Summary
Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.
Abstract
In de afgelopen jaren heeft het genoom van een ontwerp voor de blinde Mexicaanse cavefish (Astyanax mexicanus) vrijgegeven, onthullen de identiteit van de reeks voor duizenden genen. Voorafgaande onderzoek naar deze opkomende modelsysteem gekapitaliseerd op uitgebreide genoom-brede onderzoeken, die talrijke kwantitatieve trait loci (QTL) die is gekoppeld aan verschillende grot-geassocieerde fenotypen hebben geïdentificeerd. De mogelijkheid om de erfelijke basis voor verandering van de fenotypische verbinden met de genen van belang blijft echter een aanzienlijke uitdaging. Een techniek die dieper begrip van de rol van ontwikkeling in de evolutie van de troglomorphic vergemakkelijken kan is geheel-mount kruising in situ. Deze techniek kan worden toegepast om rechtstreeks vergelijken van genexpressie tussen grot - en oppervlakte-woning vormen, kandidaat benoemen genen onderliggende gevestigde QTL, identificeren van genen van belang van volgende-generatie sequencing studies of ontwikkelen van andere ontdekking-gebaseerde benaderingen. In dit verslag stellen we een eenvoudig protocol, ondersteund door een flexibele controlelijst, die wijd aangepast voor gebruik goed buiten het gepresenteerde studie-systeem worden kan. Gehoopt wordt dat dit protocol als een grote bron voor de Astyanax -Gemeenschap en daarbuiten dienen kan.
Introduction
Kruising in situ is een gemeenschappelijke methode voor de kleuring van vaste weefsels om te visualiseren van gen expressie patronen1. Deze techniek heeft jarenlang in andere traditionele2 - en niet-traditionele3 modelsystemen, voor een verscheidenheid van biologische studies verricht. Er zijn echter verschillende stappen en reagentia moet deze procedure uitvoeren. Voor onderzoekers die deze techniek nog nooit hebt uitgevoerd, kan starten van het proces worden intimiderende als gevolg van de vele stappen. Verder, het langdurige karakter van deze procedure leent zich voor technische fouten, die kunnen lastig zijn om op te lossen.
Het algemene doel van dit artikel is om een eenvoudige en ongecompliceerde methode die zal deze kruising techniek voor een breed publiek toegankelijk te maken. Verklein de invoering van fouten en presenteren we een eenvoudige benadering die levert hoge kwaliteit gen expressie kleuring en minimaliseert aspecifieke achtergrond signaal. Deze procedure is vergelijkbaar met andere benaderingen ontwikkeld in traditionele modelsystemen, zoals Danio rerio4. Hier, streven wij naar het vergemakkelijken van zorgvuldige uitvoering van elke stap met behulp van een downloadbare checklist (aanvullende bestand 1), zorgvuldige uitvoering van het protocol te bevorderen. De reden hiervoor is het vergemakkelijken van de organisatie door middel van de vele stappen die betrokken zijn bij deze procedure. Dit artikel is geschikt voor onderzoekers ook geïnteresseerd in het uitvoeren van geheel-mount kruising in situ in het ontwikkelen van embryo's, maar de procedure nog niet hebben uitgevoerd. Het voordeel van de gekozen aanpak voor Astyanax onderzoekers is dat het is getest en in zowel cavefish en oppervlakte vissen morphs bewezen, teneinde vergelijkende expressie analyses. De onderhavige methode kan worden gebruikt door onderzoekers in studies over Astyanax en andere systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati (Protocol #10-01-21-01).
1. fixatie
- Gewenste aantal Astyanax mexicanus embryo's uit een tank van fokken te isoleren en op te lossen ~ 50 embryo's tegelijk. Als embryo's groot en oude zijn, wellicht 25 tegelijk om ervoor te zorgen zelfs fixatie vast te stellen.
- Afhankelijk van de leeftijd van het embryo, gebruik maken van de IACUC-goedgekeurde methode van narcose. Voor oudere embryo's met een goed functionerend zenuwstelsel, offeren embryo's via verdoving overdosis. Dienovereenkomstig, plaatst u in een oplossing van ~ 1% tricaïne (gebufferd op een pH van 7,4) embryo's om te minimaliseren van pijn en ongemak voor het organisme.
