Summary
Her presenterer vi en følsom, rask, og diskriminerende post-gel Fargemetode til bilde RNAs tagget med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, ved hjelp av enten native eller denaturering polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Etter å ha kjørt standard PAGE gels, kan mango-Tagged RNA enkelt farget med TO1-biotin og deretter analyseres ved hjelp av allment tilgjengelige fluorescens lesere.
Abstract
Native og denaturering polyakrylamid gels brukes rutinemessig til å karakterisere ribonucleoprotein (RNP) kompleks mobilitet og å måle RNA størrelse, henholdsvis. Så mange gel-Imaging teknikker bruke spesifikke flekker eller dyre fluoroforen sonder, følsom, diskriminerende, og økonomiske gel-Imaging metoder er svært ønskelig. RNA mango kjerne sekvenser er små (19 – 22 NT) sekvens motiver som, når de er lukket av en vilkårlig RNA-stamme, kan enkelt og rimelig legges til en RNA av interesse. Disse mango Tags binder med høy affinitet og spesifisitet til en tiazol-oransje fluoroforen ligand kalt TO1-biotin, som blir tusenvis av ganger mer fluorescerende ved binding. Her viser vi at mango i, II, III, og IV kan brukes til spesielt bilde RNA i gels med høy følsomhet. Så lite som 62,5 fmol av RNA i native gels og 125 fmol av RNA i denaturering gels kan oppdages ved soaking gels i en avbildnings buffer som inneholder kalium og 20 nM TO1-biotin i 30 min. Vi demonstrerer spesifisitet av det mango-kodede systemet ved å avbilde en mango-Tagged 6S bakteriell RNA i sammenheng med en kompleks blanding av total bakteriell RNA.
Introduction
Mango er en RNA merking system bestående av et sett av fire små fluorescerende RNA aptamers som binder tett (nanomolar binding) til enkle derivater av tiazol-Orange (TO1-biotin, figur 1a)1,2,3 . Ved binding økes fluorescens av denne ligand 1 000-til 4 000-fold avhengig av den spesifikke aptamer. Den høye lysstyrken til mango-systemet, som for mango III overstiger det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (eGFP), kombinert med nanomolar bindende affinitet til RNA mango-aptamers, gjør at den kan brukes både i bildebehandling og ved rensing av RNA komplekser2,4.
X-ray-strukturene til mango I5, II6og III7 har blitt bestemt til høy oppløsning, og alle tre aptamers bruker en RNA-quadrapleksbilder til å binde TO1-biotin (figur 1B– D). De kompakte kjernene av alle tre aptamers er isolert fra den eksterne RNA-sekvensen via kompakte adapter motiver. Både mango I og II benytter en fleksibel GNRA-lignende sløyfe adapter for å koble sine mango kjerner til en vilkårlig RNA duplex (figur 1B, C). I kontrast, bruker mango III en stiv triplex motiv for å koble sin kjerne til en vilkårlig RNA Helix (figur 1d, lilla rester), mens strukturen i mango IV er foreløpig ikke kjent. Siden den ligand kjernen i hver av disse aptamers er adskilt fra den eksterne RNA-sekvensen av disse spiral adapterne, synes det sannsynlig at de alle kan enkelt innlemmes i en rekke RNAs. Den bakterielle 6s regulatoriske RNA (mango i), komponenter av gjær spliceosome (mango i), og den menneskelige 5s RNA, U6 RNA, og en C/D scaRNA (mango II og IV) har alle blitt tagget i denne moten2,8, noe som tyder på at mange biologiske RNAs kan merkes med RNA mango aptamer-systemet.
Denaturering og Native gels brukes ofte til å studere RNAs. Denaturering gels brukes ofte til å bedømme RNA størrelse eller RNA prosessering, men vanligvis, i tilfelle av en nordlig blot, for eksempel, krever flere langsomme og sekvensielle trinn for å generere et bilde. Mens andre RNA fluorogenic aptamers, slik som RNA spinat og brokkoli, har vært brukt med hell for gel Imaging9, no fluorogenic aptamer system hittil besitter høylys styrke og affinitet av mango-systemet, noe som gjør det av stor interesse å undersøke mango ' s gel-Imaging evner. I denne studien lurte vi på om RNA mango-systemet bare kunne utvides til gel Imaging, ettersom eksitasjon-og utslipps bølgelengdene til TO1-biotin (henholdsvis 510 NM og 535 NM) er egnet for bildebehandling i eGFP-kanalen som er felles for de fleste fluorescerende instrumenter for gel skanning.
Den post-gel farging protokollen som presenteres her gir en rask måte å spesifikt oppdage mango-Tagged RNA molekyler i native og denaturering polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Denne farge metoden innebærer soaking gels i en buffer som inneholder kalium og TO1-biotin. RNA mango aptamers er G-quadrapleksbilder basert og kalium er nødvendig for å stabilisere slike strukturer. Ved hjelp av RNA transkribere fra minimale mango-koding DNA maler (se protokollen delen), kan vi bare oppdage så lite som 62,5 fmol av RNA i native gels og 125 fmol av RNA i denaturering gels, ved hjelp av en enkel fargeprotokoll. I motsetning til vanlige uspesifisert nukleinsyre yre flekker (se tabell over materialer, referert til SG fra heretter), kan vi tydelig identifisere mango-Tagged RNA selv når høye konsentrasjoner av totalt umerkede RNA er til stede i prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling av reagensene
-
TO1-biotin poststaining oppløsning (gel farge løsning)
- Lag 1 L av 1 M fosfat buffer ved pH 7,2 ved 25 ° c ved å tilsette 342 mL 1 M av na2HPO4 og 158 ml 1 m NaH2PO4. Juster pH til 7,2 ved 50 mM ved å tilsette den aktuelle fosfat oppløsningen. Sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar oppløsningen i plasticware ved romtemperatur.
