Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Måling af Global cellulære Matrix Metalloproteinase og metaboliske aktivitet i 3D Hydrogels

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

Her, en protokol, der er præsenteret for indkapsling og dyrkning af celler i poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized med en fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-nedbrydeligt peptid. Cellulære MMP og metaboliske aktivitet måles direkte fra hydrogel kulturer ved hjælp af en standard mikrotiterplade læser.

Abstract

Tre-dimensionelle (3D) celle kultur systemer sammenfatte ofte tættere i vivo cellulære svar og funktioner end traditionelle todimensionale (2D) kultur systemer. Måling af cellefunktion i 3D kultur er dog ofte mere udfordrende. Mange biologiske assays kræve hentning af cellulære materiale, som kan være svært i 3D kulturer. Én måde at løse denne udfordring er at udvikle nye materialer, der aktiverer måling af cellefunktion i materialet. Her præsenteres en metode til måling af cellulære matrix metalloproteinase (MMP) aktivitet i 3D hydrogels i en 96-brønds format. I dette system functionalized en poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel med en fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellulære MMP aktivitet er proportional med fluorescens intensitet og kan måles med en standard mikrotiterplade læser. Miniaturisering af denne analyse til en 96-brønds format reduceret tidsforbrug for eksperimenterende sæt op ved 50% og reagens brug af 80% pr. betingelse i forhold til den tidligere 24-godt version af analysen. Denne analyse er også kompatibel med andre målinger af cellefunktion. F.eks er en metabolisk aktivitet assay vist her, som kan foregå samtidigt med MMP aktivitet målinger inden for den samme hydrogel. Analysen er påvist med menneskelige melanom celler indkapslet på tværs af en vifte af celle såning tætheder for at bestemme den passende indkapsling tæthed for arbejdsområde i analysen. Efter 24 timer af celle indkapsling var MMP og metaboliske aktivitet udlæsninger proportional med celle såning tæthed. Mens analysen er vist her med en fluorogenic nedbrydeligt substrat, kunne analyse og metode være tilpasset til en bred vifte af hydrogel systemer og andre fluorescerende sensorer. Sådan en analyse er en praktisk, effektiv og let tilgængelige 3D dyrkningsbaserede platform for en bred vifte af applikationer.

Introduction

Tre-dimensionelle (3D) kultur systemer ofte tættere sammenfatte i vivo cellulære svar end traditionelle todimensionale (2D) kultur systemer, se flere fremragende publikationer1,2,3 . Imidlertid udnytter 3D kultur systemer til at måle cellefunktion har været udfordrende på grund af vanskeligheden ved cellulære hentning og yderligere prøve behandling. Dette problem begrænser måling af mange cellulære funktioner i 3D kultur systemer. At overvinde denne vanskelighed, nye teknikker er nødvendige for at muliggøre nem måling af cellefunktion inden for 3D-miljøer. Én måde at løse dette behov er udviklingen af materialer, der ikke blot støtter 3D cellekultur men også optage sensorer til at måle cellefunktion. For eksempel, har flere hydrogel systemer indarbejdet fluorogenic protease cleavable fraspaltning for at aktivere visualisering af protease aktivitet inden for 3D-miljøer4,5,6,7. Mens disse systemer var oprindelig udnyttes til mikroskopisk billeddannelse, kan disse systemer også være tilpasset til brug i en global matrix metalloproteinase (MMP) aktivitet assay ved hjælp af en standard Pladelæser, gør det muligt for facile måling af en cellefunktion i en 3D miljø8.

MMPs, en superfamilien af zink proteaser, spiller vigtige roller i normale væv homøostase og mange sygdomme. MMPs nedbrydes og remodel ekstracellulære matrix (ECM), Kløve celle overfladen receptorer og cytokiner og aktivere andre MMPs9,10. MMPs spiller en kritisk rolle i fysiologiske processer såsom sårheling og sygdomme som gigt, åreforkalkning, Alzheimers, og kræft (Se anmeldelser i 9,10,11). I kræft, er høj MMP udtryk niveauer stærkt korreleret med kræft metastaser og dårlig prognose12. Desuden kan MMPs bidrage til tumor progression ved at fremme kræft celle invasion og migration, cellulære processer, der er i sagens natur 3D fænomener13,14. Derfor er der stor interesse i mulighed for at måle MMP aktivitet i 3D kultur i mange sammenhænge, herunder grundlæggende biologiske undersøgelser og stof screening assays.

