Summary
ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.
Abstract
في السنوات الأخيرة، صدرت مشروع جينوم ل cavefish المكسيكية المكفوفين (مكسيكي أستياناكس)، الكشف عن هويات تسلسل لآلاف جينات. رسملة البحوث السابقة في هذا النظام النموذجي الناشئة على إجراء تحقيقات شاملة على نطاق الجينوم التي حددت عديدة السمات الكمية المكاني (QTL) المرتبطة بشتى تعمل المرتبطة بالكهف. بيد أن القدرة على الاتصال الجينات التي تهم بالأساس الموروثة لتغيير المظهرية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. هو أسلوب واحد يمكن أن تيسر فهم أعمق لدور التنمية في تطور تروجلومورفيك الجامعة-جبل التهجين في الموقع. يمكن تنفيذ هذا الأسلوب مباشرة مقارنة التعبير الجيني بين أشكال الكهف وسطح المسكن، وترشيح الجينات الكامنة أنشئت QTL، تحديد الجينات للفائدة من الدراسات تسلسل الجيل القادم، أو تطوير أخرى النهج القائم على الاكتشاف. وفي هذا التقرير، نقدم بروتوكول بسيط، تدعمها قائمة مرجعية مرنة، يمكن تكييفها على نطاق واسع للاستخدام خارج نظام الدراسة المقدمة. ونأمل أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كمورد واسعة للمجتمع أستياناكس وما بعدها.
Introduction
التهجين في الموقع أسلوب شائع لتلطيخ الأنسجة الثابتة لتصور أنماط التعبير الجيني1. وقد أجريت هذه التقنية للسنوات الأخرى التقليدية2 و غير التقليدية3 نظم نموذجية، لمجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، العديد من الخطوات والكاشفات ضرورية لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. للمحققين الذين أدوا ابدأ هذا الأسلوب، يمكن الشروع في العملية تخويف نظراً للخطوات العديدة التي ينطوي عليها. علاوة على ذلك، طبيعة هذه الإجراءات المطولة يفسح المجال للأخطاء التقنية، التي يمكن أن يكون تحديا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
والهدف العام لهذه المادة هو تقديم أسلوب بسيط ومباشر سوف تجعل هذه التقنية التهجين متاحة لجمهور واسع. للحد من إدخال أخطاء، نقدم نهجاً واضحة غلة تلطيخ التعبير الجيني عالية الجودة ويقلل من الإشارات الخلفية غير محددة. هذا الإجراء مماثل للنهج الأخرى المتقدمة في نظم النموذج التقليدي، مثل دانيو rerio4. هنا، نحن نهدف إلى تسهيل التنفيذ الدقيق لكل خطوة باستخدام قائمة مرجعية لتحميل (تكميلية ملف 1)، النهوض بالتنفيذ الدقيق للبروتوكول. والأساس المنطقي لذلك تيسير المنظمة من خلال العديد من الخطوات المتعلقة بهذا الإجراء. هذا المقال مناسب للباحثين المهتمين في أداء الجامعة-جبل التهجين في الموقع في تطوير الأجنة، ولكن لا إجراء بعد الإجراء. وميزة النهج الذي تم اختياره للباحثين أستياناكس هو أنه قد تم اختبارها وأثبتت في كل من كافيفيش ونقرأ الأسماك السطحية، مما يسهل إجراء تحليلات مقارنة التعبير. طريقة عرض يمكن أن يستخدمها الباحثون في الدراسات أستياناكس وغيرها من النظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سينسيناتي (البروتوكول رقم 10-01-21-01).
1-التثبيت
- عزل العدد المطلوب من الأجنة أستياناكس مكسيكي من خزان لتربية وإصلاح الأجنة ~ 50 في وقت واحد. إذا الأجنة الكبيرة والقديمة، قد يكون من الضروري على إصلاح 25 في وقت واحد لضمان التثبيت حتى.
- تبعاً لعمر الجنين، استخدام أسلوب الموافقة على IACUC للتخدير. لكبار السن من الأجنة مع أداء الجهاز العصبي، التضحية بالأجنة عن طريق جرعة زائدة من مخدر. تبعاً لذلك، وضع الأجنة في حل تريكيني ~ 1% (مخزنة على درجة الحموضة 7.4) للتقليل من الألم والانزعاج للكائن الحي.
- عندما لا يستجيب للمس الأجنة، يحل محل نظام المياه التي تحتوي على تريكيني، وإضافة ~ 1 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4).