- Klargjør 5x farge løsning for gel (uten TO1-biotin) som følger. Utgjør en 1 L-løsning ved å blande 247,5 mL ddH2O, 700 ml 1 m KCl, 50 ml 1 m fosfat buffer (pH 7,2) og 2,5 ml mellom 20. Sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar løsningen i plasticware. Den kan oppbevares ved romtemperatur.
Merk: MgCl2 kan legges til denne løsningen hvis det er nødvendig fordi det potensielt kan stabilisere RNA-komplekser. Dette vil ha en beskjeden innvirkning på fluorescerende signal2. - Lag en 1x gel farge løsning ved hjelp av farge løsningen 5x gel fra trinn 1.1.2 og umiddelbart før bruk, supplere den med TO1-biotin fluoroforen (se tabell over materialer) til en endelig konsentrasjon på 20 nM. Du kan for eksempel legge til 20 mL 5x farge oppløsning på 80 mL deionisert vann for å lage 100 mL 1x gel farge løsning, og tilsett 2 μL av en 1 mM TO1-biotin (klargjort i dimethylformamide).
Merk: utryddelse koeffisienten for TO1-biotin fargestoff på 500 NM er 63 000 M-1· cm-1, målt i farge løsning1.
-
Denaturering PAGE (2x denaturering løsning for gel lasting og løsninger A, B, C, ammonium persulfate og tetrametyletylendiamin)
- Klargjør 50 mL 2x denaturering ved å blande 40 mL formamid, 0,5 mL 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA, pH 8,0) og 9,5 mL ddH2O. Løsningen kan oppbevares ved romtemperatur. Lasting av fargestoffer er ikke lagt til denne løsningen som det kan skjule fluorescerende Imaging.
- Forbered 2x denaturering gel lasting fargestoff som følger. Ved rensing av RNA-og DNA-oligonukleotider, tilsett 0,5 mL på 2,5% (w/v) bromophenol blå (BB) og 0,5 mL på 2,5% (w/v) xylen cyanol (XC) til løsningen beskrevet i trinn 1.2.1, og tilsett 8,5 mL av ddH2O i stedet for 9,5 ml. Løsningen kan oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 100 mL oppløsning ved å veie ut 200,2 g urea (formel vekt: 60,06 g/mol) og legge den til 312,5 mL 40% 19:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide. Rør den med en magnetisk rør bar med maksimal hastighet til oppløst (ca 3 h) og utgjør løsningen til 500 mL ved hjelp av ddH2O. Merk at de endelige konsentrasjonene er 6,667 M urea og 25% 19:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide. Oppbevares ved 4 ° c i ren plasticware.
- Forbered 1 L løsning B ved å veie ut 400,4 g urea og gjøre opp løsningen til 1 L med ddH2O; røre til urea har oppløst. Løsning B kan oppbevares ved romtemperatur.
- Klargjør løsning C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) som følger. Forbered 4 L av 10x TBE ved veiing ut 432 g Tris base og 220 g borsyre syre, og legger til 160 mL av 0,5 M EDTA med en pH på 8 (filtrert), og gjør opp løsningen til 4 L med ddH2O. Et stort lager av denne bufferen er laget som det er også brukt som gel kjører buffer.
- Klargjør 10% ammonium persulfate (APS) ved å oppløse 1 g av APS i et total volum på 10 mL ddH2O. oppbevares ved 4 ° c.
- Hold tetrametyletylendiamin (TEMED) hendig. Oppbevar den ved 4 ° c sammen med APS-løsningen.
-
Native PAGE (2x native gel lasting løsning)
- Forbered 50 mL 2 x ukomprimert gel lasting løsning ved å blande 25 mL 100% glyserol, 10 mL 5x farge oppløsning, og 15 mL ddHtoO å gjøre opp løsningen til 50 ml.
Merk: som i denaturering gel delen, lasting fargestoffer kan legges til denne aksjen, men deres tillegg kan potensielt skjule fluorescerende signal i gel, og dermed bør unngås.
- Forbered 50 mL 2 x ukomprimert gel lasting løsning ved å blande 25 mL 100% glyserol, 10 mL 5x farge oppløsning, og 15 mL ddHtoO å gjøre opp løsningen til 50 ml.
2. forberedelse og lasting av denaturering gels
- Forbered en denaturering gel med en passende prosentandel ved å følge tabell 1. Vurder den spesifikke gel avstøpning systemet; 30 mL gels brukes ofte. Den aktuelle gel prosenten kan anslås ved hjelp av tabell 2: Velg polyakrylamid PROSENTEN der bb og XC fargestoffer har motilities raskere og tregere, HENHOLDSVIS enn RNA av interesse, for å sikre høy-band separasjon i den aktuelle størrelsen Området.
- Bland løsninger A, B og C i henhold til tabell 1 og Legg til APS og TEMED umiddelbart før du helle gelen. Bland løsningene godt i rene plasticware.
