Summary
Ici, nous présentons une méthode sensible, rapide et discriminante de coloration post-gel pour imager les ARN marqués avec des aptamers de mangue d'ARN I, II, III, ou IV, utilisant des gels indigènes ou dénaturants de gel de polyacrylamide (PAGE). Après avoir utilisé des gels PAGE standard, l'ARN étiqueté mangue peut être facilement taché de TO1-Biotine, puis analysé à l'aide de lecteurs de fluorescence couramment disponibles.
Abstract
Les gels polyacrylamides indigènes et dénaturants sont couramment utilisés pour caractériser la mobilité complexe de ribonucleoprotein (RNP) et pour mesurer la taille de l'ARN, respectivement. Comme de nombreuses techniques d'imagerie par gel utilisent des taches non spécifiques ou des sondes de fluorophore coûteuses, des méthodologies sensibles, discriminatoires et économiques d'imagerie par gel sont hautement souhaitables. Les séquences de noyau de mangue d'ARN sont de petits motifs de séquence (19-22 nt) qui, une fois fermés par une tige arbitraire d'ARN, peuvent être simplement et peu coûteux annexés à un ARN d'intérêt. Ces étiquettes de mangue se lient avec une forte affinité et spécificité à un ligand fluorophore thiazole-orange appelé TO1-Biotine, qui devient des milliers de fois plus fluorescent lors de la liaison. Ici, nous montrons que la mangue I, II, III, et IV peut être utilisé pour imager spécifiquement l'ARN dans les gels à haute sensibilité. Aussi peu que 62,5 fmol d'ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d'ARN dans les gels dénaturants peuvent être détectés par des gels de trempage dans un tampon d'imagerie contenant du potassium et 20 nM TO1-Biotine pendant 30 min. Nous démontrons la spécificité du système Mango-étiqueté par l'imagerie d'un ARN bactérien 6S marqué par Mango dans le contexte d'un mélange complexe de l'ARN bactérien total.
Introduction
La mangue est un système de marquage à ARN composé d'un ensemble de quatre petits aptamers à ARN fluorescents qui se lient étroitement (liaison nanomolaire) à de simples dérivés du thiazole-orange (TO1-Biotine, Figure 1A)1,2,3 . Lors de la liaison, la fluorescence de ce ligand est multipliée par 1 000 à 4 000 selon l'aptamer spécifique. La haute luminosité du système Mango, qui pour Mango III dépasse celle de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), combinée avec l'affinité de liaison nanomolaire des aptamers de mango d'ARN, lui permet d'être employé dans l'imagerie et la purification de l'ARN complexes2,4.
Les structures de rayons X de Mango I5, II6, et III7 ont été déterminées à haute résolution, et les trois aptamers utilisent un quadruplex d'ARN pour lier TO1-Biotine (Figure 1B- D). Les noyaux compacts des trois aptamères sont isolés de la séquence externe de l'ARN par des motifs d'adaptateur compacts. Mango I et II utilisent tous deux un adaptateur flexible de boucle gNRA-like pour relier leurs cœurs de mangue à un duplex arbitraire d'ARN (figure 1B,C). En revanche, Mango III utilise un motif triplex rigide pour connecter son noyau à une hélice arbitraire de l'ARN (Figure 1D, résidus violets), alors que la structure de Mango IV n'est pas actuellement connue. Comme le noyau liant ligand de chacun de ces aptamères est séparé de la séquence externe de l'ARN par ces adaptateurs hélicoïdaux, il semble probable qu'ils puissent tous être simplement incorporés dans une variété d'ARN. L'ARN régulateur bactérien 6S (Mango I), les composants de la levure spliceosome (Mango I), et l'homme 5S ARN, U6 ARN, et un C / D scaRNA (Mango II et IV) ont tous été marqués avec succès de cette façon2,8, ce qui suggère que de nombreux les ARN biologiques peuvent être étiquetés à l'aide du système d'aptamer DE mango d'ARN.
Les gels dénaturants et indigènes sont couramment utilisés pour étudier les ARN. Les gels dénaturants sont souvent utilisés pour juger de la taille de l'ARN ou du traitement de l'ARN, mais généralement, dans le cas d'une tache nordique, par exemple, nécessitent plusieurs étapes lentes et séquentielles afin de générer une image. Alors que d'autres aptamers fluorogènes d'ARN, tels quel'épinard d'ARN et le brocoli, ont été employés avec succès pour l'imagerie de gel 9, aucun système fluorogenic d'aptamer à ce jour possède la luminosité élevée et l'affinité du système de mangue, le faisant d'un intérêt considérable d'étudier les capacités d'imagerie par gel de Mango. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si le système de mango d'ARN pourrait être simplement étendu à l'imagerie de gel, car les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de TO1-Biotine (510 nm et 535 nm, respectivement) sont appropriées pour l'imagerie dans le canal d'eGFP commun à la plupart fluorescent instrumentation de balayage de gel.
Le protocole de coloration post-gel présenté ici fournit un moyen rapide de détecter spécifiquement les molécules d'ARN étiquetées mango dans les gels d'électrophorèse de gel polyacrylamide (PAGE) indigènes et dénaturants. Cette méthode de coloration consiste à tremper les gels dans un tampon contenant du potassium et de la TO1-Biotine. Les aptamers de mangue d'ARN sont g-quadruplex basés et le potassium est exigé pour stabiliser de telles structures. À l'aide de l'ARN transcrit à partir de modèles d'ADN minimaux encodants par Mango (voir la section du protocole), nous pouvons simplement détecter aussi peu que 62,5 fmol d'ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d'ARN dans les gels dénaturants, en utilisant un protocole de coloration simple. Contrairement aux taches d'acide nucléique non spécifiques courantes (voir Tableau des matériaux, référence à SG à partir de là), nous pouvons clairement identifier l'ARN marqué par mango, même lorsque des concentrations élevées d'ARN total non étiqueté sont présents dans l'échantillon.