- إزالة الحل برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين). إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
تنبيه: منهاج العمل الخطرة (أي، هو قابل للاشتعال وهو الجلد والرئة مهيجة)، والتعامل مع الرعاية.
2-الجفاف
- ليذوي الأجنة وإزالة الحل مثبت وشطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. ضع قارورة تحتوي على الجنين بزاوية (بين 30° و 45°)، على شاكر منصة أثناء الشطف. ما زالت تغسل الأجنة مرتين، 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي.
- إذا كان لا يزال لدى الأجنة المشيمة، ضع جميع الأجنة 50 في 100 مم × 25 مم طبق بيتري، وعزلها بعناية من تشوريونس استخدام مجموعتين من الملقط الساعاتي (على سبيل المثال، #5 الملقط) تحت مجهر.
ملاحظة: أثناء الخطوات الموضحة أدناه، وما تبقى من البروتوكول، بعناية إزالة جميع السائل من الخطوة السابقة باستخدام نظيف، الماصات الزجاجية باستور قبل إضافة الحل التالي - يذوي الأجنة في سلسلة من يغسل متزايدة التركيز من الميثانول (ميوه) هو موضح أدناه. تخفيف تستند إلى وحدة تخزين إجمالي 1 مل مع 500 ميليلتر من الخوض في كل قنينة زجاجية 4 مل الحل. تنفيذ كافة الخطوات الجفاف في درجة حرارة الغرفة (RT) على منصة شاكر.
- بعناية إزالة الحل برنامج تلفزيوني. إضافة حل ميوه 25% (250 ميليلتر من ميوه) + 750 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل ميوه 25%. إضافة حل ميوه 50% (500 ميليلتر من ميوه) + 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل ميوه 50%. إضافة حل ميوه 75% (750 ميليلتر من ميوه) + 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل ميوه 75%. إضافة حل ميوه 100% (1 مل ميوه). هز بلطف على شاكر منصة لأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 3 مرات.
- عند هذه النقطة، تخزين الأجنة المجففة، حسب الحاجة، قارورة زجاجية في-20 درجة مئوية (طويلة الأجل). وبدلاً من ذلك، المضي مباشرة إلى يوم 1 من البروتوكول.
3-يوم 1: الإماهة
- الحصول على الأجنة المجففة من الثلاجة-20 درجة مئوية (أو الشروع في مباشرة من الخطوة 2، 5).
- فرز الأجنة باستخدام ماصة باستور. واحد يمكن فرز على أساس مورفوتيبي (أي كهف و/أو السطح)، وتقدير عدد الجينات في كل تجربة. وهناك أجنة عادة ما لا يزيد عن 12 كل قنينة فرز مرة واحدة. للحفاظ على المنظمة، استخدام الأشرطة الملونة مختبر لتعيين القنينات والماصات لكل الجينات. سوف تبقى الأجنة في القنينة نفسها في جميع أنحاء البروتوكول بأكملها.
ملاحظة: يستخدم EtOH لتعقيم بين مكان غيض ماصة باستور في 100%. - تعيين حمام مائي هز إلى 70 درجة مئوية لاستخدامه في خطوة لاحقة. استخلاص ميوه في قنينة أجنة تم فرزها بعناية، واستبدال مع 500 ميليلتر من جديد 100% ميوه. المياه والصرف الصحي بإيجاز (~ 1 دقيقة) على منصة شاكر.
- ترطيب الأجنة في زيادة تركيز برنامج تلفزيوني x 1 مع 20 توين (PBT، انظر أدناه) على منصة شاكر. تستند تخفيف وحدة تخزين نهائي تمييع 1 مل مع 500 ميليلتر الخوض في كل قنينة.
- إضافة حل PBT 25% (250 ميليلتر من PBT، ميليلتر 750 من ميوه). هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل PBT 25%. إضافة حل PBT 50% (500 ميليلتر من PBT، 500 ميليلتر من ميوه). هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل PBT 50%. إضافة حل PBT 75% (750 ميليلتر من PBT، 250 ميليلتر من ميوه). هز بلطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- بعناية إزالة الحل PBT 75%. إضافة حل PBT 100% (1 مل PBT). هز بلطف على شاكر منصة لأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 3 مرات.
4-يوم 1: الهضم والتثبيت
- إعداد بروتيناز ك (PK) الحل بإضافة 1 ميليلتر من PK (20 ملغ/مل) إلى 2 مل PBT.
- توقعا للخطوات اللاحقة، الحصول على مختبرين المجمدة من المخازن المؤقتة التهجين (هيب--و + هيب؛ انظر تكميلية الملف 2 و 3 ملف إضافي) ومنهاج عمل بيجين من تخزين-20 درجة مئوية.