PIND hydrogels er almindeligt brugt til 3D cellekultur på grund af deres højt vandindhold, resistens over for protein adsorption og afstemmelige karakter. PIND hydrogels har været functionalized med en række fraspaltning til direkte cellefunktion, som med ECM mimetiske peptider som M.H.T., RLD og IKVAV for at lette celle vedhæftning, eller direkte tøjring af vækstfaktorer som omdanne vækst faktor-β (TGF-β) 15,16. Mere nylig, PIND hydrogels har været functionalized med sensor peptider, der aktiverer måling af cellefunktion som godt5,8. Specifikt, brugen af en PIND hydrogel system functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid aktiveret måling af cellulære MMP aktivitet i 3D kulturer med en standard Pladelæser og kræves ingen yderligere behandling. Disse systemer er også kompatibel med andre målinger af cellulære funktion, herunder metaboliske aktivitet. Her, er en protokol, der beskrevet for måling af MMP aktivitet af celler dyrkes i en 3D PIND hydrogel functionalized med en fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid og resultater præsenteret demonstrerer indledende optimeringseksperimenter behov for brug af dette assay. Menneskelige melanom celler (A375) blev indkapslet i fluorogenic hydrogels over en række såning tætheder for at bestemme de passende seeding tætheder, der er inden for arbejdsområdet i analysen. Efter 24 timer af indkapsling, blev MMP og metaboliske aktivitet målt, udnytter en standard mikrotiterplade læser. Næste, MMP aktivitet var normaliseret til metaboliske aktivitet til at bestemme seeding tætheder inden for det lineære område af analysen. Endelig, intra-plade koefficienten for variationen procentdele (% CV) blev beregnet mellem tre afspejler reproducerbarhed af de opnåede resultater. Denne metode giver mulighed for enkel og hurtig 3D cellekultur og nem måling af protease aktivitet med minimal prøve behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel komponenter forberedelse

  1. Syntetisere de fluorescerende protease-nedbrydeligt peptider som beskrevet andetsteds8, udnytter fluorescein som fluorescerende molekylet og dabcyl som quencher. Opløse peptid i DMSO til en koncentration på 10 mM og opbevares i et-80 ° C fryser i små (~ 30 µL) prøver at undgå gentagne fryse-tø cykler.
    Bemærk: Disse peptider kan også købes kommercielt. Denne protokol kræver en C-terminale cystein i peptid sekvens aktivere kovalente iblanding i hydrogel polymer netværk.
  2. Forberede 8 arm 40 kDa poly (etylenglykol) Amin (PEG)-norbornene (NB) som beskrevet17. Kontroller ende gruppe functionalization på mere end 90% bruger 1H NMR. Opløse PIND-NB i sterile fosfat buffer saltopløsning (PBS) på 25% w/v og butik i-80 ° C fryser i (~ 300 µL) delprøver.
    Bemærk: PIND functionalized med norbornene kan også købes kommercielt.
  3. Syntetisere foto-initiativtager lithium phenyl 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) som beskrevet andetsteds18. Opløse LAP i sterilt vand til en koncentration af 68 mM og gemme i et-80 ° C fryser i (~ 300 µL) delprøver.
    Bemærk: som et alternativ, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kan bruges som foto-initiativtager. LAP og Irgacure kan købes kommercielt.
  4. Opløse MMP-nedbrydeligt peptid crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) og celle vedhæftning peptid (CRGDS) i sterilt vand til en koncentration på 200 mM og 100 mM henholdsvis, og gemme dem i en-80 ° C fryser i (~ 300 µL og ~ 30 µL) delprøver, henholdsvis.

