Summary
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.
Abstract
בשנים האחרונות, גנום טיוטה עבור מקסיקני עיוור cavefish (Astyanax mexicanus) שוחררה, לחשוף את זהותם רצף אלפי גנים. מחקר קודם במערכת מודל המתעוררים הזאת באותיות רישיות על חקירות הגנום כולו מקיף זיהו אינספור אתרים תכונה כמותית כמותיים המשויך פנוטיפים שונים הקשורים המערה. עם זאת, היכולת להתחבר הגנים של ריבית הבסיס heritable לשינוי פנוטיפי נשאר אתגר משמעותי. טכניקה אחת זה יכול להקל על הבנה עמוקה יותר של התפקיד של פיתוח באבולוציה troglomorphic הוא היברידיזציה כולה-הר. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להשוות בין גנים בין המערה - ואת משטח המגורים טפסים, למנות מועמד גנים שבבסיס QTL הוקמה, לזהות את הגנים של עניין ממחקרים הדור הבא רצפי או לפתח את זה ישירות גישות מבוססות-גילוי. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט, הנתמך על-ידי רשימת תיוג גמיש, אשר ניתן להתאים באופן נרחב לשימוש הרבה מעבר למערכת המחקר הציג. יש לקוות כי פרוטוקול זה יכול לשמש משאב רחבה למען הקהילה Astyanax ומעבר.
Introduction
היברידיזציה באתר היא שיטה נפוצה עבור צביעת רקמות קבוע להמחיש דפוסי ביטוי גנים1. טכניקה זו בוצעה שנים אחרים מסורתי2 שגרתיים3 דגם מערכות, למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים. עם זאת, מספר צעדים, ריאגנטים נחוצים לבצע הליך זה בהצלחה. עבור חוקרים אשר מעולם לא ביצע בטכניקה זו, מפעיל את התהליך יכולה להיות מאיימת בשל הצעדים רבים הכרוכים עוד יותר, מהות ההליך ממושך משאיל את עצמו על שגיאות טכניות, אשר עשויה להיות מאתגרת כדי לפתור בעיות.
המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג שיטה פשוטה שיעבד טכניקה זו הכלאה נגיש לקהל רחב. כדי לצמצם את המבוא של שגיאות, אנו מציגים בגישה ישירה התשואות באיכות גבוהה ג'ין ביטוי מכתים, ממזער את האות רקע שאינם ספציפיים. הליך זה דומה גישות אחרות שפותחה במערכות דגם מסורתיים, כגון רזבורה rerio4. כאן, אנו שואפים לקדם יישום זהיר של כל שלב באמצעות רשימת פעולות לביצוע להורדה (1 קובץ משלים), כדי לקדם את יישום זהיר של הפרוטוקול. הרציונל לביצוע פעולה זו היא להקל על הארגון בשלבים רבים הכרוכים בהליך זה. מאמר זה מתאים מהחוקרים המעוניינים בביצוע היברידיזציה כולה-הר בפיתוח עוברי, אך עדיין לא ביצעתי את ההליך. היתרון של הגישה שבחרת עבור חוקרים Astyanax הוא כי זה יש נבדק והוכח cavefish והן morphs דגים השטח, ובכך להקל ביטוי השוואתי ניתוחים. ניתן להשתמש בשיטת שהוצגו על ידי חוקרים מחקרים על Astyanax ומערכות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת סינסינטי (פרוטוקול #10-01-21-01).
1. קיבוע
- לבודד את המספר הרצוי של Astyanax mexicanus עוברי מטנק הרבייה ותקן ~ 50 העוברים במועד. אם העוברים גדול וישן, ייתכן צורך לתקן 25 בכל פעם כדי להבטיח קיבוע אפילו.
- בהתאם לגיל של העובר, לנצל את השיטה שאושרו על-ידי IACUC של הרדמה. עבור עוברי בוגרים עם מערכת העצבים מתפקדת, להקריב את העוברים דרך יתר הרדמה. בהתאם לכך, מקום עוברי פתרון של tricaine ~ 1% (נאגר ל pH 7.4) כדי למזער את הכאב ואי נוחות עבור האורגניזם.