- السماح لمنهاج عمل بيجين لذوبان الجليد في الرايت
- ضع مختبرين هيب-وهيب + في حمام مائي الدورية 70 درجة مئوية. ضع جميع الكواشف والقوارير داخل صغيرة "طوقا" مع قاع فتحات الشباك، داخل جهاز حمام المياه العائمة. وهذا يتيح مجرد إضافة وإزالة أنابيب وقنينات من حمام الماء 70 درجة مئوية الدورية.
- بلطف إضافة PK حل vial(s) لضمان جميع أنسجة الأجنة مغطاة تماما مع الحل. هضم الأجنة لأغراض ~ 12 دقيقة في حل عملي PK على شاكر منصة.
ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة الهضم من المحقق لضمان تحقيق أفضل النتائج. - رسم بلطف خارج الحل كيه، والفيضانات بإيجاز القنينة مع PBT تمييع أي pk المتبقية.
- رسم قبالة الحل PBT واستبدال مع 500 ميليلتر من PBT الجديدة. تسمح حل شطف على شاكر منصة لمدة 5 دقائق.
- رسم قبالة PBT واستبدال مع 500 ميليلتر المذابة 4% منهاج عمل بيجين. السماح للأجنة لاحتضان لمدة 20 دقيقة على شاكر منصة في الرايت
- رسم قبالة 4% منهاج عمل بيجين، والفيضانات بإيجاز القنينة مع PBT تمييع أي منهاج العمل المتبقي. رسم الخروج PBT، واستبدال مع 500 ميليلتر من PBT الطازجة. السماح للأجنة شطف لمدة 5 دقائق على شاكر منصة. كرر هذه الخطوة 4 مرات أكثر.
5-يوم 1: بريهيبريديزيشن
- مكان 500 ميليلتر من حل هيب المعالجون مسبقاً إلى القنينة. بعناية بوضع القنينة في 70 درجة مئوية المياه حمام (داخل أطواق منع التسرب) دون اهتزاز، لمدة 5 دقائق.
- رسم قبالة هيب-الحل والفيضانات القنينة مع 500 ميليلتر من قبل حرارة هيب + الحل. مكان القنينة مرة أخرى إلى حوض ماء 70 درجة مئوية مع الهز (40 لفة في الدقيقة). احتضانها لأي ح 4، أو بين ليلة وضحاها.
ملاحظة: سوف تسفر عن حضانة ح 4 بروتوكول كاملة في الموقع التي سوف تستمر لمدة 4 أيام في المجموع. وهنا، يقدم هذه الخطوة كحضانة بين عشية وضحاها، التي ستسفر عن بروتوكول تدوم 5 أيام في المجموع.
6-يوم 2: التهجين
- ضع قاسمة هيب + من الثلاجة-20 درجة مئوية إلى اهتزاز حمام الماء الساخن لمدة 5 دقائق.
- رسم قبالة هيب + من القنينة واستبدال مع 500 ميليلتر من قبل حرارة هيب +. لهذا الحل، بعناية إضافة 2 ميليلتر من مسبار الحمض النووي الريبي لكل قنينة. بلطف دوامة القنينة لضمان التوزيع العادل للتحقيق.
- احتضان الحل هيب + (مع التحقيق وأضاف) في حمام الماء الساخن 70 درجة مئوية بين ليلة وضحاها بينما تهز 40 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: أحد إعادة استخدام هيب + (مع التحقيق) الحل. ولهذا الغرض، تتخذ هيب + مع التحقيق من الأول تشغيل من الثلاجة-20 درجة مئوية ومكان في حمام ماء الساخن للحد الأدنى 5 + هيب استبدال من يوم 1 البروتوكول مع هيب + مع التحقيق والسماح لحضانة بين عشية وضحاها في حمام الماء الساخن.
7-يوم 3: إعداد الحل
- إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي المسمى هيب + مع مسبار الحمض النووي الريبي "الجينات في المصالح". إعداد سلسلة تخفيف الذي سيتم استخدامه خلال اليوم الثالث.