2. analysen media forberedelse

  1. Forberede varme, inaktiverede, trækul strippet føtal bovint serum (FBS) til MMP assay:
    Bemærk: Proteaser i FBS kan producere en høj baggrund signal MMP assay; Det anbefales derfor, at varme-inaktivere og trækul strip FBS for assay medier.
    1. Inaktivere 100 mL FBS af varme i 30 min. ved 55 ° C.
      Bemærk: 100 mL FBS blev udnyttet her for aliquoting og opbevaring ved-20 ° C til fremtidig brug. Mindre mængder kan bruges efter behov.
    2. Tilføje 0,25% w/v af aktivt kul og 0.025% w/v i dextran til en lille mængde af FBS (ca. 5 mL) og rør indtil en gylle dannes. Derefter tilsættes resten af FBS og omrystes i 30 min. ved 55 ° C.
    3. Der centrifugeres ved 1,962 x g i 20 min. ved 4 ° C. Derefter overføre supernatanten til et andet fartøj.
    4. Gentag trin 2.1.2 men ved 37 ° C efterfulgt af trin 2.1.3. Sterilisere supernatanten ved hjælp af et 0,45 µm filter og derefter en 0,2 µm filter.
  2. Forberede assay medier ved hjælp af media suppleret med 1% trækul strippet FBS, 2 mM L-glutamin, 10 U/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin.
    Bemærk: Medier uden phenol rød anbefales, fordi det har mindre fluorescens indblanding. Andre tilføjelser til assay medier såsom insulin, vækstfaktorer, osv. lægges så længe absorbansen og fluorescens spektrum toppe ikke overlapper med sensor (494 nm/521 nm).
  3. Fortyndet bakteriel collagenase enzym type I i 10 og 1.000 µg/mL i assay medier som positiv kontrol.

3. Hydrogel forberedelse og celle indkapsling

  1. Forberede hydrogel forløber løsning.
    1. Tilføje reagenser til 1,5 mL tube i følgende rækkefølge, vortexing efter tilsætning af hver komponent: 20 mM 8 arm 40 kDa PIND-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-nedbrydeligt peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP, og 0,25 mM fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid.
      Bemærk: Tabel 1 viser hydrogel forløber løsning indholdet, stock koncentrationer, arbejder koncentrationer, formler til beregning af volumen, og de krævede mængder nødvendige for at gøre 120 µL af hydrogel forløber løsning, som er tilstrækkelig til at gennemføre en eksperimentere med 10 hydrogels. For at tage hensyn til tab af hydrogel løsning på grund af pipettering, øge det samlede omfang af 20%. De kommercielle peptider leveres ofte i en sure brint chloridopløsning; Derfor er NaOH tilsættes for at opnå et slut-pH på 7. pH af den endelige løsning bør bekræftes af brugeren.
    2. Opdele hydrogel forløber løsning i flere 1,5 mL rør, en tube pr. betingelse bliver testet.
      Bemærk: Flere kontrol betingelser, hvor hydrogels er forberedt uden tilsætning af celler er foreslået. For en negativ kontrol, for at tage hensyn til ikke-specifikke nedbrydning af fluorogenic sensor, én hydrogel betingelse kan sættes i varmeskab med kontrolelementet køretøjets eller eksperimenterende medierne alene hvis der er ingen behandling betingelser. For en positiv kontrol og kalibrering mellem eksperimenter, hydrogels kan sættes i varmeskab med en protease, kendt for at kløve fluorogenic sensoren. For eksempel, blev to koncentrationer af bakteriel collagenase brugt her.
  2. Indkapsle celler i hydrogels.
    1. Forberede en enkelt cellesuspension som passer til den celletype bliver brugt. For eksempel, vaske en 10 cm parabol af A375 melanom celler med 10 mL PBS. Trypsinize celler ved hjælp af 0,05% trypsin og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 til 3 min. tælle celler med en hemocytometer til at bestemme samlede celle nummer.
    2. Centrifugeres celle løsning på 314 x g i 3 min, Aspirér dyrkningsmedier, så genopslæmmes celler i PBS på cirka tre gange den højeste krævede seeding tæthed for eksperimentet. For eksempel, blev en cellesuspension med en massefylde på 21 x 106 celler brugt her at nå en endelig encapsulated tæthed på 7 x 106 celler/mL.
    3. Tælle cellerne igen for at sikre en nøjagtig celle koncentration.
    4. Tilføje suspenderede celler og PBS til hvert rør af hydrogel forløber løsning ifølge de krævede seeding tæthed (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 x 106 celler/mL i dette eksempel). Tilføje PBS betingelser med ingen celler i stedet for suspenderede celler.
      Bemærk: Alle betingelser bør have den samme endelige hydrogel forløber løsning volumen at sikre forholdet mellem hydrogel komponenter og PBS er konstant. Gør ikke vortex rør, der har celler i dem, pippeteres der kraftigt op og ned uden at oprette bobler for at blande opløsningen forløber.
    5. Undvære 10 µL af opløsningen hydrogel forløber i en steril sort rund 96-brønd bundplade, at sikre, at spidsen er centreret i midten af hver godt mens udlevering.
    6. Polymerisere hydrogel forløber løsning ved at udsætte plade til ultra ultraviolet (UV) lys på 4 mW/cm2 for 3 min.
      Bemærk: UV lampe (UVL-56 håndholdte UV-lampe, UVP, Upland, CA) producerer UV-A lys på en lang UV bølgelængde (365 nm), som påvirker ikke cellulære levedygtighed.
    7. Tilføj 150 µL af assay medier i alle pladens huller, undtagen for positive kontrol betingelserne uden indkapslede celler. De positive kontrol, Tilføj 150 µL af collagenase enzym løsning.
    8. Tilføj 150 µL af PBS til de ydre pladens huller til at reducere fordampning under inkubation.