- Hell gel løsningen i en egnet gel avstøpning apparat, etter at alle komponenter er omhyggelig ren. Løft den ene siden av apparatet slik at gelen blir litt skråstilt ved tapping, for å unngå at eventuelle luftbobler blir fanget i selve gelen.
- Sett inn ønsket kam og la den til polymeres (ca. 30 min.). Observer polymerisering ved å se nøye etter en endring i indeksen av brytning rundt gel brønner. Gjør opp gel tank ved hjelp 1x løsning C (1x TBE) og forsiktig fjerne kam. Ved hjelp av en sprøyte, aspirer ut brønnene umiddelbart før prøven lasting.
- Klargjør denaturering prøver som følger. Tilsett 2x denaturering gel lasting løsning til RNA prøver av interesse å gjøre denaturering gel lasting løsning 1x og varme-denaturere ved 95 ° c i 5 min ved hjelp av en thermocycler eller vannbad.
- Før lasting av prøvene, luft-avkjøle dem flere minutter før de er kule å ta på. Load prøvene ved å legge dem på bunnen av hver brønn, med gel-loading tips.
Merk: runde spisser kan brukes til gels med 1 mm tykkelse eller mer; Bruk flate tips for tynnere gels. - Kjør denaturering gels ved romtemperatur. Sørg for at effekten er tilstrekkelig lav slik at glass platene på gel systemet ikke sprekke.
Merk: i vårt laboratorium, 28 W for 20 cm x 16 cm plater var tilstrekkelig for dette formålet.
3. forberedelse og lasting av innfødte gels
- Forbered en innfødt gel med en passende prosentandel ved å henvise til tabell 3. Vurder den spesifikke gel avstøpning systemet, men husk at 30 mL gels brukes ofte. Bland løsningene på 1x TBE, 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide og glyserol i henhold til tabell 3, og add APS og TEMED umiddelbart før helle gelen. Fortsett som beskrevet i trinn 2,3 og 2,4.
- Klargjør innfødte prøver ved å legge til 2x ukomprimert laste løsning i RNA-eksemplene av interesse for å gjøre løsningen 1x og la den ruge ved romtemperatur i 100 minutter før den kjører gelen for å sikre fullstendig RNA-bretting.
- Kjør den innfødte gel i en 4 ° c kaldt rom, slik at effekten er tilstrekkelig lav til å ikke varme gel.
Merk: i vårt laboratorium, 14 W for 20 cm x 16 cm plater var tilstrekkelig for dette formålet.
4. RNA forberedelse ved kjøring T7 transkripsjon
Merk: DNA-sekvenser som brukes for oppkjøringen transkripsjon10 av RNA mango konstruksjoner ble bestilt kommersielt. I denne metoden, DNA oligonukleotider inneholder omvendt komplement (RC) av både sekvensen som skal skrives og T7 promoter er hybridisert til en T7 promoter topp strand sekvens og deretter skrives in vitro. Nedenfor, for hver oligonukleotid, RC av mango Core sekvensen er vist i fet og RC av T7 promoter regionen er vist i kursiv. Rester i vanlig skrift tilsvarer ellers vilkårlig komplementære vinkel områder som kreves for å la mango kjernen til riktig fold.
Mango jeg: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT cgt ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
MANGO II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT cgt ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
MANGO III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC Luftfartstilsynet TCC TTC CTT CGT ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
MANGO IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC Act CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT gag TCG TAT TAA AG
T7 Top strand: CTT TAA TAC GAC TCA-KODE G
- Preparativ gel rensing av DNA oligonukleotider
- For en 0,2 mikromol DNA-syntese, resuspend den deprotected DNA-oligonukleotid i 100 μL av ddH2O og 100 μL av 2x denaturering lasting fargestoff (fra trinn 1.2.2). I dette tilfellet, inkludert gel lasting fargestoffer i lasting løsningen på samme konsentrasjon som i trinn 1.2.2 foretrekkes.
- Rens DNA-oligonukleotid ved hjelp av en 50 mL preparativ skala denaturering gel av den aktuelle polyakrylamid prosenten; Bruk tabell 2 til å velge gel-prosenten. Bruk for eksempel en 8% gel for en 50 NT-sekvens. Ideelt sett bør bromophenol blå kjøre raskere enn oligonukleotid, og xylen cyanol bør kjøre saktere.
Merk: i laboratoriet vårt ble slike gels kastet ved hjelp av støping avstandsstykker som var 1,5 mm tykk og en gel-loading kam med brønner som var 2-2,5 cm bred. - Last 100 μL av DNA-oligonukleotid løsninger fremstilt i trinn 4.1.2 per preparativ gel samt beskrevet i trinn 2.4 – 2.7.
- Forsiktig tørke utsiden av gel, fjerne glassplater, og dekker begge sider av gel i plastfolie. Plasser den på en fluorescerende bilde skjerm (aluminium-støttet tynt lag kromatografi plater impregnert med fluoroforen er en økonomisk løsning) og bruke en kort bølgelengde UV håndholdt lampe for å visualisere DNA-båndene ved UV skygging.
- En skarp, veldefinert skygge bør observeres hvis DNA-syntese er av høy kvalitet. Merk båndene på plast brytes, ved hjelp av en permanent markør.