- استخدام أنابيب منفصلة 6، إعداد السلسلة التالية من تخفيف هيب-وسترات الصوديوم المالحة (SSC, 0 إلى 100%) في حجم 1 مل، ومكان لهم في 70 درجة مئوية تهز المياه حمام: أنبوب 1 = 100%-هيب (1 مل من هيب-): أنبوب 2 = 25% 2 x SSC (250 ميليلتر من 2 x SSC، ميليلتر 750 من هيب-)؛ أنبوب SSC 2 x 3 = 50% (500 ميليلتر لل SSC x 2، 500 ميليلتر هيب--)؛ أنبوب 4 = 75% 2 x التعاون بين بلدان الجنوب (ميليلتر 750 ال SSC x 2، 250 ميليلتر هيب--)؛ أنبوب 5 = 100% 2 x التعاون بين بلدان الجنوب (1 مل ال 2 x SSC)؛ أنبوب SSC 0.2 x 6 = 100% (2 مل من 0.2 x SSC).
ملاحظة: تكون متيقظة لتركيز التعاون بين بلدان الجنوب، كما أنها تتغير من 2 x إلى 0.2 x. - استخدام 4 فصل الأنابيب وإعداد السلسلة التالية من تخفيف PBT والتعاون بين بلدان الجنوب في وحدة تخزين 1 مل ومكان في RT: أنبوب 1 = 25% PBT (250 ميليلتر من PBT، ميليلتر 750 من 0.2 x SSC)؛ أنبوب PBT 2 = 50% (500 ميليلتر من PBT، 500 ميليلتر ال SSC 0.2 x)؛ أنبوب PBT 3 = 75% (750 ميليلتر من PBT، 250 ميليلتر ال SSC 0.2 x)؛ أنبوب PBT 4 = 100% (1 مل PBT).
- إعداد أنبوب مع 2 مل من حمض الماليك المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 توين (مابت) العامل الحل.
- إعداد اثنان أنابيب مخروطية الشكل 15 مل من عرقلة الحل. في كل أنبوبة، بإضافة 0.2 جم كاشف حظر إلى 10 مل مابت (انظر 4 ملف إضافي). مكان كل الأنابيب في خلاط نوتاتينج (أو شاكر منصة) حتى يذوب تماما في الحل (ما يصل إلى 3 ح).
- استخدام أنابيب منفصلة 6، إعداد السلسلة التالية من تخفيف هيب-وسترات الصوديوم المالحة (SSC, 0 إلى 100%) في حجم 1 مل، ومكان لهم في 70 درجة مئوية تهز المياه حمام: أنبوب 1 = 100%-هيب (1 مل من هيب-): أنبوب 2 = 25% 2 x SSC (250 ميليلتر من 2 x SSC، ميليلتر 750 من هيب-)؛ أنبوب SSC 2 x 3 = 50% (500 ميليلتر لل SSC x 2، 500 ميليلتر هيب--)؛ أنبوب 4 = 75% 2 x التعاون بين بلدان الجنوب (ميليلتر 750 ال SSC x 2، 250 ميليلتر هيب--)؛ أنبوب 5 = 100% 2 x التعاون بين بلدان الجنوب (1 مل ال 2 x SSC)؛ أنبوب SSC 0.2 x 6 = 100% (2 مل من 0.2 x SSC).
8-اليوم الثالث: Probe إزالة
- رسم قبالة هيب + (مع التحقيق) الحل مع كوب ماصة باستور ووضعه في العقيمة، المسمى أنبوب ميكروسينتريفوجي. تحتفظ هذه الأنبوبة في الثلاجة-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (إذا كان وصف التحقيق الناجح).
- بعناية قم بإضافة 500 ميليلتر للحارة SSC/هيب-تخفيف (المبينة أدناه). تبني في كل من الحلول التالية بشأن 10 دقيقة في حمام المياه تهز 70 درجة مئوية.
- احتضان تسلسلياً مع 100% هيب-(1 مل من هيب-)، 25% 2 x SSC (250 ميليلتر من 2 x SSC، ميليلتر 750 من هيب-)، 50% 2 x SSC (500 ميليلتر من 2 x SSC، 500 ميليلتر هيب-)، 75% 2 x SSC (ميليلتر 750 2 x SSC، 250 ميليلتر هيب-)، 100% 2 x SSC (1 مل 2 x SSC) ، 100% 0.2 x SSC (2 مل 0.2 x SSC).
- وفي أعقاب الخطوة الأخيرة، احتضان في كل من الحلول التالية لمدة 10 دقائق. كل من إينكوبيشنز التالية تجري في RT على شاكر منصة: 25% PBT (250 ميليلتر من PBT، ميليلتر 750 من 0.2 x SSC)، 50% PBT (500 ميليلتر من PBT، 500 ميليلتر من 0.2 x SSC)، 75% PBT (750 ميليلتر من PBT، 250 ميليلتر من 0.2 x SSC) ، 100% PBT (1 مل PBT).