4. MMP og metaboliske aktivitet måling

  1. Måle fluorescens umiddelbart efter indkapsling til at etablere en baseline fluorescens målingen og sikre ensartethed i hydrogel polymerisering. Læs pladen ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade scan læser udnytter en uigennemsigtig 96-brønd plade protokol med et område indstilling på 494 nm/521 nm (excitation/emission). Dette vil være 0 h Læs.
  2. Inkuber plade i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 til 18 h.
  3. Tilføje metaboliske aktivitet reagens (resazurin) på 1:10 (v/v) til hver brønd.
  4. Inkuber plade i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for en yderligere 6 h.
    Bemærk: Denne inkubationstiden kan variere afhængigt af celletype.
  5. Måle fluorescens på 24 h efter indkapsling. Læs pladen ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade scan læser udnytter en uigennemsigtig 96-brønd plade protokol med et område indstilling på 494 nm/521 nm (excitation/emission) for MMP aktivitet og 560 nm/590 nm (excitation/emission) for metaboliske aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den aktuelle analyse blev tilpasset fra en tidligere udviklede og karakteriseret 3D hydrogel kultur system functionalized med en fluorogenic MMP cleavable sensor8. Fluorogenic MMP sensoren bruges her består af et peptid sekvens, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ angiver webstedet kavalergang), var tidligere optimeret til spaltning af MMP-14 og MMP-1119. Peptid er mærket med en fluorescerende molekyle (fluorescein) og en quencher molekyle (dabcyl) på hver side af kavalergang websted (figur 1). Ved udsættelse af fluorogenic sensor til den passende protease, fluorophore og quencher er adskilt og fluorescens øger. Her, var analysen miniaturized fra en 24-godt plade til en 96-brønd plade format, at fjerne flere trin i indkapsling processen og reducere den tid, der kræves for at udføre et eksperiment med 50%. Yderligere, reduceret omfanget af reagenser forbruges af 80%, som hydrogel diskenheder blev reduceret fra 50 µL til 10 µL pr. brønd. Desuden ved hjælp af en 96-brønd tallerken, kunne 20 betingelser i tre testes i stedet for de 12 betingelser i dubletter pr. 24-godt plade. En skematisk af celle indkapsling proces er illustreret i figur 2. Etiket 1 og 2 svarer til trin 3.1 og 3.2 i protokollen, henholdsvis. Etiketter 3-5 svarer til trin 3.2.5 til 3.2.7 i protokollen. Etiketter 6 til 9 svarer til trin 4,2 til 4,5 i protokollen.