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Protocol
1. Préparation des réactifs
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SOLUTION de coloration TO1-Biotine (solution de coloration de gel)
- Faire 1 L de 1 M tampon de phosphate à pH 7,2 à 25 oC en ajoutant 342 ml de 1 M de Na2HPO4 et 158 ml de 1 M NaH2PO4. Ajuster le pH à 7,2 à 50 mm en ajoutant la solution de phosphate appropriée. Filtre stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 m et rangez la solution dans des plastiques à température ambiante.
- Préparer la solution de coloration 5x gel (sans TO1-Biotine) comme suit. Faire une solution de 1 L en mélangeant 247,5 ml de ddH2O, 700 ml de 1 M KCl, 50 ml de tampon de phosphate de 1 M (pH 7,2) et 2,5 mL d'entre10 20. Filtre stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 m et stockez la solution dans des plastiques. Il peut être stocké à température ambiante.
REMARQUE : MgCl2 peut être ajouté à cette solution si nécessaire car elle peut potentiellement stabiliser les complexes d'ARN. Cela aura un impact modeste sur le signal fluorescent2. - Faites une solution de coloration de gel 1x en utilisant la solution de coloration de gel 5x de l'étape 1.1.2 et, immédiatement avant l'utilisation, complétez-la avec le fluorophore de TO1-Biotine (voir tableau des matériaux)à une concentration finale de 20 nM. Par exemple, ajouter 20 ml de solution de coloration de gel 5x à 80 ml d'eau déionisée pour faire 100 ml de solution de coloration de gel 1x, et ajouter 2 l d'un stock de 1 mM to1-Biotine (préparé en diméthylformamide).
REMARQUE : Le coefficient d'extinction du colorant TO1-Biotine à 500 nm est de 63 000 M-1cm-1, mesuré dans la solution de coloration1.
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Page dénaturante (2x solution de chargement de gel dénaturant et solutions A, B, C, ammonium persulfate, et téramethylethylenediamine)
- Préparer 50 ml de solution de chargement de gel dénaturant 2x en mélangeant 40 ml de formamide, 0,5 ml d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA, pH 8.0), et 9,5 mL ddH2O. La solution peut être stockée à température ambiante. Les colorants de chargement ne sont pas ajoutés à cette solution car elle peut obscurcir l'imagerie fluorescente.
- Préparer 2x dénaturant le colorant de chargement de gel comme suit. Lors de la purification de l'ARN et de l'ADN oligonucléotides, ajoutez 0,5 mL de 2,5 % (w/v) bleu bromophenol (BB) et 0,5 mL de 2,5 % (w/v) cyanol xylène (XC) à la solution décrite à l'étape 1,2,1, et ajoutez 8,5 mL de ddH2O au lieu de 9,5 mL. La solution peut être stockée à température ambiante.
- Préparer 100 ml de solution A en pesant 200,2 g d'urée (poids de la formule : 60,06 g/mol) et en l'ajoutant à 312,5 ml de 40 % 19:1 acrylamide :N,N'-methylenebisacrylamide. Remuer avec une barre magnétique à la vitesse maximale jusqu'à dissolution (environ 3 h) et faire la solution à 500 ml en utilisant ddH2O. Notez que les concentrations finales sont 6.667 M urée et 25% 19:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide. Conserver à 4 oC dans des plastiques propres.
- Préparer 1 L de la solution B en pesant 400,4 g d'urée et faire la solution à 1 L avec ddH2O; remuer jusqu'à ce que l'urée soit dissoute. La solution B peut être conservée à température ambiante.
- Préparer la solution C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) comme suit. Préparer 4 L de 10x TBE en pesant 432 g de base Tris et 220 g d'acide borique, en ajoutant 160 ml de 0,5 M EDTA avec un pH de 8 (filtré), et en constituant la solution à 4 L avec ddH2O. Un grand stock de ce tampon est fait car il est également utilisé comme tampon de fonctionnement de gel.
- Préparer 10% de persulfate d'ammonium (APS) en dissolvant 1 g d'APS dans un volume total de 10 ml de ddH2O. Magasin à 4 oC.
- Gardez la tétramethylethylenediamine (TEMED) à portée de main. Conservez-le à 4 oC avec la solution APS.
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Native PAGE (2x solution de chargement de gel indigène)
- Préparer 50 ml de solution de chargement de gel indigène 2x en mélangeant 25 ml de glycérol à 100 %, 10 ml de solution de coloration de gel 5x et 15 ml de ddH2O pour compenser la solution à 50 ml.
REMARQUE : Comme dans la section de gel dénaturant, les colorants de chargement peuvent être ajoutés à ce stock, mais leur addition peut potentiellement obscurcir le signal fluorescent dans le gel et, par conséquent, devrait être évité.
- Préparer 50 ml de solution de chargement de gel indigène 2x en mélangeant 25 ml de glycérol à 100 %, 10 ml de solution de coloration de gel 5x et 15 ml de ddH2O pour compenser la solution à 50 ml.
2. Préparation et chargement des gels dénaturants
- Préparer un gel dénaturant avec un pourcentage approprié en suivant le tableau 1. Considérez le système spécifique de coulée de gel ; Les gels de 30 ml sont couramment utilisés. Le pourcentage de gel approprié peut être estimé en utilisant le tableau 2: sélectionnez le pourcentage de polyacrylamide lorsque les colorants BB et XC ont des motricités plus rapides et plus lentes, respectivement, que l'ARN d'intérêt, afin d'assurer une séparation à haute bande dans la taille pertinente gamme.
- Mélangez les solutions A, B et C selon le tableau 1 et ajoutez APS et TEMED immédiatement avant de verser le gel. Mélangez bien les solutions dans des plastiques propres.
- Verser la solution de gel dans un appareil de coulée de gel approprié, après s'être assuré que tous les composants sont scrupuleusement propres. Soulevez un côté de l'appareil de sorte que le gel soit légèrement incliné lors de la coulée, afin d'éviter que les bulles d'air ne se coincent dans le gel lui-même.
