Summary
هنا نقدم طريقة حساسة وسريعة، والتمييز بعد جل تلطيخ لصورة RNAs الموسومة مع الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، وذلك باستخدام إما الأصلي أو التشويه البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (صفحة) المواد الهلامية. بعد تشغيل المواد الهلامية القياسية الصفحة، يمكن أن تكون ملطخة بسهولة RNA المانجو مع TO1-البيوتين ومن ثم تحليلها باستخدام القراء الفلورسنت المتاحة عادة.
Abstract
وتستخدم المواد الهلامية البولي أكريلاميد الأصلية والتشويهية بشكل روتيني لوصف حركية الريبونوكليوبروتين (RNP) المعقدة وقياس حجم الحمض النووي الريبي، على التوالي. كما العديد من تقنيات التصوير هلام استخدام البقع غير محددة أو تحقيقات الفلوروفور مكلفة، حساسة، والتمييز، ومنهجيات التصوير الهلام يُستحسن للغاية. إن تسلسلات الرنا مانجو الأساسية هي زخارف تسلسلية صغيرة (19-22 ن) يمكن أن تكون ببساطة وبتكلفة زهيدة ملحقة بالحمض النووي الريبي ذي الأهمية، عندما تكون مغلقة بواسطة جذع RNA تعسفي. هذه العلامات المانجو ربط مع تقارب عالية وخصوصية لالثيازول البرتقالي الفلورية صلة تسمى TO1-البيوتين، الذي يصبح آلاف المرات أكثر الفلورسنت على الربط. هنا نظهر أن المانجو الأول، الثاني والثالث، والرابع يمكن استخدامها لتصوير الحمض النووي الريبي على وجه التحديد في المواد الهلامية مع حساسية عالية. يمكن الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة عن طريق نقع المواد الهلامية في مخزن التصوير الذي يحتوي على البوتاسيوم و 20 نانوم TO1-البيوتين لمدة 30 دقيقة. نحن نبرهن على خصوصية نظام المانجو الموسومة من خلال تصوير RNA البكتيرية 6S المانجو الموسومة في سياق خليط معقد من مجموع الحمض النووي الريبي البكتيرية.
Introduction
المانجو هو نظام وسم الجيش الملكي النيبالي يتكون من مجموعة من أربعة aptamers RNA الفلورسنت الصغيرة التي تربط بإحكام (nanomolar ملزمة) إلى مشتقات بسيطة من الثيازول البرتقالي (TO1-البيوتين، الشكل 1A)1،2،3 . عند الربط، يتم زيادة الفلورسنت من هذا ليجاند 1000- إلى 4،000 أضعاف اعتمادا على aptamer محددة. السطوع عال من المانجو نظامة, أيّ ل مانجو [إييي] يتجاوز أنّ من يعزّز بروتين خضراء [فلورسنت] ([إجفب]), يضمّ مع ال [ننوملور] التصاق تقارب من ال [رنا] مانجو [أبتمرس], يسمح هو أن يكون استعملت على حدّ سواء في التصوير والتطهير من [رنا] مجمعات2,4.
وقد تم تحديد هياكلالأشعة السينية من المانجو الأول 5، II6،وIII7 إلى دقة عالية، وجميع aptamers الثلاثة تستخدم رباعية RNA لربط TO1-البيوتين (الشكل1B-D). يتم عزل النوى المدمجة من جميع aptamers الثلاثة من تسلسل الجيش الملكي النيبالي الخارجي عن طريق زخارف محول المدمجة. المانجو الأول والثاني على حد سواء الاستفادة من مرنة GNRA مثل حلقة محول لربط النوى المانجو إلى ثنائي الحمض النووي الريبي التعسفي (الشكل1B،C). وعلى النقيض من ذلك، يستخدم مانجو الثالث عزر ثلاثي جامد لربط جوهره بحلزونية RNA اعتباطية (الشكل1D، بقايا الأرجواني)، في حين أن بنية مانجو الرابع غير معروف حاليا. بما أنّ ال [ليغّد-لّس] لب من كلّ من هذا [أبتمرس] يكون فصلت من ال [رنا] خارجيّة تسلسل ب هذا محولات حلزونيّة, يبدو هو على الأرجح أنّ هم يستطيع كلّ كنت ببساطة أدمجت داخل تشكيل ال [رنا]. وقد تم وضع علامة على 6S البكتيرية التنظيمية RNA (مانجو الأول)، مكونات من spliceosome الخميرة (مانجو الأول)، و5S الإنسان الجيش الملكي النيبالي، U6 الجيش الملكي النيبالي، وscaRNA C / D (مانجو الثاني والرابع) كل بنجاح الموسومة في هذا الأزياء2،8، مما يشير إلى أن العديد من يمكن وضع علامات RNAs البيولوجية باستخدام نظام APTAMER المانجو RNA.
تستخدم عادة ً المواد الهلامية والطبيعية لدراسة RNAs. وغالبا ما تستخدم المواد الهلامية التحلل للحكم على حجم RNA أو معالجة الحمض النووي الريبي، ولكن عادة، في حالة وصمة عار الشمالية، على سبيل المثال، تتطلب عدة خطوات بطيئة ومتتابعة من أجل توليد صورة. في حين تم استخدام APTAMERs النابية الفلورية الأخرى، مثل السبانخ والقرنبيط RNA، بنجاح للهلام التصوير9، لا يوجد نظام aptamer الفلورية حتى الآن تمتلك سطوع عالية والتقارب من نظام المانجو، مما يجعلها ذات أهمية كبيرة للتحقيق في قدرات مانجو في التصوير بهلام. في هذه الدراسة، تساءلنا عما إذا كان نظام المانجو RNA يمكن أن تمتد ببساطة إلى التصوير هلام، كما الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات من TO1-البيوتين (510 نانومتر و 535 نانومتر، على التوالي) هي مناسبة للتصوير في قناة eGFP المشتركة لمعظم الفلورسنت هلام المسح الآلات.