Merk: Beskytt huden og øynene mot UV-lys og hold eksponeringer kort for å unngå å skade nukleinsyre syre prøve. - Ved å plassere gelen på en ren glassplate, skjær forsiktig ut de markerte båndene og plasser hver gel fragment i 400 μL av 300 mM NaCl. Eluere DNA over natten, ved hjelp av en Rotator ved romtemperatur.
- Gjenopprette eluent i et rent sentrifugerør og tilsett 2,5 ekvivalenter av etanol for å utløse DNA. Vortex godt og plassere røret ved-20 ° c i 30 min.
- Pellet prøven i en benk topp sentrifuger ved 156 000 x g i 30 min ved 4 ° c. Fjern forsiktig supernatanten og resuspend pellet i ddH2O. Bruk en spektrofotometer til å nøyaktig bestemme DNA-oligonukleotid konsentrasjon. Oppbevar prøven som en 10 μM-lager for enkelhets skyld ved-20 ° c.
- Kjøre-off transkripsjon og gel rensing av RNA-prøver
- Forbered 5x nukleosid trifosfat (NTP) lager ved å blande flytende NTP-aksjer som består av en endelig konsentrasjon på 40 mM guanosin trifosfat (GTP, 11 400 M-1· cm-1), 25 mm cytidinanaloger trifosfat (CTP, 7 600 M-1· cm-1), 25 mm adenosin trifosfat (ATP, 5 000 M-1· cm-1), og 10 mm uridindifosfatglukuronosyltransferase trifosfat (UTP, 10 000 M-1· cm-1); alle utryddelse koeffisienter ved 260 NM.
Merk: væske eller pulverisert aksjer kan fås kommersielt. Hvis forberede primære bestander av pulver, nøye justere pH til en endelig pH på 7,9, ved hjelp av 1 M NaOH. Alikvot aksjen i 1,5 mL mikrosentrifugen rør og oppbevar den ved-20 ° c. - Forbered 100 mL av 10x T7 transkripsjon buffer lager ved å blande 25,6 mL av 1 M Tris-HCl, 14,4 mL 1 M Tris base, 26 mL 1 M MgCl2, 10 ml 10% Triton X-100, og 0,637 g av spermidin. Gjør opp aksjen til et endelig volum på 100 mL ved å legge ddH2O.
Merk: en endelig pH i 7,9 av 1x-oppløsningen skal bekreftes ved bruk av en kalibrert pH-måler. De 10x skal være sterile filtrert og lagret ved-20 ° c i passende størrelse alikvoter. - Utfør transkripsjon som følger.
- Legg til følgende reagenser for å gjøre opp en endelig konsentrasjon av 1x T7 transkripsjon buffer ved hjelp av 10x T7 transkripsjon buffer lager og ddH2O (fra trinn 4.2.2), 1x NTPs, 10 mm DITHIOTREITOL (DTT), 1 μM T7 topp strand sekvens (se avsnitt 4 merknad for sekvens), 1 μM gel-renset mango DNA sekvens (trinn 2,1), og T7 RNA polymerase enzym (1 U/μL).
- Vortex, snurr ned, og ruge løsningen ved 37 ° c i 2 t eller til den blir uklar og en hvit utfelling danner i bunnen av røret. En 50 μL-transkripsjon bør resultere i 50 μL av ~ 50 μM RNA etter gel-rensing. Legg til et likt volum på 2x denaturering fargestoff og oppbevar det ved-20 ° c til det er klart for gel rensing.
- Gel-rens den resulterende RNA som beskrevet i avsnittet DNA-oligonukleotider gel rensing ved å følge trinn 4.1.2 \ u 20124.1.8, og erstatte RNA-prøven for DNA-en.
Merk: RNA er ekstremt følsom for RNase-degradering, så pass på at alle trinn, hansker og ren Laboratoriefrakk bæres til enhver tid. Sørg for at alle prøvene er klargjort og lagret i en gangs plasticware for å beskytte mot RNase-forurensning, og vask glassplater forsiktig med varm såpe og vann før bruk, skyll dem grundig med ddH2O, og tørk glass med hjelp av etanol påføres fra en klem flaske. - Bruk 1 μL av den endelige RNA-prøven, og bruk en dråpe BAS ert spektrofotometer til å bestemme absorbansen ved 260 NM. Bruke en utryddelse koeffisient bestemmes av nærmeste nabo metoden, beregne RNA konsentrasjon og justere prøven konsentrasjon til 10 μM med ddH2O for convenience. Oppbevar RNA-prøvene ved-20 ° c.
- Forbered 5x nukleosid trifosfat (NTP) lager ved å blande flytende NTP-aksjer som består av en endelig konsentrasjon på 40 mM guanosin trifosfat (GTP, 11 400 M-1· cm-1), 25 mm cytidinanaloger trifosfat (CTP, 7 600 M-1· cm-1), 25 mm adenosin trifosfat (ATP, 5 000 M-1· cm-1), og 10 mm uridindifosfatglukuronosyltransferase trifosfat (UTP, 10 000 M-1· cm-1); alle utryddelse koeffisienter ved 260 NM.
- Escherichia coli Total råolje nukleinsyre syre utvinning
Merk: følgende protokoll er et eksempel. Denne protokollen bruker endogenously uttrykt mango I-Tagged 6S RNA fra en plasmider i E. coli, og induksjon fra denne plasmider er beskrevet andre steder i detalj4.- Ved anvendelsen av denne studien, klargjør 500 mL indusert celler for både pEcoli-RNA mango og pEcoli-T1 plasmider (cellene er indusert ved en OD600nm av 1). Pellets cellene og oppbevar dem ved-80 ° c før bruk.