- ברגע העוברים אינם מגיבים למגע, להחליף את מערכת מים המכילים tricaine, וכן להוסיף מ ~ 1 ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).
- הסר את הפתרון PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). את העוברים בן לילה ב 4 º C.
התראה: PFA מסוכנים (קרי, זה דליק והוא העור, הריאות מגרה), לטפל.
2. התייבשות
- מייבשים את העוברים, להסיר את הפתרון מקבע ולשטוף עם 1 מ"ל ל- PBS. במקום בקבוקונים המכילים העובר בזווית (בין 30° 45°), על פלטפורמה מטרף במהלך השטיפה. ממשיכים לשטוף את העוברים פעמיים, 5 דקות לכל לשטוף.
- אם העוברים יש עדיין chorion, למקם את כל העוברים 50 100 מ"מ x 25 מ"מ פטרי, בזהירות לבודד אותם מן chorions באמצעות שני זוגות מלקחיים של שען (למשל, מלקחיים #5) תחת מיקרוסקופ.
הערה: במהלך השלבים המתוארים להלן, ואת לשארית של הפרוטוקול, בזהירות להסיר את כל נוזל מהשלב הקודם באמצעות נקי, זכוכית פסטר סיליקון לפני הוספת את הפתרון הבא - מייבשים את העוברים בסדרה של שוטף יותר ויותר מרוכז של מתנול (MeOH) המתוארים להלן. דילולים מבוססים על הנפח הכולל 1 מ"ל עם 500 µL של פתרון נכנס כל בקבוקון זכוכית 4 מ"ל. לבצע כל השלבים התייבשות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת בשייקר.
- הסר בזהירות את הפתרון PBS. להוסיף פתרון MeOH 25% (250 µL של MeOH) + µL 750 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 25%. להוסיף פתרון MeOH 50% (500 µL של MeOH) + µL 500 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 50%. להוסיף פתרון MeOH 75% (750 µL של MeOH) + µL 250 ל- PBS. מנערים בעדינות על פלטפורמה מטרף למשך 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון MeOH 75%. להוסיף פתרון MeOH 100% (1 מ"ל של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.
- בשלב זה, החנות מיובש עוברי, לפי הצורך, ב המבחנות זכוכית ב-20 ° C (לטווח ארוך). לחלופין, להמשיך ישירות יום 1 של הפרוטוקול.
3. יום 1: התייבשות
- להשיג עוברי מיובש של המקפיא-20 ° C (או להמשיך ישירות משלב 2.5).
- למיין את העוברים באמצעות פיפטה של פסטר. אחד ניתן למיין על בסיס morphotype (קרי, מערת ו/או משטח) ולאחר מספר גנים העריכו ניסוי. ישנם העוברים בדרך כלל לא יותר מ 12 לכל מבחנה פעם ממוינים. כדי לשמור על הארגון, אשתמש בקלטת מעבדה צבעוניים כדי לייעד בקבוקונים, פיפטות כל הגן. עוברי תישאר בבקבוקון אותו לאורך כל פרוטוקול כולו.
הערה: המקום קצה פיפטה פסטר 100% EtOH לחטא אותה בין משתמש. - הגדר באמבט מים חזק עד 70 ° C כדי לשמש בשלב מאוחר יותר. . בזהירות, למשוך החוצה את MeOH ב צלוחיות של העוברים מיון ולהחליף עם 500 µL של חדש 100% MeOH. לשטוף בקצרה (~ 1 דקות) על פלטפורמת בשייקר.
- נתרענן עוברי בריכוז גדל והולך של PBS x 1 עם Tween 20 (PBT, ראה להלן) על פלטפורמת בשייקר. דילולים מבוססים על אמצעי אחסון דילול הסופי של 1 מ"ל עם 500 µL נכנס לכל מבחנה.
- להוסיף פתרון PBT 25% (250 µL של PBT, 750 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון PBT 25%. להוסיף פתרון PBT 50% (500 µL של PBT, 500 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון PBT 50%. להוסיף פתרון PBT 75% (750 µL של PBT, 250 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את הפתרון PBT 75%. להוסיף פתרון PBT 100% (1 מ"ל של PBT). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.
