Summary
이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.
Abstract
최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 된 여러 단계를 통해 조직 촉진 것입니다. 이 문서 전체 마운트 제자리 교 잡 배아 개발 수행에 관심이 있는 연구자에 적합 하지만 아직 절차 수행 하지. Astyanax 연구에 대 한 선택된 방법의 장점은 것 그것이 테스트 되 고 cavefish에 따라서 비교 식 분석을 촉진 하는 표면 물고기 변경해 입증. Astyanax 및 다른 시스템에 대 한 연구에서 연구자에 의해 제시 메서드를 사용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학 신시내티 (프로토콜 #10-01-21-01)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 고정
- 번 식 탱크에서 Astyanax mexicanus 배아의 원하는 번호를 분리 하 고 한 번에 ~ 50 배아를 수정. 태아는 크고 오래 된, 경우 25도 고정 되도록 한 번에 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다.
- 태아의 나이 따라 마 취의 IACUC 승인 방법을 이용 한다. 작동 신 시스템으로 이전 배아에 대 한 마 취 과다 통해 배아를 희생. 따라서 통증과 유기 체에 대 한 불편을 최소화 하기 위해 ~ 1 %tricaine (pH 7.4에 버퍼링)의 솔루션에 배아를 배치 합니다.
- 배아, 터치 응답 하지 일단 대체 시스템 물 tricaine를 포함 하 고 ~ 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 1 추가 합니다.
- PBS 솔루션을 제거 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정
주의: PFA (즉, 그것은 가연성 이며 피부와 폐 자극) 유해 하, 주의 처리.
2입니다. 탈수
- 배아, 탈수 통 솔루션을 제거 하 고 1 mL의 PBS로 씻어. 린스 하는 동안 플랫폼 통에 각도 (30 °와 45 °) 사이 포함 하는 태아 튜브를 놓습니다. 계속 씻어 두 번 배아 세척 당 5 분.
- 배아는 chorion 아직도 가진다면 모든 50 배아는 100 x 25 mm 페 트리 접시에 놓고 조심 스럽게 시계의 겸 자 (예: #5 집게) 현미경의 2 세트를 사용 하 여 chorions에서 그들을 분리 합니다.
참고: 아래, 그리고 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 설명 하는 단계 동안 신중 하 게 제거 모든 액체 깨끗 한를 사용 하 여 이전 단계에서 다음 솔루션을 추가 하기 전에 유리 파스퇴르 펫 - 메탄올 (MeOH) 아래에 설명 된의 점점 집중된 세척의 시리즈에 배아를 탈수. 희석 솔루션 각 4 mL 유리 유리병에가의 500 µ L 1 mL 전체 볼륨을 기반으로 합니다. 플랫폼 통에 상 온 (RT)에서 모든 탈수 단계를 수행 합니다.
- 조심 스럽게 PBS 솔루션 제거. 25 %MeOH 솔루션 (MeOH의 250 µ L) + PBS의 750 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 25 %MeOH 솔루션. 50 %MeOH 솔루션 (MeOH의 500 µ L) + PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 50 %MeOH 솔루션. 75 %MeOH 솔루션 (MeOH의 750 µ L) + PBS의 250 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분 동안 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 75 %MeOH 솔루션. 100 %MeOH 솔루션 (MeOH의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 이 시점에서,-20 ° C (장기)에 그들의 유리 튜브에 필요에 따라 탈수 배아를 저장 합니다. 또는 하루 1 프로토콜의 직접 진행 합니다.
3. 주 1: 재
- -20 ° C 냉장고에서 탈수 배아를 얻기 (또는 단계 2.5에서 직접 진행).
- 배아는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 정렬 합니다. 하나에 따라 morphotype (즉, 동굴 및 표면)를 정렬할 수 있습니다 그리고 유전자의 수는 각 실험에서 평가. 한 번 정렬 유리병 당 일반적으로 더 이상 12 배아가 있다. 조직 유지, 병 및 각 유전자에 대 한 펫을 지정 하 컬러 랩 테이프를 사용 합니다. 배아는 전체 프로토콜을 통해 같은 유리병에 있을 것입니다.