- Utfør RNA-ekstraksjon som følger.
- Ta 0,5 mL av den induserte pEcoli celle pellet og tilsett 500 μL av equilibrated fenol. Deretter Vortex prøven; løsningen vil bli melkeaktig hvit. Sentrifuger med maksimal hastighet på 2 min for å skille lagene.
- Pakk ut det øverste laget, som vil være litt gult, og gjenta trinn 4.3.2.1 ved å legge til et lik volum av fenol, sentrifugering og utpakking for totalt 5x (eller til det midterste laget, som er ugjennomsiktig hvit, forsvinner og bare to klare lag er igjen).
- Tilsett fenol-ekstrahert vandig volum til et likt volum av kloroform, Vortex, og deretter, sentrifuger med maksimal hastighet i 2 min.
- Pakk ut det vandige laget og Legg NaCl til en endelig konsentrasjon på 300 mM. Utløse den resulterende nukleinsyre syre ved tilsetning av 2,5 ekvivalenter av etanol, Vortex, spinne ned, og utløse ved-20 ° c i minst 30 min.
- Pellet i en benk topp sentrifuger på 15,6 x 1 000 x g ved 4 ° c i 30 min. Fjern forsiktig supernatanten og resuspend pellet i 100 ΜL av ddH2O.
- Legg til en DNase jeg fordøyelsen trinn til denne prosedyren, etter refererte protokoll11, for å oppnå total RNA.
Merk: Vortex kraftig til pellet er helt oppløst i ddH2O.
5. etter gel farging
- Forbered 1x gel farge løsning i henhold til oppskriften i trinn 1.1.3 og legg den til en ren glassbeholder som er bred nok til å komfortabelt passe gel.
Merk: Borosilikatglass glass beholdere med Snap Fit lokk tjene dette formålet godt. - Legg nok 1x gel farge løsning til beholderen slik at gelen er helt dekket med løsningen og væsken sloshes over toppen av gelen når den er plassert på orbital rotator.
Merk: beholderen må være stor nok til å passe gel slik at den kan bevege seg rundt og har nok buffer i beholderen for å fullt dekke gelen. - Når den innfødte eller denaturering gel er ferdig kjører (§ 2 eller 3, henholdsvis), fjerne gel fra apparatet og kuttet av sine brønner. Det kan være nyttig å fjerne et hjørne av gelen for orientering senere i analysen.
- Overfør gelen forsiktig til 1x gel farge løsning fremstilt i trinn 5,2.
Merk: gels er skjøre og utsatt for å bryte så vær forsiktig når du overfører gel. Hold lokket på farge beholderen til enhver tid, slik at det ikke forurenser gelen. - Plasser gelen på en orbital Rotator med en hastighet på 100 RPM i 30 min ved romtemperatur.
Merk: Pass på at gelen ikke bretter tilbake på seg selv; Hvis ikke, kan RNA-en spre seg ut av gelen og så merke en annen del av gelen.
6. Imaging mango-merket RNAs i gel
- Forsiktig Dekanter bilde bufferen. Skyll gelen raskt med vann, noe som sikrer nok væske rester for å holde gelen litt mobil i beholderen.
- Forsiktig overføre gel på Imager. Overføring ved å nøye plukke opp sidene av gel og plassere den på imager skuffen; Alternativt kan gelen helles langsomt inn i skuffen. Kontroller at det ikke er noen bobler under gelen, og at det ikke er overflødig væske under gelen. En pipette rullet over gelen kan være nyttig å fjerne overflødig væske.
Merk: Bruk et papir håndkle til å suge opp overflødig væske. - Ta et gel bilde, observere fluorescens mellom eksitasjon bølgelengde 510 NM og utslipps bølgelengde 535 NM (for eksempel grønt lys på 520 NM bølgelengde fluorescens innstillinger på imager). Kontroller at innstillingene er fullt optimalisert på instrumentet og Følg nøye instruksjonene for instrumentet som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort mango-Tagged RNAs ble utarbeidet som beskrevet i protokollen delen. Forutsatt at fluorescens i denaturering forhold ville være mest vanskelig å observere på grunn av tilstedeværelsen av urea i gels, vi først studerte motstanden av mango aptamers til urea, som fungerer som en nukleinsyre acid denaturant. Vi fant ut at mango aptamers er vesentlig motstandsdyktig mot denaturering opp til en urea konsentrasjon på ca 1 M (figur 2a). Før du legger gel farge løsning til en denaturering gel, den endelige konsentrasjonen av urea i gelen er 6 M. legge til tilstrekkelig farge løsning for å redusere denne konsentrasjonen til 1 M ville derfor være optimalt for å sikre full mango fluorescens for alle fire aptamers. I praksis, den farging protokollen oppnådde mindre enn dette helt optimale resultatet, men dette kan bare rettes opp hvis nødvendig ved hjelp av mer farging løsning eller ved enkel hensiktsmessig å endre løsningen en gang under farging.