4. יום 1: לעיכול, קיבוע
- להכין proteinase של K (PK) פתרון על-ידי הוספת 1 µL של PK (20 מ"ג/מ"ל) 2 מיליליטר PBT.
- בציפייה והשלבים, להשיג aliquots הקפוא של מאגרי הכלאה (Hyb - ו Hyb +; ראה משלימה קובץ 2 ו- 3 קובץ משלים), כדורגלן של אחסון-20 ° C.
- לאפשר PFA להפשיר-RT.
- מקום aliquots של Hyb - ו Hyb + אמבט מים מסתובב של 70 מעלות צלזיוס. מקם כל ריאגנטים, בקבוקונים בתוך קטן "אטם" עם חלק תחתון עם רשת שינוי, בתוך המנגנון אמבט מים צף. פעולה זו מאפשרת תוספת פשוטה והסרה של צינורות, בקבוקונים מהאמבטיה מים של 70 מעלות צלזיוס מסתובב.
- בעדינות להוסיף פתרון PK vial(s) של העוברים להבטיח לכל רקמות יהיו מכוסים לגמרי פתרון. לעכל את העוברים ~ 12 דקות ב- PK הפתרון עובד על פלטפורמה ניעור.
הערה: האורך של מערכת העיכול יכולים להיות מגוונים על-ידי החוקר כדי להבטיח תוצאות מיטביות. - למשוך בעדינות את הפתרון PK, בקצרה להציף את המבחנה עם PBT לדלל כל הנותרים PK.
- לצייר את הפתרון PBT והחלף µL 500 של PBT חדש. לאפשר את הפתרון לשטוף על ניעור פלטפורמה עבור 5 דקות.
- להרחיק PBT ולהחליף µL 500% 4 המופשרים מחברים. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 20 דקות על ניעור פלטפורמה ב- RT.
- להרחיק את % 4 מחברים, ויטביע בקצרה את המבחנה עם PBT לדלל כל כדורגלן הנותרים. להרחיק את PBT, והחלף µL 500 של PBT טריים. לאפשר עוברי לשטוף למשך 5 דקות על פלטפורמה ניעור. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.
5. יום 1: Prehybridization
- במקום 500 µL של Hyb-פתרון ומחוממת מראש לתוך הבקבוקון. בזהירות הכנס את המבחנה 70 מעלות צלזיוס המים אמבט (בתוך אטמים) מבלי לרעוד, במשך 5 דקות.
- לצייר את הפתרון Hyb, להציף את המבחנה עם 500 µL של טרום ומחוממת Hyb + פתרון. מניחים את הצנצנת בחזרה לתוך האמבט מים 70 מעלות צלזיוס ברעידות (40 סל ד). תקופת דגירה של גם 4 שעות, או למשך הלילה.
הערה: דגירה 4 שעות תניב פרוטוקול באתרו מלאה יימשך 4 ימים בסך הכל. כאן, שלב זה מוצג הדגירה לילה, אשר תניב פרוטוקול שנמשך 5 ימים בסך הכל.
6. יום 2: הכלאה
- המקום aliquot של Hyb + מהמקפיא-20 ° C באמבט מים חמים חזק במשך 5 דקות.
- להרחיק את Hyb + מ המבחנה והחלף 500 µL של Hyb מראש ומחוממת +. על הפתרון הזה, בזהירות להוסיף 2 µL של RNA בדיקה לכל מבחנה. מערבולת בעדינות את הצנצנת כדי להבטיח הפצה אפילו של המכשיר.
- דגירה Hyb + (עם בדיקה נוספת) הפתרון באמבט מים חמים 70 ° C בלילה תוך כדי טלטול-40 סל ד.
הערה: אפשר להיעזר מחדש Hyb + (עם המכשיר) פתרון. בשביל זה, סעו Hyb + עם החללית הראשונה לרוץ מקפיא-20 ° C, המקום אותו באמבט מים חמים במשך 5 דק החלף Hyb + מיום 1 פרוטוקול עם Hyb + עם בדיקה ולאפשר המקננת בן לילה באמבט מים חמים.