참고: 장소 100%에서 파스퇴르 피 펫의 끝 사이 소독 EtOH를 사용 합니다. - 이후 단계에서 사용 될 70 ° C에 떨고 물 목욕을 설정 합니다. 정렬 된 배아의 튜브에 MeOH 밖으로 신중 하 게, 그리고 새로운 100%의 500 µ L를 바꿉니다 MeOH. 세척 짧게 (~ 1 분) 플랫폼 통에.
- 플랫폼 통에 트윈 20 (PBT, 아래 참조)와 1 x PBS의 증가 농도에 배아 리하이드레이션 희석은 바탕 1 mL 최종 희석 볼륨 500 µ L 각 유리병에가.
- 25 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 750 µ L의 250 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 25 %PBT 솔루션. 50 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 500 µ L의 500 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 50 %PBT 솔루션. 75 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 250 µ L의 750 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 75 %PBT 솔루션. 100 %PBT 솔루션 (PBT의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
4. 주 1: 소화와 고정
- PBT의 2 개 mL를 PK (20 mg/mL)의 1 µ L을 추가 하 여 가수분해 K (PK) 솔루션을 준비 합니다.
- 후속 단계의 기대에,-20 ° C 저장에서 교 잡 버퍼 (Hyb-및 Hyb +; 보완 파일 2 와 보조 파일 3참조)와 PFA의 냉동된 aliquots를 가져옵니다.
- PFA 실시간에서 해빙 하는 것을 허용합니다
- Hyb-및 Hyb +의 aliquots 회전 70 ° C의 물 욕조에 배치 합니다. 모든 시 약 및 작은 "개 스" 메쉬 바닥 부동 목욕 정수기 내부 내부 튜브를 배치 합니다. 간단한 추가 및 제거의 튜브와 튜브 회전 70 ° C 물 탕에서 수 있습니다.
- 부드럽게 추가 배아 모든 조직 확보의 vial(s)에 PK 솔루션 솔루션으로 완전히 덮여 있다. 태아 ~ 12 분 PK 작업 솔루션 플랫폼 셰이 커에 대 한 다이제스트.
참고: 소화의 길이 최적의 결과 보장 하기 위해 수 사관에 의해 변화 될 수 있습니다. - 부드럽게 PK 솔루션에서 그리고 모든 나머지 PK. 희석 PBT와 유리병을 간단히 홍수
- PBT 솔루션에서 그리고 새로운 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 5 분에 대 한 플랫폼 셰이 커에 린스에 솔루션을 수 있습니다.
- PBT에서 그리고 해 동된 4%의 500 µ L를 바꿉니다 PFA. 실시간에서 플랫폼 통에 20 분 동안 품 어 배아 있도록
- 4% 그리기 PFA, 짧게 어떤 나머지 PFA 희석 PBT와 유리병을 홍수. PBT, 떨어져 그리고 신선한 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 배아 플랫폼 통에 5 분 동안 린스를 허용 합니다. 이 단계 4 번 더 반복 합니다.
5. 주 1: Prehybridization
- 유리병으로 미리 데워 Hyb 솔루션의 장소 500 µ L. 신중 하 게는 70 ° C 물 (가스 켓) 내부 목욕 없이 5 분 동안 흔들어에 유리병을 배치 합니다.
- Hyb 솔루션에서 그리고 미리 데워 Hyb + 솔루션의 500 µ L로 유리병을 홍수. 다시 흔들어 (40 rpm)와 70 ° C 물 목욕으로 유리병을 놓습니다. 어느 4 h incubate 나 밤새.
참고: 4 h 인큐베이션 총에서 4 일 동안 지속 될 것 이다 완전 한 현장에서 프로토콜을 얻을 것입니다. 여기,이 단계는 총에서 5 일 지속 되는 프로토콜을 보장할 하룻밤 부 화도 제공 됩니다.
6. 주 2: 교 잡
- 5 분 동안 흔들어 뜨거운 물 목욕으로-20 ° C 냉동 고에서의 Hyb + 약 수를 놓습니다.