- Insérez le peigne désiré et laissez-le polymériser (environ 30 min). Observez la polymérisation en cherchant de près un changement dans l'indice de réfraction autour des puits de gel. Maquillez le réservoir de gel en utilisant la solution 1x C (1x TBE) et retirez soigneusement le peigne. À l'aide d'une seringue, aspirer les puits immédiatement avant le chargement de l'échantillon.
- Préparer les échantillons dénaturantcommes comme suit. Ajoutez 2x solution de chargement de gel dénaturant aux échantillons d'ARN d'intérêt pour faire la solution de chargement de gel dénaturant 1x et la chaleur-dénature à 95 oC pendant 5 min en utilisant un thermocycleur ou un bain d'eau.
- Avant de charger les échantillons, refroidissez-les à l'air plusieurs minutes jusqu'à ce qu'ils soient frais au toucher. Chargez les échantillons en les superposant au fond de chaque puits, à l'aide de pointes de chargement de gel.
REMARQUE : Des pointes rondes peuvent être utilisées pour les gels d'épaisseur de 1 mm ou plus; utiliser des pointes plates pour les gels plus minces. - Exécuter les gels dénaturants à température ambiante. Assurez-vous que la puissance est suffisamment faible pour que les plaques de verre du système de gel ne se fissurent pas.
REMARQUE : Dans notre laboratoire, 28 W pour des plaques de 20 cm x 16 cm étaient suffisants à cette fin.
3. Préparation et chargement des gels indigènes
- Préparer un gel indigène avec un pourcentage approprié en se référant au tableau 3. Considérez le système spécifique de coulée de gel, mais gardez à l'esprit que les gels de 30 ml sont couramment utilisés. Mélanger les solutions de 1x TBE, 40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide, et le glycérol selon le tableau 3, et ajouter APS et TEMED immédiatement avant de verser le gel. Procédez comme décrit dans les étapes 2.3 et 2.4.
- Préparer des échantillons indigènes en ajoutant 2x solution de chargement de gel indigène aux échantillons d'ARN d'intérêt pour faire la solution 1x et lui permettre d'incuber à température ambiante pendant 100 min avant d'exécuter le gel pour assurer le pliage complet de l'ARN.
- Faire fonctionner le gel indigène dans une chambre froide à 4 oC, en veillant à ce que la puissance soit suffisamment faible pour ne pas chauffer le gel.
REMARQUE : Dans notre laboratoire, 14 W pour des plaques de 20 cm x 16 cm suffisait à cette fin.
4. Préparation de l'ARN par transcription T7 de ruissellement
REMARQUE : Les séquences d'ADN utilisées pour la transcription de ruissellement10 des constructions d'ARN Mango ont été commandées commercialement. Dans cette méthode, les oligonucléotides d'ADN contenant le complément inverse (RC) de la séquence à transcrire et du promoteur T7 sont hybrides à une séquence de brin supérieur de promoteur T7 et ensuite transcrit in vitro. Ci-dessous, pour chaque oligonucléotide, le RC de la séquence de base de mangue est montré en gras et le RC de la région de promoteur T7 est montré en italique. Les résidus dans la police régulière correspondent à des régions hélicoïdales complémentaires par ailleurs arbitraires requises pour permettre au noyau de mangue de se plier correctement.
Mangue I: GCA CGT ACT CTC CTC CCc GCA CCG CC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCT CCT CCT C GTACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
- Purification du gel préparifice des oligonucléotides d'ADN
- Pour une synthèse de l'ADN à l'échelle de l'amol de 0,2 , resuspendre l'oligonucléotide d'ADN déprotégé en 100 oL de ddH2O et 100 oL de colorant de chargement dénaturant 2x (à partir de l'étape 1.2.2). Dans ce cas, y compris les colorants de chargement de gel dans la solution de chargement à la même concentration que dans l'étape 1.2.2 est préféré.
- Purifier l'oligonucléotide d'ADN à l'aide d'un gel dénaturant à l'échelle préparative de 50 ml du pourcentage approprié de polyacrylamide; utiliser le tableau 2 pour choisir le pourcentage de gel. Par exemple, utilisez un gel de 8 % pour une séquence de 50 nt. Idéalement, le bleu bromophénol devrait courir plus vite que l'oligonucléotide, et le cyanol de xylène devrait courir plus lentement.
REMARQUE : Dans notre laboratoire, de tels gels ont été coulés à l'aide d'espaceurs de coulée d'une épaisseur de 1,5 mm et d'un peigne à chargement de gel avec des puits de 2 à 2,5 cm de large. - Chargez 100 L des solutions d'oligonucléotide d'ADN préparées à l'étape 4.1.2 par gel préparatif ainsi que décrites dans les étapes 2.4-2.7.
- Séchez soigneusement l'extérieur du gel, retirez les plaques de verre et recouvrez les deux côtés du gel d'une pellicule plastique. Placez-le sur un écran d'imagerie fluorescente (les plaques de chromatographie à couches minces à l'aluminium imprégnées de fluorophore sont une solution économique) et utilisez une lampe uv à longueur d'onde courte pour visualiser les bandes d'ADN par l'ombre UV.
- Une ombre nette et bien définie doit être observée si la synthèse de l'ADN est de haute qualité. Marquer les bandes sur la pellicule plastique, à l'aide d'un marqueur permanent.
REMARQUE : Protégez la peau et les yeux de la lumière UV et gardez les expositions courtes pour éviter d'endommager l'échantillon d'acide nucléique. - Placer le gel sur une plaque de verre propre, découper soigneusement les bandes marquées et placer chaque fragment de gel dans 400 L de 300 mM NaCl. Éluter l'ADN pendant la nuit, à l'aide d'un rotateur à température ambiante.