- Zodra de embryo's niet-reagerende te raken, vervang systeem water met tricaïne en voeg ~ 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
- Verwijder de PBS-oplossing en voeg 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Repareren van embryo's 's nachts bij 4 ° C.
Let op: PFA is gevaarlijke (dat wil zeggen, het is brandbaar en is een huid en longen irriterende), voorzichtig behandelen.
2. uitdroging
- Uitdrogen van de embryo's, verwijder de kleefpoeders oplossing en spoel met 1 mL PBS. Plaats embryo-bevattende flesjes onder een hoek (tussen 30° en 45°), op een platform shaker tijdens spoelen. Blijven wassen de embryo tweemaal, 5 min per wasbeurt.
- Als embryo's nog steeds een chorion, alle embryo 50 's in een 100 x 25 mm petrischaal en hen zorgvuldig te isoleren van de chorions met behulp van twee sets van de horlogemaker verlostang (bijvoorbeeld #5 verlostang) onder een microscoop.
Opmerking: Tijdens de stappen hieronder, en voor de rest van het protocol, verwijder voorzichtig alle vloeistof uit de vorige stap met behulp van schone, glas Pasteur pipettes alvorens toe te voegen de volgende oplossing - Uitdrogen van de embryo's in een reeks van steeds meer geconcentreerde wasbeurten van methanol (MeOH) die hieronder worden beschreven. De verdunningen zijn gebaseerd op een totaal volume van 1 mL met 500 µL van oplossing gaan op elke 4 mL glazen ampul. Stappen alle uitdroging bij kamertemperatuur (RT) op platform shaker.
- Verwijder voorzichtig de PBS-oplossing. Voeg een 25% MeOH oplossing (250 µL van MeOH) + 750 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
- Verwijder voorzichtig de 25% MeOH-oplossing. Voeg een 50% MeOH oplossing (500 µL van MeOH) + 500 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
- Verwijder voorzichtig de 50% MeOH-oplossing. Voeg een 75% MeOH oplossing (750 µL van MeOH) + 250 µL van PBS. Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 minuten.
- Verwijder voorzichtig de 75%-MeOH-oplossing. Het toevoegen van een 100% MeOH-oplossing (1 mL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min. deze stap 3 keer herhalen.
- Op dit punt, gedehydreerd winkel embryo's, zo nodig, in hun glazen flesjes bij-20 ° C (lange termijn). U kunt ook gaan rechtstreeks naar dag 1 van het protocol.
3. dag 1: rehydratatie
- Gedehydrateerde embryo's verkrijgen bij-20 ° C vriezer (of gaan direct uit stap 2.5).
- Sorteren van de embryo's met behulp van een precisiepipet Pasteur. Een kunt sorteren op basis van morphotype (d.w.z., grot en/of oppervlak), en het aantal genen beoordeeld in elk experiment. Er zijn meestal niet meer dan 12 embryo's per flacon eenmaal gesorteerd. Als u wilt behouden organisatie, door gekleurde lab tape te gebruiken flesjes en pipetten voor elk gen aan te wijzen. Embryo's zal blijven in de dezelfde flacon gedurende het gehele protocol.
Opmerking: Plaats het topje van de Pipet van Pasteur in 100% EtOH te steriliseren tussen gebruikt. - Stel een schudden waterbad tot 70 ° C te worden gebruikt in een latere stap. Zorgvuldig, trekken uit de MeOH in flesjes van gesorteerde embryo's en vervangen 500 µL van nieuwe 100% MeOH. Wash kort (~ 1 min) op platform shaker.
- Hydrateren embryo's in een toenemende concentratie van 1 x PBS met tween-20 (PBT, zie hieronder) op platform shaker. De verdunningen zijn gebaseerd op een volume van 1 mL in de uiteindelijke verdunning met 500 µL gaan op elke flacon.