Når mango-Tagged RNA konstruksjoner ble kjørt inn i en denaturering gel, farging tiden var optimalisert for maksimal gel fluorescens ved lasting tre forskjellige mango III beløper seg til en 8% denaturering gel (figur 2b). En gang kurset viste at etter 5 min av soaking i gel farging løsning, fluorescens var godt synlig. Maksimal fluorescens av mango III konstruksjonen ble oppnådd etter 20 – 40 min av farging, hvoretter den lille RNAs som ble brukt i denne studien begynte å spre seg ut av gelen, noe som resulterte i tap av fluorescerende signal (figur 2b). Følgelig ble både innfødte og denaturering gels beiset i 30 minutter hver. Lengre RNA konstruksjoner kunne lett tolerere lengre flekker ganger som de ville være mye mindre sannsynlighet for å spre ut av gelen.
Noen av RNA mango aptamers foldet raskere enn andre. Hver av mango aptamers brukt i denne studien ble inkubert i en gel buffer supplert med 1,5 M urea og 100 nM TO1-biotin fargestoff og analyseres ved hjelp av en fluorometer. Mango I, II og III ble helt foldet etter 10 minutter, mens mango IV ble vesentlig foldet bare etter 40 min (figur 3a). I fravær av urea, folding var mye raskere som var forventet (figur 3b). For å sikre at de innfødte gel prøvene var helt foldet, preincubated vi prøver for 100 min før du kjører dem i native gels. Praktisk talt, dataene i Figur 3 antyder denne gangen kan bli betydelig redusert avhengig av mango aptamer brukes.
Når protokollen var optimalisert for å oppdage RNA mango aptamer fluorescens, ble følsomheten til poststaining metoden bestemt for hver av mango variantene i begge native gels. Single band som tilsvarer godt foldet RNAs ble observert for hver av de fire mango i native gels (figur 4a). Ved seriell fortynning, så lite som 62,5 fmol av mango II kan observeres, mens så lite som 125 fmol av mango I, III, og IV var lett å visualisere. Kvantifisering av innfødte gels var log-lineær over ca 1,5 størrelsesordener, med mango I, II og IV oppfører seg på en mer lineær måte enn mango III (figur 4b).
Resultatene av denaturering gels var litt mindre følsomme enn native gels men var mer lineær. Så lite som 125 fmol av mango II og III ble lett oppdages (figur 4c). Interessant nok indikerte kvantifisering (figur 4d) at denaturering gels var log-lineære eller to størrelsesordener. Vi hypothesize at, i motsetning til de innfødte gels hvor RNA folder var kanskje utsatt for delvis denaturering under gel kjører prosessen, tilstedeværelsen av urea i denaturering gel kan gi en mer homogen måte å brette aptamers når de er plassert i farge løsningen TO1-biotin.
Som med alle gel farge metoder, hvis gelen ikke er nøye overført til beholderen, eller den roterende hastigheten er for høy i farge perioden, kan gelen fold tilbake på seg selv (figur 5a). Dette kan resultere i mango-merket RNA prøve spre fra ett sted av gel til en annen, men kan lett unngås i praksis. I native gels og, spesielt, for mango IV, observerte vi at ufullstendig folding kan manifestere i utseendet på flere band antagelig tilsvarer delvis/misfolded RNA konformasjonen (figur 5B) som følge av kortere folding ganger. Folding problemer i native gels kan unngås ved preincubating RNA prøvene hensiktsmessig som tidligere beskrevet, og ved å kjøre native gels i et kaldt rom. I denaturering gels, der RNA folder in situ i gelen, misfolding var ikke et betydelig problem. Til slutt, i fravær av RNA, var svært liten bakgrunn fluorescens observert i enten gel system.
Deretter ble det spesielle ved RNA mango-merket studert ved å overexpressing 6S regelverket RNA i bakterier. Denne RNA-en ble tidligere merket med mango I (figur 1e)4. Bakterielle celler ble forvandlet med enten pEcoli-RNA mango plasmider (heretter M plasmider) eller pEcoli-T1 plasmider som en negativ kontroll (heretter E plasmider). Transformert celler ble dyrket i flytende lysogeny buljong medium til en OD600 av 1,0 ble nådd. Kulturene ble deretter indusert med 50 μM isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) for 40 min. Cellene ble høstet via sentrifugering ved 6 000 x g i 15 min. total RNA ble ekstrahert ved bruk av fenol-kloroform ekstraksjon fra celle pellets12 som beskrevet i protokoll seksjonen. Den totale RNA prøvene ble konsentrert av etanol nedbør og deretter behandlet med DNase I, etter protokollen, for å fjerne DNA11. Før bruk ble RNA konsentrert av etanol-utfelling.
Total bakteriell RNA ble kjørt inn i 8% denaturering gels (figur 6) og beiset med enten SG13 eller TO1-biotin. For SG farging, 10 μL av 10, 000x SG ble tilsatt til 100 mL gel buffer; ellers var farge protokollen identisk med den som ble brukt for TO1-biotin. Som forventet, sterk SG farging ble observert for en rekke RNAs, men mest fremtredende for ribosomal (rRNA) og overføre RNAs (tRNA) (figur 6, venstre panel). Mens mango-avhengige flekker (M Lanes) kan sees i disse SG-beiset gels, kunne de ikke være entydig identifisert gitt den komplekse farging mønsteret observert ved hjelp av denne universelle flekken. I kontrast til TO1-biotin-farget gels fremhevet mango-avhengige band som de mest fremtredende band. Bare de ribosomal RNA-båndene blir sett på som konkurranse med de 6-avhengige bandene. En rekke nonspecifically fargede band kan også observeres. Likevel var det mango-avhengige band igjen dominerende, har bare rRNA og tRNA band som svakt konkurrerende konkurrenter (figur 6, høyre panel).