يوفر بروتوكول تلطيخ ما بعد الجل المعروض هنا طريقة سريعة للكشف على وجه التحديد عن جزيئات الحمض النووي الريبي التي تحمل علامات المانجو في المواد الهلامية البولي أكريلاميد هلام البولي أكريلاميد الأصلي والتشويه (PAGE). هذه الطريقة تلطيخ ينطوي على نقع المواد الهلامية في العازلة التي تحتوي على البوتاسيوم وTO1-البيوتين. الحمض النووي الريبي المانجو aptamers هي G-رباعية أساس والبوتاسيوم مطلوب لتحقيق الاستقرار في هذه الهياكل. باستخدام RNA نسخت من الحد الأدنى من قوالب الحمض النووي ترميز المانجو (انظر قسم البروتوكول)، يمكننا ببساطة الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ مباشرة. على النقيض من البقع الحمضية النووية غير محددة المشتركة (انظر جدول المواد، المشار إليها SG من هنا)، يمكننا تحديد بوضوح MANGO-الموسومة الجيش الملكي النيبالي حتى عندما تركيزات عالية من مجموع RNA غير الموسومة موجودة في العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
-
TO1-البيوتين بعد البقع الحل (هلام تلطيخ الحل)
- جعل 1 L من 1 M الفوسفات العازلة في درجة الحموضة 7.2 عند 25 درجة مئوية عن طريق إضافة 342 مل من 1 M من Na2HPO4 و 158 مل من 1 م NaH2PO4. ضبط رقم الألف إلى 7.2 في 50 mM عن طريق إضافة حل الفوسفات المناسب. معقمة تصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكروم وتخزين الحل في البلاستيك في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 5X هلام تلطيخ الحل (دون TO1-البيوتين) على النحو التالي. تشكل 1 L الحل عن طريق خلط 247.5 مل من ddH2O، 700 مل من 1 KCl م، 50 مل من 1 M الفوسفات العازلة (حس 7.2)، و 2.5 مل من توين 20. معقمة تصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكروم وتخزين الحل في البلاستيك. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن إضافة MgCl2 إلى هذا الحل إذا لزم الأمر لأنه يمكن أن تستقر مجمعات RNA. وهذا سيكون له تأثير متواضع على إشارة الفلورسنت2. - قم بإزالة محلول جل 1x باستخدام محلول جل 5x لتلوين هُنا من الخطوة 1.1.2، ومباشرة قبل الاستخدام، قم باستكماله بـ TO1-Biotin fluorophore (انظر جدولالمواد) إلى تركيز نهائي قدره 20 طن متري. على سبيل المثال، إضافة 20 مل من 5X هلام تلطيخ الحل إلى 80 مل من الماء منزوع الديون لجعل 100 مل من 1X هلام تلطيخ الحل، وإضافة 2 ميكرولتر من 1 mM TO1-البيوتين الأسهم (أعدت في dimethylformamide).
ملاحظة: معامل الانقراض لصبغ TO1-البيوتين في 500 نانومتر هو 63000 م-1سم-1،يقاس في تلطيخ الحل 1.
-
إزالة الكتثر PAGE (2x حل تحميل جل المزيل والحلول A، B، C، بيركبريتات الأمونيوم، ورباعي ميثيل الإيثيلين ديامين)
- إعداد 50 مل من 2X حل تحميل هلام التحلل عن طريق خلط 40 مل من الفورماميد، 0.5 مل من 0.5 M حمض الإيثيلين ثنائي اتكالتيستيك (EDTA، ورقم الحموضة 8.0)، و 9.5 مل ddH2O. يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة. لا يتم إضافة الأصباغ التحميل إلى هذا الحل كما أنه قد يحجب التصوير الفلورسنت.
- إعداد 2X هلام التحلل صبغ التحميل على النحو التالي. عند تنقية الحمض النووي الريبي والحمض النووي oligonucleotides، إضافة 0.5 مل من 2.5٪ (ث / الخامس) بروموفينول الأزرق (BB) و 0.5 مل من 2.5٪ (ث / الخامس) السيلانال الزلين (XC) إلى الحل المبين في الخطوة 1.2.1، وإضافة 8.5 مل من ddH2O بدلا من 9.5 مل. يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 100 مل من الحل A عن طريق وزنها من 200.2 غرام من اليوريا (وزن الصيغة: 60.06 غرام / مول) وإضافته إلى 312.5 مل من 40٪ 19:1 الأكريلاميد: N،N'-ميثيلين بيسيكريلاميد. حرك مع شريط التحريك المغناطيسي في أقصى سرعة حتى يذوب (حوالي 3 ح) ويشكلون الحل إلى 500 مل باستخدام ddH2O. لاحظ أن التركيزات النهائية هي 6.667 M اليوريا و 25٪ 19:1 الأكريلاميد: ن، N'-ميثيلين بيسيكريل. يخزن في 4 درجة مئوية في البلاستيك نظيفة.
- إعداد 1 لتر من الحل B عن طريق وزنها من 400.4 غرام من اليوريا ويشكلون الحل إلى 1 لتر مع ddH2O؛ يُحرّك المزيج حتى يذوب اليوريا. يمكن الاحتفاظ الحل B في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الحل C (10x تريس-بورات-EDTA [TBE]) على النحو التالي. إعداد 4 L من 10X TBE عن طريق وزنها من 432 غرام من قاعدة تريس و 220 غرام من حمض البوريك، مضيفا 160 مل من 0.5 M EDTA مع حموضة من 8 (تصفيتها)، ويشكلون الحل إلى 4 L مع ddH2O. يتم إجراء مخزون كبير من هذا المخزن المؤقت كما يتم استخدامه أيضا كمخزن تشغيل هلام.
- إعداد 10٪ من الكبريتات الأمونيوم (APS) عن طريق حل 1 غرام من APS في حجم إجمالي 10 مل من ddH2O. مخزن في 4 درجة مئوية.
- حافظ على رباعي ميثيل الإيثيلين (TEMED) في متناول اليدين. تخزينه في 4 درجة مئوية جنبا إلى جنب مع الحل APS.
-
الصفحة الأصلية (2x هلام الأصلي حل التحميل)
- إعداد 50 مل من 2X هلام الأصلي تحميل الحل عن طريق خلط 25 مل من 100٪ الجلسرين، 10 مل من 5X هلام تلطيخ الحل، و 15 مل من ddH2O لتعويض الحل إلى 50 مل.
ملاحظة: كما هو الحال في قسم جل التشويه، يمكن إضافة الأصباغ التحميل إلى هذا المخزون، ولكن إضافتها يمكن أن تحجب إشارة الفلورسنت في الجل، وبالتالي، ينبغي تجنبها.
- إعداد 50 مل من 2X هلام الأصلي تحميل الحل عن طريق خلط 25 مل من 100٪ الجلسرين، 10 مل من 5X هلام تلطيخ الحل، و 15 مل من ddH2O لتعويض الحل إلى 50 مل.