- Récupérer l'éludanse dans un tube de centrifugeuse propre et ajouter 2,5 équivalents d'éthanol pour précipiter l'ADN. Vortex bien et placer le tube à -20 oC pendant 30 min.
- Pelleter l'échantillon dans une centrifugeuse supérieure de banc à 156 000 x g pendant 30 min à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans ddH2O. Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer avec précision la concentration d'oligonucléotide d'ADN. Conservez l'échantillon sous forme de stock de 10 m pour plus de commodité à -20 oC.
- Transcription de ruissellement et purification de gel des échantillons d'ARN
- Préparer 5x stock de triphosphate nucléoside (NTP) en mélangeant des stocks ntP liquides constitués d'une concentration finale de 40 mM de guanosine triphosphate (GTP, 11 400 M-1cm-1), 25 mM de cytidine triphosphate (CTP, 7 600 M-1cm-1), 25 mM adénosine triphosphate (ATP, 5 000 M-1cm-1), et 10 mM d'uridine triphosphate (UTP, 10 000 M- 1cm-1); tous les coefficients d'extinction à 260 nm.
REMARQUE : Les stocks liquides ou en poudre peuvent être obtenus commercialement. Si vous préparez les stocks primaires à partir de poudre, ajustez soigneusement le pH à un pH final de 7,9, à l'aide de 1 M NaOH. Aliquot le stock dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml et le stocker à -20 oC. - Préparer 100 ml de 10x T7 transcription tampon stock en mélangeant 25,6 mL de 1 M Tris-HCl, 14,4 ml de 1 M Tris base, 26 ml de 1 M MgCl2, 10 ml de 10% Triton X-100, et 0,637 g de spermidine. Composent le stock à un volume final de 100 ml en ajoutant ddH2O.
REMARQUE : Un pH final de 7,9 de la solution 1x doit être confirmé à l'aide d'un pH mètre calibré. Le 10x doit être filtré stérilement et stocké à -20 oC dans des aliquots de taille convenable. - Effectuer la transcription comme suit.
- Ajouter les réactifs suivants pour constituer une concentration finale de tampon de transcription 1x T7 à l'aide du stock tampon de transcription 10x T7 et ddH2O (à partir de l'étape 4.2.2), 1x NTP, 10 mM de dithiothreitol (TTT), 1 'M T7 séquence du brin supérieur (voir la section 4 Note pour le séquence), 1 séquence d'ADN de mangue purifiée par gel (étape 2.1), et enzyme de polymérase d'ARN T7 (1 U/L).
- Vortex, spin down, and incubate the solution at 37 oC for 2 h or until it becomes cloudy and a white precipitate forms at the bottom of the tube. Une transcription de 50 L devrait donner lieu à 50 L d'ARN de 50 m après la purification du gel. Ajouter un volume égal de colorant dénaturant 2x et le stocker à -20 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la purification du gel.
- Gel-purifier l'ARN résultant tel que décrit dans la section de purification de gel d'oligonucléotides d'ADN en suivant des étapes 4.1.2-u20124.1.8, substituant l'échantillon d'ARN pour l'ADN.
REMARQUE : L'ARN est extrêmement sensible à la dégradation de la RNase, alors assurez-vous que, à toutes les étapes, des gants et une blouse de laboratoire propre sont portés en tout temps. Assurez-vous que tous les échantillons sont préparés et stockés dans des plastiques à usage unique pour se protéger contre la contamination par la RNase, et lavez soigneusement les plaques de verre avec du savon chaud et de l'eau avant de l'utiliser, rincez-les soigneusement avec le ddH2O et séchez la verrerie avec le l'aide de l'éthanol appliqué à partir d'une bouteille de compression. - Utilisez 1 L de l'échantillon d'ARN final et, à l'aide d'un spectrophotomètre à base de gouttelettes, déterminez l'absorption à 260 nm. À l'aide d'un coefficient d'extinction déterminé par la méthode voisine la plus proche, calculez la concentration d'ARN et ajustez la concentration de l'échantillon à 10 M avec ddH2O pour plus de commodité. Conserver les échantillons d'ARN à -20 oC.
- Préparer 5x stock de triphosphate nucléoside (NTP) en mélangeant des stocks ntP liquides constitués d'une concentration finale de 40 mM de guanosine triphosphate (GTP, 11 400 M-1cm-1), 25 mM de cytidine triphosphate (CTP, 7 600 M-1cm-1), 25 mM adénosine triphosphate (ATP, 5 000 M-1cm-1), et 10 mM d'uridine triphosphate (UTP, 10 000 M- 1cm-1); tous les coefficients d'extinction à 260 nm.
- Escherichia coli extraction totale d'acide nucléique brut
REMARQUE : Le protocole suivant est un exemple. Ce protocole utilise endogènement exprimé Mango I-marqué 6S ARN à partir d'un plasmide dans E. coli, et l'induction de ce plasmide est décrit ailleurs dans le détail4.- Aux fins de cette étude, préparer 500 ml de cellules induites pour la mangue pEcoli-ARN et les plasmides pEcoli-T1 (les cellules sont induites à un OD600nm de 1). Pelleter les cellules et les stocker à -80 oC avant de les utiliser.
- Effectuez l'extraction d'ARN comme suit.
- Prenez 0,5 ml de granule de cellules pEcoli induite et ajoutez 500 l de phénol équilibré. Ensuite, vortex l'échantillon; la solution deviendra blanc laiteux. Centrifugeàeur à vitesse maximale pendant 2 min pour séparer les couches.
- Extraire la couche supérieure, qui sera légèrement jaune, et répéter l'étape 4.3.2.1 en ajoutant un volume égal de phénol, centrifuge, et l'extraction pour un total de 5x (ou jusqu'à ce que la couche moyenne, qui est blanc opaque, disparaît et seulement deux couches claires sont à gauche).
- Ajouter le volume aqueux extrait du phénol à un volume égal de chloroforme, de vortex, puis de centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2 min.