Figur 1: mango aptamer system. (A) TO1-biotin-fluoroforen. (B) mango I. (C) mango II. (D) mango III. Paneler B–D viser den sekundære strukturen for hver aptamer. P1 er en vilkårlig stamme. Den GNRA-lignende Stem-loop (her GAAA) funnet i mango i og II er vist i rødt, er triplex motiv av mango III vist i lilla. (E) 6s Regulatory RNA merket med mango i. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effekt av urea på mango aptamer fluorescens og optimal farging ganger. (A) en urea-titrering med 50 NM RNA mango i (oransje sirkler), mango II (grønne sirkler), mango III (lilla sirkler), og mango IV (blå sirkler), sammen med 100 nM TO1-biotin fargestoff og ved angitte urea konsentrasjoner. Prøvene var inkubert for 40 min før fluorescens ble lest på en eksitasjon bølgelengde på 510 NM og en utslipps bølgelengde på 535 NM. (B) MANGO III RNA ble lastet inn i en 8% denaturering gel og beiset med en gel løsning som inneholder 20 NM endelig TO1-biotin fargestoff. For hvert angitte tidspunkt ble 0,064, 0,32 og 1,6 pmol av mango III RNA brukt fra venstre til høyre. Gelen bildet ble avbildet med en fluorescens imager ved hjelp av en 520 NM laser og en 10 min eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: folding tider av mango aptamers i nærvær og fravær av urea. (A) i nærvær av 1,5 M urea og 100 nM TO1-biotin, fluorescens tid kurs ble utført ved hjelp av 50 NM for hver RNA mango KONSTRUERE (RNA mango i: oransje prikker, mango II: grønne prikker, mango III: lilla prikker, og mango IV: blå prikker). (B) identisk med panel A, bortsett fra i fravær av urea. All tid kurs ble utført ved romtemperatur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fluorescerende bilder av innfødt og DENATURERING side med RNA mango-konstruksjoner. (A) 8% native gel med serielt fortynnet RNA mango konstruksjoner. Lanes I, II, III og IV hver inneholder 8 pmol endelige mengder av RNA mango I, II, III og IV, henholdsvis. Retten paneler er todelt seriell fortynninger inneholder 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0,5 pmol, 0,25 pmol, 0,125 pmol, og 0,0625 pmol av enten mango I, II, III, eller IV, som indikert. Lane 12 inneholder ingen RNA. (B) kvantifisering av tre replikerer av de innfødte gel (standardavvik av gjennomsnittet som vises for hver). (C) en 8% denaturering gel med de samme prøvene lastet som i panel A, bortsett fra det faktum at denaturering gel lasting løsning ble brukt i stedet for native gel lasting løsning. (D) tre kvantifisert replikerer av denaturering gel (standardavvik av gjennomsnittet som vises for hver). Alle gel bilder ble visualisere et gel imager med en 520 NM laser og en 10 min eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: suboptimal gels og ufullstendig folding av MANGO IV i en 8% innfødt gel. (A) en seriell fortynning av typen vist i Figur 4 for mango II, men viser effekten av gel folding under farge protokollen. (B) mango IV native gel prøver som ikke var tillatt å kaste seg for lenge nok i native buffer før gel lasting utstillingen doble band. Ellers er disse resultatene ligner på mango IV resultatene vist i figur 4a. Alle gel bilder ble visualisere ved hjelp av en gel imager med en 520 NM laser og en 10 min eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: mango-Tagged RNAs kan påvises i nærvær av total RNA, ved hjelp av TO1-biotin farging. 8% denaturering gels ble lastet med 100 ng av total RNA og ble kjørt i 30 min. Den venstre gel ble farget med SG og høyre panel med TO1-biotin. For begge panelene, felt merket E ble lastet med 100 ng av pEcoli-T1 (ingen mango tag) og baner merket M ble lastet med 100 ng av pEcoli-RNA mango (6S RNA merket med en mango jeg tag). TO1-biotin-flekket gel bilder ble visualisere ved hjelp av et imager med en 520 NM laser og en 10 min eksponering. SG-flekket gel bilder ble visualisere ved hjelp av en gel imager ved hjelp av en 460 NM laser og en 10 min eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Prosent | GEL-VOLUM | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5 | A | 4 | 6 | 10 |
| B | 14 | 21 | 35 for alle | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 6 | A | 4,8 for alle | 7,2 for alle | 12 |
| B | 13,2 for alle | 19,8 for alle | 33 for alle | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 8 | A | 6,4 for alle | 9,6 for alle | 16 |
| B | 11,6 for alle | 17,4 for alle | 29 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 10 | A | 8 | 12 | 20 |
| B | 10 | 15 | 25 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 12 | A | 9,6 for alle | 14,4 for alle | 24 |
| B | 8,4 for alle | 12,6 for alle | 21 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 15 | A | 12 | 18 | 30 |
| B | 6 | 9 | 15 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 20 | A | 16 | 24 | 40 for alle |
| B | 2 | 3 | 5 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| APS (μL) | 48 for alle | 72 for alle | 120 for alle | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 for alle | |
Tabell 1: DENATURERING side gel avstøpning tabellen. A = løsning A, B = løsning B, C = løsning C.