7. יום 3: פתרון הכנה
- להכין צינורות microcentrifuge Hyb + המסומנת החללית RNA "ג'ין-של-עניין". הכינו את סדרת דילולים ייעשה שימוש במהלך יום 3.
- באמצעות צינורות נפרדת 6, להכין את הבאים סדרת דילולים של Hyb - ו נתרן מלוחים ציטראט (האס, 0 ל- 100%) 1 מ"ל נפח, ובמקום אותם ב- 70 מעלות צלזיוס רועד רשמים: צינור 1 = 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-): צינור 2 = 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 3 = 50% (500 µL של 2 x האס, 500 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 4 = 75% (750 µL של 2 x האס, 250 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 5 = 100% (1 מ"ל של האס x 2); צינור 6 = 100% 0.2 x האס (2 מ"ל של 0.2 x האס).
הערה: לעמוד על המשמר של הריכוז של האס, כפי שהוא משתנה מ- 2 x 0.2 x. - באמצעות 4 להפריד בין צינורות להכין סדרת דילולים PBT, האס באמצעי אחסון 1 מ"ל הבאים, במקום בגיל RT: צינור 1 = 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC); צינור PBT 2 = 50% (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x האס); צינור 3 = 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x האס); צינור 4 = 100% PBT (1 מ"ל של PBT).
- הכן צינור 2 מ ל חומצה maleic מאגר המכיל הפתרון עובד Tween 20 (MABT).
- להכין שני צינורות חרוט 15 מ"ל של חסימת פתרון. כל צינור, להוסיף 0.2 גר' ריאגנט חסימה 10 מ"ל של MABT (ראה 4 קובץ משלים). מקום שני צינורות על מיקסר nutating (או פלטפורמה שאכר) עד התפרקה לחלוטין בתמיסה (עד 3 h).
- באמצעות צינורות נפרדת 6, להכין את הבאים סדרת דילולים של Hyb - ו נתרן מלוחים ציטראט (האס, 0 ל- 100%) 1 מ"ל נפח, ובמקום אותם ב- 70 מעלות צלזיוס רועד רשמים: צינור 1 = 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-): צינור 2 = 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 3 = 50% (500 µL של 2 x האס, 500 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 4 = 75% (750 µL של 2 x האס, 250 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 5 = 100% (1 מ"ל של האס x 2); צינור 6 = 100% 0.2 x האס (2 מ"ל של 0.2 x האס).
8. יום 3: בדיקה להסרת
- לצייר את Hyb + (עם המכשיר) פתרון עם זכוכית פיפטה פסטר והנח אותו לתוך סטרילי, הנקרא צינור microcentrifuge. שומרים על הצינורית הזאת במקפיא-20 ° C לשימוש עתידי (אם תיוג-בדיקה מוצלחת).
- להוסיף בזהירות µL 500 של חמה האס/Hyb-דילולים (מסומן להלן). דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות כל באמבט מים חזק 70 מעלות צלזיוס.
- דגירה ברצף עם 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL של 2 x SSC, 500 µL של Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL של 2 x SSC, 250 µL של Hyb-), 100% 2 x SSC (1 מ"ל של 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 מ של 0.2 x SSC).
- בעקבות הצעד האחרון, דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות. כל incubations הבא יתקיים ב RT על פלטפורמה ניעור: 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 מ"ל של PBT).
- לאחר דגירה 10 דקות, להסיר את 100% PBT, ולהוסיף 500 µL של MABT לתוך כל מבחנה. חזור על שלב זה פעמיים במשך 5 דקות.
9. יום 3: חסימת
- הסר MABT כל מבחנה, הצפה עם פתרון חסימה מעורבבים מראש מאחד הצינורות (להכין בשלב 7.1.4). במקום המבחנה על מיקסר nutating עבור ~ 4 h-RT.
- להוסיף 2 µL של אנטי-DIG-AP Fab קטעים למבחנה השני של 10 מ"ל חסימת פתרון (להכין בשלב 7.1.4) ו בקצרה מערבולת.