- Voeg een 25% PBT oplossing (250 µL van PBT-, 750 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
- Verwijder voorzichtig de 25% PBT-oplossing. Voeg een 50% PBT oplossing (500 µL van PBT-, 500 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
- Verwijder voorzichtig de 50% PBT-oplossing. Voeg een 75% PBT oplossing (750 µL van PBT-, 250 µL van MeOH). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min.
- Verwijder voorzichtig de 75% PBT-oplossing. Voeg een 100% PBT oplossing (1 mL van PBT). Voorzichtig schudden in een roteerapparaat platform voor 5 min. deze stap 3 keer herhalen.
4. dag 1: Spijsvertering en fixatie
- Bereiden een proteïnase K (PK) oplossing door 1 µL van PK (20 mg/mL) toe te voegen aan 2 mL PBT.
- In afwachting van latere stappen, verkrijgen bij bevroren aliquots van hybridisatie buffers (Hyb- en Hyb +; Zie aanvullende bestand 2 en aanvullende bestand 3) en PFA-20 ° C-opslag.
- Toestaan PFA te ontdooien op RT.
- Plaats aliquots van Hyb- en Hyb + in een roterende 70 ° C waterbad. Plaats alle reagentia en flesjes binnen een kleine "pakking" met een gaas bodem, binnen het zwevende water bad apparaat. Hierdoor is eenvoudige toevoeging en verwijdering van buizen en flesjes uit de roterende 70 ° C waterbad.
- Zachtjes toevoegen PK oplossing voor de vial(s) van embryo's te waarborgen van alle weefsels zijn volledig bedekt met een oplossing. Het verteren van embryo's voor ~ 12 min in PK werkende oplossing op het platform schudapparaat.
Opmerking: De lengte van de spijsvertering kan worden gevarieerd door de onderzoeker voor optimale resultaten. - Zachtjes trekken uit de PK-oplossing, en kort overspoelen de flacon met PBT om te verdunnen van eventuele resterende PK.
- Trekken uit de PBT-oplossing en vervangen 500 µL van nieuwe PBT. Laat de oplossing te spoelen in het roteerapparaat platform voor 5 min.
- Trekken uit PBT en vervangen 500 µL van ontdooide 4% PFA. Toestaan dat de embryo's Incubeer gedurende 20 minuten op het schudapparaat platform op RT.
- Trekken uit de 4% PFA, en kort overspoelen de flacon met PBT om te verdunnen van eventuele resterende PFA. Trekken uit de PBT en vervangen 500 µL van verse PBT. Toestaan dat embryo's te spoelen gedurende 5 minuten op het schudapparaat platform. Herhaal deze stap 4 vaker.
5. dag 1: Prehybridization
- Plaats 500 µL voorverwarmde Hyb-oplossing in de flacon. Zorgvuldig plaatst de flacon in de 70 ° C water bad (binnenkant pakkingen) zonder schudden, 5 min.
- Trekken uit de Hyb-oplossing en overstroming van de flacon met 500 µL voorverwarmde Hyb + oplossing. Plaats de ampul terug in het waterbad van 70 ° C met schudden (40 rpm). Incubeer gedurende beide 4 h, of 's nachts.
Opmerking: Een 4 uur incubatie levert een volledige in-situ protocol dat voor 4 dagen in totaal duren zal. Hier, wordt deze stap gepresenteerd als een overnachting incubatie, die een protocol duren 5 dagen in totaal zal opleveren.
6. dag 2: kruising
- Plaats een aliquoot gedeelte van Hyb + uit de diepvries van-20 ° C in het schudden bad warm water gedurende 5 minuten.
- Trekken uit de Hyb + uit de flacon en vervangen 500 µL voorverwarmde Hyb +. Voor deze oplossing, Voeg aan elke flacon 2 µL van RNA sonde. Zachtjes swirl het flesje om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van de sonde.
- Incubeer de oplossing Hyb + (met toegevoegde sonde) in het waterbad van 70 ° C's nachts terwijl het schudden van 40 toeren per minuut.
Opmerking: Kan men opnieuw gebruiken Hyb + (met sonde) oplossing. Hiervoor meenemen Hyb + sonde uit de eerste run van de vriezer van-20 ° C en plaats het in een waterbad voor 5 min. vervangen Hyb + vanaf de dag 1 protocol met Hyb + met sonde en toestaan dat 's nachts het broeden in warm waterbad.
