Summary
Här presenterar vi en känslig, snabb och diskriminerande post-gel färgning metod för att bilden RNAs märkta med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, med antingen infödda eller denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Efter att ha kört standard PAGE gels, kan mango-taggade RNA lätt färgas med TM-biotin och sedan analyseras med vanligt förekommande fluorescensläsare.
Abstract
Native och denaturering polyakrylamidgeler används rutinmässigt för att karakterisera ribonukleoprotein (RNP) komplex rörlighet och för att mäta RNA-storlek, respektive. Eftersom många gel-Imaging tekniker använder ospecifik fläckar eller dyra fluorophore sonder, känsliga, diskriminerande, och ekonomiska gel-Imaging metoder är mycket önskvärt. RNA mango kärnsekvenser är små (19-22 NT) sekvens motiv som, när de stängs av en godtycklig RNA-stam, kan enkelt och billigt bifogas ett RNA av intresse. Dessa mango Taggar binda med hög affinitet och specificitet till en tiazol-orange fluorophore ligand kallas TM-biotin, som blir tusentals gånger mer fluorescerande på bindning. Här visar vi att mango I, II, III, och IV kan användas för att specifikt bild-RNA i geler med hög känslighet. Så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denatureringen geler kan upptäckas genom blöt läggning geler i en avbildning buffert som innehåller kalium och 20 nM-TM-biotin för 30 min. Vi demonstrerar särdragen hos mango-märkta systemet genom att avbilda en mango-Tagged 6S bakterie-RNA i samband med en komplex blandning av totalt bakteriellt RNA.
Introduction
Mango är ett RNA märknings system som består av en uppsättning av fyra små fluorescerande RNA aptamers som binder tätt (nanomolar bindning) till enkla derivat av thiazol-orange (1-biotin, figur 1a)1,2,3 . Vid bindning ökas fluorescensen av denna ligand 1 000-till 4 000-faldigt beroende på den specifika aptameren. Den höga ljus styrkan hos mango systemet, som för mango III överstiger den av förstärkt grönt fluorescerande protein (egfp), kombinerat med HDAC vid nanomolära bindande affinitet av RNA mango aptamers, gör det möjligt att användas både i Imaging och rening av RNA komplex2,4.
Röntgen strukturerna av mango I5, II 6, och III7 har fastställts till hög upplösning, och alla tre aptamers utnyttja ett RNA FYRPLEX till bind TM1-biotin (figur 1b-D). De kompakta kärnorna av alla tre aptamers isoleras från den externa RNA-sekvensen via kompakta adaptermotiv. Mango I och II båda använder en flexibel GNRA-like loop adapter för att ansluta sina mango kärnor till en godtycklig RNA duplex (figur 1b, C). Däremot använder mango III en styv Triplex motiv för att ansluta sin kärna till en godtycklig RNA Helix (figur 1d, lila rester), medan strukturen av mango IV är för närvarande inte känd. Eftersom den ligand-bindande kärnan i var och en av dessa aptamers är skild från den externa RNA-sekvensen av dessa spiralformade adaptrar, verkar det troligt att de alla kan helt enkelt införlivas i en mängd olika RNAs. Den bakteriella 6s regulatoriska RNA (mango i), komponenter i jäst spliceosome (mango i), och den mänskliga 5s RNA, U6 RNA, och en C/D scarna (mango II och IV) har alla framgångs rikt märkts på detta sätt2,8, vilket tyder på att många biologiska RNAs kan märkas med hjälp av RNA mango Aptamer systemet.
Denaturering och Native gels används ofta för att studera RNAs. Denaturering geler används ofta för att bedöma RNA-storlek eller RNA-bearbetning, men typiskt, i fallet med en nordlig blot, till exempel, kräver flera långsamma och sekventiella steg för att generera en bild. Medan andra RNA fluorogena aptamers, såsom RNA spenat och broccoli, har använts framgångs rikt för gel Imaging9, ingen fluorgenic Aptamer system hittills besitter hög ljus styrka och affinitet av mango systemet, vilket gör det av stort intresse att undersöka mango ' s gel-Imaging förmågor. I denna studie, undrade vi om RNA mango systemet helt enkelt kan utvidgas till gel Imaging, eftersom excitation och utsläpp våg längder av TM-biotin (510 nm och 535 nm, respektive) är lämpliga för avbildning i eGFP-kanalen som är gemensam för de flesta fluorescerande instrument för gel skanning.
Den post-gel färgning protokoll som presenteras här ger ett snabbt sätt att specifikt upptäcka mango-märkta RNA molekyler i infödda och denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Denna färgning metod innebär blöt läggning geler i en buffert som innehåller kalium och TM-biotin. RNA mango aptamers är G-fyrplex baserat och kalium krävs för att stabilisera sådana strukturer. Använda RNA transkriberas från minimal mango-kodning DNA-mallar (se protokollet avsnitt), kan vi helt enkelt upptäcka så lite så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denaturering geler, med hjälp av en enkel färgning protokoll. I motsats till vanliga ospecifika nukleinsyra fläckar (se tabell över material, hänvisas till SG från Hereon), kan vi tydligt identifiera mango-märkta RNA även när höga koncentrationer av totalt omärkta RNA är närvarande i provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagenserna
-
TM-lösning för efterfärgning av biotin (gel färgning lösning)
- Gör 1 L 1 M fosfatbuffert vid pH 7,2 vid 25 ° c genom tillsats av 342 mL 1 M na2HPO4 och 158 ml 1 m NaH2Po4. Justera pH till 7,2 vid 50 mM genom att tillsätta lämplig fosfat lösning. Steril-filter med hjälp av ett 0,2 μm filter och förvara lösningen i plasticware vid rums temperatur.