- بعد حضانة 10 دقيقة، إزالة 100% PBT، وإضافة 500 ميليلتر من مابت في كل قنينة. كرر هذه الخطوة مرتين لمدة 5 دقائق.
9-يوم 3: حظر
- إزالة مابت من كل قنينة والفيضانات مع حل حظر خلط من واحدة من هذه الأنابيب (أعد الخطوة 7.1.4). ضع القنينة في خلاط نوتاتينج ح ~ 4 في الرايت
- إضافة 2 ميليلتر من القوات المسلحة البوروندية مكافحة دعيج-AP شظايا إلى القنينة الثانية من 10 مل عرقلة الحل (أعد الخطوة 7.1.4) ودوامه بإيجاز.
- ملء كل قنينة تماما تقريبا مع عرقلة الحل (~ 5 مل) ووضع في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في ثلاجة عند 4 درجة مئوية.
10-يوم 4: يشطف مابت
- إعداد قنينة أسهم من 10% مصل الماعز العادي (خ ع) في مابت (إضافة 100 ميليلتر من فئة الخدمات العامة الوطنية إلى 900 ميليلتر من مابت).
- رسم قبالة الحل حظر في كل قنينة وإضافة 500 ميليلتر من خليط خ ع/مابت في كل قنينة. السماح للأجنة لاحتضان لمدة 25 دقيقة في RT على شاكر منصة.
- استبدال خليط خ ع/مابت مع 500 ميليلتر من 100% مابت. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر منصة. أداء هذا شطف 11 أكثر من مرة طوال اليوم كل 30 دقيقة.
- ملء القنينة مع 100% مابت، ومكان في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في غرفة ثلاجة أو مقصورة على 4 درجة مئوية.
11-اليوم الخامس: التحقيق في التصور
- إعداد قاسمة 50 مل من المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP) (انظر تكميلية ملف 5). الجمع بين ما يلي في أنبوب مخروطي 50 مل مغلفة برقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء: 5 مل من 1 م تريس (pH 9.5)، 5 مل من 50 مم مجكل2, 5 مل من 1% 20 توين، 5 مل من كلوريد الصوديوم م 1، 30 مل ddH2O.
- إزالة مابت واستبدال مع 1 مل من المخزن المؤقت AP (أنبوب ملفوفة في إحباط). يغسل لمدة 5 دقائق. القيام بذلك مرتين لضمان الإزالة الكاملة مابت.
- إزالة المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس واستبدالها مع 1 مل من المخزن المؤقت AP مع 3.5 ميكروليتر 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (بسب) و 4-5 ميكروليتر تيترازوليوم نيترو--الأزرق (NBT). استبدال مع وكالة اسوشييتد برس الطازجة المخزن المؤقت/NBT/بسب بمجرد اكتمال كل ساعة حتى رد الفعل. ترصد عن كثب، التحقق من كل 15 دقيقة، للسماح لرد فعل التلون أن تجري حتى تحقق المستوى المطلوب من تلطيخ. إذا كان متسرعا يبدأ النموذج، استبدال الحل عاجلاً.
- وقف رد فعل التلون قبل الشطف الأجنة في المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس 100% الطازجة (بدون NBT/بسب) يشطف متابعة دقيقة 5 في PBT حتى يتم تحقيق مستويات مثلى من إشارة (مع الحد الأدنى من المبالغ لتلوين الخلفية). تواصل شطف العينات مع زيادة تخفيف PBT في المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس على النحو التالي: 25% PBT (250 ميكروليتر من PBT، ميكروليتر 750 من المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس)، شطف لمدة 5 دقائق؛ 50% PBT (500 ميكروليتر من PBT، 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس)، شطف لمدة 5 دقائق؛ 75% PBT (750 ميكروليتر من PBT، 250 ميكروليتر من المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس)، شطف لمدة 5 دقائق.
- شطف الأجنة في ~ 5 مل 100% هو PBT في خلاط نوتاتينج حتى الرغبة في تلوين خلفية الحد الأدنى الذي تم التوصل إليه. التبديل مع PBT جديدة عدة مرات. وهذا يمكن أن يستغرق عدة أيام.
- عند الشطف أجنة كاملة، يغسل في 500 ميكروليتر من PBS العقيمة على شاكر منصة. أداء هذا الشطف مرتين لمدة 5 دقائق. بعد أن يغسل برنامج تلفزيوني، بعد إصلاح العينات في ميكروليتر 500 4% منهاج عمل بيجين ح 1 في RT على شاكر منصة. وبدلاً من ذلك، الإصلاح بين عشية وضحاها في 1 مل 4% منهاج عمل بيجين في الثلاجة على 4 درجة مئوية.