7. dag 3: Oplossing voorbereiding
- Het bereiden van microcentrifuge buizen met het label Hyb + met de "gene-of-interest" RNA-sonde. Maak de reeks verdunningen die zal worden gebruikt tijdens de dag 3.
- Met 6 afzonderlijke buizen, maak de volgende reeks verdunningen van Hyb- en zoute Natriumcitraat (SSC, 0 tot 100%) in een volume van 1 mL en plaats hen in de 70 ° C schudden bad het water: 1 = 100% Tube Hyb-(1 mL Hyb-): Tube 2 = 25% 2 x SSC (250 µL van 2 x SSC, 750 µL van Hyb-); 3 = 50% 2 x SSC buis (500 µL van 2 x SSC, 500 µL van Hyb-); 4 = 75% 2 x SSC buis (750 µL van 2 x SSC, 250 µL van Hyb-); Tube van 5 = 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC); Buis 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
Opmerking: Waakzaam van de concentratie van SSC, zoals het wordt gewijzigd van 2 x 0,2 x. - Met behulp van 4 aparte buizen, maak de volgende reeks verdunningen van PBT- en WS in een volume van 1 mL, en plaats op RT: Tube 1 = 25% PBT (250 µL van PBT-, 750 µL van 0,2 x SSC); Buis 2 = 50% PBT (500 µL van PBT-, 500 µL van 0,2 x SSC); Buis 3 = 75% PBT (750 µL van PBT-, 250 µL van 0,2 x SSC); Tube 4 = 100% PBT (1mL van PBT).
- Een buis met 2 mL maleïnezuur buffer met tween-20 (MABT) werkende oplossing voor te bereiden.
- Twee 15 mL conische buizen van het blokkeren van de oplossing voor te bereiden. In elke buis, Voeg 0.2 g van blokkerende reagens tot 10 mL van MABT (Zie aanvullende bestand 4). Plaats beide buizen op een nutating mixer (of platform shaker) tot volledig is opgelost in-oplossing (maximaal 3 h).
- Met 6 afzonderlijke buizen, maak de volgende reeks verdunningen van Hyb- en zoute Natriumcitraat (SSC, 0 tot 100%) in een volume van 1 mL en plaats hen in de 70 ° C schudden bad het water: 1 = 100% Tube Hyb-(1 mL Hyb-): Tube 2 = 25% 2 x SSC (250 µL van 2 x SSC, 750 µL van Hyb-); 3 = 50% 2 x SSC buis (500 µL van 2 x SSC, 500 µL van Hyb-); 4 = 75% 2 x SSC buis (750 µL van 2 x SSC, 250 µL van Hyb-); Tube van 5 = 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC); Buis 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
8. dag 3: Sonde verwijdering
- Trekken uit Hyb + (met sonde) oplossing met een glazen pipet van Pasteur en leg deze in een steriel, met het label microcentrifuge buis. Deze buis in de vriezer van-20 ° C voor toekomstig gebruik behouden (als sonde-labeling is van succesvol).
- Voeg voorzichtig 500 µL van de warme WS/Hyb-verdunningen (onderstaande). Incubeer in elk van de volgende oplossingen voor elke 10 minuten in het waterbad van 70 ° C schudden.
- Incubeer opeenvolgend met 100% Hyb-(1 mL Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL van 2 x SSC, 750 µL van Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL van 2 x SSC, 500 µL van Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL van 2 x SSC, 250 µL van Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
- Na de laatste stap, incubeer in elk van de volgende oplossingen voor elke 10 min. Alle van de volgende incubations plaatsvinden op RT op het schudapparaat platform: 25% PBT (250 µL van PBT-, 750 µL van 0,2 x SSC), 50% PBT (500 µL van PBT-, 500 µL van 0,2 x SSC), 75% PBT (750 µL van PBT-, 250 µL van 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 mL van PBT).
- Na een 10 min incubatie, verwijderen de 100% PBT-, en voeg 500 µL van MABT in elke flacon. Herhaal deze stap tweemaal voor 5 min.