2. إعداد وتحميل المواد الهلامية التشويه
- إعداد هلام التشويه مع نسبة مئوية مناسبة من قبل الجدول 1. النظر في نظام الصب هلام محددة. تستخدم المواد الهلامية 30 مل عادة. يمكن تقدير نسبة الجل المناسبة باستخدام الجدول2: اختر نسبة البولي أكريلاميد حيث يكون لأصباغ BB وXC motilities أسرع وأبطأ، على التوالي، من الحمض النووي الريبي من الفائدة، لضمان فصل عالية النطاق في الحجم ذات الصلة مجموعه.
- خلط الحلول A، B، C وفقا للجدول 1 وإضافة APS وTEMED مباشرة قبل صب هلام. خلط الحلول بشكل جيد في البلاستيك نظيفة.
- صب الحل هلام في جهاز الصب هلام المناسب، بعد التأكد من أن جميع المكونات نظيفة بدقة. رفع جانب واحد من الجهاز بحيث يتم إمالة الجل قليلا عند صب، لتجنب أي فقاعات الهواء تصبح محاصرة داخل هلام نفسها.
- أدخل المشط المطلوب واتركه لبوليمريز (حوالي 30 دقيقة). مراقبة البلمرة من خلال البحث عن كثب عن تغيير في مؤشر الانكسار حول الآبار هلام. قم بمكياج خزان الجل باستخدام محلول C 1x (1x TBE) وقم بإزالة المشط بعناية. باستخدام حقنة، استنشق الآبار مباشرة قبل تحميل العينة.
- إعداد عينات التشويه على النحو التالي. إضافة 2X هلام إزالة العينات تحميل العينات من الفائدة لجعل حل تحميل هلام denaturing 1X والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام thermocycler أو حمام مائي.
- قبل تحميل العينات، تبريد الهواء لهم عدة دقائق حتى تبرد لمسة. تحميل العينات عن طريق طبقات لهم في الجزء السفلي من كل بئر، وذلك باستخدام نصائح هلام التحميل.
ملاحظة: يمكن استخدام نصائح مستديرة للهلام من 1 مم سمك أو أكثر؛ استخدام نصائح مسطحة للهلام أرق. - تشغيل المواد الهلامية المزيلة للتشويه في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن القوة الكهربائية منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لوحات الزجاج من نظام هلام لا تصدع.
ملاحظة: في مختبرنا، كان 28 واط ل20 سم × 16 سم لوحات كافية لهذا الغرض.
3. إعداد وتحميل المواد الهلامية الأصلية
- إعداد هلام أصلي مع نسبة مئوية مناسبة عن طريق الإشارة إلى الجدول 3. النظر في نظام الصب هلام محددة، ولكن نضع في اعتبارنا أن 30 هلام مل تستخدم عادة. مزيج من حلول 1X TBE، 40٪ 29: 1 أكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيسيكريلاميد، والجلسرين وفقا للجدول 3،وإضافة APS وTEMED مباشرة قبل صب الجل. المتابعة كما هو موضح في الخطوتين 2.3 و 2.4.
- إعداد عينات أصلية عن طريق إضافة 2X هلام الأصلي تحميل الحل إلى عينات RNA من الفائدة لجعل الحل 1X والسماح لها باحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 100 دقيقة قبل تشغيل هلام لضمان كامل RNA للطي.
- تشغيل هلام الأصلي في غرفة باردة 4 درجة مئوية، وضمان أن القوة الكهربائية منخفضة بما فيه الكفاية لعدم تسخين الجل.
ملاحظة: في مختبرنا، كان 14 واط ل20 سم × 16 سم لوحات كافية لهذا الغرض.
4. الجيش الملكي النيبالي إعداد بواسطة النسخ T7 جولة من الإعادة
ملاحظة: تم طلب تسلسل الحمض النووي المستخدم ة في نسخ الإعادة 10 من بنيات المانجو RNA تجاريا. في هذه الطريقة، يتم تهجين oligonucleotides الحمض النووي الذي يحتوي على تكملة عكسية (RC) من كل من تسلسل ليتم نسخها والمروج T7 إلى سلسلة حبلا أعلى المروج T7 ومن ثم نسخها في المختبر. أدناه، لكل oligonucleotide، يتم عرض RC من تسلسل جوهر المانجو بالخط العريض ويظهر RC من منطقة المروج T7 في مائلة. وتتوافق المخلفات في الخطوط العادية مع المناطق الحلزونية التكميلية التعسفية المطلوبة للسماح لنواة المانجو بطيها بشكل صحيح.
مانجو الأول: GCA CGT شركة الاتصالات الدولية مركز مكافحة الإرهاب CTC TCC CCCCtt CGT ACG TCG C TA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الثاني: GCA CGT لجنة مكافحة الإرهاب CTC Ctc TCC TCT CGTACG TCG TCG CTGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الثالث: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الرابع: GCA CGT ACT CGC CTC لجنة مكافحة الإرهاب لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق التعاونية تكت غ غ غ ج غ مجلس التعاون الخليجي تات أغت تغ غ ت ات تا AG
T7 أعلى ستراند: CTT تا تاك GAC TCA CTA TAG G
- تنقية جل إعدادي من الحمض النووي oligonucleotides
- لتخليق الحمض النووي على نطاق 0.2 ميكرومول، قم بتعليق الأوليغونوكليوتيد الحمض النووي غير المحمي في 100 ميكرولتر من ddH2O و 100 ميكرولتر من صبغ التحميل المزيل للتشوه 2x (من الخطوة 1.2.2). في هذه الحالة، بما في ذلك الأصباغ تحميل هلام في محلول التحميل في نفس التركيز كما في الخطوة 1.2.2 يفضل.
- تنقية الأوليغونوكليوتيد الحمض النووي باستخدام 50 مل هلام مقياس إعدادي من نسبة البولي أكريلاميد المناسبة; استخدام الجدول 2 لاختيار نسبة هلام. على سبيل المثال، استخدم جل 8% لتسلسل 50 nt. من الناحية المثالية، يجب تشغيل الأزرق بروموفينول أسرع من oligonucleotide، وينبغي تشغيل السيلانول الزيلين أبطأ.
ملاحظة: في مختبرنا، تم صب هذه المواد الهلامية باستخدام الفواصل الصب التي كانت 1.5 مم سميكة وهلام تحميل مشط مع الآبار التي كانت 2-2.5 سم واسعة. - قم بتحميل 100 ميكرولتر من حلول الحمض النووي الأوليغونوكليوتيد التي تم إعدادها في الخطوة 4.1.2 لكل جل إعدادي كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.7.
- جفف بعناية خارج الجل، وإزالة لوحات الزجاج، وتغطية كلا الجانبين من هلام في التفاف البلاستيك. وضعه على شاشة التصوير الفلورسنت (الألومنيوم المدعومة رقيقة طبقة لوحات الكروماتوغرافيا مشربة مع فلوروفور هي حل اقتصادي) واستخدام مصباح قصير الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية المحمولة باليد لتصور نطاقات الحمض النووي من قبل التظليل الأشعة فوق البنفسجية.