- Extraire la couche aqueuse et ajouter NaCl à une concentration finale de 300 mM. Précipitez l'acide nucléique résultant par l'ajout de 2,5 équivalents d'éthanol, de vortex, de spin down et précipitez-vous à -20 oC pendant au moins 30 min.
- Pelleter dans une centrifugeuse de banc à 15,6 x 1 000 x g à 4 oC pendant 30 min. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en 100 oL de ddH2O.
- Ajouter une étape de digestion DNase I à cette procédure, suivant le protocole référencé11, pour obtenir l'ARN total.
REMARQUE: Vortex vigoureusement jusqu'à ce que la pastille est complètement dissous en ddH2O.
5. Coloration post-gel
- Préparer la solution de coloration de gel 1x selon la recette dans l'étape 1.1.3 et l'ajouter à un récipient en verre propre qui est assez large pour s'adapter confortablement le gel.
REMARQUE : Les récipients en verre de Borosilicate avec les couvercles d'ajustement de claquement servent bien à cet usage. - Ajouter assez de 1x gel solution de coloration au récipient de sorte que le gel est complètement recouvert de la solution et le liquide sloshes sur le dessus du gel quand il est placé sur le rotateur orbital.
REMARQUE : Le récipient doit être assez grand pour s'adapter au gel de sorte qu'il puisse se déplacer et avoir assez de tampon dans le récipient pour couvrir entièrement le gel. - Une fois que le gel natif ou dénaturant a fini de fonctionner (section 2 ou 3, respectivement), retirez le gel de l'appareil et coupez ses puits. Il peut être utile d'enlever un coin du gel pour l'orientation plus tard dans l'analyse.
- Transférer délicatement le gel à la solution de coloration de gel 1x préparée à l'étape 5.2.
REMARQUE: Les gels sont fragiles et sujettes à la rupture alors soyez prudent lors du transfert du gel. Gardez le couvercle sur le récipient de coloration en tout temps afin de ne pas contaminer le gel. - Placer le gel sur un rotateur orbital à une vitesse de 100 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE : Assurez-vous que le gel ne se replie pas sur lui-même; sinon, l'ARN peut se diffuser hors du gel et ainsi étiqueter une partie différente du gel.
6. Imagerie Des ARN étiquetés mangue dans le gel
- Décant soigneusement le tampon d'imagerie. Rincer le gel rapidement avec de l'eau, en veillant à ce qu'il reste suffisamment de liquide pour garder le gel légèrement mobile dans le récipient.
- Transférer délicatement le gel sur l'imageur. Transférer en ramassant soigneusement les côtés du gel et en le plaçant sur le plateau de l'imageur; alternativement, le gel peut être versé lentement sur le plateau. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles sous le gel et qu'il n'y a pas d'excès de liquide sous le gel. Une pipette roulée sur le gel peut être utile pour enlever tout excès de liquide.
REMARQUE : Utilisez un essuie-tout pour absorber l'excès de liquide. - Prenez une image de gel, en observant la fluorescence entre la longueur d'onde d'excitation 510 nm et la longueur d'onde d'émission 535 nm (par exemple, feu vert à 520 nm réglages de fluorescence de longueur d'onde sur l'imageur). Assurez-vous que les réglages sont entièrement optimisés sur l'instrument et suivez attentivement les instructions pour l'instrument utilisé.
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Representative Results
Des ARN à courte mangue ont été préparés comme décrit dans la section du protocole. En supposant que la fluorescence dans les conditions dénaturantes serait plus difficile à observer en raison de la présence d'urée dans les gels, nous avons d'abord étudié la résistance des accoucheuses de mangue à l'urée, qui agit comme un dénaturant d'acide nucléique. Nous avons constaté que les acquiamères à la mangue sont considérablement résistants à la dénaturation jusqu'à une concentration d'urée d'environ 1 M (figure 2A). Avant d'ajouter une solution de coloration de gel à un gel dénaturant, la concentration finale d'urée dans le gel est de 6 M. L'ajout d'une solution de coloration suffisante pour diminuer cette concentration à 1 M serait donc optimal pour assurer la fluorescence complète de la mangue pour les quatre aptamères. Dans la pratique, le protocole de coloration a obtenu moins que ce résultat entièrement optimal, mais cela pourrait simplement être corrigé si nécessaire en utilisant plus de solution de coloration ou par le simple expédient de changer la solution une fois pendant la coloration.
Une fois que les constructions d'ARN étiquetées Mango ont été écrasées dans un gel dénaturant, le temps de coloration a été optimisé pour la fluorescence maximale de gel en chargeant trois différentes quantités de mangue III dans un gel dénaturant de 8% (figure 2B). Un cours de temps a indiqué qu'après 5 min de trempage dans la solution de coloration de gel, la fluorescence était clairement visible. La fluorescence maximale de la construction De Mango III a été obtenue après 20 à 40 min de coloration, après quoi les petits ARN utilisés dans cette étude ont commencé à se diffuser hors du gel, entraînant une perte de signal fluorescent (figure 2B). Par conséquent, les gels indigènes et dénaturants ont été souillés pendant 30 min chacun. Des constructions d'ARN plus longues pourraient facilement tolérer des temps tachés plus longs car ils seraient beaucoup moins susceptibles de se diffuser hors du gel.
Certains des aptamers de mangue d'ARN se sont pliés plus rapidement que d'autres. Chacun des aptamers de mangue utilisés dans cette étude a été incubé dans un tampon de gel complété avec 1,5 M d'urée et 100 nM TO1-Biotine colorant et analysé à l'aide d'un fluoromètre. La mangue I, II et III a été entièrement pliée après 10 min, tandis que la mangue IV s'est considérablement repliée seulement après 40 min (figure 3A). En l'absence d'urée, le pliage a été beaucoup plus rapide que prévu (figure 3B). Pour nous assurer que les échantillons de gel indigènes étaient entièrement pliés, nous avons préincubé des échantillons pendant 100 minutes avant de les exécuter dans des gels indigènes. Pratiquement, les données de la figure 3 suggèrent que cette période pourrait être considérablement réduite selon l'aapte mango utilisé.