- 유리병에서 떨어져 Hyb + 그리고 미리 데워 Hyb + 500 µ L를 바꿉니다. 이 솔루션을 신중 하 게 각 유리병에 RNA 프로브 2 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 프로브 분배 되도록 유리병을 소용돌이 친다.
- 40 rpm에서 떨고 있는 동안 70 ° C 온수 목욕에서 Hyb + (추가 조사)와 솔루션 밤새 품 어.
참고: 하나 다시 Hyb + (프로브) 솔루션을 사용할 수 있습니다. 이 위해 걸릴 Hyb + 프로브 처음부터 실행-20 ° C 냉동 고에서 장소 5 분 바꾸기 Hyb + 1 일에서에 대 한 뜨거운 물 목욕에 프로브 Hyb + 프로토콜 고 뜨거운 물 목욕에서 하룻밤 배양.
7. 주 3: 솔루션 준비
- Microcentrifuge 튜브 "유전자의 관심" RNA 프로브 Hyb + 표시를 준비 합니다. 3 일 동안 사용할 수 있는 희석의 시리즈를 준비 합니다.
- Hyb-및 염 분 나트륨 시트르산 (SSC, 0 ~ 100%)의 희석의 다음 시리즈를 준비 6 별도 튜브를 사용 하 여, 1 mL 볼륨, 그리고 장소에서 떨고 70 ° C에 물 목욕: 1 = 100% 튜브 Hyb-(1 mL의 Hyb-): 2 = 25% 튜브 2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L); 3 = 50 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-500 µ L의 500 µ L); 4 = 75 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-250 µ L의 750 µ L); 튜브 5 = 100 %2 배 SSC (2 x SSC의 1 mL); 6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC의 2 개 mL) 튜브.
참고: 심하지 SSC의 농도의 0.2 2 x에서 변경 x. - 튜브를 분리 1 mL 볼륨에 PBT와 SSC의 희석의 다음 시리즈를 준비 하 고 RT에 4를 사용 하 여: 1 = 25% 튜브 PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC); 2 = 50 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 500 µ L의 500 µ L); 3 = 75 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 250 µ L의 750 µ L); 4 = 100 %PBT (PBT의 1 mL) 튜브.
- 포함 된 트윈 20 (MABT) 작업 솔루션 maleic 산 버퍼의 2 mL 튜브를 준비 합니다.
- 두 개의 15 mL 원뿔 튜브 차단 솔루션의 준비. 각 관에서 MABT의 10 mL를의 차단 시 약 0.2 g을 추가 ( 추가 파일 4참조). (최대 3 h) 솔루션에 완전히 녹아 때까지 nutating 믹서 (또는 플랫폼 통)에 모두 관을 놓습니다.
- Hyb-및 염 분 나트륨 시트르산 (SSC, 0 ~ 100%)의 희석의 다음 시리즈를 준비 6 별도 튜브를 사용 하 여, 1 mL 볼륨, 그리고 장소에서 떨고 70 ° C에 물 목욕: 1 = 100% 튜브 Hyb-(1 mL의 Hyb-): 2 = 25% 튜브 2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L); 3 = 50 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-500 µ L의 500 µ L); 4 = 75 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-250 µ L의 750 µ L); 튜브 5 = 100 %2 배 SSC (2 x SSC의 1 mL); 6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC의 2 개 mL) 튜브.
8. 주 3: 조사 제거
- 유리 피 펫 파스퇴르 Hyb + (프로브) 솔루션에서 그립니다 고 그것은 살 균, microcentrifuge 튜브를 표시 합니다. (프로브 라벨 성공 하면) 나중에 사용-20 ° C 냉동 실에이 관을 유지 합니다.
- 신중 하 게는 따뜻한 SSC/Hyb-희석 (아래 표시)의 500 µ L를 추가 합니다. 각 70 ° C 떨고 물 탕에서 10 분 다음 솔루션의 각에서 품 어.