- وينبغي ملاحظة ظل هش ومحدد جيدا إذا كان تركيب الحمض النووي من نوعية عالية. وضع علامة على العصابات على التفاف البلاستيك، وذلك باستخدام علامة دائمة.
ملاحظة: حماية الجلد والعينين من الأشعة فوق البنفسجية وإبقاء التعرض قصيرة لتجنب إتلاف عينة حمض النووية. - وضع الجل على لوحة زجاجية نظيفة، وقطع بعناية من العصابات ملحوظ ووضع كل جزء جل في 400 ميكرولتر من 300 m M كلوريد الصوديوم. إهتم بالحمض النووي بين عشية وضحاها، باستخدام دوار في درجة حرارة الغرفة.
- استعادة eluent في أنبوب الطرد المركزي نظيفة وإضافة 2.5 مكافئات من الإيثانول لترسب الحمض النووي. دوامة جيدا ووضع الأنبوب في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بيليه العينة في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء في 156،000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه في DDH2O. استخدام مطياف لتحديد بدقة تركيز الحمض النووي القلة. تخزين العينة كمخزون 10 μM للراحة في -20 درجة مئوية.
- نسخ الإعادة وتنقية هلام عينات الجيش الملكي النيبالي
- إعداد 5x النوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (NTP) الأسهم عن طريق خلط المخزونات NTP السائلة تتكون من تركيز نهائي من 40m غوانوسين ثلاثي الفوسفات (GTP, 11,400 M-1*1 سم -1), 25 m cytidine triphosphate (CTP, 7,600 M-1+cm-1),25 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP, 5,000 M-1*cm-1),و 10 m اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP, 10,000 M-1·cm-1); جميع معاملات الانقراض في 260 نانومتر.
ملاحظة: يمكن الحصول على مخزونات سائلة أو مسحوق تجاريا. إذا كان إعداد المخزونات الأولية من مسحوق، وضبط بعناية ورقم الألف إلى رقم الألف النهائي من 7.9، وذلك باستخدام 1 M الناهو. Aliquot المخزون في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. - إعداد 100 مل من 10x T7 النسخ المخزن المؤقت عن طريق خلط 25.6 مل من 1 م تريس-HCl، 14.4 مل من1 M تريس قاعدة، 26 مل من 1 M MgCl 2، 10 مل من 10٪ تريتون X-100، و 0.637 غرام من الحيوانات المنوية. تشكل الأسهم إلى حجم نهائي من 100 مل عن طريق إضافة ddH2O.
ملاحظة: يجب تأكيد رقم الألف النهائى من 7.9 من محلول 1x باستخدام مقياس حُمَّل حُمَد. يجب أن تكون 10x معقمة تصفيتها وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots الحجم المناسب. - إجراء النسخ على النحو التالي.
- إضافة الكواشف التالية لتشكل تركيز نهائي من 1X T7 النسخ العازلة باستخدام 10x T7 النسخ المخزن المؤقت وddH2O (من الخطوة 4.2.2)، 1x NTPs، 10 m من dithiothreitol (DTT)، 1 μM T7 تسلسل حبلا أعلى (انظر القسم 4 ملاحظة ل تسلسل)، 1 ميكروم هلام تنقية تسلسل الحمض النووي المانجو (الخطوة 2.1)، وT7 RNA البلمرة الإنزيم (1 U / ميكرولتر).
- دوامة، تدور إلى أسفل، واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو حتى يصبح غائما وأشكال عجل أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب. وينبغي أن يؤدي النسخ 50 ميكرولتر في 50 ميكرولتر من ~ 50 ميكرومتر الحمض النووي الريبي بعد تنقية هلام. إضافة حجم متساو من 2X صبغ التشويه وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة لتنقية هلام.
- جل-تنقية الحمض النووي الريبي الناتجة كما هو موضح في قسم تنقية هلام القلة النوى DNA باتباع الخطوات 4.1.2\u20124.1.8، استبدال عينة RNA للحمض النووي.
ملاحظة: الحمض النووي الريبي حساس للغاية لتدهور RNase، لذلك تأكد من أن في جميع الخطوات، يتم ارتداء القفازات ومعطف مختبر نظيف في جميع الأوقات. ضمان إعداد وتخزين جميع العينات في الأواني البلاستيكية ذات الاستخدام الواحد للحماية من التلوث RNase، وغسل لوحات الزجاج بعناية مع الصابون الساخن والماء قبل الاستخدام، وشطفها جيدا مع ddH2O، وتجفيف الأواني الزجاجية مع مساعدة من الإيثانول تطبيقها من زجاجة الضغط. - استخدم 1 μL من عينة RNA النهائية، وباستخدام مطياف يستند إلى قطرة، تحديد الامتصاص في 260 نانومتر. باستخدام معامل الانقراض الذي يحدده أقرب طريقة مجاورة، حساب تركيز الحمض النووي الريبي وضبط تركيز العينة إلى 10 ميكرومتر مع ddH2O للراحة. تخزين عينات الجيش الملكي النيبالي في -20 درجة مئوية.
- إعداد 5x النوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (NTP) الأسهم عن طريق خلط المخزونات NTP السائلة تتكون من تركيز نهائي من 40m غوانوسين ثلاثي الفوسفات (GTP, 11,400 M-1*1 سم -1), 25 m cytidine triphosphate (CTP, 7,600 M-1+cm-1),25 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP, 5,000 M-1*cm-1),و 10 m اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP, 10,000 M-1·cm-1); جميع معاملات الانقراض في 260 نانومتر.
- الإشريكية القولونية مجموع استخراج حمض النووية الخام
ملاحظة: البروتوكول التالي مثال. يستخدم هذا البروتوكول الذاتي أعرب المانجو I-معلم 6S RNA من بلازميد في E. القولونية, ويوصف الحث من هذا البلازميد في مكان آخر بالتفصيل4.- لأغراض هذه الدراسة، إعداد 500 مل من الخلايا المستحثة لكل من PECOLI-RNA مانجو وpecoli-T1 البلازميدات (الخلايا هي الناجمة في OD600nm من 1). قم بعملية الكري الخلايا وتخزينها عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- إجراء استخراج الجيش الملكي النيبالي على النحو التالي.
- خذ 0.5 مل من بيليه الخلية pecoli المستحثة وإضافة 500 ميكرولتر من الفينول الملتبس. ثم، دوامة العينة؛ الحل سيصبح أبيض حليبي. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة لفصل الطبقات.