- Förbered 5x gel färgning lösning (utan TM-biotin) enligt följande. Gör upp en 1 L lösning genom att blanda 247,5 mL ddH2O, 700 ml 1 m KCl, 50 ml 1 m fosfatbuffert (pH 7,2) och 2,5 ml Tween 20. Steril-filter med hjälp av ett 0,2 μm filter och förvara lösningen i plasticware. Den kan förvaras i rums temperatur.
Obs: MgCl2 kan läggas till denna lösning om det behövs eftersom det kan potentiellt stabilisera RNA-komplex. Detta kommer att ha en blygsam inverkan på den fluorescerande signalen2. - Gör upp en 1x gel färgning lösning med hjälp av 5x gel färgning lösning från steg 1.1.2 och, omedelbart före användning, komplettera den med tm 1-biotin fluorophore (se tabell över material) till en slutlig koncentration av 20 nM. Tillsätt till exempel 20 mL 5x gel färgning lösning till 80 mL avjoniserat vatten för att göra 100 mL 1x gel Färgnings lösning, och tillsätt 2 μL av en 1 mM TM-biotin lager (beredd i dimetylformamid).
Anmärkning: utdöpningskoefficienten för1-biotin-färgämnet vid 500 nm är 63 000 M-1· cm-1, mätt i infärgnings lösning.
-
Denaturering sida (2x denatureringen gel lastning lösning och lösningar A, B, C, ammonium persulfat, och tetrametylethylendiamin)
- Bered 50 mL 2x påfyllnings lösning med denaturerad gel genom att blanda 40 mL formamid, 0,5 mL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA, pH 8,0) och 9,5 mL ddH2O. Lösningen kan förvaras vid rums temperatur. Påfyllnings färg ämnen läggs inte till denna lösning eftersom det kan dölja fluorescerande avbildning.
- Förbered 2x denatureringen gel lastning färg ämne enligt följande. Vid rening av RNA och DNA-oligonukleotider, tillsätt 0,5 mL 2,5% (w/v) Bromophenolblått (BB) och 0,5 mL 2,5% (w/v) xylencyanol (XC) till den lösning som beskrivs i steg 1.2.1, och tillsätt 8,5 mL ddH2O istället för 9,5 ml. Lösningen kan förvaras vid rums temperatur.
- Bered 100 mL lösning A genom att väga upp 200,2 g urea (formel vikt: 60,06 g/mol) och tillsätta den till 312,5 mL 40% 19:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid. Rör den med en magnetisk rör stång vid maximal hastighet tills upplöst (ca 3 h) och utgör lösningen till 500 mL med ddH2O. Observera att slutkoncentrationerna är 6,667 M urea och 25% 19:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide. Förvaras vid 4 ° c i ren plasticware.
- Bered 1 L lösning B genom att väga 400,4 g urea och fyll lösningen till 1 L med ddH2O; tills urea har lösts upp. Lösning B kan förvaras vid rums temperatur.
- Bered lösning C (10x tris-borate-EDTA [TBE]) enligt följande. Förbered 4 L av 10x TBE genom att väga ut 432 g av tris bas och 220 g borsyra, lägga 160 mL av 0,5 M EDTA med ett pH på 8 (filtrerad), och att göra upp lösningen till 4 L med ddH2O. Ett stort lager av denna buffert görs eftersom det också används som gel löpbuffert.
- Bered 10% ammoniumpersulfat (APS) genom att lösa upp 1 g APS till en total volym på 10 mL ddH2O. förvaras vid 4 ° c.
- Håll tetrametylethylendiamin (TEMED) behändig. Förvara den vid 4 ° c tillsammans med APS-lösningen.
-
Inbyggd sida (2x inbyggd gel lastning lösning)
- Förbered 50 mL 2x inbyggd gel lastning lösning genom att blanda 25 mL 100% glycerol, 10 mL 5x gel färgning lösning, och 15 mL ddH2O för att kompensera för lösningen till 50 ml.
Anmärkning: som i denaturering gel avsnitt, kan ladda färg ämnen läggas till detta bestånd, men deras tillägg kan potentiellt dölja den fluorescerande signalen i gelen och därmed bör undvikas.
- Förbered 50 mL 2x inbyggd gel lastning lösning genom att blanda 25 mL 100% glycerol, 10 mL 5x gel färgning lösning, och 15 mL ddH2O för att kompensera för lösningen till 50 ml.
2. beredning och lastning av denaturerad gel
- Förbered en denaturerad gel med en lämplig procents ATS genom att följa tabell 1. Tänk på det specifika gel gjutning systemet; 30 mL gel används ofta. Lämplig gel procents ATS kan uppskattas med hjälp av tabell 2: Välj polyakrylamidprocenten där BB och XC-färgämnen har motilitationer snabbare och långsammare, respektive, än RNA av intresse, för att säkerställa hög-band separation i den relevanta storleken Utbud.