- استبدال مثبت مع الطازجة، PBS العقيمة. أداء هذا الشطف مرتين على الأقل للحد الأدنى 5 مكان الأجنة في ~ 4 مل من 100% PBS العقيمة، وتخزين طويل الأجل في 4 درجات مئوية.
12-التصوير
- تشكل صفيحة تصوير في طبق بتري استخدام 3% [اغروس] وعازلة تاي.
ملاحظة: الكميات تعتمد على لوحات كم مطلوبة. يمكن إعادة استخدام لوحات عدة مرات. من المستحسن أن العفن مستطيلة ضحلة ويوضع في طبق بتري بينما الجل هو التبريد بهدف إنشاء اكتئاب لاحتواء الأجنة على اللوحة. - وضع الأجنة في اللوحة في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: من الأفضل أن تصب بلطف الأجنة على لوح بدلاً من بيبيتينج بها لأنه قد تم العثور على أنها سوف تتمسك بداخل الماصات البلاستيكية. - استخدام الفحص المجهري الخفيفة من أجل تصور كل الأجنة. استخدام مجس صريحا للمناورة الأجنة إلى الموضع المطلوب.
- تأخذ صورة عندما يكون الجنين في الموضع المطلوب. لاحظ أنه من المهم أخذ الصور للأجنة خلال بضعة أسابيع لتلطيخ المكتملة لتجنب تدهور محتمل من وصمة عار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفي هذا التقرير، نقدم نهجاً بسيطاً ومباشرا للقيام بوضع العلامات الجنينية أستياناكس عينات لتحليل التعبير الجيني عالية الجودة. هذا الأسلوب يمكن أن تنفذ في أربعة أو خمسة أيام، ويتم تمثيل كل خطوة رئيسية في الإجراء في مخطط انسيابي مرمزة (الشكل 1). عند الانتهاء، يجب أن المرفأ أجنة ملطخة تسمية لوني أرجواني داكن في الأنسجة التعبير عن الجينات خاصة لمصلحة. وقد نفذنا هذا البروتوكول بنجاح في كل من Pachón كافيفيش (الشكل 2A–ب، ه) واجنة الأسماك السطحية (الشكل 2–د، و).
كانت الملون الأجنة كافيفيش لاثنين من عوامل النسخ أن التسمية أنسجة crest العصبي مبكرا و Sox9 و Tfap2a5،6. تثبت الأجنة المسمى للتعبير Sox9 وسم واضح في وضع الأقواس branchial والزعنفة الصدرية (أصفر رؤوس الأسهم، الشكل 2 أ). ملاحظة أن تلطيخ غائب تقريبا في كيس ألمح أو سميتس النامي في الجناح (الشكل 2A). وبالمثل، Tfap2a التعبير الواضح في الأجزاء من الرأس النامي، فضلا عن أوائل الهجرة crest العصبي الخلايا (الشكل 2B، رأس السهم) على طول منطقة الجناح الظهرية للجنين. هو الجين الممثل الثالث للأجنة كافيفيش Phf20a، علامة على التفريق أوستيوبلاست7. ملاحظة تلطيخ إيجابية في الأجزاء من سوميتيك mesoderm ومؤخرة الرأس التي تتجه إلى نشوء نسيج عظمى (الشكل 2E، رؤوس الأسهم).
في أجنة الأسماك السطحية، أننا سبر للجينات ككسكرو Adcyap1aو Sox10. ككسكر ترميز مستقبلات غشاء زمنياً ز-بروتين الذي يربط بين المستقطبات الامتحانات8. العلامات الإيجابية موجودة في مناطق معزولة من الرأس والجناح (الشكل 2 واو، رؤوس الأسهم)، فضلا عن بعض الخلايا الفردية تغمر كيس ألمح. يتم التعبير عن الجينات تفعيل adenylate cyclase ببتيد، Adcyap1a، في مناطق الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك خلايا الغدة النخامية. ملاحظة التعبير محددة للغاية في المجموعات الثنائية المزدوجة، والخلايا على الجانب الظهري للجنين؛ فضلا عن منطقة أكبر من التعبير خط الوسط (الشكل 2، رؤوس الأسهم). وأخيراً، نقدم التعبير عن Sox10، عامل نسخ التي تسميات المبكر crest العصبي و oligodendrocyte خلايا10. ويتضح تلطيخ إيجابية محددة للغاية كعلامة مبكرة من قمة العصبية على اليسار والطرفين حق الجنين الظهرية (الشكل 2D، رؤوس الأسهم).
