 수 있었고, 망고 I, III 및 IV의 125 fmol은 쉽게 시각화되었습니다. 네이티브 겔의 정량화는 망고 I, II 및 IV가 망고 III(도 4B)보다 더 선형적인 방식으로행동하면서 약 1.5배 이상의 크기로 로그 선형이었다.
변성 겔의 결과는 네이티브 겔보다 약간 덜 민감했지만 더 선형적이었습니다. 망고 II 및 III의 125 fmol만큼 적게쉽게 검출되었다 (그림 4C). 흥미롭게도, 정량화(그림4D)는변성 겔이 로그 선형 또는 2배 크기임을 나타냈다. 우리는 RNA 주름이 젤 실행 과정 도중 부분적인 변성으로 아마 복종된 네이티브 젤과는 달리, 변성 젤에 있는 요소의 존재는 일단 에 배치되면 aptamers를 접는 더 균질한 쪽을 제공할 수 있다는 것을 가설을 세워. TO1-비오틴 염색 용액.
모든 겔 염색 방법론과 마찬가지로, 겔이 용기 내로 조심스럽게 전달되지 않거나 염색 기간 동안 회전 속도가 너무 높으면 겔이 다시그 자체로 접을 수 있습니다 (도 5A). 이것은 망고 꼬리표가 붙은 RNA 견본이 젤의 한 장소에서 다른 장소로 확산될 수 있습니다 그러나 실제로 쉽게 피할 수 있습니다. 네이티브 젤에서, 특히, 망고 IV의 경우, 우리는 불완전한 접이식이 아마도 부분 / 잘못 접힌 RNA 적합성에 대응하는 여러 밴드의 출현에서 나타날 수 있음을 관찰 (그림5B)짧은 접는 시간에서 유래. 네이티브 젤의 접이식 문제는 앞서 설명한 바와 같이 RNA 샘플을 적절하게 사전 인큐베이팅하고 차가운 방에서 네이티브 젤을 실행하여 피할 수 있습니다. RNA가 젤 내의 그 안에 있는 접는 변성 젤에서, 잘못 접는 것은 중요한 문제가 아니었습니다. 마지막으로, RNA가 없는 경우, 어느 겔 시스템에서도 배경 형광이 거의 관찰되지 않았다.
다음으로, RNA 망고 태그의 특이성은 박테리아에서 6S 조절 RNA를 과발현함으로써 연구되었다. 이 RNA는 이전에 망고 I (그림1E)4를 사용하여 태그되었습니다. 세균세포는 pEcoli-RNA 망고 플라스미드(henceforth M 플라스미드) 또는 pEcoli-T1 플라스미드를 음성 대조군으로 변형시켰다(이에 따라서 E 플라스미드). 형질전환된 세포는 1.0의 OD600까지 액체 리소제니 국물 배지에서 성장하였다. 배양부는 40분 동안 50 μM 이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드(IPTG)로 유도하였다. 세포는 15분 동안 6,000 x g에서 원심분리를 통해 수확하였다. 총 RNA 샘플을 에탄올 침전으로 농축한 다음 프로토콜에 따라 DNase I로 처리하여 DNA11을제거하였다. 사용하기 전에, RNA는 에탄올 강수량에 의해 집중되었다.
총 세균RNA는 8% 변성 겔(도 6)으로 실행되었고 SG13 또는 TO1-비오틴으로 염색하였다. SG 염색을 위해, 10 μL의 10,000x SG를 100 mL의 겔 버퍼에 첨가; 그렇지 않으면, 염색 프로토콜은 TO1-비오틴에 사용되는 것과 동일했다. 예상대로, 강한 SG 염색은 다수의 RNA에 대해 관찰되었지만, 리보좀(rRNA) 및 전사 RNA(tRNA)에대해 가장 두드러지게 관찰되었다(도 6, 좌측 패널). 망고 의존성 염색(M 차선)은 이러한 SG 염색 젤에서 볼 수 있었지만, 이 보편적인 얼룩을 사용하여 관찰된 복잡한 염색 패턴을 고려할 때 고유하게 식별될 수 없었습니다. 대조적으로, TO1-비오틴 스테인드 젤은 망고 의존적 밴드를 가장 눈에 띄는 밴드로 강조했습니다. 리보소말 RNA 밴드만이 6S 망고 의존 밴드와 경쟁하는 것으로 보입니다. 비특이적 염색 밴드의 숫자는 또한 관찰 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 망고 의존밴드는 다시 지배적이었고, rRNA 및 tRNA 밴드만을약한 경쟁경쟁자로 하였다(도 6, 우측 패널).