Une fois que le protocole a été optimisé pour détecter la fluorescence des aptamers de mangue d'ARN, la sensibilité de la méthode de coloration a été déterminée pour chacune des variantes de mangue dans les deux gels indigènes. Des bandes simples correspondant à des ARN bien pliées ont été observées pour chacune des quatre mangues dans les gels indigènes (figure 4A). Lors de la dilution en série, aussi peu que 62,5 fmol de Mango II ont pu être observés, tandis que aussi peu que 125 fmol de Mangue I, III, et IV ont été facilement visualisés. La quantification des gels indigènes était en rondins linéaires sur environ 1,5 ordre de grandeur, avec Mango I, II et IV se comportant d'une manière plus linéaire que La mangue III (Figure 4B).
Les résultats des gels dénaturants étaient légèrement moins sensibles que les gels indigènes mais étaient plus linéaires. Aussi peu que 125 fmol de Mangue II et III ont été facilement détectés (Figure 4C). Fait intéressant, la quantification (figure 4D) a indiqué que les gels dénaturants étaient indilignes ou deux ordres de grandeur. Nous émettons l'hypothèse que, contrairement aux gels indigènes où les plis d'ARN ont peut-être été soumis à la dénaturation partielle pendant le processus de fonctionnement de gel, la présence de l'urée dans le gel dénaturant pourrait fournir un moyen plus homogène de plier les aptamers une fois qu'ils sont placés dans la solution de coloration TO1-Biotin.
Comme avec toutes les méthodes de coloration de gel, si le gel n'est pas soigneusement transféré dans le récipient, ou la vitesse de rotation est trop élevée pendant la période de coloration, le gel peut se replier sur lui-même (Figure 5A). Cela peut entraîner la diffusion de l'échantillon d'ARN étiqueté mangue d'un endroit à l'autre, mais peut être facilement évité dans la pratique. Dans les gels indigènes et, en particulier, pour la mangue IV, nous avons observé que le pliage incomplet peut se manifester dans l'apparition de plusieurs bandes vraisemblablement correspondant à des conformations d'ARN partiellement/mal repliées (Figure 5B) résultant de temps de pliage plus courts. Les problèmes de pliage dans les gels indigènes peuvent être évités en préincérant des échantillons d'ARN de manière appropriée comme décrit précédemment et en exécutant des gels indigènes dans une pièce froide. Dans les gels dénaturants, où l'ARN se replie in situ dans le gel, le pliage erroné n'était pas un problème significatif. Enfin, en l'absence d'ARN, très peu de fluorescence de fond a été observée dans l'un ou l'autre système de gel.
Ensuite, la spécificité de l'étiquette de mangue d'ARN a été étudiée en surexprimant l'ARN régulateur 6S dans les bactéries. Cet ARN a été précédemment marqué à l'aide de mangue I (Figure 1E)4. Les cellules bactériennes ont été transformées avec le plasmide de mangue de pEcoli-ARN (maintenant M plasmid) ou le plasmide de pEcoli-T1 comme contrôle négatif (maintenant E plasmid). Des cellules transformées ont été cultivées dans le milieu liquide de bouillon de lysogénie jusqu'à ce qu'un OD600 de 1.0 ait été atteint. Les cultures ont ensuite été induites avec 50 'M isopropyl '-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pendant 40 min. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min. L'ARN total a été extrait à l'aide de l'extraction de chloroforme de phénol-phénol à partir de granulés cellulaires12, tel que décrit dans la section du protocole. Les échantillons totaux d'ARN ont été concentrés par précipitation d'éthanol et ont ensuite été traités avec dNase I, suivant le protocole, pour enlever l'ADN11. Avant d'utiliser, l'ARN était concentré par les précipitations d'éthanol.
L'ARN bactérien total a été exécuté dans 8% gels dénaturants (figure 6) et souillé avec SG13 ou TO1-Biotine. Pour la coloration SG, 10 l de 10 000x SG ont été ajoutés à 100 ml de tampon de gel ; autrement, le protocole de coloration était identique à celui utilisé pour TO1-Biotine. Comme prévu, de fortes taches de SG ont été observées pour une multitude d'ARN, mais surtout pour les ARN ribosomal (rRNA) et les ARN de transfert (ART) (figure6, panneau gauche). Bien que la coloration dépendante de la mangue (voies M) puisse être observée dans ces gels tachés de SG, elles n'ont pas pu être identifiées de façon unique étant donné le modèle complexe de coloration observé à l'aide de cette tache universelle. En revanche, les gels tachés de TO1-Biotine ont mis en évidence les bandes dépendantes de la mangue comme les bandes les plus importantes. Seules les bandes d'ARN ribosomal sont considérées comme en concurrence avec les bandes 6S Mango-dépendantes. Un certain nombre de bandes non spécifiquement tachées pourraient également être observées. Néanmoins, les bandes dépendantes de La mangue étaient de nouveau dominantes, n'ayant que les bandes rRNA et tRNA comme concurrents faiblement concurrents (figure6, panneau droit).