نحن نقدم كل من هذين النوعين من القضايا التباس قد تواجه المحققين الآخرين. المسألة الأولى أحد لقاءات دورية بقع الشروريه من العلامات غير محددة. قد تنشأ هذه البقع ترسبات من يشطف مابت النهائية، أو المخزن المؤقت AP أثناء ردود الفعل التلون. مثال على هذه العلامات غير محددة من الواضح في كيس ألمح جنين أسماك السطح الملون للتعبير عن Pnp4a. هذا الجين يشفر إنزيم (بورين نوكليوزيد فوسفوريلاز) التي تسهل إنتاج تصبغ قزحي الألوان11. هذا الجين أولاً واضح في العين النامية والمثانة السباحة. وأزيلت بقع الشروريه لوحظ في بعض العينات السطحية (الشكل 3 ألف)، يغسل متكررة واستبدال من المخزن المؤقت AP + NBT/بسب في المراحل النهائية للبروتوكول (الشكل 3B). مسألة ثانية أن أحد لقاءات دورية هو تعبير منتشر، وإلى حد كبير غير محددة من الجينات التي ستنتج خلاف ذلك نمط تعبير متميزة. من الأمثلة على ذلك الجين BMP4، الذي يظهر كنمط منتشر إلى حد كبير مع مستويات منخفضة من تشروموجين في جميع أنحاء العينة (الشكل 3). في حالات كهذه، ونحن عموما تحديد منطقة مختلفة من الجين وتضخيم إلى ناقل وإجراء توليف مسبار جديد (انظر 6 ملف إضافي). ويرد مثال العينة التحكم (لا التحقيق) (الشكل 3D) لتوضيح طبيعة أعمالنا مسبار BMP4 الفاشلة منتشر وغير محددة.
رقم 1: مخطط انسيابي بسيط للجامعة-جبل التهجين في الموقع. ويستخدم هذا المخطط الانسيابي لون الترميز لتوضيح الخطوات الرئيسية من التهجين في الموقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تلطيخ الممثل للجينات الست، باستخدام كل من الكهف ونقرأ السطحية من أستياناكس- توضح الصورة (A) تلوين المحددة (الأسهم الصفراء) ل Sox9 على الجانب الأفقي حق ح 72 بعد الإخصاب (hpf) Pachón كافيفيش (45 x). (ب) تلوين المحددة ل Tfap2a واضح على الجانب الأفقي حق 36 هبف Pachón كافيفيش (45 x). يتم تسمية ثنائية (ج) وتلطيخ خط الوسط (رؤوس الأسهم الصفراء) من Adcyap1a في المنطقة الظهرية للأسماك السطحية هبف 72 (100 س). (د) Staining من Sox10 في الأنسجة العصبية كريست من الأسماك السطحية هبف 24 (100 س). (ﻫ) Phf20a يوضح نمط التعبير في المنطقة الظهرية من 24 الإغماء، ولكنها واضحة، هبف Pachón كافيفيش (100 س). (و) سيتوكين مستقبلات، ككسكر، تعرب في مناطق متميزة من الجانب الأفقي الحق من الأسماك السطحية هبف 24 (100 س). مقياس أشرطة في أ، ب، ه، و = 0.5 مم؛ تغيير حجم أشرطة في ج، د = 2.5 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
رقم 3: أمثلة من نتائج دون المستوى الأمثل للجامعة-جبل التهجين في الموقع. تلوين المحددة (A) ويتضح جنبا إلى جنب مع ترسبات غير محددة و/أو الحطام (السهم الأحمر) على الجانب الأفقي حق 72 هبف Pachón كافيفيش (100 س). (ب) التحقيق نفسه تصور في A، التي تصور تلطيخ نفس أنماط دون متسرعا أو الخلفية في 72 هبف Pachón كافيفيش (100 س). هبف (ج) الجناح الجانبي حق 72 كافيفيش Pachón يوضح تلطيخ منتشر، وغير محددة ل BMP4 في 45 x التكبير. (د) 72 ألف هبف Pachón cavefish تعرض لهذا البروتوكول، دون إضافة مسبار (45 x). تغيير حجم أشرطة = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظراً لضعف الجيش الملكي النيبالي للتدهور، إحدى الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول يتعلق بتوليف العقيمة لمسبار الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تحقيق يتم إنشاؤها بعناية، ويقدم نتائج جيدة، فإنه يمكن إعادة استخدامها في ردود المصبوغة لاحقة. خطوة حاسمة ثانية هو إنتاج دقيق لجميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول. حيث يتضمن هذا البروتوكول عدة أيام وخطوات صغيرة كثيرة، فمن الضروري أن الكواشف كل دقة تنتج، وتخزينها بطريقة عقيمة. علاوة على ذلك، من المهم أساسا أن المحقق يبقى المسار الدقيق لكل خطوة في البروتوكول. وقد وجدنا أن القائمة المرجعية المقدمة من خطوات يمكن أن تكون مفيدة للغاية في ضمان إتمام صحيحة ودقيقة لكل جانب من هذا البروتوكول.