그림 1: 망고 압타머 시스템. (A) TO1-비오틴 불소. (B) 망고 I. (C) 망고 II. (D) 망고 III. 패널 B – D는 각 압타머의 보조 구조를 보여줍니다. P1은 임의의 줄기입니다. 망고 I및 II에서 발견되는 GNRA 유사 줄기 루프(여기 GAAA)는 빨간색으로 표시되며, 망고 III의 트리플렉스 모티프는 보라색으로 표시됩니다. (E) 망고 I. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 망고 압타머 형광과 최적의 염색 시간에 대한 우레아의 효과. (a) 50 nM RNA 망고 I (주황색 원), 망고 II (녹색 원), 망고 III (보라색 원), 망고 IV (파란색 원)를 사용하여 우레아 적정을 100 nM TO1-비오틴 염료와 함께 지시 된 우레아 농도에서. 샘플을 510 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장에서 형광을 판독하기 전에 40 분 동안 배양하였다. (B) 망고 III RNA를 8% 변성 겔로 적재하고 20 nM 최종 TO1-비오틴 염료를 함유하는 겔 용액으로 염색하였다. 각 표시된 시점마다, 망고 III RNA의 0.064, 0.32 및 1.6 pmol을 왼쪽에서 오른쪽으로 사용하였다. 겔 영상을 520 nm 레이저 및 10분 노출을 사용하여 형광 이미저로 시각화시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 요소의 존재 와 부재에서 망고 aptamers의 접이식 시간. (A) 1.5 M 우레아 및 100 nM TO1-비오틴의 존재에서, 형광 시간 과정은 각 RNA 망고 구조의 50 nM을 사용하여 수행하였다 (RNA 망고 I : 오렌지 점, 망고 II : 녹색 점, 망고 III : 보라색 점, 및 망고 IV : 파란색 점). (B) 패널 A와동일하며, 우레아가 없는 경우를 제외하고. 모든 시간 과정은 실온에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RNA 망고 구성을 가진 네이티브 및 변성 페이지의 형광 이미지. (A) 연속적으로 희석된 RNA 망고가 있는 8% 네이티브 젤. 레인 I, II, III, 및 IV는 각각 RNA 망고 I, II, III 및 IV의 8pmol 최종 수량을 각각 함유한다. 오른쪽 패널은 표시된 대로 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0.5 pmol, 0.25 pmol, 0.125 pmol 및 0.0625 pmol을 포함하는 두 가지 직렬 희석입니다. 레인 12에는 RNA가 포함되어 있지 않습니다. (B) 네이티브 겔의 3개의 복제본을 정량화한다(각각에 대해 도시된 평균의 표준 편차). (C) 패널 A에서와동일한 샘플을 가진 8% 변성 겔은, 변성 겔 로딩 용액이 네이티브 겔 로딩 용액 대신 사용되었다는 사실을 제외하고는. (D) 3개의 정량화된 변성 겔의 복제본(각각에 대해 도시된 평균의 표준 편차). 모든 겔 이미지는 520 nm 레이저및 10분 노출로 겔 이미저를 가시화시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 8% 네이티브 젤에 망고 IV의 최적이 아닌 젤 및 불완전한 접이식. (a) 망고 II에 대해 도 4에 도시된 종류의 직렬 희석이지만 염색 프로토콜 동안 겔 폴딩의 효과를 나타내고 있다. (B) 망고 IV 네이티브 겔 샘플은 겔 로딩 전에 네이티브 버퍼에서 충분히 오랫동안 접을 수 없었던 이중 대역을 나타낸다. 그렇지 않으면 이러한 결과는 그림 4A에표시된 망고 IV 결과와 유사합니다. 모든 겔 이미지는 520 nm 레이저와 10분 노출을 가진 젤 이미저를 사용하여 시각화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 망고 태그RNA는 TO1-Biotin 염색을 사용하여 총 RNA의 존재에서 검출될 수 있다. 8% 변성 겔을 총 RNA 100 ng로 적재하고 30분 동안 실행하였다. 좌측 겔은 SG와 TO1-비오틴으로 우측 패널로 염색시켰다. 두 패널 모두에 대해, E라고 표시된 레인은 100 ng의 pEcoli-T1(망고 태그 없음)으로 로드되었고 M이라고 표시된 레인은 100 ng의 pEcoli-RNA 망고(망고 I 태그로 태그가 지정된 6S RNA)로 로드되었습니다. TO1-비오틴 스테인드 겔 이미지는 520 nm 레이저와 10분 노출을 가진 이미저를 사용하여 시각화되었다. SG 염색겔 영상을 460 nm 레이저 및 10분 노출을 사용하여 겔 이미저를 사용하여 시각화시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 비율 | 젤 부피 | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5% | A. | 4개 | 6개 | 10개 |