- استخراج الطبقة العليا، والتي سوف تكون صفراء قليلا، وتكرار الخطوة 4.3.2.1 عن طريق إضافة حجم متساو من الفينول، سنتريفيجينغ، واستخراج ما مجموعه 5X (أو حتى الطبقة الوسطى، وهو أبيض مبهمة، يذهب بعيدا وتترك طبقتين فقط واضحة).
- أضف كمية الماء المستخرجة من الفينول إلى حجم متساو ٍ من الكلوروفورم، الدوامة، ثم أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.
- استخراج الطبقة المائي وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 300 mM. يُعجّل بالحمض النووي الناتج عن إضافة 2.5 مكافئات من الإيثانول، الدوامة، الدوران، والتعجيل عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- بيليه في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء في 15.6 X 1000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة خطوة DNase I الهضم إلى هذا الإجراء، باتباع البروتوكول المشار إليه11، للحصول على مجموع الجيش الملكي النيبالي.
ملاحظة: دوامة بقوة حتى يتم حل تماما بيليه في ddH2O.
5. بعد جل تلطيخ
- أعد محلول جل 1x لتلوين هذي اللطخة حسب الوصفة في الخطوة 1.1.3 وأضفها إلى وعاء زجاجي نظيف واسع بما يكفي ليناسب الجل بشكل مريح.
ملاحظة: حاويات زجاجية البورسليكات مع أغطية تناسب المفاجئة تخدم هذا الغرض بشكل جيد. - إضافة ما يكفي من 1X هلام تلطيخ الحل إلى الحاوية بحيث يتم تغطية هلام تماما مع الحل وsloshes السائل على الجزء العلوي من هلام عندما يتم وضعها على الدوار المداري.
ملاحظة: يجب أن تكون الحاوية كبيرة بما يكفي لتناسب الجل بحيث يمكن أن تتحرك حولها ويكون ما يكفي من العازلة في الحاوية لتغطية الجل بالكامل. - بمجرد الانتهاء من هلام الأصلي أو التشويه تشغيل (القسم 2 أو 3، على التوالي)، وإزالة هلام من الجهاز وقطع آباره. يمكن أن يكون من المفيد لإزالة زاوية من هلام للتوجيه في وقت لاحق في التحليل.
- نقل بعناية هلام إلى 1X هلام تلطيخ الحل أعدت في الخطوة 5.2.
ملاحظة: المواد الهلامية هشة وعرضة للكسر حتى تكون حذرا عند نقل هلام. الحفاظ على غطاء على حاوية تلطيخ في جميع الأوقات حتى لا تلوث الجل. - ضع الجل على المدورة المدارية بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تأكد من أن الجل لا أضعاف مرة أخرى على نفسه; خلاف ذلك، قد تنتشر الجيش الملكي النيبالي من هلام وتسمية ذلك جزء مختلف من هلام.
6. تصوير المانجا الموسومة RNAs في هلام
- بعناية decant المخزن المؤقت التصوير. شطف الجل بسرعة بالماء، وضمان ما يكفي من بقايا السائل للحفاظ على هلام المحمول قليلا في الحاوية.
- نقل بعناية هلام على الصور. نقل بعناية عن طريق التقاط الجانبين من هلام ووضعه على علبة الصور. بدلا من ذلك، يمكن سكب هلام ببطء على صينية. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت الجل وأنه لا يوجد سائل زائد تحت الجل. يمكن أن تكون الماصة المنفّلة على الجل مفيدة لإزالة أي سائل زائد.
ملاحظة: استخدم منشفة ورقية لامتصاص السوائل الزائدة. - تأخذ صورة هلام، ومراقبة الفلورسنت بين الإثارة الطول الموجي 510 نانومتر وانبعاث الطول الموجي 535 نانومتر (على سبيل المثال، الضوء الأخضر في 520 نانومتر الطول الموجي إعدادات الفلورسنت على جهاز التصوير). تأكد من أن الإعدادات هي الأمثل تماما على الصك واتبع بعناية التعليمات للأداة المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأعدت الرناقصيرة التي تحمل علامات المانجو على النحو المبين في قسم البروتوكول. على افتراض أن الفلورسنت في ظروف التشويه سيكون من الصعب مراقبة بسبب وجود اليوريا في المواد الهلامية، درسنا لأول مرة مقاومة aptamers المانجو إلى اليوريا، والتي تعمل كمطهر حمض نووي. وجدنا أن aptamers المانجو هي مقاومة كبيرة لdenaturation تصل إلى تركيز اليوريا من حوالي 1 م (الشكل2A). قبل إضافة محلول جل تلطيخ إلى هلام التشويه، والتركيز النهائي من اليوريا في هلام هو 6 M. إضافة ما يكفي من محلول تلطيخ لتقليل هذا التركيز إلى 1 M، وبالتالي، يكون الأمثل لضمان كامل الفلور المانجو لجميع aptamers الأربعة. في الممارسة العملية، حقق بروتوكول تلطيخ أقل من هذه النتيجة المثلى تماما، ولكن هذا يمكن ببساطة تصحيحها إذا لزم الأمر باستخدام حل أكثر تلطيخ أو عن طريق وسيلة بسيطة لتغيير الحل مرة واحدة أثناء تلطيخ.
مرة واحدة تم تشغيل بناءات RNA التي تحمل علامات المانجو في هلام التشويه، تم تحسين وقت تلطيخ لأقصى قدر من الفلورسنت هلام عن طريق تحميل ثلاثة كميات مختلفة المانجو الثالث في هلام 8٪ denaturing (الشكل2B). وكشفت دورة زمنية أنه بعد 5 دقيقة من نقع في محلول جل تلطيخ، كان الفلورسنت واضح للعيان. تم الحصول على أقصى فلورفلور من بناء المانجو الثالث بعد 20-40 دقيقة من تلطيخ، وبعد ذلك الوقت بدأت RNAs الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة في الانتشار من الجل، مما أدى إلى فقدان إشارة الفلورسنت (الشكل2B). ونتيجة لذلك، كانت كل من المواد الهلامية الأصلية ومزيلة للتلوين لمدة 30 دقيقة لكل منهما. أطول RNA الانشاءات يمكن أن تتسامح بسهولة أطول أوقات ملطخة لأنها ستكون أقل بكثير من المرجح أن تنتشر من الهلام.