Figure 1 : Système d'aptamer de mangue. (A) TO1-Biotin fluorophore. (B) Mangue I. (C) Mangue II. (D) Mangue III. Les panneaux BetD montrent la structure secondaire de chaque aptane. P1 est une tige arbitraire. La boucle de tige GNRA-like (ici GAAA) trouvée dans La mangue I et II est montrée en rouge, le motif triplex de Mango III est montré en violet. (E) L'ARN réglementaire 6S étiqueté avec Mango I. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Effet de l'urée sur la fluorescence des avamères de mangue et les temps de coloration optimaux. (A) Une titration d'urée utilisant 50 nM RNA Mango I (cercles orange), Mangue II (cercles verts), Mangue III (cercles violets), et Mangue IV (cercles bleus), ainsi que 100 nM TO1-Biotine colorant et aux concentrations d'urée indiquées. Les échantillons ont été incubés pendant 40 min avant que la fluorescence ne soit lue à une longueur d'onde d'excitation de 510 nm et une longueur d'onde d'émission de 535 nm. (B) L'ARN de Mango III a été chargé dans un gel dénaturant de 8% et souillé avec une solution de gel contenant 20 nM colorant final TO1-Biotine. Pour chaque point de temps indiqué, 0,064, 0,32 et 1,6 pmol d'ARN de Mangue III ont été utilisés de gauche à droite. L'image de gel a été visualisée avec un imageur de fluorescence utilisant un laser de 520 nm et une exposition de 10 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Temps de pliage des accoucheurs de mangue s'il y a présence et absence d'urée. (A) En présence de 1,5 M d'urée et 100 nM TO1-Biotine, des cours de fluorescence ont été effectués à l'aide de 50 nM de chaque ARN Mango construit (RNA Mango I: points orange, Mango II: points verts, Mango III: points violets, et Mango IV: points bleus). (B) Identique au panneau A, sauf en l'absence d'urée. Tous les cours de temps ont été exécutés à température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images fluorescentes de PAGE native et dénaturante avec ARN Mango construits. (A) Un gel indigène de 8% avec des constructions de mangue d'ARN en série diluées. Les voies I, II, III et IV contiennent chacune 8 quantités finales d'ARN Mango I, II, III et IV, respectivement. Les panneaux de droite sont deux dilutions sérielles contenant 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0,5 pmol, 0,25 pmol, 0,125 pmol, et 0,0625 pmol de Mango I, II, III ou IV, comme indiqué. La voie 12 ne contient pas d'ARN. (B) Quantification de trois répliques du gel indigène (déviation standard de la moyenne indiquée pour chacun). (C) Un gel dénaturant de 8% avec les mêmes échantillons chargés que dans le panneau A, à l'exception du fait que la solution de chargement de gel dénaturant a été utilisée au lieu de la solution de chargement de gel indigène. (D) Trois répliques quantifiées du gel dénaturant (déviation standard de la moyenne indiquée pour chacun). Toutes les images de gel ont été visualisées un imageur de gel avec un laser de 520 nm et une exposition de 10 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Gels sous-optimaux et pliage incomplet de La mangue IV dans un gel indigène à 8 %. (A) Une dilution sérielle du type indiquée dans la figure 4 pour La mangue II, mais montrant l'effet du pliage du gel pendant le protocole de coloration. (B) Échantillons de gel indigène siniso isodu iv qui n'ont pas été laissés plier assez longtemps dans un tampon indigène avant de charger le gel présentent des bandes doubles. Dans le cas contraire, ces résultats sont semblables aux résultats de Mango IV indiqués à la figure 4A. Toutes les images de gel ont été visualisées à l'aide d'un imageur de gel avec un laser de 520 nm et une exposition de 10 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Les ARN étiquetés mangue peuvent être détectés en présence de l'ARN total, à l'aide de la coloration TO1-Biotine. 8% gels dénaturants ont été chargés avec 100 ng d'ARN total et ont été exécutés pendant 30 min. Le gel gauche a été taché avec SG et le panneau droit avec TO1-Biotine. Pour les deux panneaux, les voies étiquetées E étaient chargées de 100 ng de pEcoli-T1 (pas d'étiquette de mangue) et les voies étiquetées M étaient chargées de 100 ng de gogo pEcoli-ARN (6S ARN étiqueté avec une étiquette Mango I). Des images de gel to1-Biotin-tachées ont été visualisées à l'aide d'un imageur avec un laser de 520 nm et une exposition de 10 min. Des images de gel souillés de SG ont été visualisées à l'aide d'un imageur de gel à l'aide d'un laser de 460 nm et d'une exposition de 10 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| pourcentage | VOLUME DE GEL | |||
| 20 ml | 30 ml | 50 ml | ||
| 5% | un | 4 ( en plus) | 6 Annonces | 10 Ans et plus |
| B | 14 (en) | 21 Ans, états-unis | 35 Annonces | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 6 % | un | 4,8 Annonces | 7,2 Annonces | 12 Ans, états-unis |
| B | 13,2 | 19,8 | 33 Ans, états-unis ( | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 8 % | un | 6,4 Annonces | 9,6 Annonces | 16 Annonces |
| B | 11,6 Annonces | 17,4 Annonces | 29 Ans et plus | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 10% | un | 8 Annonces | 12 Ans, états-unis | 20 Ans, états-unis |
| B | 10 Ans et plus | 15 Annonces | 25 Annonces | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 12 % | un | 9,6 Annonces | 14,4 | 24 Ans, états-unis |
| B | 8,4 | 12,6 Annonces | 21 Ans, états-unis | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 15% | un | 12 Ans, états-unis | 18 ans, états-unis qui | 30 Ans, états-unis ( |
| B | 6 Annonces | 9 (en) | 15 Annonces | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| 20% | un | 16 Annonces | 24 Ans, états-unis | 40 ans, états-unis ( |
| B | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| C | 2 (en) | 3 (en) | 5 Annonces | |
| APS (L) | 48 Annonces | 72 Annonces | 120 Ans et plus | |
| TEMED (L) | 20 Ans, états-unis | 30 Ans, états-unis ( | 50 Annonces | |
Tableau 1 : Table de coulée de gel PAGE dénaturante. Une solution A, B et Une solution B, C et une solution C.
| Dénaturation Gel % | BB (mobilité nt) | XC (mobilité dans nt) |
| 5 Annonces | 35 Annonces | 130 Ans et plus |
| 6 Annonces | 26 Annonces | 106 Annonces |
| 8 Annonces | 19 ans, états-unis qui | 70 à 80 ans |
| 10 Ans et plus | 12 Ans, états-unis | 55 Annonces |
| 20 Ans, états-unis | 8 Annonces | 28 Annonces |
| 23 Ans, états-unis | 5 à 6 ans |
Tableau 2 : Mobilités approximatives de gel bleu bromophenol (BB) et de cyanol xylène (XC) de chargement de colorants de chargement dans les gels dénaturants de polyacrylamide.