| B | 14세 | 21세 | 35세 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 6% | A. | 4.8 | 7.2 | 12세 |
| B | 13.2 | 19.8 | 33세 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 8% | A. | 6.4 | 9.6 | 16세 |
| B | 11.6 | 17.4 | 29세 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 10% | A. | 8개 | 12세 | 20개 |
| B | 10개 | 15세 | 25개 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 12% | A. | 9.6 | 14.4 | 24세 |
| B | 8.4 | 12.6 | 21세 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 15% | A. | 12세 | 18세 | 30개 |
| B | 6개 | 9개 | 15세 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| 20% | A. | 16세 | 24세 | 40 |
| B | 2개 | 3개 | 5개 | |
| C | 2개 | 3개 | 5개 | |
| APS(μL) | 48세 | 72세 | 120개 | |
| TEMED (μL) | 20개 | 30개 | 50개 | |
표 1: 페이지 젤 주조 테이블 을 치명화. A = 솔루션 A, B = 솔루션 B, C = 솔루션 C.
| 변성 젤 % | BB (~ 이동성 nt) | XC (~ nt의 이동성) |
| 5개 | 35세 | 130명 |
| 6개 | 26세 | 106 |
| 8개 | 19세 | 70-80 |
| 10개 | 12세 | 55세 |
| 20개 | 8개 | 28세 |
| 23세 | 5-6 |
표 2: 폴리아크릴아미드 변성 겔에서 브로모페놀 블루(BB) 및 자일렌 시안놀(XC) 젤 로딩 염료의 근사겔 동원.
| 비율 | 젤 부피 | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5% | 1X베 | 16.5 | 24.75 | 41.25 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 2.5 | 3.75 | 6.25 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 6% | 1X베 | 16세 | 24세 | 40 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 3개 | 4.5 | 7.5 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 8% | 1X베 | 15세 | 22.5 | 37.5 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 4개 | 6개 | 10개 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 10% | 1X베 | 14세 | 21세 | 35세 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 5개 | 7.5 | 12.5 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 12% | 1X베 | 13세 | 19.5 | 32.5 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 6개 | 9개 | 15세 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 15% | 1X베 | 11.5 | 17.25 | 28.75 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 7.5 | 11.25 | 18.75 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| 20% | 1X베 | 9개 | 13.5 | 22.5 |
| 40% 29:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌비사릴라미드 | 10개 | 15세 | 25개 | |
| 글리세롤 | 1개 | 1.5 | 2.5 | |
| APS(μL) | 48세 | 72세 | 120개 | |
| TEMED (μL) | 20개 | 30개 | 50개 | |
표 3: 네이티브 PAGE 젤 주조 테이블.