- Blanda lösningarna A, B och C enligt tabell 1 och tillsätt APS och TEMED omedelbart före hälla gelen. Blanda lösningarna väl i ren plasticware.
- Häll gel lösningen i en lämplig gel gjutnings apparat, efter att alla komponenter är noggrant rena. Lyft ena sidan av apparaten så att gelen är något lutad när du häller, för att undvika att luft bubblor fastnar i själva gelen.
- Sätt i önskad kam och låt den polymerisera (ca 30 min). Observera polymerisation genom att titta noga för en förändring i indexet för refraktion runt gel brunnar. Gör upp gel tanken med 1x lösning C (1x TBE) och försiktigt bort kammen. Aspirera ut brunnarna omedelbart före prov lastning med hjälp av en spruta.
- Förbered denatureringen prover enligt följande. Lägg till 2x denaturering gel lastning lösning till RNA prover av intresse för att göra denaturering gel lastning lösning 1x och värme-denaturering vid 95 ° c i 5 min med hjälp av en termocykler eller vatten bad.
- Innan du laddar proverna, luft-kyla dem flera minuter tills de är svala vid beröring. Ladda proverna genom att skiktning dem på botten av varje brunn, med hjälp av gel-loading tips.
Obs: runda tips kan användas för geler med 1 mm tjocklek eller mer; Använd platta tips för tunnare geler. - Kör denatureringen gelen vid rums temperatur. Se till att wattiden är tillräckligt låg så att glas plattorna i gel systemet inte spricka.
Obs: i vårt laboratorium räckte 28 W för 20 cm x 16 cm plattor för detta ändamål.
3. beredning och lastning av infödda geler
- Förbered en ursprunglig gel med en lämplig procents ATS genom att hänvisa till tabell 3. Överväg det specifika gel gjutning systemet, men tänk på att 30 mL geler används ofta. Blanda lösningarna av 1x TBE, 40% 29:1 akrylamid: N, N'-methylenebisacrylamide, och glycerol enligt tabell 3, och tillsätt APS och TEMED omedelbart före hälla gelen. Fortsätt enligt beskrivningen i steg 2,3 och 2,4.
- Förbered infödda prover genom att lägga till 2x Native gel lastning lösning på RNA prover av intresse för att göra lösningen 1x och låta den Inkubera vid rums temperatur för 100 min innan du kör gelen för att säkerställa fullständig RNA vikning.
- Kör den ursprungliga gelen i en 4 ° c kallt rum, se till att wattiden är tillräckligt låg för att inte värma gelen.
Obs: i vårt laboratorium räckte 14 W för 20 cm x 16 cm plattor för detta ändamål.
4. RNA beredning genom avrinning T7 transkription
Obs: DNA-sekvenser som används för run-off transkription10 av RNA mango konstrukter beställdes kommersiellt. I denna metod är DNA-oligonukleotider som innehåller det omvända komplementet (RC) för både den sekvens som ska transkriberas och T7-Promotorn hybridiseras till en T7-promotor av topp-strandsekvensen och transkriberas sedan in vitro. Nedan, för varje oligonukleotid, RC av mango kärnsekvensen visas i fetstil och RC i T7 promotor visas i kursiv stil. Rester i vanliga typsnitt motsvarar annars godtyckliga kompletterande spiralformade områden som krävs för att tillåta mango kärnan att ordentligt vika.
Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT Cgt ACG TGC cta tag TGA GTC GTA tta AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC tct CCT Cgt ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA tta AAG
Mango III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC ctt CGT ACG TGC cta tag TGA GTC GTA tta AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC Act CCC TCG GTA CGT gcc TAT AGT gag TCG TAT TAA AG
T7 Top strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
- Preparativ gel rening av DNA-oligonukleotider
- För en DNA-syntes i 0,2 μmol-skala, Återsuspendera den deskyddade DNA-oligonukleotiden i 100 μL av ddH2O och 100 μl av 2x denatureringsfärg (från steg 1.2.2). I detta fall, inklusive gel lastning färg ämnen i lastning lösning vid samma koncentration som i steg 1.2.2 är att föredra.
- Rena DNA-oligonukleotiden med hjälp av en 50 mL preparativ skala denatureringsgel av lämplig polyakrylamidprocent. Använd tabell 2 för att välja gel procent. Använd till exempel en 8% gel för en 50 NT-sekvens. Helst bör bromfenolblått köras snabbare än oligonukleotiden, och xylencyanol bör gå långsammare.
Obs: i vårt laboratorium, var sådana geler gjutna med gjutdistansmaskiner som var 1,5 mm tjocka och en gel-lastning kam med brunnar som var 2-2.5 cm bred. - Lasta 100 μL av de DNA-oligonukleotidslösningar som utarbetats i steg 4.1.2 per preparativ gel och som beskrivs i steg 2.4 – 2.7.
- Torka försiktigt utsidan av gelen, ta bort glas plattorna, och täck båda sidorna av gelen i plastfolie. Placera den på en fluorescerande bild behandling skärm (aluminium-backed tunnskikts kromatografi plattor impregnerade med fluorophore är en ekonomisk lösning) och använda en kort våglängd UV handhållen lampa för att visualisera DNA-banden genom UV-skuggning.