- 100% 순차적으로 품 어 Hyb-Hyb-(1 mL), 25 %2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L), 50 %2 x SSC (500 µ L 2의 x SSC의 Hyb-500 µ L), 75 %2 x SSC (750 µ L 2의 x SSC, 250 µ L의 Hyb-), 100 %2 x SSC (2의 1 mL x SSC) 100 %0.2 x SSC (0.2의 2 mL x SSC).
- 마지막 단계, 10 분에 대 한 다음 솔루션의 각에서 품 어. 다음 외피의 모든 플랫폼 셰이 커에 RT에서 열릴: 25 %PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC), 50 %PBT (PBT, 0.2의 500 µ L의 500 µ L x SSC), 75 %PBT (PBT, 0.2의 250 µ L의 750 µ L x SSC) 100 %PBT (PBT의 1 mL).
- 10 분 부 화 후 100% 제거 PBT, 각 유리병에 MABT의 500 µ L을 추가 하 고. 5 분 동안 두 번이 단계를 반복 합니다.
9. 주 3: 차단
- 각 유리병 및 튜브 (준비 단계 7.1.4에서에서) 중 하나에서 premixed 차단 솔루션 홍수에서 MABT를 제거 합니다. 실시간에서 ~ 4 h nutating 믹서에 장소 유리병
- 2 추가 안티 DIG AP 팹의 µ L 10 mL 차단 솔루션 (준비 단계 7.1.4에서에서) 그리고 짧게 소용돌이의 두 번째 약 병을 조각.
- 채워 각 유리병 거의 완전히 차단 솔루션 (~ 5 mL)와 4 ° c.에 냉장고에 하룻밤 nutating 믹서에
10. 주 4: MABT 린스
- MABT에 10% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 재고 유리병을 준비 (900 µ L MABT의 NGS의 100 µ L 추가).
- 각 유리병에 차단 솔루션에서 그리고 각 유리병에 500 µ L NGS/MABT 혼합물의 추가. 플랫폼 셰이 커에 RT에 25 분 동안 품 어 배아를 허용 합니다.
- 100%의 500 µ L NGS/MABT 혼합물 바꿉니다 MABT. 플랫폼 셰이 커에 RT에서 30 분 동안 품 어. 이 린스 11 번 이상 하루 30 분 마다 수행 합니다.
- 100 %MABT와 4 ° c.에 냉장고 또는 대형 챔버에 하룻밤 nutating 믹서에 유리병을 채우기
11. 주 5: 프로브 시각화
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼의 약 50 mL 수 준비 ( 보충 파일 5참조). 50 mL 원뿔 튜브 빛 노출을 제한에 알루미늄 호 일에 싸여 다음 결합: 1 M Tris (pH 9.5), 50 mM MgCl2, 1%의 5 mL의 5 mL의 5 mL 트윈 20, 1 M NaCl, ddH2O의 30 mL의 5 mL.
- MABT를 제거 하 고 AP 버퍼 (호 일에 싸여 튜브) 1 mL를 바꿉니다. 5 분 동안 씻어 보자. MABT의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 두 번 이렇게.
- AP 버퍼를 제거 하 고 AP 버퍼 3.5 μ 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) 및 4.5의 1 mL를 바꿉니다 니트로 블루 tetrazolium (NBT)의 μ. 매 시간 마다 반응까지 완료 되 면 갓된 AP 버퍼/NBT/BCIP로 바꿉니다. 매 15 분, 채색 반응 얼룩의 원하는 수준을 달성 때까지 자리를 차지할 수 있도록 검사, 밀접 하 게 모니터링 합니다. 침전 양식 하기 시작, 빨리 솔루션을 교체 합니다.
- 들러 채색 반응 (NBT/BCIP) 없이 신선한 100 %AP 버퍼에 배아를 rinsing PBT에서 5 분 계속 린스에 대 한 신호 (배경 얼룩의 최소 금액)와 최적의 수준을 달성 하는 때까지. 린스 표본 같습니다 AP 버퍼에 PBT의 희석을 증가 함께 계속: 25 %PBT (PBT, AP 버퍼의 750 μ의 250 μ), 린스 5 분; 50 %PBT (PBT, AP 버퍼의 500 μ의 500 μ), 린스 5 분; 75 %PBT (PBT, AP 버퍼의 250 μ의 750 μ), 5 분 동안 씻어.