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Discussion
망고 형광 태그의 중요한 장점은 단일 태그를 여러 가지 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이러한 aptamers의 높은 밝기와 친화력은 세포 시각화2뿐만 아니라 시험관 내 RNA 또는 RNP 정제4에도유용하게 만듭니다. 따라서 젤 이미징은 망고 태그의 다기능성을 간편하게 확장합니다. 망고 겔 화상 진찰 감도는 북부 얼룩14의 그것 보다는 약간 더 작습니다 그러나 RNA 견본의 60-120 fmol를 쉽게 검출할 수 있습니다, 길고 지루한 막 전송 및 탐사 단계를 필요로 하지 않고. 이는 겔15의작은 RNA에 대해 이전에 발견된 혼성화 기반 의 프로빙 효율과 비교할 수 있다. 다른 형광 aptamer 방법론 - 특히, RNA 시금치 - 더 큰 감도와 특이성을 가지고있지만9, 아무도 현재 동시에 단일 RNA 태그를 할 수있는 망고 aptamer 시스템의 높은 밝기와 친화력을 가지고 세포 화상 진찰, RNP 정화, 그리고 지금 젤 화상 진찰을 위해 이용됩니다.
이 젤 염색 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. RNA 솔루션으로 작업할 때는 용액을 멸균여되어야 하며 일회용 플라스틱 웨어를 사용해야 합니다. Catuion, 복합체 또는 RNA 구조로 네이티브 젤을 실행하는 것은 젤에 대한 전력 수준이 너무 높고 젤 가열을 초래하는 경우 쉽게 변성 될 수 있습니다. 사용된 유리 제품이 깨끗하고 RNases로 오염되지 않았는지 확인하십시오. 또한 젤을 옮기고 집어 들 때는 항상 조심해야 하며 깨지기 쉽고 파손되기 쉽기 때문에 주의하십시오.
TO1-Biotin 얼룩은 겔을 빠르게 침투하지만, 여기에 제시된 데이터는 망고 IV 접이식, 특히 속도 제한이 있을 수 있음을 나타낸다(도2 및 도3). 프로토콜 섹션에 명시된 조건을 사용하여, 우리는 변성 겔에서 크기의 두 순서를 통해 네 개의 aptamers 모두에 대한 로그 선형 동작을 관찰, 정량화에 유용한 방법을 만들기 (그림4C,D). 이 연구에 사용된 작은 망고 압태머가 젤 매트릭스에서 쉽게 확산되기 때문에, 우리는 더 긴 RNA 구성을 위해 정량이 개선될 것으로 기대합니다.
여기에서 입증된 망고 태그 젤 이미징 방법론은 견고하며 민감도 및 특이성 측면에서 간단히 확장될 수 있을 것으로 예상됩니다. 망고 IV하지 않는 동안 망고 I, II, 및 III는 안정적으로 접는다. 우리는 destaining 프로토콜을 탐구하지 않은 동안, 우리는 이러한 접근 방식이 단순히 특이성을 향상시킬 수 있다고 예상. 이 작업의 범위를 넘어서는 동안, TO1-비오틴 불소 불소를 사용할 때 망고 태그RNA에 수여된 형광 및 비오틴 태그는 겔 분석 및 정제를 더욱 간소화할 가능성이 높게 나타난다. 시판되는 이차 바이오틴 라벨링 기술은 예를 들어, 이 간단한 RNA 망고 태깅 시스템의 검출 한계를 더욱 강화할 것을 약속한다. 마찬가지로, 네이티브 망고 태그 RNA 단백질 복합체는 젤에서 용출 될 수 있으며 용출 RNA 복합체를 포착할 수 있도록 스트렙 타비딘 자기 구슬을 사용하여 회수 될 가능성이 나타납니다. 이것은 관심있는 RNA에 망고 꼬리표를 추가하는 간단한 편법에 의해 생물학적으로 중요한 RNA 및 RNA 복합체의 일상적인 정제를 더욱 단순화할 것입니다.
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Disclosures
망고 형광 시스템에 대한 특허출원 중입니다.
Acknowledgments
저자들은 라즈반 코조카루와 아미르 압돌라자데의 기술적 지원과 원고를 증명해 준 레나 돌고시나에게 감사를 표한다. 이 프로젝트에 대한 기금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 P.J.U.에 보조금을 운영함으로써 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
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