بعض من الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers مطوية بسرعة أكبر من غيرها. تم احتضان كل من aptamers المانجو المستخدمة في هذه الدراسة في العازلة هلام تكملها 1.5 M اليوريا و 100 طن TO1-البيوتين صبغ وتحليلها باستخدام مقياس الفلور. المانجو الأول والثاني والثالث كانت مطوية بالكامل بعد 10 دقيقة، في حين أن المانجو الرابع أصبح مطوية بشكل كبير إلا بعد 40 دقيقة (الشكل 3A). في غياب اليوريا، كان للطي أسرع بكثير كما كان متوقعا (الشكل3B). للتأكد من أن عينات هلام الأصلي كانت مطوية بالكامل، ونحن عينات preincubated لمدة 100 دقيقة قبل تشغيلها في المواد الهلامية الأصلية. عمليا، تشير البيانات في الشكل 3 هذه المرة يمكن أن تخفض إلى حد كبير اعتمادا على aptamer المانجو المستخدمة.
مرة واحدة تم تحسين البروتوكول للكشف عن الحمض النووي الريبي المانجو aptamer الفلورسنت، تم تحديد حساسية طريقة بوستيستين لكل من المتغيرات المانجو في كل من المواد الهلامية الأصلية. وقد لوحظت نطاقات واحدة مطابقة لRNAs مطوية جيدا لكل من المانجو الأربعة في المواد الهلامية الأصلية (الشكل4A). على تخفيف المسلسل، يمكن ملاحظة أقل من 62.5 fmol من المانجو الثاني، في حين أن أقل من 125 fmol من المانجو الأول والثالث، وIV كان من السهل تصور. كان القياس الكمي للهلام اتّماج ة يخطّي ّ ة ل1.5 تقريبا من المقدار، مع مانجو الأول والثاني والرابع يتصرف بطريقة خطية أكثر من مانجو الثالث (الشكل4B).
وكانت نتائج المواد الهلامية المزيلة للضوء أقل حساسية من المواد الهلامية الأصلية ولكنها كانت أكثر خطية. تم اكتشاف أقل من 125 فمول من المانجو الثاني والثالث بسهولة (الشكل4C). ومن المثير للاهتمام، أن القياس الكمي (الشكل4D)أشار إلى أن المواد الهلامية التشويهية كانت خطية أو اثنين من أوامر الحجم. نحن نفترض أنه، على النقيض من المواد الهلامية الأصلية حيث طيات الحمض النووي الريبي ربما تعرضت للتشويه الجزئي خلال عملية تشغيل هلام، وجود اليوريا في هلام التشويه قد توفر طريقة أكثر تجانسا لطي aptamers مرة واحدة يتم وضعها في TO1-البيوتين تلطيخ الحل.
كما هو الحال مع جميع منهجيات التلطيخ هلام، إذا لم يتم نقل هلام بعناية في الحاوية، أو سرعة الدورية عالية جدا خلال فترة تلطيخ، قد أضعاف هلام مرة أخرى على نفسه (الشكل 5A). وهذا يمكن أن يؤدي إلى عينة RNA التي تحمل علامات المانجو التي تُنشر من مكان واحد للهلام إلى آخر ولكن يمكن تجنبها بسهولة في الممارسة العملية. في المواد الهلامية الأصلية، وخاصة بالنسبة لمانجو الرابع، لاحظنا أن للطي غير مكتملة يمكن أن تظهر في مظهر نطاقات متعددة يفترض المقابلة جزئيا / misfolded RNA التشكيلات (الشكل5B)الناتجة عن أقصر مرات للطي. يمكن تجنب قضايا الطي في المواد الهلامية الأصلية عن طريق احتضان عينات الحمض النووي الريبي بشكل مناسب كما سبق وصفه وتشغيل المواد الهلامية الأصلية في غرفة باردة. في المواد الهلامية المزيلة، حيث يطوي الجيش الملكي النيبالي في الموقع داخل هلام، لم يكن misfolding مشكلة كبيرة. وأخيرا، في غياب الجيش الملكي النيبالي، لوحظ القليل جدا من الفلورسنت الخلفية في أي من نظام هلام.
بعد ذلك، تمت دراسة خصوصية العلامة المانجو RNA عن طريق المبالغة في التعبير عن RNA التنظيمية 6S في البكتيريا. تم وضع علامة على هذا الجيش الملكي النيبالي سابقا باستخدام المانجو الأول (الشكل 1E)4. تحولت الخلايا البكتيرية إما مع pecoli-RNA المانجو plasmid (من الآن فصاعدا M plasmid) أو pEcoli-T1 البلازميد كتحكم سلبي (من الآن فصاعدا E plasmid). نمت الخلايا المحولة في السائل الليسوجين مرق المتوسطة حتى تم التوصل إلى OD600 من 1.0. ثم تم حث الثقافات مع 50 ميكروبروبيل الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبرانوسيد (IPTG) لمدة 40 دقيقة. وقد تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بمعدل 000 6 غرام x غرام لمدة 15 دقيقة. وتركزت عينات الحمض النووي الريبي الكلي من قبل الإيثانول هطول الأمطار ومن ثم معالجتها مع DNase I، بعد البروتوكول، لإزالة الحمض النووي11. قبل استخدام، كان يتركز الجيش الملكي النيبالي من قبل هطول الأمطار الإيثانول.
تم تشغيل مجموع الحمض النووي الريبي البكتيريإلى 8٪ المواد الهلامية التشويه (الشكل 6) وملطخة إما SG13 أو TO1-البيوتين. لتلطيخ SG، تمت إضافة 10 μL من 10000x SG إلى 100 مل من العازلة هلام؛ خلاف ذلك، كان بروتوكول تلطيخ مطابق لتلك المستخدمة TO1-البيوتين. كما هو متوقع، لوحظت SG تلطيخ قوي للعديد من RNAs، ولكن أبرز هابيل (رنا) ونقل RNAs (tRNA) (الشكل6، لوحة اليسار). في حين أن تلطيخ المانجو تعتمد (M الممرات) يمكن أن ينظر إليها في هذه المواد الهلامية SG الملطخة، فإنها لا يمكن تحديدها بشكل فريد نظرا لنمط تلطيخ معقدة لوحظت باستخدام هذه البقعة العالمية. وعلى النقيض من ذلك، سلطت المواد الهلامية الملطخة بـ TO1-Biotin الضوء على العصابات المعتمدة على المانجو باعتبارها أبرز الفرق. فقط ال [ريبوسومل] [رنا] اعتبرت نطاقات أن يكون في منافسة مع ال 6[س] [منغو-دبندنت] نطاقات. ويمكن أيضا ملاحظة عدد من العصابات الملطخة غير محددة. ومع ذلك, كان ال [منغو-دبندنت] نطاقات ثانية مسيطرة, يتلقّى فقط ال [ررنا] و [ترنا] نطاقات ك [وكلي] ينافس منافسات (شكل 6, يصحّ لوح).