- PBT nutating 믹서 최소 배경 얼룩이 지 원하는 때까지에 도달 하는 100%의 ~ 5 mL에 배아를 씻어. 스위치 밖으로 신선한 PBT 여러 번. 이것은 몇 일 걸릴 수 있습니다.
- 때 플랫폼 통에 살 균 PBS의 500 μ에 완료, 세척 배아 rinsing. 5 분 동안 두 번이 린스를 수행 합니다. PBS 세척 후 4%의 500 μ에는 표본에 수정 후 PFA 플랫폼 통에 RT에 1 시간에 대 한. 4%의 1 mL에서 하룻밤 수정 또는, 4 ° c.에 냉장고에는 PFA
- 신선한, 함께 정착 액을 대체 살 균 PBS. 수행이 린스 5 분 장소에 적어도 두 번 배아 100% 살 균 PBS의 ~ 4 ml에서와 4 ° c.에 긴 기간 저장
12입니다. 영상
- 3 %agarose 및 태 버퍼를 사용 하 여 페 트리 접시에 이미징 접시를 확인 합니다.
참고: 수량 얼마나 많은 접시는 필요에 따라 달라 집니다. 접시 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. 젤 접시에 배아를 포함 하는 우울증을 만들려면 냉각 하는 동안 얕은 직사각형 형 페 트리 접시에 배치 하는 것이 좋습니다. - 배아는 PBS에서 접시에 놓습니다.
참고:이 부드럽게 그들을 밖으로 그들은 플라스틱 펫의 내부에 붙어 것입니다 발견 되었습니다 때문에 pipetting 대신 접시에 배아를 부 어 좋습니다. - 가벼운 현미경 검사 법 사용 하 여 각 배아를 시각화. 무딘 프로브를 사용 하 여 원하는 위치로 배아를 책략.
- 태아는 원하는 위치에 이미지를 가져가 라. 참고 완료 얼룩 얼룩의 잠재적인 저하를 방지 하는 몇 주 이내 태아의 이미지를가지고 하는 것이 중요 합니다.
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Representative Results
이 보고서에서 우리는 높은-품질 유전자 표정 분석에 대 한 미 발달 Astyanax 표본의 라벨 수행 하는 단순 하 고 간단 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 4 개 또는 5 일에 실시 될 수 있습니다 하 고 절차의 각 주요 단계 색된 순서도 (그림 1)에 표시 됩니다. 완료 되 면, 얼룩진된 배아 관심사의 특정 유전자를 표현 하는 조직에서 어두운 자주색 반음계 레이블을 항구 합니다. 우리는 성공적으로 Pachón cavefish (그림 2A-B, E)에 표면 물고기 (그림 2C-D, F) 배아가이 프로토콜을 실행 했다.
그 레이블 초기 신경 크레스트 조직, Sox9 및 Tfap2a5,6cavefish 배아 두 녹음 방송 요인에 대 한 얼룩 했다. Sox9 식에 대 한 분류 하는 배아 개발 아가미 아치와 가슴 지 느 러 미 (노란색 화살표, 그림 2A)에서 명확한 레이블 보여 줍니다. 얼룩은 거의 결 석 노 른 자 삭 또는 측면 (그림 2A)에 개발 somites에. 마찬가지로, Tfap2a 식 뿐만 아니라 초기 마이그레이션 신경 크레스트 셀 (그림 2B, 화살촉) 태아의 등 쪽 측면 지역 따라 개발 머리 부분에 분명 하다. Cavefish 배아에 대 한 세 번째 대표 유전자 Phf20a, osteoblast 차별화7의 표식입니다. Note somitic mesoderm 및 뼈 조직 (그림 2E, 화살촉)을 운명 후부 머리 부분에서 긍정적인 얼룩.