9. dag 3: blokkeren
- Verwijderen MABT uit elke flacon en floodlight met voorgemengde blokkerende oplossing van één van de buizen (bereid in stap 7.1.4). Flacon plaats op een nutating mixer voor ~ 4 h op RT.
- Voeg 2 µL van Anti-DIG-AP Fab fragmenten aan de tweede flacon van 10 mL oplossing (bereid in stap 7.1.4) en kort vortex blokkeren.
- Elke flacon bijna volledig te vullen met het blokkeren van de oplossing (~ 5 mL) en plaats op nutating mixer overnachting in een koelkast bij 4 ° C.
10. dag 4: MABT gespoeld
- Bereiden van een voorraad flacon van 10% normale geit serum (NGS) in MABT (Voeg 100 µL van NGS aan 900 µL van MABT).
- Trekken uit de blokkerende oplossing in elk flesje en voeg 500 µL van NGS/MABT mengsel in elke flacon. Toestaan dat de embryo's Incubeer gedurende 25 min op RT op het schudapparaat platform.
- Het mengsel van het NGS/MABT vervangen door 500 µL van 100% MABT. Incubeer gedurende 30 min op RT op het schudapparaat platform. Het uitvoeren van deze spoelen 11 vaker gedurende de dag elke 30 min.
- Vul de flacon met 100% MABT en op een mixer nutating overnachting in een kamer van het ijskast of inloop bij 4 ° C.
11. dag 5: Sonde visualisatie
- Bereiden van een hoeveelheid van 50 mL van alkalische fosfatase (AP) buffer (Zie aanvullende bestand 5). Combineren van de volgende handelingen uit in een conische tube van 50 mL, verpakt in aluminiumfolie om lichte blootstelling te beperken: 5 mL 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL 50 mM MgCl2, 5 mL van de 1% Tween 20, 5 mL van de 1 M NaCl, 30 mL ddH2O.
- MABT Verwijder en vervang met 1 mL AP buffer (buis gewikkeld in folie). Laat het wassen gedurende 5 minuten. Doe dit twee keer om ervoor te zorgen volledige verwijdering van MABT.
- AP buffer te verwijderen en te vervangen met 1 mL van AP buffer met 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BVIE) en 4.5 μL van nitro-blauw tetrazolium (NBT). Vers bereide AP buffer/NBT/BVIE vervangen zodra elk uur tot reactie voltooid is. Volgen, controleren elke 15 min, zodat de verkleuring reactie plaatsvinden totdat het gewenste niveau van kleuring is bereikt. Als neerslag te vormen begint, vervangt u de oplossing vroeg.
- Kleuring zet de reactie stop door het spoelen van de embryo's in vers 100% AP buffer (zonder NBT/BVIE) voor 5 min. doorgaan gespoeld in PBT totdat optimale niveaus van signaal (met een minimale hoeveelheid achtergrondkleuring) worden verkregen. Blijven spoelen exemplaren met toenemende verdunningen van PBT in AP Buffer als volgt: 25% PBT (250 μL van PBT-, 750 μL van AP Buffer), spoelen gedurende 5 minuten; 50% PBT (500 μL van PBT-, 500 μL van AP Buffer), spoelen gedurende 5 minuten; 75% PBT (750 μL van PBT-, 250 μL van AP buffer), spoel gedurende 5 minuten.
- Spoel de embryo's in de ~ 5 mL 100% PBT op nutating mixer totdat de gewenste minimale achtergrondkleuring is bereikt. Schakel uit met verse PBT meerdere malen. Dit kan enkele dagen duren.
- Wanneer spoelen compleet, wassen embryo's in 500 μL van steriele PBS op een platform shaker is. Deze spoel tweemaal voor 5 min uitvoeren. Nadat PBS wast, na correctie van de specimens in 500 μL van 4% PFA gedurende 1 uur bij RT op een platform shaker. Ook 's nachts oplossen in 1 mL 4% PFA in de koelkast bij 4 ° C.
- Het fixeer vervangen door verse, steriele PBS. Deze spoelen uitvoeren ten minste tweemaal voor 5 min. plaats de embryo's in ~ 4 mL steriele PBS van 100%, en opslaan van lange termijn bij 4 ° C.
12. imaging
- Make-up een imaging plaat in een petrischaal met 3% agarose en TAE-buffer.
Opmerking: Hoeveelheden afhankelijk van hoeveel platen nodig zijn. Platen kunnen meerdere malen worden hergebruikt. Het wordt aanbevolen dat een ondiepe rechthoekige schimmel in de petrischaal wordt geplaatst, terwijl de gel is koeling om het maken van een depressie bevatten de embryo's op de plaat. - Plaats de embryo's op de plaat in de PBS.
Opmerking: Het is het beste voorzichtig pour embryo's op het bord in plaats van hen uit pipetteren omdat is gebleken dat ze aan de binnenkant van plastic pipetten vasthouden zullen. - De lichte microscopie van gebruik om het visualiseren van elk embryo. Gebruik een botte sonde te manoeuvreren van embryo's naar de gewenste positie.
- Neem een afbeelding wanneer het embryo in de gewenste positie is. Merk op dat het belangrijk is om beelden te nemen van embryo's binnen een paar weken van voltooide kleuring Voorkom mogelijke aantasting van de vlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit verslag geven wij een eenvoudige en ongecompliceerde benadering standaardinteracties labeling van embryonale Astyanax specimens voor kwalitatief hoogwaardige gen expressie analyse. Deze techniek kan worden uitgevoerd in vier of vijf dagen, en elke belangrijkste stap in de procedure is vertegenwoordigd in een kleurgecodeerde stroomdiagram (Figuur 1). Zodra voltooid, moeten gebeitst embryo's haven een donkere paarse chromatische label in weefsels die het bepaalde gen van belang. We hebben dit protocol met succes geïmplementeerd in zowel Pachón cavefish (figuur 2A-B, E) en oppervlakte vissen (figuur 2C-D, F) embryo's.
De cavefish embryo's werden gekleurd voor twee transcriptiefactoren die label vroege neurale crest weefsels, Sox9 en Tfap2a5,6. Embryo's die zijn gelabeld voor Sox9 uitdrukking tonen duidelijke etikettering in de ontwikkelende branchial bogen en pectoral fin (gele pijlpunten, figuur 2A). Merk op dat de kleuring vrijwel afwezig is in de dooierzak of de ontwikkelende somieten op de flank (figuur 2A). Tfap2a expressie is ook duidelijk in het rechterdeel van de ontwikkelingslanden hoofd, evenals de vroege migratie neurale kamcellen (figuur 2B, pijlpunt) langs de dorsale flank regio van het embryo. Het derde vertegenwoordiger gen gepresenteerd voor cavefish embryo's is Phf20a, een marker van osteoblast differentiatie7. Opmerking de positieve kleuring in het rechterdeel van de somitic mesoderm en posterieure hoofd die bestemd zijn te leiden tot beenderige weefsels (figuur 2E, pijlpunten).
In oppervlakte vissen embryo's peilden we voor de genen CXCR, Adcyap1aen Sox10. CXCR codeert een G-eiwit membraan-gebonden receptoren die CXC chemokines8 bindt. Positieve etikettering is aanwezig in geïsoleerde regio's van het hoofd en de flank (figuur 2F, pijlpunten), evenals een paar afzonderlijke cellen overliggende de dooierzak. Het gen adenylaat cyclase-activeren polypeptide, Adcyap1a, wordt uitgedrukt in regio's van het centrale zenuwstelsel, met inbegrip van hypofyse cellen. Opmerking de zeer specifieke expressie in gepaarde, bilaterale clusters van cellen op het dorsale aspect van het embryo; Naast een grotere regio middellijn expressie (figuur 2C, pijlpunten). Tot slot presenteren we de expressie van Sox10, een transcriptiefactor welke etiketten vroege neurale kuif en oligodendrocyte cellen10. Zeer specifieke positieve kleuring is duidelijk als een vroege marker van neurale crest aan de linkerkant en rechterkant van het dorsale embryo (figuur 2D, pijlpunten).
Presenteren wij elk van de twee soorten storende problemen die zich bij andere onderzoekers voordoen kunnen. De eerste kwestie die een regelmatig ontmoetingen is punctate vlekjes van aspecifieke labeling. Deze vlekken kunnen ontstaan als neerslag uit de laatste MABT gespoeld of de AP-buffer tijdens de kleuring reacties. Een voorbeeld van deze aspecifieke labeling is duidelijk op de dooierzak van een embryo van de oppervlakte vissen gekleurd voor expressie van Pnp4a. Dit gen codeert voor een enzym (purine nucleoside werkte) die de productie van iriserende pigmentatie11vergemakkelijkt. Dit gen is eerst duidelijk in het derde oog en de zwemblaas. De punctate vlekjes waargenomen in enkele oppervlakte exemplaren (figuur 3A), werden geëlimineerd door frequente wasbeurten en vervanging van de AP Buffer + NBT/BVIE in de definitieve stadia van het protocol (figuur 3B). Een tweede kwestie die men regelmatig tegenkomt is de diffuse, grotendeels niet-specifieke expressie van genen die anders een verschillende expressiepatroon zou produceren. Een voorbeeld is het gen BMP4, die wordt weergegeven als een grotendeels diffuus patroon met lage niveaus van chromogeen aanwezig in het model (Figuur 3 c). In gevallen zoals deze, we over het algemeen een andere regio van het gen te identificeren, versterken in een vector en uitvoeren van een nieuwe sonde synthese (Zie aanvullende bestand 6). Het voorbeeld van een besturingselement (geen sonde) model (figuur 3D) wordt verstrekt ter illustratie van de diffuse en niet-specifieke aard van onze mislukte BMP4 -sonde.
Figuur 1: een eenvoudig stroomdiagram voor geheel-mount in situ hybridisatie. Dit stroomdiagram maakt gebruik van kleurcodering ter illustratie van de belangrijkste stappen van de kruising in situ. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger kleuring voor zes genen, met behulp van zowel de grot en de oppervlakte morphs van Astyanax. (A) afbeelding toont de specifieke kleuring (gele pijlen) van Sox9 aan de juiste laterale kant van een 72 h na bevruchting (hpf) Pachón cavefish (45 x). (B) specifieke kleuring voor Tfap2a duidelijk op de rechts laterale kant van een 36 is hpf Pachón cavefish (45 x). (C) bilateraal en middellijn (gele pijlpunten) verkleuring van de Adcyap1a worden aangeduid in de dorsale regio van een 72 hpf oppervlakte vis (100 x). (D) Staining van Sox10 in de weefsels van de neurale crest van een 24 hpf oppervlakte vis (100 x). (E) Phf20a toont een flauw, maar duidelijk patroon van meningsuiting in de dorsale regio van een 24 hpf Pachón cavefish (100 x). (F) de cytokine receptor, CXCR, wordt uitgedrukt in verschillende regio's van de juiste laterale kant van een 24 hpf oppervlakte vis (100 x). Schaal/omlaagbalken in A, B, E, F = 0.5 mm; schaal bars in C, D = 2,5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve voorbeelden van sub-optimale resultaten voor geheel-mount in situ hybridisatie. (A) specifieke kleuring blijkt naast aspecifieke neerslag en/of puin (rode pijlpunt) op het recht laterale aspect van een 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (B) de dezelfde sonde gevisualiseerd in A, beeltenis van de dezelfde kleuring patronen zonder neerslag of achtergrond in een 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (C) de juiste laterale flank van een 72-hpf Pachón cavefish toont diffuse, niet-specifieke kleuring voor BMP4 bij 45 x vergroting. (D) A 72 hpf Pachón cavefish onderworpen aan dit protocol, zonder de toevoeging van de sonde (45 x). Schaal bars = 0.5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de kwetsbaarheid van RNA voor afbraak betreft een van de belangrijkste stappen in het protocol de steriele synthese van de RNA-sonde. Echter, als een sonde zorgvuldig wordt gegenereerd, met goede resultaten, kan het worden hergebruikt in latere kleuring reacties. Een tweede cruciale stap is de zorgvuldige productie van alle reagentia in het gehele protocol gebruikt. Aangezien dit protocol betrekking heeft op verschillende dagen en veel kleine stapjes, is het essentieel dat alle reagentia nauwkeurig worden geproduceerd, en opgeslagen in een steriele wijze. Verder is het van fundamenteel belang dat de onderzoeker zorgvuldig bijgehouden van elke stap in het protocol wordt. We hebben vastgesteld dat de verstrekte checklist van stappen kunnen uiterst nuttig om ervoor de te zorgen nauwkeurige en precieze voltooiing van elk aspect van dit protocol.
We Wijzig niet vaak het protocol die we hier gepresenteerd. Echter, onderzoekers sonde incubations bij verschillende temperaturen dan degene die voorgesteld kunnen uitvoeren (bijvoorbeeld 70 ° C). Kleine wijzigingen in de kruising temperaturen zal gevolgen voor binding van sondes van RNA, en daarom op zoek naar de optimale hybridisatie temperatuur kan positief beïnvloeden de kwaliteit van de kleuring. Met betrekking tot het oplossen van problemen, raden wij andere onderzoekers gebruik maken van de checklist voorzien van dit artikel (aanvullende bestand 1). Behoud voorzichtig records is een noodzakelijke eerste stap bij het waarborgen van hoogwaardige kleuring. Een tweede, kleine wijziging is voorgesteld is het uitvoeren van de reactie van de uiteindelijke kleuring zonder schommelen (bijvoorbeeld zonder te plaatsen op een platform schudapparaat of nutator). De reden hiervoor is dat regelmatig wij nota nemen van de productie van neerslag, die vermoedelijk vloeit uit de AP-bufferoplossing voort. Deze neerslag meestal overstains een donkere kleur en wordt gemaakt van punctate (niet-specifieke) achtergrond op het gekleurd weefsel. Wij bereiden om te minimaliseren van de productie van deze neerslag, gesteriliseerde AP buffer vlak voor elke reactie. Verder, zodra NBT en BVIE zijn toegevoegd aan de buffer, wij vervangen door verse buffer en NBT/BVIE elk uur totdat de kleuring reactie is voltooid.
Een beperking tot de onderhavige methode is dat een chromatische vlek werd gebruikt voor gen expressie visualisatie. Wij verkiezen deze aanpak, aangezien het is rendabel, en alleen de lichte microscopie van vereist te visualiseren. Als een waren geïnteresseerd in het beoordelen van de kwantitatieve verschillen, raden we dat ze gebruiken een fluorescerende kleuring reactie. Hierdoor kunnen semi-kwantificatie, bijvoorbeeld door vergelijking van de relatieve fluorescerende eenheden van meningsuiting tussen experimenten.
Protocollen voor in situ hybridisatie zijn beschikbaar wijd op het web12,13, en ook in wetenschappelijke publicaties. Het protocol dat wij presenteren werd speciaal ontwikkeld voor onze modelsysteem, Astyanax mexicanus. We hebben dit protocol gebruikt om vlekken van de expressie van tientallen genen, en voel me daarin consequent hoge kwaliteit resultaten. Een belangrijk voordeel van dit protocol is de stapsgewijze checklist van de items die u wilt inschakelen van de detective om meerdere taken tegelijkertijd nauwkeurige voltooiing van elk van de stappen van dit protocol. Wij hopen dat dit protocol zal als een nuttige bron naar andere onderzoekers in het veld en daarbuiten dienen, en anticiperen op dat deze gemeenschappelijke laboratorium techniek toekomstige ontdekkingen genotype te koppelen aan de fenotype in de blind Mexicaanse cavefish zal steunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank leden van de bruto lab voor nuttige opmerkingen op dit manuscript. Wij willen vier middelbare schoolstudenten die dit protocol tijdens de zomer stages in 2017 en 2018 gebruikt, met inbegrip van Christine Cao, Michael Warden, Aki Li en David Nwankwo erkennen. HL werd gesteund door een UC biologie stam Fellowship in de zomer van 2017. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Science Foundation (DEB-1457630 aan de JBG), en de nationale instituten van tand- en craniofaciale onderzoek (NIH; DE025033 aan de JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