- En skarp, väldefinierad skugga bör observeras om DNA-syntesen är av hög kvalitet. Markera banden på plastfolie, med hjälp av en permanent markör.
Obs: skydda hud och ögon från UV-ljus och hålla exponeringar kort för att undvika att skada nukleinsyra provet. - Placera gelen på en ren glas skiva, försiktigt skära ut de markerade banden och placera varje gel fragment i 400 μL av 300 mM NaCl. Elute DNA över natten, med hjälp av en Rotator i rums temperatur.
- Återvinna eluenten i en ren centrifug röret och tillsätt 2,5 ekvivalenter av etanol för att utlösa DNA. Vortex väl och placera röret vid-20 ° c i 30 min.
- Pelletar provet i en bänk centrifug vid 156 000 x g i 30 min vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten och omsuspendera pelleten i ddH2O. Använd en spektrofotometer för att exakt bestämma koncentrationen av DNA-oligonukleotid. Förvara provet som en 10 μM lager för bekvämlighet vid-20 ° c.
- Run-off transkription och gel rening av RNA-prover
- Förbered 5x nukleosidtrifosfat (NTP) lager genom att blanda flytande NTP lager består av en slutlig koncentration av 40 mM Guanosintrifosfat (GTP, 11 400 M-1· cm-1), 25 mm CYTIDIN trifosfat (CTP, 7 600 M-1· cm-1), 25 mm adenosintrifosfat (ATP, 5 000 M-1· cm-1) och 10 mm URIDINTRIFOSFAT (UTP, 10 000 m-1· cm-1); alla utdöningskoefficienter vid 260 Nm.
Anmärkning: flytande eller pulveriserad lager kan erhållas kommersiellt. Om beredning av primära bestånd av pulver, noggrant Justera pH till ett slutligt pH 7,9, med 1 M NaOH. Alikvot av beståndet i 1,5 mL mikrocentrifugerör och förvara det vid-20 ° c. - Förbered 100 mL 10x T7 transkriptionsbuffert lager genom att blanda 25,6 mL 1 M Tris-HCl, 14,4 mL 1 M tris bas, 26 mL 1 M MgCl2, 10 ml 10% Triton X-100, och 0,637 g Spermidin. Gör upp beståndet till en slutlig volym på 100 mL genom att tillsätta ddH2O.
Anmärkning: ett slutligt pH på 7,9 i 1x-lösningen ska bekräftas med en kalibrerad pH-mätare. 10x bör vara sterila-filtreras och förvaras vid-20 ° c i lagom storlek Ali kvoter. - Utför transkription på följande sätt.
- Tillsätt följande reagenser för att kompensera för en slutlig koncentration av 1x T7 transkriptionsbuffert med 10x-transkriptionsbuffertlagret och ddH2O (från steg 4.2.2), 1x NTPs, 10 mm ditiothreitol (DTT), 1 μM T7 Top strand sekvens (se avsnitt 4 anmärkning för 1 μM gel-renad mango DNA-sekvens (steg 2,1) och T7 RNA-polymeras enzym (1 U/μL).
- Vortex, snurra och inkubera lösningen vid 37 ° c i 2 timmar eller tills den blir grumlig och en vit fällning bildas i botten av röret. En 50 μL transkription bör resultera i 50 μL av ~ 50 μM RNA efter gel rening. Tillsätt en lika stor volym 2x denaturerat färg ämne och förvara det vid-20 ° c tills det är klart för gel rening.
- Gel-renar den resulterande RNA som beskrivs i DNA oligonukleotides gel rening avsnitt genom att följa steg 4.1.2 \ u 20124.1.8, ersätta RNA-provet för DNA.
Obs: RNA är extremt känsligt för RNase nedbrytning, så se till att i alla steg, handskar och en ren labbrock bärs hela tiden. Se till att alla prover bereds och lagras i engångsbruk plasticware att skydda mot RNase kontaminering, och tvätta glas plattor noggrant med varm tvål och vatten före användning, skölj dem grundligt med ddH2O, och torka glas med hjälp av etanol som appliceras från en kläm flaska. - Använd 1 μL av det slutliga RNA-provet och bestäm absorbansen vid 260 Nm med hjälp av en droplet-baserad spektrofotometer. Beräkna RNA-koncentrationen och justera prov koncentrationen till 10 μM med ddH2O för enkelhetens skull med hjälp av en utrotningskoefficient som bestäms av närmaste granne-metod. Förvara RNA-proverna vid-20 ° c.
- Förbered 5x nukleosidtrifosfat (NTP) lager genom att blanda flytande NTP lager består av en slutlig koncentration av 40 mM Guanosintrifosfat (GTP, 11 400 M-1· cm-1), 25 mm CYTIDIN trifosfat (CTP, 7 600 M-1· cm-1), 25 mm adenosintrifosfat (ATP, 5 000 M-1· cm-1) och 10 mm URIDINTRIFOSFAT (UTP, 10 000 m-1· cm-1); alla utdöningskoefficienter vid 260 Nm.