For at etablere påvisningsgrænserne og signalere vifte af analysen, var hydrogels functionalized med fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid inkuberes med en række koncentrationer (0 til 2.000 µg/mL) af bakteriel collagenase enzym type jeg. Efter 24 h inkubation ved 37 ° C, blev en Pladelæser brugt til at måle fluorescens (figur 3). Fra disse målinger, dynamiske (laveste og højeste opdaget signaler) og arbejdsområde (3 standardafvigelser over den laveste detekterede Signals) og 3 standardafvigelser under den højeste detekterede Signals blev fastsat. Efter 24 h inkubation, blev det observeret at det laveste detekterede Signals blev produceret af negative kontroller (baggrundsstøj) på 0 µg/mL collagenase, mens den højeste opdaget signal blev produceret af 1000 µg/mL collagenase eller ovenfor, hvor signalet begynder at Plateau (figur 3). Fra dynamikområde, var arbejdsområde beregnet til at være mellem ≈0.16 µg/mL og ≈474 µg/mL af collagenase, en bred signalområde på tværs af tre størrelsesordener.

For celle kultur assays, skal den relevante celle tæthed, der resulterer i fluorescens behandlinger inden for arbejdsområdet i analysen bestemmes for hver celle. Her præsenteres repræsentative data for melanom cell line A375, indkapslet i en række tætheder fra 0,25 til 7 x 106 celler/mL. Fluorescens intensitet blev erhvervet udnytter en standard mikrotiterplade læser på to forskellige tidspunkter: 1) direkte efter indkapsling (0 h) og 2) efter 24 h af indkapsling. Ved 0 h var fluorescens aflæsninger lave på tværs af seeding tætheder (figur 4A), som forventet. Efter 24 timer af kultur (fig. 4B) var MMP aktivitet direkte proportional med den seeding tæthed, hvor flere celler resulterede i flere spaltning af fluorogenic MMP cleavable sensor og højere fluorescens intensitet. Som interne kontroller, hydrogels indeholder ingen celler blev inkuberet med 0, type 10, og 1000 µg/mL af collagenase I-enzym til at angive de low, medium og høje niveauer af signal henholdsvis (som fastlagt af collagenase signal rækkevidde karakterisering i Figur 3) og repræsenteret af stiplede linjer i figur 4B. Yderligere, arbejde område grænser blev beregnet ud fra 0 og 1000 µg/mL signaler og repræsenteret af stiplede linjer i figur 4B. Seeding tætheder på eller større end 1 x 106 celler/mL falder inden for arbejdsområdet. Metaboliske aktivitet målinger af A375 cellelinje blev også direkte proportional med cellen såning tæthed (fig. 4C). Tidligere, MMP aktivitet er blevet normaliseret til metaboliske aktivitet som en intern kontrol til at bestemme MMP aktivitet på en per celle grundlag8. Normalisere MMP aktivitet til metaboliske aktivitet på tværs af seeding tætheder resulterede i ingen signifikant forskel i MMP aktiviteter ved såning tætheder større end 2 x 106 celler/mL (figur 4D). Bestem variabiliteten mellem tre i hver tallerken (intra-plade variation) koefficienten for variationen procentdel (% CV) blev beregnet for både MMP og metaboliske aktivitet og er opsummeret i tabel 2. % CV under 20% angiver, at den intra-plade variation inden for tre er acceptabelt for systemet at producere ensartede resultater20,21.