표면 물고기 배아에서 우리는 CXCR, Adcyap1a및 Sox10유전자에 대 한 조사. CXCR 는 CXC 발산8G-단백질 막 바인딩 수용 체를 인코딩합니다. 긍정적인 라벨은 노른자위 sac overlying 몇 가지 개별 셀 뿐 아니라 머리 (그림 2F, 화살촉), 측면의 고립 된 지역에서. 유전자 adenylate 있고 활성화 polypeptide, Adcyap1a, 뇌 세포를 포함 하 여 중앙 신경의 영역에 표시 됩니다. 참고; 태아의 등 쪽 부분에 셀의 이점, 양자 클러스터에 매우 구체적인 식 뿐만 아니라 중간 식 (그림 2C, 화살표)의 더 큰 지역. 마지막으로, 우리는 레이블 초기 신경 크레스트와 oligodendrocyte 셀10 Sox10, 녹음 방송 요인의 표정을 제시. 매우 구체적인 긍정적인 얼룩 왼쪽에 신경 크레스트의 초기 마커 및 (그림 2D, 화살촉) 등 태아의 오른쪽 측면으로 분명 하다.
선물이 각각 두 종류의 혼란 문제 다른 조사 발생할 수 있습니다. 하나는 정기적으로 발생 하는 첫 번째 문제는 일반적인 라벨의 punctate 얼룩입니다. 이 점 들 채색 반응 동안에 최종 MABT 린스 또는 AP 버퍼에서 침전으로 발생할 수 있습니다. 이 일반적인 라벨의 예를 들어 Pnp4a의 표현에 대 한 스테인드 표면 물고기 태아의 노 른 자 골목에 분명 하다. 이 유전자는 무지개 빛깔의 염색11의 생산을 촉진 하는 효소를 (purine nucleoside phosphorylase)을 인코딩합니다. 이 유전자 처음 개발 눈과 수영 방광에 분명 하다. 일부 표면 표본 (그림 3A), 관찰 하는 punctate 얼룩 자주 세척 및 프로토콜 (그림 3B)의 최종 단계에서 AP 버퍼 + NBT/BCIP의 교체에 의해 삭제 되었다. 두 번째 문제는 정기적으로 만난다 그렇지 않으면 고유 식 패턴을 생성 하는 유전자의 확산, 크게 일반적인 표현 이다. 한 예로 유전자 BMP4, chromogen 견본 (그림 3C) 걸쳐 존재의 낮은 수준으로 크게 확산 패턴으로 표시 되는. 이러한 경우, 우리 일반적으로 유전자의 다른 영역을 식별, 벡터에 증폭 하 고 새로운 프로브 합성을 수행 ( 보충 파일 6참조). 제어 (프로브) 견본 (그림 3D)의 예는 우리의 실패 BMP4 프로브의 확산 및 일반적인 특성을 설명 하기 위해 제공 됩니다.
그림 1: 전체-마운트 제자리 교 잡에 대 한 간단한 순서도. 이 순서도 제자리 교 잡의 주요 단계를 설명 하기 위해 색 구분을 사용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 6 유전자, 동굴 및 Astyanax의 표면 변경해 사용 하 여 얼룩. (A) 이미지 표시는 특정 얼룩 (노란색 화살표) 72 h 후 수정 (hpf)의 오른쪽 측면에 Sox9 의 Pachón cavefish (45 x). (B) 특정 얼룩 Tfap2a 는 36의 오른쪽 측면에 분명 대 한 hpf Pachón cavefish (45 x). (C) 양측 및 중간의 Adcyap1a (노란색 화살표) 얼룩 72 hpf 표면 물고기 (100 x) 등 지역에 표시 되어 있습니다. (D) 24 hpf 표면 물고기 (100 배)의 신경 크레스트 조직에서 Sox10 의 얼룩. (E) Phf20a 등 지역에는 24의 표현의 희미 하지만 분명, 패턴을 보여줍니다 hpf Pachón cavefish (100 x). (F)는 cytokine 수용 체, CXCR, 24 hpf 표면 물고기 (100 배)의 오른쪽 측면 쪽의 별개의 영역에 표시 됩니다. 스케일 바 A, B, E, f에서 = 0.5 m m; C, D에서에서 바 규모 = 2.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 전체-마운트 제자리 교 잡에 대 한 최적의 결과의 대표적인 예. (A) 특정 얼룩은 일반적인 침전 및 파편 (붉은 화살표)는 72의 오른쪽 측면 측면에 함께 분명 hpf Pachón cavefish (100 x). (B) A에서 시각 같은 프로브, 침전 없이 72에 배경 패턴 같은 얼룩을 묘사한 hpf Pachón cavefish (100 x). (C)는 72의 오른쪽 측면 측면 hpf Pachón cavefish에 확산, 일반적인 얼룩 BMP4 에 대 한 45 x 확대 하는 방법을 보여 줍니다. (D) A 72 hpf Pachón cavefish 프로브 (45 x)의 추가 없이이 프로토콜을 복종. 스케일 바 = 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 살 균 방식에서으로 저장. 또한, 그것은 근본적으로 중요 한 탐정 프로토콜에서 각 단계의 주의 트랙을 유지입니다. 우리는 단계 제공 된 검사 목록을 매우 정확 하 고 정확한 준공이이 프로토콜의 각 부분을 확보에 유용할 수 있습니다 나타났습니다.