- Auktor Total utvinning av rå nukleinsyra
Anmärkning: följande protokoll är ett exempel. Detta protokoll använder endogent uttryckt mango i-Tagged 6S RNA från en Plasmid i E. coli, och induktion från denna Plasmid beskrivs på andra ställen i detalj4.- Vid tillämpningen av denna studie, förbereda 500 mL av inducerade celler för både pEcoli-RNA mango och pEcoli-T1 plasmider (cellerna induceras vid en OD600Nm 1). Pellets cellerna och förvara dem vid-80 ° c före användning.
- Utför RNA-extraktion enligt följande.
- Ta 0,5 mL av den inducerade pEcoli-cellpelleten och tillsätt 500 μL av den utjämade fenol. Sedan, Vortex provet; lösningen blir mjölkvit. Centrifugera vid maximal hastighet i 2 min för att separera lagren.
- Extrahera det översta lagret, som kommer att vara något gult, och upprepa steg 4.3.2.1 genom att lägga till en lika stor volym av fenol, centrifugering, och extrahera för totalt 5x (eller tills det mellersta skiktet, som är ogenomskinlig vit, går bort och endast två klara lager är kvar).
- Tillsätt fenol-extraherade vatten volym till en lika stor mängd kloroform, Vortex, och sedan, Centrifugera vid maximal hastighet för 2 min.
- Extrahera vatten skiktet och tillsätt NaCl till en slutlig koncentration av 300 mM. Påskynda den resulterande nukleinsyran genom tillsats av 2,5 ekvivalenter etanol, virvel, snurra ner och fällning vid-20 ° c i minst 30 min.
- Pellet i en bänk centrifug på 15,6 x 1 000 x g vid 4 ° c i 30 min. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 ΜL DDH2O.
- Lägg till ett DNase I mat smältning steg till denna procedur, efter det refererade protokollet11, för att få totalt RNA.
Obs: skaka kraftigt tills pelleten är helt upplöst i ddH2O.
5. färgning efter gel
- Förbered 1x gel färgning lösning enligt receptet i steg 1.1.3 och tillsätt den till en ren glas behållare som är tillräckligt bred för att bekvämt passa gelen.
Anmärkning: borosilikatglas behållare med Snap Fit lock tjäna detta ändamål väl. - Tillsätt tillräckligt 1x gel färgning lösning till behållaren så att gelen är helt täckt med lösningen och vätskan sloshes över toppen av gelen när den är placerad på orbital rotator.
Obs: behållaren måste vara tillräckligt stor för att passa gelen så att den kan röra sig och ha tillräckligt med buffert i behållaren för att helt täcka gelen. - När den infödda eller denaturering gel har slutat köra (avsnitt 2 eller 3, respektive), ta bort gelen från apparaten och skära av dess brunnar. Det kan vara bra att ta bort ett hörn av gelen för orientering senare i analysen.
- Överför försiktigt gelen till 1x gel färgning lösning beredd i steg 5,2.
Obs: gelerna är sköra och benägna att bryta så var försiktig när du överför gelen. Förvara alltid locket på infärgnings behållaren så att gelen inte kontaminerar. - Placera gelen på en orbital Rotator med en hastighet av 100 RPM för 30 min i rums temperatur.
Obs: se till att gelen inte vika tillbaka på sig själv; annars, RNA kan sprida ut ur gelen och så etikett en annan del av gelen.
6. Imaging mango-märkta RNAs i gel
- Häll försiktigt på bildbufferten. Skölj gelen snabbt med vatten och se till att det finns tillräckligt med vätska kvar för att hålla gelen lite rörlig i behållaren.
- Överför försiktigt gelen till kameran. Överför genom att försiktigt plocka upp sidorna av gelen och placera den på kameran facket; Alternativt kan gelen långsamt hällas på brickan. Se till att det inte finns några bubblor under gelen och att det inte finns någon överflödig vätska under gelen. En pipett som rullas över gelen kan vara användbar för att avlägsna överflödig vätska.
Obs: Använd en pappers hand duk för att suga upp överflödig vätska. - Ta en gel bild, Observera fluorescens mellan excitation våglängd 510 nm och emission våglängd 535 nm (till exempel, grönt ljus vid 520 Nm våglängd fluorescens inställningar på kameran). Se till att inställningarna är helt optimerade på instrumentet och följ noga instruktionerna för det instrument som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort mango-märkta RNAs har förberetts enligt beskrivningen i protokoll sektionen. Om man antar att fluorescens i denaturering villkor skulle vara svårast att observera på grund av närvaron av urea i gelerna, vi först studerade motståndet av mango aptamers till urea, som fungerar som en nukleinsyra denaturerande. Vi fann att mango aptamers är väsentligen resistenta mot denaturering upp till en urea koncentration på cirka 1 M (figur 2A). Innan du lägger till gel färgning lösning till en denaturering gel, den slutliga koncentrationen av urea i gelen är 6 M. lägga till tillräcklig färgning lösning för att minska denna koncentration till 1 M skulle därför vara optimalt för att säkerställa full mango fluorescens för alla fyra aptamers. I praktiken uppnådde infärgnings protokollet mindre än detta helt optimala resultat, men detta kan helt enkelt rättas till om det behövs genom att använda mer Färgnings lösning eller genom att enkelt ändra lösningen en gång under infärgning.