- למלא כל בקבוקון כמעט לחלוטין עם חסימת פתרון (~ 5 מ"ל) ומניחים על מיקסר nutating בין לילה במקרר-4 מעלות צלזיוס.
10. יום ד'-MABT שטיפות
- להכין בקבוקון מניות של 10% עז נורמלית בסרום (הגדרות) ב MABT (להוסיף 100 µL של המיתרים µL 900 של MABT).
- להרחיק את הפתרון חסימה ב כל בקבוקון ולהוסיף 500 µL תערובת המיתרים/MABT לתוך כל מבחנה. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 25 דקות ב RT על פלטפורמה ניעור.
- החלף את התערובת המיתרים/MABT µL 500 של 100% MABT. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT-ניעור פלטפורמה. לבצע שטיפה זו 11 פעמים נוספות במהלך היום כל 30 דקות.
- ממלאים את הצנצנת עם 100% MABT, ובמקום על מיקסר nutating לילה ב תא במקרר או ללא הזמנה ב 4 º C.
11. יום 5: בדיקה ויזואליזציה
- להכין את aliquot 50 מ של מאגר phosphatase אלקליין (AP) (ראה 5 קובץ משלים). לשלב הבא 50 מ ל צינור חרוטי עטוף בנייר אלומיניום להגביל את החשיפה אור: 5 מ של 1 מ' טריס (pH 9.5), 5 מ של 50 מ מ MgCl2, 5 מ של 1% Tween 20, 5 מ של 1 M NaCl, 30 מ של ddH2O.
- להסיר MABT והחלף 1 מ"ל של מאגר AP (הצינור עטופה בנייר כסף). . תן לזה להציף במשך 5 דקות. עושים זאת פעמיים כדי להבטיח הסרה מלאה של MABT.
- להסיר את מאגר AP והחלף 1 מ"ל של AP מאגר עם 3.5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ו 4.5 μL של ניטרו-כחול tetrazolium (NBT). החלף הטרי AP מאגר/NBT/BCIP לאחר סיום כל שעה עד התגובה. לפקח מקרוב, בדיקת כל 15 דקות, כדי לאפשר את התגובה הגיוון להתקיים עד הרמה הרצויה של צביעת הושגה. אם התמיסה מתחילה להיווצר, להחליף את הפתרון מוקדם יותר.
- לעצור את התגובה הגיוון על ידי שטיפה העוברים במאגר AP 100% טריים (ללא NBT/BCIP) 5 דק המשך שטיפות ב- PBT עד רמות אופטימלית של האות (עם כמות מינימלית של צביעת הרקע) מושגות. ממשיכים לשטוף דגימות עם הגדלת דילולים של PBT במאגר AP כדלקמן: 25% PBT (250 μL של PBT, μL 750 מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 50% PBT (500 μL של PBT, 500 μL מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 75% PBT (750 μL של PBT, μL 250 מאגר AP), לשטוף במשך 5 דקות.
- לשטוף עוברי ב ~ 5 מ ל 100% PBT-nutating מיקסר עד רצוי רקע מינימלי מכתים מתמלאת. מעבר החוצה עם PBT טרי מספר פעמים. זה יכול לקחת מספר ימים.
- כאשר שטיפה מלאה, תשטוף עוברי ב μL 500 ל- PBS סטרילי על פלטפורמה מטרף. לבצע שטיפה זו פעמיים במשך 5 דקות. לאחר PBS שוטפים, פוסט-לתקן את דגימות μL 500 של 4% מחברים עבור h 1 RT על פלטפורמה מטרף. לחלופין, את בן לילה ב 1 מ"ל של 4% PFA במקרר-4 מעלות צלזיוס.
- החלף מקבע את רענן, PBS סטרילי. לבצע שטיפה זו לפחות פעמיים במשך 5 דק המקום העוברים ב ~ 4 מ ל 100% PBS סטרילי, ולאחסן לטווח ארוך ב 4 º C.
12. הדמיה
- לפצות צלחת הדמיה בצלחת פטרי באמצעות 3% agarose וטה מאגר.