Figure 1
Figur 1 : Fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid design. Fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid består af en rygrad peptid GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ angiver webstedet kavalergang), der bestemmer specificiteten af sensoren. Peptid er mærket med en quencher (dabcyl) og en fluorophore (fluorescein), som er unquenched (fluorescerer) når rygraden peptid er kløvet af MMP. En thiol gruppe er konjugeret til rygraden peptid aktivere kovalente reaktion med norbornene funktionelle grupper i molekylet PIND kobling sensoren til hydrogel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Assay skematisk. Hydrogel forløber løsningskomponenter er blandet med celler suspenderet i PBS. Forløber løsningen er så pipetted i sort, rund bund, 96-brønd plader og polymeriserede ved udsættelse for UV-lys i 3 min. Assay medier er tilføjet, og Pladerne inkuberes i 18 h (37 ° C, 5% CO2). Metaboliske aktivitet reagens resazurin derefter tilsættes, og Pladerne inkuberes i en yderligere 6 h. MMP og metaboliske aktivitet måles ved hjælp af en fluorescerende mikrotiterplade læser med et godt scan protokol på de angivne excitation/emission bølgelængder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Dynamisk og arbejdsområde i analysen. Hydrogels functionalized med fluorogenic MMP-nedbrydeligt peptid blev inkuberet med en række koncentrationer af collagenase enzym type jeg i 24 timer ved 37 ° C og fluorescens intensitet blev målt. Stiplede linjer repræsenterer rækken dynamisk og i orden. n = 3, mener ± standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Effekt af såning tæthed af melanom cell line A375 på MMP aktivitet. A indledende måling (0 h) af MMP aktivitet for A375 cellelinje indkapslet over en række seeding tætheder. n = 3 gennemsnit ± SD. (B) måling af MMP aktivitet på 24 h. 0, 10 og 1000 µg/mL af collagenase er repræsenteret af stiplede linjer. Stiplede linjer repræsenterer arbejdsområde (WR) beregnet fra collagenase kontrol. n = 3, mener ± SD. (C) Measurement af metaboliske aktivitet for A375 cellelinje indkapslet i 24 timer over en række såning tætheder og inkuberes med resazurin til 6 h. n = 3, mener ± SD. (D) A375 MMP aktivitet normaliseret til metaboliske aktivitet. n = 3, mener ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Table 1
Tabel 1: Hydrogel forløber løsning forberedelse.

Table 2
Tabel 2: Intra-plade % CV af assay med A375 cellelinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D in vitro-cellekultur sammenfatter mange vigtige aspekter af in vivo-miljø. Men 3D kultur gør også vurderingen af cellefunktion og signalering, udfordrende, så mange biologiske assays kræver cellulære hentning og det store antal celler. Derfor, udvikling af en simpel 3D kultur system, der muliggør måling af cellulære funktion uden yderligere prøve behandling ville i høj grad øge nytten af 3D kultur systemer. 3D-systemet beskrevet her kan tilpasses til en lang række forskellige applikationer. Sekvensen af fluorogenic sensor kan ændres for at opdage andre proteaser. For eksempel, den fluorogenic cleavable sensor sekvens (GPQG↓IWGQK) som kan kløves af MMP-1, -2, -3, -7, -8 og -9, blev tidligere udnyttet til at opdage melanom MMP aktivitet i svar til kemoterapeutika22. Brug af ordningen for PIND hydrogel giver også mulighed for præcis uafhængig tuning af den cellulære mikromiljø, herunder de mekaniske egenskaber, nedbrydeligheden og matrix vedhæftning fraspaltning inden for hydrogel. Vedhæftning molekyle M.H.T. bruges i dette arbejde er en fibronektin-afledte sekvens og muliggør integrin-medieret vedhæftning. Andre adhæsionsmolekyler såsom (RLD) og (IKVAV) der er afledt af fibrinogen og laminin henholdsvis kunne udnyttes til at aktivere andre typer af integrin receptorer. For eksempel blev det påvist, at ændre adhæsionsmolekyler ændret strækning af aorta utætte hjerteklapper interstitielle celler (VIC), som kan have en effekt på aorta ventil stenose15. Hydrogel crosslinker sekvens kan styre nedbrydelighed af hydrogel og indkapslet cellulære adfærd inden for hydrogel. For eksempel blev det påvist at fibroblaster havde øget spredning og celle spredning når kulturperler i hurtigere nedværdigende hydrogels, som kan fremskynde den helbredende proces i vivo23. Mekaniske egenskaber af mikromiljø kan også regulere cellefunktion, og hydrogel stivhed kan ændres ved at ændre antallet af våben i PIND macromer, PIND molekylvægt og forholdet mellem PIND og crosslinker.