När mango-märkta RNA konstruktioner kördes in i en denaturering gel, var infärgnings tiden optimerad för maximal gel fluorescens genom lastning tre olika mango III belopp i en 8% denaturering gel (figur 2b). En tid kurs avslöjade att efter 5 min av blöt läggning i gel färgning lösning, var fluorescens klart synlig. Maximal fluorescens av mango III-konstruktionen erhölls efter 20 – 40 min av färgning, varefter de små RNAs som användes i denna studie började sprida sig ut ur gelen, vilket resulterade i en förlust av fluorescerande signal (figur 2b). Följaktligen, både infödda och denaturering geler färgas i 30 min vardera. Längre RNA konstruktioner kan lätt tolerera längre färgade gånger eftersom de skulle vara mycket mindre benägna att sprida ut ur gelen.
Några av RNA mango aptamers viks snabbare än andra. Var och en av de mango aptamers som används i denna studie var inkuberas i en gel buffert kompletteras med 1,5 M urea och 100 nM TM-biotin färg ämne och analyseras med hjälp av en fluorometer. Mango I, II, och III var helt vikas efter 10 min, medan mango IV blev avsevärt vikas först efter 40 min (figur 3a). I avsaknad av urea var vikningen mycket snabbare som förväntades (figur 3b). För att säkerställa att de infödda gel proverna var helt vikas, vi preinkubated prover för 100 min innan du kör dem i infödda geler. Praktiskt, data i figur 3 antyder denna tid kan minskas avsevärt beroende på mango Aptamer används.
När protokollet var optimerad för att upptäcka RNA mango Aptamer fluorescens, känsligheten av postfärgning metoden bestämdes för varje mango varianter i både infödda geler. Enstaka band som motsvarar välvikta RNAs observerades för var och en av de fyra Mangos i infödda geler (figur 4a). Efter seriell utspädning, så lite som 62,5 fmol av mango II kunde observeras, medan så lite som 125 fmol av mango I, III, och IV var lätt visualiseras. Kvantifiering av infödda geler var log-linjär över ca 1,5 storleksordningar, med mango I, II och IV beter sig på ett mer linjärt sätt än mango III (figur 4b).
Resultaten av denatureringen geler var något mindre känsliga än de infödda geler men var mer linjär. Så lite som 125 fmol av mango II och III upptäcktes lätt (figur 4c). Intressant, kvantifiering (figur 4D) visade att denaturering geler var log-linjär eller två storleksordningar. Vi hypotes om att, i motsats till de infödda geler där RNA veck var kanske utsätts för partiell denaturering under gelen körs processen, närvaron av urea i denatureringsgel kan ge ett mer homogent sätt att vika aptamers när de placeras i Färgnings lösningen för TM-biotin.
Som med alla gel färgning metoder, om gelen inte försiktigt överförs till behållaren, eller den roterande hastigheten är för hög under infärgnings perioden, kan gelen vika tillbaka på sig själv (figur 5a). Detta kan resultera i mango-märkta RNA prov diffusa från en plats av gelen till en annan, men kan lätt undvikas i praktiken. I infödda geler och, särskilt, för mango IV, observerade vi att ofullständig vikning kan manifestera i utseendet på flera band förmodligen motsvarar delvis/misvikta RNA kon formationer (Figur 5b) följd av kortare hopfällbara tider. Folding frågor i native gels kan undvikas genom att Preinkubera RNA prover på lämpligt sätt som tidigare beskrivits och genom att köra infödda geler i ett kallt rum. I denaturering geler, där RNA veck in situ inom gelen, Skellefteåsjukan var inte ett betydande problem. Slutligen, i avsaknad av RNA, mycket liten bakgrund fluorescens observerades i antingen gel-systemet.
Därefter studerades specificiteten hos RNA mango-taggen genom att överuttrycka 6S regulatoriska RNA i bakterier. Detta RNA har tidigare märkts med mango I (figur 1e)4. Bakterie celler transformerades med antingen pEcoli-RNA mango Plasmid (hädanefter M Plasmid) eller pEcoli-T1 Plasmid som en negativ kontroll (hädanefter E Plasmid). Transformerade celler odlades i flytande lysogeni buljong medium till en OD600 av 1,0 nåddes. Kulturerna induceras därefter med 50 μM isopropylβ-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) för 40 minuter. Cellerna skördades genom centrifugering vid 6 000 x g i 15 min. totalt RNA extraherades med fenol-fenol kloroform extraktion från cell pellets12 som beskrivs i avsnittet protokoll. De totala RNA-proverna koncentrerades genom etanol fällning och behandlades sedan med DNase I, efter protokollet, för att ta bort DNA11. Före användning koncentrerades RNA genom etanol fällning.
Totalt bakterie-RNA kördes in i 8% denaturerade geler (figur 6) och färgas med antingen SG13 eller 1-biotin. För SG-färgning lades 10 μL av 10 000 x SG till 100 mL gelbuffert. i annat fall var infärgnings protokollet identiskt med det som används för TM--biotin. Som väntat observerades stark SG-färgning för en mängd RNAs, men mest framträdande för ribosomal (rRNA) och överförings-RNAs (tRNA) (figur 6, vänster panel). Medan mango-beroende färgning (M kör fält) kunde ses i dessa SG-färgade geler, kunde de inte identifieras unikt med tanke på komplexa Färgnings mönstret observerats med hjälp av denna universella fläcken. I kontrast, den TM-biotin-färgade gels betonade mango-beroende band som de mest framträdande banden. Endast de ribosomala RNA-banden ses vara i konkurrens med 6S mango-beroende band. Ett antal icke-specifikt färgade band kan också observeras. Ändå var de mango-beroende banden återigen dominerande, med endast rRNA och tRNA band som svagt konkurrerande konkurrenter (figur 6, höger panel).
Figur 1: mangoaptamersystemet. A) mer änenfluor-biotin fluorophore. Bmango I.cmango II. (D) mango III. Paneler B–D visar den sekundära strukturen för varje Aptamer. P1 är en godtycklig stam. Den GNRA-liknande Stem-loop (här GAAA) finns i mango i och II visas i rött, Triplex motivet av mango III visas i lila. (E) 6s REGULATORISKA RNA märkta med mango I. please Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekt av urea på mango aptamerfluorescens och optimala infärgnings tider. A) en ureaktrering med 50 nm RNA mango i (orange cirklar), mango II (gröna cirklar), mango III (lila cirklar), och mango IV (blå cirklar), tillsammans med 100 Nm. tm-biotin färg ämne och vid indikerade urea koncentrationer. Proverna inkuberades för 40 min innan fluorescens lästes vid en exciteringvåglängd på 510 nm och en emissions våglängd på 535 nm. (B) mango III RNA laddades i en 8% denaturering gel och färgas med en gel lösning som innehåller 20 nM slutlig 1-biotin färg ämne. För varje indikerad tids punkt användes 0,064, 0,32 och 1,6 pmol mango III RNA från vänster till höger. Gelen avbildar visualiserades med en fluorescensimager som använder en 520 Nm laser och en 10 min exponering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: viktider för mango aptamers i närvaro och avsaknad av urea. (A) vid förekomst av 1,5 M urea och 100 Nm TM 3-biotin utfördes fluorescens-kurser med 50 nM i varje RNA mango-konstruktion (RNA mango i: orange prickar, mango II: gröna prickar, mango III: lila prickar, och mango IV: blå prickar). B) identiska med panel A, utom i avsaknad av urea. Alla tids kurser utfördes vid rums temperatur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fluorescerande bilder av infödda och DENATURERING Page med RNA mango konstruktioner. (A) en 8% Native gel med seriellt utspädd RNA mango konstruktioner. Lanes I, II, III och IV innehåller vardera 8 pmol slutliga kvantiteter av RNA mango I, II, III, och IV, respektive. De högra panelerna är tvåfaldigt seriella spädningar som innehåller 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0,5 pmol, 0,25 pmol, 0,125 pmol och 0,0625 pmol av antingen mango I, II, III, eller IV, som anges. Lane 12 innehåller inget RNA. Bkvantifiering av tre replikat av den ursprungliga gelen (standard avvikelse för medelvärdet som visas för varje). Cen 8-procentig denaturerad gel med samma prov, lastad som i panel A, med undantag för det faktum att en gel laddnings lösning för denaturering användes i stället för inbyggd gel laddnings lösning. (D) tre kvantifierade replikat av denaturerad gel (standard avvikelse för medelvärdet som visas för varje). Alla gel bilder visualiserades en gel Imager med en 520 Nm laser och en 10 min exponering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: de suboptimala gelerna och den ofullständiga vikningen av mango IV i en 8% ursprunglig gel. A) en seriell utspädning av den sort som visas i figur 4 för mango II men som visar effekten av gel vikning under infärgnings protokollet. (B) mango IV Native gel prover som inte tilläts vika tillräckligt länge i infödda buffert innan gel lastning uppvisar dubbla band. Annars, dessa resultat liknar mango IV resultat som visas i figur 4a. Alla gel bilder visualiserades med hjälp av en gel Imager med en 520 Nm laser och en 10 min exponering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: mango-märkta RNAs kan detekteras i närvaro av totalt RNA, med hjälp av TM--biotin färgning. 8% denaturering geler lastades med 100 ng av totalt RNA och kördes för 30 min. Den vänstra gelen färgas med SG och den högra panelen med TM-biotin. För båda panelerna, filer märkta E lastades med 100 ng av pEcoli-T1 (ingen mango tagg) och köer märkt M lastades med 100 ng av pEcoli-RNA Mango (6S RNA märkta med en mango jag tagg). TM-en-biotin-färgade gel bilder visualiserades med hjälp av en Imager med en 520 Nm laser och en 10 min exponering. SG-färgade gel bilder visualiserades med hjälp av en gel Imager med hjälp av en 460 Nm laser och en 10 min exponering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Procent | GEL VOLYM | |||
| 20 mL | 30 mL | 50-100 mL | ||
| 5 | A | 4 | 6 | 10 |
| B | 14 | 21 | 35 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 6 | A | 4,8 | 7,2 | 12 |
| B | 13,2 | 19,8 | 33 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 8 | A | 6,4 | 9,6 | 16 |
| B | 11,6 | 17,4 | 29 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 10 | A | 8 | 12 | 20 |
| B | 10 | 15 | 25 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 12 | A | 9,6 | 14,4 | 24 |
| B | 8,4 | 12,6 | 21 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 15 | A | 12 | 18 | 30 |
| B | 6 | 9 | 15 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 20 | A | 16 | 24 | 40 |
| B | 2 | 3 | 5 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 | |
Tabell 1: DENATURERING Page gel gjutning tabell. A = lösning A, B = lösning B, C = lösning C.