הערה: כמויות תלוי כמה לוחות הדרושים. צלחות חוזר מספר פעמים. מומלץ כי תבנית מלבנית רדוד ימוקם הפטרי בזמן הג'ל הוא קירור על מנת ליצור גומה להכללת העוברים על הצלחת. - מקם את העוברים על הצלחת ב-, טוב, מגניב.
הערה: מומלץ לשפוך בעדינות העוברים על צלחת במקום pipetting אותם כי זה נמצא כי הם ידבק הפנימי של פיפטות פלסטיק. - השתמש מיקרוסקופ אור על מנת להמחיש כל העובר. השתמש בדיקה בוטה לתמרן עוברי למיקום הרצוי.
- לקחת תמונה כאשר העובר נמצא במיקום הרצוי. שימו לב כי חשוב לקחת תמונות של העוברים בתוך כמה שבועות של צביעת שהושלמו כדי למנוע השפלה פוטנציאלי של כתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדו ח זה, אנו מספקים גישה פשוטה וישירה לביצוע תיוג של דגימות Astyanax עובריים לניתוח ביטוי גנים איכותיים. טכניקה זו יכולה להתבצע או ארבעה או חמישה ימים, כל שלב העיקריות בהליך מיוצג בתרשים זרימה מקודדות לפי צבעים (איור 1). עם סיום, מוכתם עוברי צריך הנמל תווית כרומטית סגול כהה ברקמות לבטא את גן מסוים של עניין. בהצלחה יישמנו פרוטוקול זה Pachón cavefish (איור 2A–B, E) והן עוברי דגים פני השטח (איור 2C–D, F).
העוברים cavefish היו מוכתמים עבור שני גורמי שעתוק את תווית מוקדם הרכס העצבי רקמות, Sox9 ו-5, Tfap2a6. עוברי שכותרתו לביטוי Sox9 להפגין תיוג ברור המתפתח קשתות branchial, מקסימום (ראשי חץ צהוב, איור 2A). שים לב מכתים הוא נעדר כמעט שק החלמון או את somites המתפתח לאגף (איור 2 א). באופן דומה, Tfap2a ביטוי ניכרת בחלקים של ראש המתפתח, כמו גם בתחילת ההעברה הרכס העצבי תאים (איור 2B, ראש חץ) לאורך האזור הגבי האגף של העובר. הגן הנציגה השלישית הציג cavefish עוברי הוא Phf20a, סמן של בידול אוסטאובלסט7. הערה ההכתמה חיובי בחלקים של והמזודרם somitic, ראש אחורי זה נועדו להצמיח הגרמית (איור 2E, ראשי חץ).
בעוברי דגים השטח, אנחנו שנבדק על הגנים CXCR, Adcyap1aו- Sox10. CXCR מקודד G-חלבון ממברנה מכורך קולטן המאגד נוגדנים CXC8. תיוג חיובי קיים באזורים מבודדים של הראש האגף (איור 2F, ראשי חץ), כמו גם כמה תאים בודדים המכסים את שק החלמון. הגן מפוליפפטיד אדנילאט cyclase. מפעיל, Adcyap1a, מבוטא באזורים של מערכת העצבים המרכזית, כולל תאים יותרת המוח. הערה ביטוי ספציפי מאוד אשכולות לזווג, דו צדדיים של תאים על ההיבט הגבי של העובר; כמו גם אזור גדול יותר של ביטוי קו האמצע (איור 2C, ראשי חץ). לבסוף, אנו מציגים הביטוי של Sox10, גורם שעתוק אילו תוויות מוקדם הרכס העצבי ו אוליגודנדרוציטים תאים10. צביעת חיובי ספציפי מאוד ניכרת כמו סמן מוקדם של הרכס העצבי בצד שמאל ובצד הימני של העובר הגבי (איור דו-ממדי, ראשי חץ).