우리는 종종 우리가 여기에 제시 된 프로토콜을 수정 하지 마십시오. 그러나, 조사자는 제안 하는 것 보다 서로 다른 온도에서 프로브 외피를 수행할 수 있습니다 (즉, 70 ° C). 교 잡 온도에서 약간의 변화는 RNA 프로브, 바인딩 영향 것 이다 그리고 그러므로, 최적의 교 잡 온도 찾고 긍정적으로 영향을 미칠 수 얼룩의 품질. 관련 문제 해결, 우리는 강하게 다른 조사 (추가 파일 1)이이 문서와 함께 제공 된 검사 목록을 활용 하 격려 한다. 주의 기록 고품질 얼룩 확보에 필요한 첫 번째 단계는 유지. 락 없이 최종 착 색 반응을 수행 하는 두 번째 사소한 수정 제안 (예를 들어, 삽입 하지 않고 플랫폼 통 또는 nutator). 이것을 위한 이유는 주기적으로 우리는 아마도 AP 버퍼 솔루션에서 발생 하는 침전의 생산 주의. 이 침전 물은 일반적으로 어두운 색을 overstains 하 고 얼룩진된 조직 punctate (일반적인) 배경 만듭니다. 이 침전의 생산을 최소화 하기 위해 우리는 각 반응 직전 소독된 AP 버퍼를 준비 합니다. 또한, NBT와 BCIP 버퍼에 추가 되었습니다, 일단 바꿉니다 그것 신선한 버퍼 및 NBT/BCIP 채색 반응이 완료 될 때까지 매 시간 마다.
제시 방법에 한계는 반음계 얼룩 진 식 시각화를 위해 사용 되었다 이다. 우리는 비용 효율적인, 그리고 시각화를 가벼운 현미경에만 필요 합니다 이후이 접근을 선호 합니다. 양적 차이 평가에 관심이 하나, 만약 그들이 사용 하는 형광 색 반응 하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 반 정량, 예를 들어 상대 형광 단위의 실험 사이 식의 비교를 통해 있습니다.
제자리 교 잡 프로토콜 과학적인 간행물에서 뿐만 아니라 웹12,13에 널리 사용할 수 있습니다. 우리는 현재 프로토콜 Astyanax mexicanus모델 시스템을 위해 특별히 개발 되었다. 우리는 유전자의 여러 수십의 식을 얼룩 느낌과 일관 되 게 높은-품질 결과 제공 합니다이 프로토콜을 이용 했다. 이 프로토콜의 중요 한 이점은 탐정이이 프로토콜의 단계 각의 정확한 완료 하면서 여러 작업을 수행할 수 있도록 항목의 단계별 체크 리스트 이다. 하겠습니다이 프로토콜 필드에 및 저쪽에, 다른 조사자를 유용한 자원으로 봉사 하 고 예상이 일반적인 실험실 기술은 미래의 발견 맹인 멕시코 cavefish 표현 형 유전자 형 연결을 지원 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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