الشكل 1: نظام المانجو أبتامر. (أ) TO1-البيوتين فلوروفور. (ب) مانجو I. (C) مانجو الثاني. (د) المانجو الثالث. لوحات B-D تظهر الهيكل الثانوي لكل أبتامر. P1 هو جذع تعسفي. تظهر حلقة الجذع الشبيهة بـ GNRA (هنا GAAA) الموجودة في مانجو الأول والثاني باللون يندّد باللون الأحمر، وتظهر الزخرفة الثلاثية للمانجو الثالث باللون الأرجواني. (E) و6S التنظيمية RNA الموسومة مع مانجو I. يرجى انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير اليوريا على فلورون المانجو ومرات التلطيخ الأمثل. (أ) المعايرة بالتحليل الكيميائي لليوريا باستخدام 50 طن من الرنا مانجو الأول (دوائر برتقالية)، ومانجو الثاني (الدوائر الخضراء)، ومانجو الثالث (دوائر أرجوانية)، ومانجو الرابع (الدوائر الزرقاء)، مع 100 طن من الصبغة TO1-البيوتين وفي تركيزات اليوريا المشار إليها. وقد تم احتضان العينات لمدة 40 دقيقة قبل قراءة الفلورسنت في ذروة الإثارة من 510 نانومتر وموجة انبعاث 535 نانومتر. (ب) تم تحميل المانجو الثالث RNA في 8٪ هلام التشويه وملطخة مع محلول هلام يحتوي على 20 طن النهائي TO1-البيوتين صبغ. لكل نقطة زمنية يشار إليها، 0.064، 0.32، و 1.6 pmol من المانجو الثالث الجيش الملكي النيبالي تم استخدامها من اليسار إلى اليمين. تم تصور صورة الجل باستخدام صورة الفلورسنت باستخدام ليزر 520 نانومتر و10 دقيقة التعرض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أوقات طي aptamers المانجو في وجود وغياب اليوريا. (أ) في وجود 1.5 م اليوريا و 100 طن TO1-البيوتين، تم تنفيذ دورات الوقت الفلورسنت باستخدام 50 طن من كل RNA مانجو بناء (RNA مانجو الأول: النقاط البرتقالية، مانجو الثاني: النقاط الخضراء، المانجو الثالث: النقاط الأرجواني، والمانجو الرابع: النقاط الزرقاء). (ب) مطابقة لللوحة أ،إلا في غياب اليوريا. وقد أجريت جميع الدورات في الوقت في درجة حرارة الغرفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور فلورسنت من الصفحة الأصلية والتشويه مع بنيات المانجو RNA. (أ) هلام الأصلي 8٪ مع RNA يخفف تسلسلي بنيات المانجو. تحتوي الممرات الأول والثاني والثالث والرابع على كميات نهائية من 8 بمول من الرنا مانجو الأول والثاني والثالث والرابع على التوالي. الألواح اليمنى هي تخفيفات تسلسلية مزدوجة تحتوي على 4 بمول، 2 بمول، 1 بمول، 0.5 بمول، 0.25 بمول، 0.125 بمول، و 0.0625 بمول من المانجو الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، كما هو مبين. لا يحتوي الممر 12 على أي الحمض النووي الريبي. (B) القياس الكمي لثلاثة تكرار اتّصل بهلام أصلي (الانحراف المعياري للمتوسط الموضحة لكل). (ج) هلام 8٪ مع عينات نفس تحميل كما في لوحة A، باستثناء حقيقة أن تم استخدام حل تحميل هلام denaturing بدلا من هلام الأصلي حل التحميل. (D) ثلاث نسخ كمية من هلام التشويه (الانحراف المعياري للمتوسط المبين لكل). وقد تصورت جميع الصور هلام مصور هلام مع 520 نانومتر ليزر و 10 دقيقة التعرض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المواد الهلامية دون المستوى الأمثل والطي غير مكتملة من المانجو الرابع في هلام الأصلي 8٪. (أ) تخفيف المسلسل من النوع المبين في الشكل 4 للمانجو الثاني ولكن تبين تأثير هلام للطي خلال بروتوكول تلطيخ. (B) العينات من الجل الأصلي مانجو الرابع التي لم يسمح لطي لفترة طويلة بما فيه الكفاية في المخزن المؤقت الأصلي قبل تحميل هلام المعرض العصابات المزدوجة. خلاف ذلك، وهذه النتائج هي مماثلة لنتائج مانجو الرابع هو مبين في الشكل 4A. وقد تصورت جميع الصور هلام باستخدام جهاز تصوير هلام مع 520 نانومتر الليزر و 10 دقيقة التعرض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي الذي يحمل علامات المانجو في وجود الحمض النووي الريبي الكلي، باستخدام تو1-بيوتين تلطيخ. تم تحميل 8٪ المواد الهلامية التشويه مع 100 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي وتشغيلها لمدة 30 دقيقة. كان الجل الأيسر ملطخًا بـ SG واللوحة اليمنى مع TO1-Biotin. لكلا الألواح، تم تحميل الممرات المسمى E مع 100 نانوغرام من pecoli-T1 (لا علامة المانجو) والممرات المسمى M تم تحميلها مع 100 نانوغرام من PECOLI-RNA مانجو (6S RNA الموسومة مع علامة المانجو أنا). تم تصور صور الجل الملطخة بـ TO1-Biotin باستخدام جهاز تصوير مع ليزر 520 نانومتر والتعرض لمدة 10 دقائق. تم تصور صور هلام SG الملطخة باستخدام صورة هلام باستخدام ليزر 460 نانومتر والتعرض 10 دقيقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| النسبه المئويه | هلام حجم | |||
| 20 مل | 30 مل | 50 مل | ||
| 5 في المائة | ألف | 4 | 6 | 10 |
| ب | 14 | 21 | 35 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 6 في المائة | ألف | 4.8 | 7.2 | 12 |
| ب | 13.2 | 19.8 | 33 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 8 في المائة | ألف | 6.4 | 9.6 | 16 |
| ب | 11-6 | 17.4 | 29 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 10 في المائة | ألف | 8 | 12 | 20 |
| ب | 10 | 15 | 25 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 12 في المائة | ألف | 9.6 | 14.4 | 24 |
| ب | 8.4 | 12.6 | 21 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 15 في المائة | ألف | 12 | 18 | 30 |
| ب | 6 | 9 | 15 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| 20 في المائة | ألف | 16 | 24 | 40 |
| ب | 2 | 3 | 5 | |
| ج | 2 | 3 | 5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| تم (ميكرولتر) | 20 | 30 | 50 | |
الجدول 1: تُلَكُن ّة جدول صب الجل PAGE. A = الحل A، B = الحل B، C = الحل C.