נציג אחד של שני סוגי בעיות מבלבלים שחוקרים אחרים עלול להיתקל. הגיליון הראשון אחד מעת לעת מפגשים הוא כתמים punctate של תיוג לא ספציפית. כתמים אלה שעלולים להתעורר כמו התמיסה של שטיפות MABT הסופית, או המאגר AP במהלך התגובות הגיוון. דוגמה של תיוג לא ספציפית זו ניכרת על שק החלמון של העובר דגים משטח מוכתם כל ביטוי של Pnp4a. גן זה מקודד אנזים (פורין nucleoside phosphorylase) המקל על ייצור של פיגמנטציה ססגוני11. גן זה מתבטא קודם העין לפתח, את השלפוחית. כתמים punctate הנהוגות הדגימות פני השטח (איור 3 א), חוסלו על ידי שוטף תכופות החלפת מאגר AP + NBT/BCIP בשלבים האחרונים של הפרוטוקול (איור 3B). בעיה שנייה אחת מעת לעת מפגשים היא הביטוי ' מאטום לשקוף ', בעיקר לא ספציפית של גנים אשר היה אחרת לייצר תבנית ביטוי מובהק. דוגמה אחת היא הגן BMP4, אשר מופיע כתבנית ברובו מפוזר עם רמות נמוכות של chromogen ברחבי הדגימה (איור 3C). במקרים מעין אלה, אנו בדרך כלל לזהות אזור אחרים של הגן, להגביר לתוך וקטור ולבצע בדיקה סינתזה חדשה (ראה 6 קובץ משלים). הדוגמה של שליטה (ללא בדיקה) הדגימה (איור 3D) מסופק להמחשת מהות ' מאטום לשקוף ', שאינם ספציפיים שלנו בדיקה BMP4 נכשלה.
איור 1: תרשים זרימה פשוטים עבור היברידיזציה כולה-הר- זה תרשים זרימה מנצל קידוד הצבעים כדי להמחיש את השלבים העיקריים של היברידיזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג צביעת עבור שישה גנים, באמצעות המערה והן morphs פני שטח של Astyanax. (א) תמונת מראה מסוים ההכתמה (חיצים צהובים) של Sox9 על הצד הימנית של הפריה לאחר 72 h (hpf) Pachón cavefish (45 x). (B) עבור Tfap2a ניכרת על הצד הימנית של 36 של צביעת ספציפי hpf Pachón cavefish (45 x). (ג) Bilateral ו קו האמצע מכתים (חץ צהוב) של Adcyap1a מסומנות באזור הגבי של 72 hpf משטח דג (100 x). (ד) Staining של Sox10 ברקמות הרכס העצבי של 24 hpf משטח דג (100 x). (E) Phf20a מדגים דפוס קלוש, אך ברור, הביטוי באזור הגבי של בגודל 24 hpf Pachón cavefish (100 x). קולטן (F) ציטוקינים, CXCR, מתבטא אזורים הנבדלים זה מזה של הצד הימנית של 24 hpf משטח דג (100 x). גודל ברים ב- A, B, E, F = 0.5 מ מ; גודל ברים c, D = 2.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דוגמאות מייצגות של תוצאות תת אופטימלית היברידיזציה כולה-הר- צביעת ספציפי (A) מתבטא לצד התמיסה שאינם ספציפיים ו/או פסולת (חץ אדום) על ההיבט הימנית של שבעים hpf Pachón cavefish (100 x). (B) המכשיר אותו דמיינו א', המתארים את ההכתמה זהה תבניות ללא התמיסה או רקע שבעים hpf Pachón cavefish (100 x). (ג) לאגף הימנית של שבעים hpf Pachón cavefish מדגים ' מאטום לשקוף ', שאינם ספציפיים צביעת עבור BMP4 בהגדלה 45 x. (ד) A 72 hpf Pachón cavefish נתון פרוטוקול זה, ללא התוספת של בדיקה (45 x). גודל ברים = 0.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל הפגיעות של RNA כדי השפלה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול נוגע הסינתזה סטרילי של החללית ה-RNA. עם זאת, אם בדיקה מופק היטב, מספק תוצאות טובות, זה יכול לעשות שימוש חוזר בתגובות מכתימים עוקבות. צעד מכריע השני הוא ייצור זהיר של כל ריאגנטים בשימוש בכל רחבי בפרוטוקול. מאז פרוטוקול זה כרוך מספר ימים של צעדים קטנים רבים, זה הכרחי כי כל ריאגנטים במדויק המיוצרים הינם מאוחסנים באופן סטרילי. יתר על כן, חשוב באופן מהותי כי החוקר ממשיך בזהירות אחר כל שלב בפרוטוקול. מצאנו כי הרשימה שסופקה מדרגות יכול להיות שימושי ביותר להבטיח השלמה ומדויקים מדויק של כל היבט של פרוטוקול זה.