| Denaturering gel% | BB (~ rörlighet NT) | XC (~ mobilitet i NT) |
| 5 | 35 | 130 |
| 6 | 26 | 106 |
| 8 | 19 | 70-80 |
| 10 | 12 | 55 |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 |
Tabell 2: ungefärliga gel utbyten av bromfenolblått (BB) och xylencyanol (XC) gel laddnings färg ämnen för geler i polyakrylamid som denatureras.
| Procent | GEL VOLYM | |||
| 20 mL | 30 mL | 50-100 mL | ||
| 5 | 1X TBE | 16,5 | 24,75 | 41,25 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 2,5 | 3,75 | 6,25 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 6 | 1X TBE | 16 | 24 | 40 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 3 | 4,5 | 7,5 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 8 | 1X TBE | 15 | 22,5 | 37,5 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 4 | 6 | 10 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 10 | 1X TBE | 14 | 21 | 35 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 5 | 7,5 | 12,5 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 12 | 1X TBE | 13 | 19,5 | 32,5 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 6 | 9 | 15 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 15 | 1X TBE | 11,5 | 17,25 | 28,75 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 7,5 | 11,25 | 18,75 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 20 | 1X TBE | 9 | 13,5 | 22,5 |
| 40% 29:1 akrylamid: N, N'-metylenebisacrylamid | 10 | 15 | 25 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 | |
Tabell 3: inbyggd sida gel Casting tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En betydande fördel med mango fluorescerande taggen är att en enda tagg kan användas på flera sätt. Den höga ljus styrka och affinitet av dessa aptamers göra dem användbara inte bara för i cell visualisering2 men också för in vitro-RNA eller RNP rening4. Därför, gel Imaging utökar mångsidigheten hos mango taggen på ett enkelt sätt. Mango gel Imaging känslighet är något mindre än en nordlig blot14 men kan lätt upptäcka 60-120 fmol av RNA-prov, utan att behöva långa och tråkiga membran överföring och sondering steg. Detta är jämförbart med hybridiserings-baserade sondering effektivitet hittades tidigare för små rnas i gel15. Medan andra fluorogena Aptamer metoder-särskilt, RNA spenat-har större känslighet och specificitet9, ingen har för närvarande samtidigt den höga ljus styrka och affinitet av mango Aptamer systemet, vilket gör att en enda RNA-tagg som ska används för cellulär avbildning, RNP rening, och nu gel Imaging.
Det finns några viktiga steg i detta gel Färgnings protokoll. Vid arbete med RNA-lösningar bör lösningarna vara sterila filtrerade, och engångsbruk plasticware bör användas. Catuion, rinnande infödda geler som komplex eller RNA strukturer kan lätt denatureras om effekt nivåerna för gelen är för höga och resultera i gel uppvärmning. Se till att alla begagnade glas varor är rena och inte förorenade med RNases. Dessutom, alltid vara försiktig när du överför och plocka upp geler som de är sköra och kan vara benägna att brott.
Den TM-biotin fläcken penetreras geler snabbt, men de uppgifter som presenteras här visar också att mango IV vikning, i synnerhet, kan vara hastighetsbegränsande (figur 2 och figur 3). Med hjälp av de villkor som anges i avsnittet protokoll, observerade vi log-linjär beteende för alla fyra aptamers över två storleksordningar i denaturering geler, vilket gör metoden användbar för kvantifiering (figur 4c, D). Eftersom den lilla mango aptamers används i denna studie lätt spridas ut ur gelmatrisen, förväntar vi oss kvantitation att förbättra för längre RNA konstruktioner.
Mango tag gel Imaging metodik visas här är robust och förväntas kunna helt enkelt utvidgas när det gäller känslighet och specificitet. Mango I, II, och III vika tillförlitligt, medan mango IV inte. Även om vi inte har utforskat avfärgnings protokollen, förväntar vi oss att ett sådant tillvägagångs sätt också helt enkelt kan förbättra specificiteten. Även utanför tillämpningsområdet för detta arbete, den fluorescens och biotin tagg tilldelats mango-märkt RNA när du använder TM-biotin fluorophore verkar mycket sannolikt att ytterligare effektivisera gel analys och rening. Kommersiellt tillgängliga sekundära biotin-märkning tekniker, till exempel, lovar att ytterligare förbättra detektions gränserna för denna enkla RNA mango-märkningssystem. Likaså verkar det troligt att infödda mango-märkta RNA protein komplex kan elueras från en gel och återvinnas med streptividin magnetiska pärlor för att fånga den eluerade RNA-komplexet. Detta skulle ytterligare förenkla rutinmässig rening av biologiskt viktiga RNAs och RNA-komplex genom att enkelt lämpa att lägga till en mango tagg till RNA av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ett patent pågår på mango fluorgenic systemet.
Acknowledgments
Författarna tackar Razvan Cojocaru och Amir Abdolahzadeh för deras tekniska hjälp och Lena Dolgosheina för korrektur läsning av manuskriptet. Finansiering tillhandahölls för detta projekt av ett kanadensiskt naturvetenskapligt och ingenjörs vetenskapligt forsknings råd (NSERC) drifts bidrag till P.J.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