| جل المزيل للون % | BB (~ التنقل nt) | XC (~التنقل في nt) |
| 5 | 35 | 130 |
| 6 | 26 | 106 |
| 8 | 19 | 70-80 |
| 10 | 12 | 55 |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 |
الجدول 2: صبغات هلامية تقريبية من مادة بروموفينول الأزرق (BB) وهلام السيلين (XC) في المواد الهلامية المزيلة للبولاكريلاميد.
| النسبه المئويه | هلام حجم | |||
| 20 مل | 30 مل | 50 مل | ||
| 5 في المائة | 1X TBE | 16.5 | 24.75 | 41.25 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 2.5 | 3.75 | 6.25 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 6 في المائة | 1X TBE | 16 | 24 | 40 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 3 | 4.5 | 7.5 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 8 في المائة | 1X TBE | 15 | 22.5 | 37.5 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 4 | 6 | 10 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 10 في المائة | 1X TBE | 14 | 21 | 35 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 5 | 7.5 | 12.5 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 12 في المائة | 1X TBE | 13 | 19.5 | 32.5 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 6 | 9 | 15 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 15 في المائة | 1X TBE | 11.5 | 17.25 | 28.75 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 7.5 | 11-25 | 18.75 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 20 في المائة | 1X TBE | 9 | 13.5 | 22.5 |
| 40٪ 29: 1 الأكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيإساكريلاميد | 10 | 15 | 25 | |
| الجلسرين | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| تم (ميكرولتر) | 20 | 30 | 50 | |
الجدول 3: الصفحة الأصلية هلام صب الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميزة كبيرة من علامة المانجو الفلورسنت هو أنه يمكن استخدام علامة واحدة بطرق متعددة. سطوع عالية والتقارب من هذه aptamers جعلها مفيدة ليس فقط لفي تصور الخلية2 ولكن أيضا لRNA في المختبر أو تنقية RNP4. ولذلك، هلام التصوير يمتد براعة العلامة المانجو بطريقة مباشرة. حساسية التصوير هلام المانجو أقل قليلا من أن من وصمة عار الشمالية14 ولكن يمكن بسهولة الكشف عن 60-120 fmol عينة من الحمض النووي الريبي، دون الحاجة إلى نقل غشاء طويلة ومملة وخطوات التحقيق. وهذا مشابه لكفاءة التحقيق القائمة على التهجين التي سبق العثور عليها لRNAs الصغيرة في هلام15. في حين أن منهجيات aptamer الفلورية الأخرى – خاصة، السبانخ RNA - لديها حساسية أكبر وخصوصية9، لا يوجد في الوقت الراهن سطوع عالية والتقارب من نظام المانجو aptamer ، والذي يسمح لعلامة واحدة RNA أن تكون تستخدم في التصوير الخلوي، تنقية RNP، والآن هلام التصوير.
هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول جل تلطيخ. عند العمل مع حلول الجيش الملكي النيبالي، يجب أن تكون الحلول معقمة تصفيتها، وينبغي استخدام البلاستيك للاستخدام الواحد. يمكن بسهولة أن تُنهي الكاتونيون، الذي يعمل بالمواد الهلامية الأصلية كمجمعات أو هياكل RNA، إذا كانت مستويات الطاقة للجل مرتفعة جدًا وينتج عنها تسخين الجل. تأكد من أن أي الأواني الزجاجية المستخدمة نظيفة وغير ملوثة RNases. بالإضافة إلى ذلك، كن حذراً دائماً عند نقل وانتقاء المواد الهلامية لأنها هشة ويمكن أن تكون عرضة للكسر.
وTO1-البيوتين وصمة عار تخترق المواد الهلامية بسرعة، ولكن البيانات المعروضة هنا تشير أيضا إلى أن مانجو الرابع للطي، على وجه الخصوص، يمكن أن يكون معدل الحد (الشكل2 و الشكل 3). باستخدام الشروط المذكورة في قسم البروتوكول، لاحظنا سلوك سجل خطي لجميع aptamers الأربعة على اثنين من أوامر من الحجم في المواد الهلامية التشويه، مما يجعل طريقة مفيدة للتكميم (الشكل4C، D). منذ aptamers المانجو الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة تنتشر بسهولة من مصفوفة هلام، ونحن نتوقع أن تتحسن الكمية لأطول بنيات الجيش الملكي النيبالي.
منهجية التصوير هلام علامة المانجو أظهرت هنا قوية ومن المتوقع أن تكون قادرة على أن تكون ببساطة تمتد من حيث الحساسية والتحديد. المانجو الأول، الثاني، والثالث أضعاف موثوق بها، في حين أن المانجو الرابع لا. وفي حين أننا لم نستكشف بروتوكولات الإزالة، فإننا نتوقع أن يؤدي هذا النهج إلى تحسين التحديد. وبينما تتجاوز هذه الأعمال، فإن علامة الفلورسنت والبيوتين الممنوحة للحمض الريبي الريبي الذي يحمل علامات المانجو عند استخدام فلوروفور من TO1-بيوتين يبدو من المرجح جداً أن تزيد من تبسيط تحليل الهلام وتنقيةه. فعلى سبيل المثال، تعد تقنيات وضع العلامات على البيوتين الثانوية المتاحة تجارياً بزيادة تعزيز حدود الكشف عن هذا النظام البسيط لوضع العلامات على المانجو من الحمض النووي الريبي. وبالمثل، يبدو من المحتمل أن مجمعات البروتين RNA الأصلي التي تحمل علامات المانجو يمكن أن توصف من هلام وتسترد باستخدام الخرز المغناطيسي streptavidin وذلك لالتقاط مجمع الحمض النووي الريبي eluted. وهذا من شأنه أن يزيد من تبسيط التنقية الروتينية للمجمعات RNAs وRNA الهامة بيولوجيا من قبل وسيلة بسيطة لإضافة علامة المانجو إلى الجيش الملكي النيبالي من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وهناك براءة اختراع معلقة في نظام الإنفلونزا المانجو.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان رازفان كوجوكارو وأمير عبد الله زاده على مساعدتهما التقنية، ولينا دولغوشينا على تصحيح المخطوطة. وتم تمويل هذا المشروع من منحة تشغيلية قدمها المجلس الكندي للبحوث الطبيعية والبحوث الهندسية إلى منظمة بي جي يو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