אנחנו לעיתים קרובות אל תשנה את פרוטוקול שהצגנו כאן. עם זאת, חוקרים עשויים לבצע בדיקה incubations בטמפרטורות שונות מאשר אלה המוצעים (קרי, 70 ° C). שינויים קלים בטמפרטורות הכלאה תשפיע על הכריכה של הגששים RNA, לפיכך, המבקשים הטמפרטורה האופטימלית הכלאה יכול להשפיע לטובה על איכות מכתים. לגבי פתרון בעיות, אנו מעודדים חוקרים אחרים לנצל את הפעולות לביצוע מסופק עם מאמר זה (1 קובץ משלים). שמירה על זהירות רשומות הוא צעד ראשון הצורך להבטיח איכות גבוהה מכתים. שינוי מינורי השני הוא הציע כדי. לבצע את התגובה הגיוון הסופי ללא נדנדה (למשל, ללא הצבת פלטפורמה בשייקר או nutator). הסיבה לכך היא כי מעת לעת נציין את הייצור של התמיסה, זה נובע ככל הנראה בופר AP. בדרך כלל, זו התמיסה overstains לצבע כהה ויוצר רקע (שאינם ספציפיים) punctate על הרקמה מוכתם. כדי למזער את הייצור של התמיסה הזו, אנו מכינים סטיריליים מאגר AP רק לפני כל תגובה. עוד, ברגע NBT, BCIP נוספו למאגר, אנחנו מחליפים אותו מאגר טרי ו- NBT/BCIP כל שעה עד התגובה הגיוון הושלמה.
מגבלה השיטה הציג הוא כתם כרומטית היה משמשים להמחשת ביטוי גנים. אנו מעדיפים גישה זו מאז זה חסכוני, ודורש רק מיקרוסקופ אור לדמיין. אם אחד היה מעוניין הערכת הבדלים כמותיים, אנו מציעים שהם משתמשים לתגובה הגיוון פלורסנט. זה יאפשר כימות למחצה, לדוגמה, באמצעות השוואה יחסית ניאון היחידות של הביטוי בין ניסויים.
פרוטוקולים עבור היברידיזציה זמינים באופן נרחב על האינטרנט12,13, וכן פרסומים מדעיים. פרוטוקול זה אנו מציגים פותחה במיוחד עבור מערכת מודל שלנו, Astyanax mexicanus. השתמשנו פרוטוקול זה מכתים את הביטוי של כמה עשרות גנים, ולהרגיש באופן עקבי מספק תוצאות איכותיות. יתרון משמעותי של פרוטוקול זה הוא הפעולות לביצוע שלב אחר שלב של פריטים כדי לאפשר את החוקר לבצע משימות מרובות תוך הבטחת ההשלמה מדויק של כל השלבים של פרוטוקול זה. אנו מקווים כי-פרוטוקול זה לשמש משאב שימושי כדי חוקרים אחרים בתחום ומעבר, צופה כי טכניקה נפוצה זו מעבדה יתמוך גילויים עתידיים קישור גנוטיפ פנוטיפ ב cavefish מקסיקני עיוור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות חברי המעבדה ברוטו עבור הערות מועילות על כתב היד הזה. ברצוננו להודות ארבעה תלמידי תיכון אשר מנוצל פרוטוקול זה במהלך התמחות קיץ בחודשים 2017 2018, לרבות כריסטין סאו, מייקל וורדן, אקי Li נוואנקוו דוד. HL נתמכה על ידי מלגת UC ביולוגיה גזע במהלך קיץ 2017. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (דב-1457630 כדי JBG), נבחרת מוסדות של שיניים ואת ואסטתיים מחקר (NIH; DE025033 אל JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