| Denaturering gel% | BB (~ mobilitet NT) | XC (~ mobilitet i NT) |
| 5 | 35 for alle | 130 for alle |
| 6 | 26 | 106 for alle |
| 8 | 19 | 70-80 for alle |
| 10 | 12 | 55 for alle |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 for alle |
Tabell 2: omtrentlig gel mobilities av bromophenol blå (BB) og xylen cyanol (XC) gel lasting fargestoffer i polyakrylamid denaturering gels.
| Prosent | GEL-VOLUM | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5 | 1X TBE | 16,5 for alle | 24,75 for alle | 41,25 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 2,5 for alle | 3,75 for alle | 6,25 for alle | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 6 | 1X TBE | 16 | 24 | 40 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 3 | 4,5 for alle | 7,5 for alle | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 8 | 1X TBE | 15 | 22,5 for alle | 37,5 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 4 | 6 | 10 | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 10 | 1X TBE | 14 | 21 | 35 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 5 | 7,5 for alle | 12,5 for alle | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 12 | 1X TBE | 13 | 19,5 for alle | 32,5 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 6 | 9 | 15 | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 15 | 1X TBE | 11,5 for alle | 17,25 for alle | 28,75 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 7,5 for alle | 11,25 for alle | 18,75 for alle | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| 20 | 1X TBE | 9 | 13,5 for alle | 22,5 for alle |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide | 10 | 15 | 25 | |
| Glyserol | 1 | 1,5 for alle | 2,5 for alle | |
| APS (μL) | 48 for alle | 72 for alle | 120 for alle | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 for alle | |
Tabell 3: native side gel avstøpning tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En betydelig fordel med mango fluorescerende koden er at en enkelt kode kan brukes på flere måter. Den høye lysstyrken og affinitet av disse aptamers gjøre dem nyttige ikke bare for i celle visualisering2 , men også for in vitro RNA eller RNP rensing4. Derfor utvider gel Imaging allsidigheten til mango-taggen på en enkel måte. Mango gel Imaging følsomhet er litt mindre enn en nordlig blot14 men kan lett oppdage 60-120 FMOL av RNA prøve, uten behov for langvarig og kjedelig membran overføring og undersøkelser trinn. Dette kan sammenlignes med den hybridisering verifiserer effektiviteten som tidligere ble funnet for små RNAs i gel15. Mens andre fluorogenic aptamer metoder-spesielt, RNA spinat-har større følsomhet og spesifisitet9, ingen har for tiden samtidig den høye lysstyrken og affinitet av mango aptamer system, som gjør at en enkelt RNA-kode for å bli brukes for cellular Imaging, RNP rensing, og nå gel Imaging.
Det er noen kritiske trinn i denne gel farging protokollen. Ved arbeid med RNA-løsninger bør løsningene være sterile filtrert, og en gangs plasticware bør brukes. Catuion, kjører native gels som komplekser eller RNA strukturer kan lett denaturert hvis strømnivået for gel er for høy og resultere i gel oppvarming. Sørg for at brukte Glassvarer er rent og ikke forurenset med RNases. I tillegg alltid være forsiktig når du overfører og plukke opp gels som de er skjøre og kan være utsatt for brudd.
Den TO1-biotin flekken penetrerer gels raskt, men dataene som presenteres her indikerer også at mango IV folding, spesielt, kan være rate begrensende (figur 2 og Figur 3). Ved å bruke betingelsene som er angitt i protokoll delen, observerte vi log-lineær adferd for alle fire aptamers over to størrelsesordener i denaturering gels, noe som gjør metoden nyttig for kvantifisering (figur 4c, D). Siden den lille mango aptamers som brukes i denne studien lett spredt ut av gel matrise, forventer vi at kvantifisering å forbedre for lengre RNA konstruksjoner.
Den mango tag gel Imaging metodikk demonstrert her er robust og er forventet å kunne være rett og slett utvidet i form av følsomhet og spesifisitet. Mango I, II og III fold pålitelig, mens mango IV ikke. Selv om vi ikke har utforsket destaining protokoller, forventer vi at en slik tilnærming kan også bare forbedre spesifisitet. Mens det er utenfor omfanget av dette arbeidet, fluorescens og biotin koden gitt til mango-Tagged RNA ved bruk av TO1-biotin fluoroforen synes svært sannsynlig å ytterligere effektivisere gel analyse og rensing. Kommersielt tilgjengelige sekundære biotin-merking teknikker, for eksempel, lover å ytterligere forsterke oppdagelsen grensene for dette enkle RNA mango-merking system. Likeledes synes det sannsynlig at native mango-Tagged RNA protein komplekser kan eluert fra en gel og utvinnes ved hjelp av streptavidin magnetiske perler for å fange eluert RNA kompleks. Dette vil ytterligere forenkle rutinen rensing av biologisk viktige RNAs og RNA komplekser av det enkle hensiktsmessig å legge en mango tag til RNA av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Et patent venter på mango fluorogenic systemet.
Acknowledgments
Forfatterne takker Razvan Cojocaru og Amir Abdolahzadeh for deres tekniske assistanse og Lena Dolgosheina for korrekturlesing av manuskriptet. Finansiering ble gitt for dette prosjektet av en kanadisk naturvitenskap og engineering Research Council (NSERC) drifts stipend til P.J.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