أننا كثيرا ما لا يعدل البروتوكول قدمنا هنا. غير أن المحققين قد أداء إينكوبيشنز التحقيق في درجات حرارة مختلفة عن تلك التي اقترحت (أي 70 درجة مئوية). سوف تؤثر التغييرات الطفيفة في درجات حرارة التهجين ملزمة لتحقيقات الجيش الملكي النيبالي، وذلك، تسعى إلى درجة الحرارة المثلى التهجين يمكن التأثير إيجابيا على نوعية تلطيخ. وفيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها، ونشجع بقوة المحققين الآخرين الاستفادة من القائمة المرجعية المقدمة مع هذه المقالة (تكميلية ملف 1). الحفاظ على دقة السجلات خطوة أولى ضرورية في ضمان جودة عالية تلطيخ. ويقترح تعديل ثانوية ثانية هي القيام برد فعل التلون النهائي دون هزاز (مثلاً، دون وضع على منصة شاكر أو نوتاتور). السبب في ذلك هو أن نلاحظ دورياً إنتاج متسرعا، التي يفترض أن تنشأ عن حل المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس. عادة هذا متسرعا أوفيرستينس إلى لون داكن ويخلق الشروريه الخلفية (غير محددة) في النسيج الملون. للتقليل من إنتاج هذا متسرعا، نعد العازلة AP معقمة قبل كل رد فعل. علاوة على ذلك، مرة واحدة قد أضيفت إلى المخزن المؤقت NBT وبسب، نحن استبداله بالمخزن المؤقت الطازجة و NBT/بسب كل ساعة حتى يكتمل رد فعل التلون.
حد إلى أسلوب عرض أن تستخدم وصمة عار لوني للتصور التعبير الجيني. ونحن نفضل هذا النهج نظراً لأنها فعالة من حيث التكلفة، ويتطلب فقط الخفيفة الميكروسكوب لتصور. إذا واحد كانت مهتمة بتقييم الاختلافات الكمية، نقترح استخدام فعل تلون فلورسنت. وهذا سيمكن شبه كوانتيتيشن، على سبيل المثال، من خلال المقارنة بين وحدات الفلورسنت النسبي للتعبير بين التجارب.
بروتوكولات التهجين في الموقع متوفرة على نطاق واسع في12،ويب13، وكذلك في المنشورات العلمية. البروتوكول الذي نقدم وضعت خصيصا لنظامنا النموذجي، أستياناكس مكسيكي. وقد استخدمنا هذا البروتوكول وصمة عار على التعبير عن عدة عشرات من الجينات، وتشعر باستمرار ويوفر نتائج عالية الجودة. ميزة كبيرة لهذا البروتوكول من قائمة البنود لتمكين المحقق لتنفيذ مهام متعددة مع ضمان إنجاز دقيق لكل خطوة من خطوات هذا البروتوكول خطوة بخطوة. ونأمل أن هذا البروتوكول بمثابة مورد مفيد للمحققين الآخرين في الميدان وما بعدها، وتوقع أن تدعم هذه التقنية المختبرية المشتركة الاكتشافات المستقبلية التي تربط بين النمط الوراثي للنمط الظاهري في كافيفيش المكسيكي أعمى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر الإجمالي لتعليقات مفيدة في هذه المخطوطة. ونود أن نعترف بأربعة من طلاب المدارس الثانوية الذين يستخدم هذا البروتوكول خلال التدريب الصيفي في عام 2017 و 2018، بما في ذلك كريستين تساو وناظر مايكل ولي Aki وديفيد نوانكوو. وأيد HL زمالة "الجذعية البيولوجيا جامعة كاليفورنيا" خلال صيف عام 2017. كان يؤيد هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم (ديب-1457630 إلى JBG)، والمعاهد الوطنية لطب الأسنان والجمجمة البحوث (المعاهد الوطنية للصحة؛ DE025033 إلى JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