| pourcentage | VOLUME DE GEL | |||
| 20 ml | 30 ml | 50 ml | ||
| 5% | 1X TBE | 16,5 annonces | 24,75 | 41,25 |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 2,5 Annonces | 3,75 | 6h25 | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 6 % | 1X TBE | 16 Annonces | 24 Ans, états-unis | 40 ans, états-unis ( |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 3 (en) | 4,5 Annonces | 7,5 | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 8 % | 1X TBE | 15 Annonces | 22,5 | 37,5 annonces |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 4 ( en plus) | 6 Annonces | 10 Ans et plus | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 10% | 1X TBE | 14 (en) | 21 Ans, états-unis | 35 Annonces |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 5 Annonces | 7,5 | 12,5 | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 12 % | 1X TBE | 13 (en) | 19,5 ans | 32,5 Annonces |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 6 Annonces | 9 (en) | 15 Annonces | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 15% | 1X TBE | 11,5 Annonces | à 17 h 25 | 28,75 |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 7,5 | à 11 h 25 | à 18 h 75 | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| 20% | 1X TBE | 9 (en) | 13,5 annonces | 22,5 |
| 40% 29:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide | 10 Ans et plus | 15 Annonces | 25 Annonces | |
| Glycérol | 1 Fois | 1,5 | 2,5 Annonces | |
| APS (L) | 48 Annonces | 72 Annonces | 120 Ans et plus | |
| TEMED (L) | 20 Ans, états-unis | 30 Ans, états-unis ( | 50 Annonces | |
Tableau 3 : Table de coulée de gel NATIVE PAGE.
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Discussion
Un avantage significatif de l'étiquette fluorescente Mango est qu'une seule étiquette peut être utilisée de plusieurs façons. La luminosité élevée et l'affinité de ces aptamers les rendent utiles non seulement pour la visualisation cellulaire 2, mais aussi pour l'ARN in vitro ou la purification RNP4. Par conséquent, l'imagerie gel étend la polyvalence de l'étiquette Mango d'une manière simple. La sensibilité d'imagerie de gel de mangue est légèrement inférieure à celle d'une tachenordique 14 mais peut facilement détecter 60-120 fmol de l'échantillon d'ARN, sans avoir besoin de transfert de membrane long et fastidieux et des étapes de sondage. Ceci est comparable à l'efficacité de sondage basée sur l'hybridation trouvée précédemment pour les petits ARN dans le gel15. Alors que d'autres méthodologies fluorogéniques aptamer- en particulier, rna Épinards- ont une plus grande sensibilité et la spécificité9, aucun n'a actuellement simultanément la luminosité élevée et l'affinité du système de marécage de mangue, qui permet à une seule étiquette d'ARN d'être utilisé pour l'imagerie cellulaire, la purification RNP, et maintenant l'imagerie gel.
Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole de coloration de gel. Lorsque vous travaillez avec des solutions d'ARN, les solutions doivent être filtrées stériles, et des logiciels plastiques à usage unique doivent être utilisés. Catuion, l'exécution des gels indigènes comme complexes ou structures d'ARN peut être facilement dénaturé si les niveaux de puissance pour le gel sont trop élevés et ont comme conséquence le chauffage de gel. Assurez-vous que toute verrerie usagée est propre et non contaminée par les RNases. En outre, soyez toujours prudent lors du transfert et la cueillette des gels car ils sont fragiles et peuvent être sujettes à la rupture.
La tache TO1-Biotine pénètre rapidement les gels, mais les données présentées ici indiquent également que le pliage de la mangue IV, en particulier, peut limiter les taux (figure2 et figure 3). En utilisant les conditions énoncées dans la section du protocole, nous avons observé un comportement log-linéaire pour les quatre aptamères sur deux ordres de grandeur dans les gels dénaturants, ce qui rend la méthode utile pour la quantification (Figure 4C, D). Puisque les petits aptamers de mangue utilisés dans cette étude facilement diffusés hors de la matrice de gel, nous nous attendons à ce que la quantitation s'améliore pour de plus longues constructions d'ARN.
La méthodologie d'imagerie de gel d'étiquette de mangue démontrée ici est robuste et devrait pouvoir être simplement étendue en termes de sensibilité et de spécificité. Mango I, II et III se plient de façon fiable, tandis que Mango IV ne le fait pas. Bien que nous n'ayons pas exploré les protocoles de destaining, nous prévoyons qu'une telle approche pourrait aussi simplement améliorer la spécificité. Bien qu'au-delà de la portée de ce travail, l'étiquette de fluorescence et de biotine conférée à l'ARN marqué par Mango lors de l'utilisation du fluorophore TO1-Biotin semble très susceptible de rationaliser davantage l'analyse et la purification du gel. Les techniques d'étiquetage secondaire de la biotine disponibles dans le commerce, par exemple, promettent d'améliorer davantage les limites de détection de ce système simple d'étiquetage de la mangue à ARN. De même, il semble probable que les complexes protéiques d'ARN marqués par mango indigènes peuvent être élucidés à partir d'un gel et récupérés à l'aide de perles magnétiques streptavidinafin afin de capturer le complexe d'ARN éludé. Cela simplifierait davantage la purification systématique des ARN et des complexes d'ARN biologiquement importants par le simple expédient d'ajouter une étiquette de mangue à l'ARN d'intérêt.
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Disclosures
Un brevet est en instance sur le système fluorogène de mangue.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Razvan Cojocaru et Amir Abdolahzadeh pour leur assistance technique et Lena Dolgosheina pour la relecture du manuscrit. Une subvention de fonctionnement du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) a été accordée à P.J.U. pour ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