Fordi MMP aktivitet varierer efter celletype, for hver ny celletype er det vigtigt at foretage en indkapsling tæthed optimeringseksperiment, som vist her. Efter 24 timer af indkapsling var MMP og metaboliske aktivitet direkte proportional med celle seeding tæthed. Dog i længere tid fluorescerende signal kan plateau, derfor timingen af analysen muligvis optimeres ved bruger8. Specifikke protease sensor kan også påvirke arbejdsområde og timing af analysen. Arbejdsområde af analysen kan bestemmes ved at foretage et signal rækkevidde eksperiment med ingen celler og et proteolytisk enzym over en bred koncentration. Inddragelse af flere ingen celle hydrogel betingelser inkuberes med enzym kontrol giver mulighed for etablering af lav (baggrundsstøj), medium og høje niveauer af signal i hvert assay (0, 10 og 1000 µg/mL collagenase her). Dette giver en indikation af hvor de signaler, der er produceret af celler falder inden for arbejdsområdet i analysen. Denne analyse er også kompatibel med andre fluorescerende sensorer, der ikke har overlappende excitation og emission spektre, som den metaboliske aktivitet assay bruges her som en intern kontrol til at beregne MMP aktivitet på pr. celle grundlag, som tidligere rapporteret8 . MMP aktivitet normaliseret til metaboliske aktivitet demonstreret gyldigheden af denne tilgang til såning tætheder på eller over 2 x 106 celler/mL, hvor der var ingen væsentlig ændring på tværs af såning tætheder. Denne normalisering er afgørende for at identificere de relevante seeding tætheder, der er inden for arbejdsområdet MMP aktivitet kurve og inden for den lineære del af normalisering kurve.

Mens analysen kan tilpasses til flere formål, er der flere begrænsninger og kritiske aspekter brugeren bør overveje, specielt vedrørende interferens med fluorescerende signal og forberedelse af hydrogels. Først, pleje skal tages med valget af dyrkningsmedier og supplerende behandlinger, som disse kan have en overlappende absorbans spektrum eller uigennemsigtighed, der kan forstyrre afsløring af fluorescens eller dæmpning af signalet. Det anbefales at bruge kultur medier, der ikke indeholder phenol rød. Også, nogle narkotika behandlinger er fluorescerende (f.eks. doxorubicin), eller har absorbans spektrum der overlapper med excitation/emission spektrum af fluorophore (fx curcuminoids). Et andet aspekt, der kan påvirke ydeevnen af analysen er hydrogel forberedelse. På grund af den høje viskositet af hydrogel forløber løsning skal pleje tages for at sikre grundig blanding af hydrogel løsning og omhyggelig pipettering praksis at forhindre ulige fluorophore indhold eller hydrogel løsning volumen i hver brønd. Pre befugtning af pipette tips og ved hjælp af lav-retention tips kan hjælpe med at reducere variation. Et andet vigtigt aspekt af hydrogel forberedelse er hydrogel form og placering i brønde. Hydrogel bør være centreret i brønden og af en ensartet form at give præcise fluorescens målinger med mindre variabilitet15. Her, aids brug af runde bundplade i centrering pipette tip i hver brønd og produktion af halvkugleform hydrogels konsekvent på tværs af alle brønde.

Ved at tilpasse ordningen 3D protease-nedbrydeligt hydrogel, kan real-time protease og metaboliske aktivitet udlæsninger påvises i en 3D mikromiljø med minimal prøve behandling. Desuden reducerer brugen af de syntetiske PIND hydrogel batch til batch variationer observeret med naturligt afledt ECM hydrogels. Derudover udnytter PIND hydrogels giver mulighed for finjustering af kemiske og mekaniske stikord af hydrogels for en forbedret kontrol af mikromiljø. Derudover PIND hydrogel polymerisering beskrevet her er et foto-indledt processen, hvilket gør det hurtig og mere medgørlige til høj overførselshastighed metoder end klassiske naturlige ECM hydrogels (dvs.., kollagen eller Matrigel), som er langsommere og temperatur følsom. Denne hurtige, bruger-kontrolleret polymerisering tillader optrapning af systemet til automatiseres yderligere ved hjælp af robot flydende handlere, som det fremgår af andre15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Ohio kræft forskning (OCR), ÅH, USA støtte dette arbejde samt King Saud University (KSU), Riyadh, KSA for at sponsorere den første forfatter. Molekylevægt af fluorescerende peptid sensor blev målt ved hjælp af matrix assisted, laser desorption-ionisering, time of flight (MALDI-TOF) massespektrometri med bistand fra Campus kemiske Instrument Center massespektrometri og proteomanalyse Facilitet på Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 Hydrogels 3D celle indkapsling Matrix Metalloproteinases metaboliske aktivitet melanom fluorescens
Måling af Global cellulære Matrix Metalloproteinase og metaboliske aktivitet i 3D Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter